JP2016540033A - 新規ケモカイン受容体、cxcr8の同定 - Google Patents
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Abstract
CXCR8シグナル伝達の増加と関連する疾患について、対象を治療する方法。該方法は、対象において、リガンドCXCL17による受容体CXCR8の活性化を阻害することを含む。該方法において、阻害は、CXCL17がCXCR8に結合することを阻害する物質を対象に投与することを含む。CXCR8/CXCL17に関与するスクリーニング方法、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト及びワクチンも提供される。【選択図】図6
Description
〔連邦政府によって後援を受けた研究又は開発に関する記載〕
本発明は、米国国立衛生研究所からの政府の支援(交付番号R01−AI093548)により、なされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有するものである。
本発明は、米国国立衛生研究所からの政府の支援(交付番号R01−AI093548)により、なされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有するものである。
配列表に対する言及
2014年9月30日に作成された、「1279588SEQLIST」と名付けられ、51キロバイトの大きさを有するASCIIテキストファイルとして、配列表が本明細書に提出される。配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
2014年9月30日に作成された、「1279588SEQLIST」と名付けられ、51キロバイトの大きさを有するASCIIテキストファイルとして、配列表が本明細書に提出される。配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は、ケモカインCXCL17、及びその受容体CXCR8/GPR35に関する。
本発明は、ケモカインCXCL17、及びその受容体CXCR8/GPR35に関する。
ヒトケモカインスーパーファミリーは、約48個のリガンドと、19個の既知の受容体を含む。大部分のリガンドの受容体は同定されたが、一部はまだ「オーファン(orphan)」のままである(1)。ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド17(CXCL17)は、発見された最新のケモカインリガンドである(2)。本発明者らは、CXCL17が、特発性肺線維症(IPF)患者の気管支肺胞洗浄において著しく発現増加する粘膜関連ケモカインであることを既に報告している(3)。重要なことに、それは、受容体が未だに同定されていない、わずかな「オーファン」ケモカインリガンドのうちの1つでもある(他はCXCL14である)(1)。
ケモカインは、体内で白血球及び他の細胞の輸送を行う走化性サイトカインのファミリーである。ケモカインは、標的細胞表面に発現するGタンパク質共役受容体(GPCR)に結合して、細胞内シグナル伝達カスケードを開始し、走化性を誘導する。ほとんどのケモカインの同族受容体は特性解析されているが(4)、最近報告されたケモカイン、CXCL17の受容体は、未だ同定されていない。本明細書に記載されるように、GPR35はCXCL17の受容体である。CXCL17は、マクロファージ及び樹状細胞を化学的に誘因することが知られている(2)。GPR35は、CXCL17−応答性ヒト単球、樹状細胞(DC)、及びTHP−1単球様細胞系により/又はそこで発現する。更に、カルシウム動員アッセイにより測定されるように、GPR35のBa/F3細胞へのトランスフェクションにより、CXCL17に対する応答性が付与される。CXCL17は、粘膜組織で発現するケモカインであり(3);GPR35の発現は、粘膜の発現パターンに酷似している。GPR35は、DRYボックス及びTxPモチーフを含む、ケモカイン受容体のいくつかの構造的特徴をも示す。GPR35は新規なケモカイン受容体であると結論され、それ故、それはケモカイン(C−X−Cモチーフ)受容体8(CXCR8)と命名されるであろう。GPR35はヒトの疾患と関連づけられ;GWAS試験により、それは炎症性腸疾患(IBD)と関連付けられた(5)。まとめると、これらの観察は、新規な粘膜ケモカインCXCL17/CXCR8軸が、呼吸器系及び消化器系の病態生理学的又は炎症過程における治療介入のための重要な標的を示すことを強く示唆する。この組み合わせはヒトで証明されているが、異なる種においても対応物は同様の組み合わせであろう。異なる種の対応物が組み合わせられる可能性があり、通常の交差反応性を示すか、天然の組み合わせと比較し、異なる親和性又はシグナル伝達能力を有する可能性がある。
一態様では、CXCR8シグナル伝達の増加と関連する障害のための対象の治療方法が提供される。該方法は、対象において、リガンドCXCL17による受容体CXCR8の活性化を阻害することを含む。該方法においては:a)阻害は、CXCL17がCXCR8に結合することを阻害する物質を対象に投与することを含むことができ;b)障害は、胃腸障害、呼吸器障害、代謝障害、感染症、又は腫瘍障害であってもよく、特定の実施形態では、肺、消化器又は生殖系炎症性疾患であってもよく;c)このような炎症性疾患としては、クローン病(CD)、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は過敏性大腸症候群(IBS)、潰瘍、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病(celiacs disease)、気管支肺異形成症、特発性肺線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、気管支炎、肺気腫、無症候性間質性肺疾患(無症候性ILD)、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、子宮内膜症、平滑筋腫、腺筋症、細菌性膣症、又は尿道の感染若しくは炎症を挙げることができ;d)又はa)〜c)の任意の組み合わせである。
他の態様では、受容体CXCR8とリガンドCXCL17との結合を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。該方法は、CXCR8を発現する細胞にCXCL17を添加すること、及び物質の存在下、細胞中でのCXCR8シグナル伝達の減少を測定することを含む。例えば、Ba/F3細胞株のCXCR8形質転換体を、CXCR8/CXCL17相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用することができる。
更なる態様では、受容体CXCR8とリガンドCXCL17との結合を阻害する物質のスクリーニング方法が提供される。該方法は、CXCR8にCXCL17を添加すること、及び物質の存在下、CXCL17のCXCR8への結合の減少を測定することを含む。
本明細書に記載される、これらの又は他の方法では、物質は、a)CXCL17又はCXCR8と結合する抗体又はその断片;b)天然又は変異体のCXCL17の配列を示すポリペプチド;c)CXCL17の非ペプチド結合変異体;d)CXCL17又はCXCR8と結合する小分子;e)CXCL17又はCXCR8と結合するアプタマー;又はa)からe)の任意の組み合わせであってもよい。
更なる態様でおいては、以下のものが提供される:
a)リガンドがCXCR8受容体と選択的に結合する、CXCR8のリガンドが提供される。リガンドは、前記受容体を介してシグナル伝達するもの、例えばアゴニスト;ヒトCXCL17の85%未満、90%未満、95%未満又はそれ以上をシグナル伝達するもの、例えばアンタゴニスト;インバースアゴニスト(CXCR8の定常活性を阻害するもの);アロステリック調節因子(CXCR8のシグナル伝達活性を変化させるが、リガンド(CXCL17)の結合を阻害しないもの);ヒトCXCL17と少なくとも約85%、90%、95%、又はそれ以上の同一性を有するもの、例えばムテイン;ヒトCXCL17と少なくとも94%の同一性を示す、少なくとも17、19、23、27、31個若しくはそれ以上のアミノ酸部分を含むもの;及び/又は霊長類のCXCR8受容体と結合するものであってもよい。リガンドは、無菌組成物中にあるもの、全身又は局所用に製剤化されたもの;治療用組成物中にあるもの;単回投与容器中にあるもの;及び/又はヒトCXCL17と少なくとも90%の配列同一性を有するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ヒトCXCL17と少なくとも約85%、90%、95%、又はそれ以上の配列同一性を含み、実施形態は、ヒトCXCL17の天然の配列と同一の配列を含まない。
b)CXCR8のリガンドと選択的に結合する抗体が提供される。該抗体は、CXCR8受容体との結合を阻害し;CXCR8受容体によるシグナル伝達を阻害し得る。
c)ヒトCXCL17に対する受容体又は結合タンパク質が提供される。受容体又は結合タンパク質は:前記ヒトCXCL17の結合により更にシグナル伝達し;CXCL17の結合により、ヒトCXCR8と比較して少なくとも約80%のシグナルをシグナル伝達し;ヒトCXCR8と少なくとも約95%の同一性を有し;又は霊長類のCXCL17と結合することができる。いくつかの実施形態では、ヒトCXCR8と少なくとも約95%以上の配列同一性を含み、該実施形態は、ヒトCXCR8の天然の配列と同一の配列を含まない。
d)CXCR8を介したCXCL17シグナル伝達の阻害方法も提供される。該方法は、a)CXCR8(受容体)をCXCL17(リガンド)アンタゴニストと:b)CXCL17(リガンド)を遮断薬と;及び/又はc)CXCR8を発現する細胞を細胞シグナル伝達の遮断薬と接触させることを含む。CXCL17(リガンド)アンタゴニストは;a)CXCR8(受容体)又は種変異体と結合する抗体(又はその断片);b)CXCL17(ケモカイン)変異体(例えば、結合するが、シグナル伝達しない;種変異体及び対応物);又はc)小分子化合物から選択することができる。遮断薬は:a)CXCL17と結合する抗体(又はその断片)(例えば、ケモカイン、結合を阻害し;種変異体を含む);b)受容体の可溶性部分であってもよい、受容体の断片;及び/又はc)小分子化合物から選択することができる。細胞シグナル伝達の遮断薬は:例えば、シグナル伝達経路のメンバーのa)RNAi、CRISPR、若しくはTALEN化合物;b)シグナル伝達経路を阻害する抗体;又はc)小分子化合物であってもよい。
e)CXCR8(受容体)シグナル伝達の誘発方法であって、前記受容体を、その同族リガンド(CXCL17又はそのアゴニストであってもよい)と接触させることを含む、前記方法。アゴニストは、CXCL17のポリペプチド配列変異体、又はCXCL17の非ペプチド結合変異体若しくはその断片であってもよい。
f)前記CXCL17アンタゴニストのスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、FLIPRアッセイ、細胞をベースとするアッセイ、生化学的アッセイ、又は他のアッセイから選択されるアッセイを含む、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR)又は関連検出システムを使用する、細胞をベースとするアッセイを使用する。該方法においては、前記スクリーニングは:i)種変異体又は対応物を含む、CXCL17と結合する抗体;ii)種変異体を含む、CXCL17のポリペプチド配列変異体;iii)CXCL17の非ペプチド結合変異体、例えば、グルコシル化又は他の修飾体;iv)小分子アンタゴニスト候補;又はv)アプタマーライブラリーを含む1種以上の化合物で行われる。
g)(f)に記載される前記遮断薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、FLIPR(moleculardevices.com/Products/Instruments/FLIPR−Systems.htmlにおけるワールドワイドウェブ)アッセイ、細胞をベースとするアッセイ、又は生化学的アッセイ等のアッセイを使用する方法;i)CXCR8又は種変異体と結合する抗体;ii)CXCL17のポリペプチド配列変異体、例えば、可溶性受容体断片又は種変異体;iii)グリコシル化又は他の修飾等の、CXCL17の非ペプチド結合変異体;iv)小分子アンタゴニスト候補;及び/又はv)アプタマーライブラリーを含む1種以上の化合物で行われる。
h)前記CXCL17アンタゴニスト又は遮断薬のスクリーニング方法であって、Ba/F3細胞株のCXCR8形質転換体が、CXCR8/CXCL17相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用され得る、前記方法。特定の実施形態では、前記スクリーニングは、細胞をベースとするアッセイ、生化学的アッセイ、又は他のアッセイであってもよい、FLIPR又は関連検出システムを使用する、細胞をベースとするアッセイを使用する。更なる実施形態では、前記スクリーニングは:a)CXCL17又は種変異体と結合する抗体;b)CXCL17又は種変異体のポリペプチド配列変異体;c)グリコシル化又は他の修飾を含む、CXCL17の非ペプチド結合変異体;d)小分子アンタゴニスト候補;又はe)アプタマーライブラリーを含む1種以上の化合物で行われる。前記スクリーニングが、FLIPRアッセイ、細胞をベースとするアッセイ、又は生化学的アッセイを使用する方法が、同様に提供される。追加の実施形態は、前記スクリーニングが:a)CXCR8、又は種対応物若しくは変異体と結合する抗体;b)可溶性受容体断片及び種対応物若しくは変異体を含む、CXCL17のポリペプチド配列変異体;c)グリコシル化又は他の修飾を含む、CXCL17の非ペプチド結合変異体;d)小分子アンタゴニスト候補;又はアプタマーライブラリーを含む1種以上の化合物で行われる。特定の一実施形態では、Ba/F3細胞株のCXCR8形質転換体が、CXCR8/CXCL17相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストをスクリーニングするために使用される。
i)CXCR8シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる、種々の胃腸障害としては:a)クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎(UC)、セリアック病、又は過敏性大腸症候群(IBS)、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病;b)胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、又は肝細胞がん、食堂がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、胃腸間質性腫瘍;c)自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の(非自己免疫性)肝硬変、原発性硬化性胆管炎、若しくは肝線維症;又はd)C型肝炎ウイルス(HCV)が媒介する肝硬変、ヘリコバクターピロリが原因の消化管潰瘍が挙げられる。例えば、Hauser,S.C.Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review,第4版、Mayo Clinic Scientific Press,2013;Hawkeyら,Clinical and Gastroenterology and Hepatology,第2版、Wiley−Blackwell,2012;及びYamada T.ら、Yamada's Handbook of Gastroenterology,第3版、Wiley−Blackwell,2013を参照のこと。
j)CXCR8シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる代謝障害としては、1型糖尿病、又は2型糖尿病が挙げられる。例えば、Fonseca,V.A.Clinical Diabetes.Elsevier,2012を参照のこと。
k)CXCR8シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる腫瘍学的代謝障害としては、白血病、リンパ腫、膠芽腫及び関連脳腫瘍が挙げられる。例えば、Mughal,T.I.Understanding Leukemias,Lymphomas and Myelomas,第2版、Informa 2012;並びにKaye,A.H.及びLaws E.R.Jr.Brain Tumors,第3版、Elsevier 2012を参照のこと。
l)CXCR8シグナル伝達の増加と関連し、本発明の方法により治療することのできる呼吸器障害は、a)小細胞肺がん(7)又は非小細胞肺がん(8)を含む肺がん(6)、若しくは中皮腫(9)(悪性);b)特発性肺線維症(10)、過敏性肺炎(11)、若しくは非特異的間質性肺炎;c)関節リウマチ若しくは強皮症等の自己免疫疾患を含む間質性肺障害と関連のある呼吸器障害;d)慢性閉塞性肺疾患(COPD)(12)、気管支肺異形成症(BPD)(13)、若しくは喘息(14);及び/又はe)気管がん、喉頭のがん、食道がん、気管支のがん、鼻腔/副鼻腔がんを含む、他の呼吸器系がんから選択することができる。例えば、Judd,S,J,Respiratory Disorders Sourcebook,第2版、Health Reference Series,2012;及びLechner,A.Respiratory,An integrated approach to disease;McGrawHill LANGE,2012を参照のこと。
m) 投与は、a)局所(topical)、局所的(local)、又は全身;b)エアロゾル又はミストとしての吸入;又はc)他の治療法との組み合わせであってもよい。
n)例えば、アジュバント及び/又はアゴニストとして、CXCL17アゴニストを含むワクチンが提供され、又は正のアロステリック調節因子を含む受容体(CXCR8)のシグナル伝達能力を変化させる、アゴニスト又はアンタゴニスト活性(CXCL17に対する)を有しない分子を含むワクチンが提供される。該ワクチンは、例えば、B型肝炎、ヒトパピローマウイルス、DPT、及び/又は麻疹ウイルスに対するワクチンにおけるもののような、防御抗原を含んでいてもよい。いくつかのケースでは、標的抗原は、腫瘍関連抗原(以下のがん:すなわち、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、及び/又は膠芽腫)、若しくは分散性(disperse)白血病及びリンパ腫における抗原である。ワクチンは、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、又は膠芽腫のために使用することができる。ワクチンは、対象に投与され得る。例えば、Plotnik,S.A.ら、Vaccines,第6版、Elsevier 2012を参照されたい。他の実施形態では、ワクチンは、寛容原性細胞の動員を阻害し得る、的確な濃度で、CXCL17のアンタゴニストを含んでいてもよい。
o)対象において上昇した血圧を媒介させる方法であって、適当量のCXCR8アゴニストを投与して前記血圧を媒介させることを含む、前記方法。いくつかの実施形態では、上昇した血圧は高血圧である。アゴニストは:a)組換え型ヒトCXCL17;b)ヒトCXCL17(種変異体を含む)のポリペプチド変異体;c)CXCL17の非ペプチド結合変異体(例えば、グリコシル化又は他の修飾)から選択することができる。
p)マクロファージ又は樹状細胞を動員する方法であって、前記方法は、CXCR8アンタゴニストを投与すること(及び、例えば、前記細胞を収集すること)を含み;更に、CCR2発現細胞中でカルシウム流を誘発する分子等として定義される、CCL2のような、CCR2アゴニストを投与することを含んでもよい。
q)胃腸、代謝及び呼吸器系疾患、及びがんを含む、ヒトの疾患の原因に関与する細胞のマーカー、白血病、リンパ腫、胃がん、結腸直腸がん、若しくは膵臓がんの転移細胞のバイオマーカー、小細胞肺がん若しくは非小細胞肺がんを含む肺がん又は悪性中皮腫の転移細胞のバイオマーカー、無症候性間質性肺疾患(無症候性ILD)のバイオマーカー、胃腸若しくは呼吸器系がんに浸潤する細胞の予後バイオマーカーとしてCXCR8を使用する方法。
r)アテローム性動脈硬化症(例えば、George,S.J.Atherosclerosis:Molecular and Cellular Mechanisms,Wiley−Blackwell 2012を参照のこと)を治療若しくは予防し、又は多発性硬化症(例えば、Holland,N.ら.Multiple Sclerosis,第4版、Demos Health,2012を参照のこと)を治療若しくは予防する方法であって、有効量の:a)CXCR8アンタゴニスト、若しくはCXCR8発現の阻害剤;又はb)CXCL17アンタゴニスト若しくはCXCL17発現の阻害剤を対象に投与することを含む、前記方法。CXCR8アンタゴニストは:a)CXCR8(又は種変異体、例えば、結合するがシグナルを伝達しない)と結合する抗体;b)CXCL17のポリペプチド配列変異体(例えば、可溶性受容体断片;種変異体);c)CXCL17の非ペプチド結合変異体(例えば、グリコシル化又は他の修飾);d)小分子アンタゴニスト;又はe)アプタマーから選択することができる。CXCR8発現又は下流シグナル伝達の阻害剤は、RNAi、CRISPR、TALEN化合物等を使用することができる。CXCL17アンタゴニストは:a)CXCL17(又は種変異体;結合するが、シグナルを伝達しない)と結合する抗体;b)CXCL17のポリペプチド配列変異体(種変異体を含む);c)CXCL17の非ペプチド結合変異体(例えば、グリコシル化又は他の修飾);d)小分子アンタゴニスト;又はe)アプタマーから選択することができる。CXCL17発現又はシグナル伝達の阻害剤は、RNAi、CRISPR、TALEN化合物等を使用することができる。
s)CXCR8を介したCXCL17シグナル伝達の阻害方法であって、CXCR8(受容体)の発現を阻害するRNAi、CRISPR、又はTALEN化合物を用いて、CXCR8受容体を減少させることを含む、前記方法。また、CXCR8を介したCXCL17シグナル伝達の阻害方法であって、CXCL17(リガンド)の発現を阻害するRNAi、CRISPR、又はTALEN化合物を用いて、CXCL17を減少させることを含む、前記方法。
t)抗−CXCR8抗体を、末梢血単核細胞調製物と混合すること、及び前記抗体によりCXCR8陽性細胞を分離することを含む、CXCR8発現細胞の分離方法。該方法においては、抗−CXCR8抗体は、モノクローナル抗体、中和抗体、若しくはヒト化抗体、又はそれらの組み合わせであってもよく;分離は、蛍光標識細胞分取によることができ、及び/又は分離は磁気ビーズ分離によることができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、CXCR8シグナル伝達の増加と関連する障害について対象を治療する方法が含まれ、物質、アゴニスト又はアンタゴニストは、以下のもの:キヌレニン酸、2−アシルリゾホスファチジン酸、クロモリン、ジクマロール、ルテオリン、ニフルミン酸、NPPB、パモ酸塩及びパモ酸、ケルセチン、チロホスチン−51、ザプリナスト、ML144、ML145、又はCID−2765487を含まない。
分子GPR35は、本出願を通してCXCR8とも呼ばれる。
対象は、ヒト又は他の動物であってもよく、通常は霊長類又は哺乳類である。
様々な種由来のCXCL17の配列は、以下の受け入れ番号(全ては参照により本明細書に組み入れられる)を有する;HGNC:19232(ヒトCXCL17)(HUGO Gene Nomenclature Committeeデータベース); Homologs:MGI:2387642 (マウスCxcl17)(MGIデータベース);RGD:1304717(ラットCxcl17)(RGDデータベース);ヌクレオチド配列:RefSeq:NM198477(NCBI Reference Sequence Database);タンパク質配列:UniProtKB:Q6UXB2(UniProt Knowledgebase)。GENBANK、NCBI、dbest、Swiss−prot、Unigene、Refseq、nr−aa、PRF、又はPDBSTRも参照のこと。
様々な種由来のCXCR8/GPR35の配列は、以下の受け入れ番号(全ては参照により本明細書に組み入れられる)を有する;HGNC:4492(ヒトGPR35)(HUGO Gene Nomenclature Committeeデータベース);Homologs:MGI:1929509(マウスGpr35)(MGIデータベース);RGD:1309404(ラットGpr35)(RGDデータベース);ヌクレオチド配列:RefSeq:NM 001195382(NCBI Reference Sequence Database);タンパク質配列:UniProtKB:Q9HC97(UniProt Knowledgebase)。GENBANK、NCBI、dbest、Swiss−prot、Unigene、Refseq、nr−aa、PRF、又はPDBSTRも参照のこと。
本発明のより完璧な理解のために、添付の図面と併用される下記の記載を参照する。
図1Aは、THP−1細胞がCXCL17に応答することを示す結果のパネルである。図1A、両者とも休止状態下、又はPGE2前処理条件下における、THP−1細胞は、CXCL17指向性走化性トランスウェルアッセイで試験し;これらの細胞も、百日咳毒素(PTX)で前処理した後、同じ方法で試験した。バーは、トランスウェルプレートの低いチャンバー内の回収された細胞(走化した)の総数を示す。
図1Bは、THP−1細胞がCXCL17に応答することを示す結果のパネルである。図1B、100nMのCXCL17で刺激した時の、休止しているか、PGE2処理したTHP−1細胞(Ca+2感応性染料を負荷)の代表的カルシウム流応答。n=2。
図1Cは、THP−1細胞がCXCL17に応答することを示す結果のパネルである。図1C、THP−1細胞により発現するCXCL17受容体の脱感作について、細胞のカルシウム流応答を誘発するために、示した時点で、100nMのCXCL17又はCCL2を別に加える。代表的なグラフを示した。n=3。
図2Aは、代表的なケモカイン受容体特徴を示す略図のパネルである。図2A、ヒト第2染色体長腕の末端領域におけるGPR35遺伝子の位置;示すように、近くに、隣接してCXCR7遺伝子をミルことが可能である。
図2Bは、代表的なケモカイン受容体特徴を示す略図のパネルである。図2B、既知のケモカイン受容体のタンパク質配列の系統発生分析。GPR35に最も近い関連メンバーがCXCR7であることを示す。
図2Cは、代表的なケモカイン受容体特徴を示す略図のパネルである。図2C、BIGE(CCR1(配列番号3)、CCR2(配列番号1)、CCR5(配列番号2)及びCXCR4(配列番号4))、並びにCXCR7(配列番号5)及びGPR35(配列番号6)による、休止状態の単球における最も大量にあるケモカイン受容体のタンパク質配列の配列比較。保護レベルは、各アミノ酸の背景に濃い灰色の陰影として示される。7つの膜貫通(TM)ドメインが示される。ボックスは、DRYボックス及びTxPモチーフを示している。矢印の頭部は、第二のTM領域に保存されたアスパラギン酸を示す。コンセンサス配列(配列番号7)も観察される。
図3Aは、GPR35がTHP−1細胞中で発現していることを示す結果のパネルである。図3A、qRT−PCRにより測定した、休止状態、又はPGE2処理したTHP−1細胞中のGPR35の相対的発現。データは、試料中のGAPDHの相対的発現を用いて標準化した。代表的実験、n=2。
図3Bは、GPR35がTHP−1細胞中で発現していることを示す結果のパネルである。図3B、アイソタイプ対照(ウサギIgG)に対する、得られたTHP−1細胞(陽性である)及びBa/F3細胞(陰性である)におけるGPR35の発現を比較するフローサイトメトリーにより測定したGPR35タンパク質発現。
図4Aは、CXCL17が、GPR35を介した細胞性カルシウム動員を誘発することを示す結果のパネルである。図4A、模倣細胞、又はCXCL17[100nM]の添加により、Ca+2感応性染料を負荷した、GPR35で一時的にトランスフェクトしたBa/F3細胞におけるカルシウム流応答。実施した3つの実験の代表的グラフ。
図4Bは、CXCL17が、GPR35を介した細胞性カルシウム動員を誘発することを示す結果のパネルである。図4B、種々の量のCXCL17の添加により、GPR35でトランスフェクトしたBa/F3細胞において観察される用量反応相関。
図5は、BIGEデータベース由来の人体の種々の細胞又は組織における、GPR35の相対的発現を示す表(表1)である。データは、マイクロアレイ分析、及びこれらの組織/細胞の各々に対応するmRNAにハイブリダイズするGPR35に対応するプローブセットの能力を意味する平均強度を示す。
図6は、HEK293細胞におけるGPR35の発現が、それらをCXCL17に応答するようにすることを示すグラフである。HEK293細胞を、ヒトGPR35コード配列を含む発現ベクターでトランスフェクトし、材料及び方法の項に記載したCa+2動員アプローチによるトランスフェクション72時間後に分析した。印をつけた時点で、100ngのCXCL17を加えて細胞を刺激した。
図7は、粘膜のケモカインCXCL14又はCCL28がGPR35シグナル伝達を誘発しないことを示すグラフである。指示した時点で、独立にヒトCXCL17、CXCL14及びCCL28(100nMの濃度で)を用いたCa+2動員について、GPR35/CXCR8 Ba/F3トランスフェクト細胞を試験した。
図8Aは、ヒトの単球により発現するGPCRを示す表(表2)である。図8Aは、表の一部を含む。
図8Bは、ヒトの単球により発現するGPCRを示す表(表2)である。図8Bは、表の一部を含む。
図9は、いくつかのケモカイン受容体の放射性リガンド置換研究の結果を示す表(表3)である(n.d.は検出できないことを意味する)。
図10は、ケモカインが誘発するβ−アレスチンの動員の結果を示す表(表4)である。
図11は、サルモネラに感染したマウスにおける、CXCR8及びCXCL17の発現を示すグラフのパネルである。
図12は、潰瘍性大腸炎のマウスモデルにおいてCXCR8が増加したことを示すグラフである。
図13は、CXCR8:CXCL17が媒介する走化性が、重要なマクロファージ化学誘因物質であるCCR2に匹敵することを示すグラフである。
図14Aは、種々の動物由来のCXCR8の配列比較である。配列比較は、CLUSTAL Omega多配列アライメントツール(Sievers及びHiggins,Clustal Omega accurate alignment of very large numbers of sequences.Methods Mol Biol.2014;1079:105−16)を使用して実施する。図において、コンセンサス残基が示され、(*)は特定の残基におおける完全配列同一性を示すが、(.)及び(:)は、特定の残基における部分的配列同一性を示す。シンボルなしは、その特定の残基において重要な配列同一性を示さない。イエネコ(配列番号8)、ウシ(配列番号9)、ヒト(配列番号10)、チンパンジー(配列番号11)、アカゲザル(配列番号12)、ラット(配列番号13)及びマウス(配列番号14)由来のCXCR8の配列が示される。図14Aは、配列比較の一部を含む。
図14Bは、種々の動物由来のCXCR8の配列比較である。配列比較は、CLUSTAL Omega多配列アライメントツール(Sievers及びHiggins,Clustal Omega accurate alignment of very large numbers of sequences.Methods Mol Biol.2014;1079:105−16)を使用して実施する。図において、コンセンサス残基が示され、(*)は特定の残基における完全配列同一性を示すが、(.)及び(:)は、特定の残基における部分的配列同一性を示す。シンボルなしは、その特定の残基において重要な配列同一性を示さない。イエネコ(配列番号8)、ウシ(配列番号9)、ヒト(配列番号10)、チンパンジー(配列番号11)、アカゲザル(配列番号12)、ラット(配列番号13)及びマウス(配列番号14)由来のCXCR8の配列が示される。図14Bは、配列比較の一部を含む。
図15は、種々の動物由来のCXCL17の配列比較である。配列比較は、CLUSTAL Omega多配列アライメントツールを使用して実施する。図において、コンセンサス残基が示され、(*)は特定の残基における完全配列同一性を示すが、(.)及び(:)は、特定の残基における部分的配列同一性を示す。シンボルなしは、その特定の残基において重要な配列同一性を示さない。マウス(配列番号15)、ラット(配列番号16)、ウシ(配列番号17)、イエネコ(配列番号18)、アカゲザル(配列番号19)、ヒト(配列番号20)及びチンパンジー(配列番号21)由来のCXCL17の配列が示される。
図16は、膜タンパク質の軽い架橋の後のCXCL17に対する走化性応答を示すグラフである。
以下の出願、すなわち2013年9月30日に出願された、米国仮特許出願第61/884,576号は、参照により本明細書に組み入れられる。
ケモカイン及びケモカイン受容体は、体内での細胞の移動を制御するが、所定のリガンドの適切な受容体を発現する応答細胞の恒常性を変化し得ることで知られている(1,15)。本発明の実施形態は、部分的に、Gタンパク質共役型受容体GPR35により表わされる、ケモカインCXCL17の同族受容体の同定に基づいている。この同定の結果として、GPR35は、ケモカイン受容体命名法の確立されたガイドラインに従って、現在、CXCR8と新たに命名することができる(1)。
CXCL17ケモカイン(種の対応物を含む)
ケモカインCXCL17は、ヒト(LocusタグUNQ473/PRO842)(Q6UXB2(UniParc))(NP_940879.1)、マウス(NCBI遺伝子ID:284340)(NP_705804.2)、チンパンジー(XP_001154726.1)、並びにイヌ、ゾウ及びゴリラを含む他の動物に存在している。CXCL17は、おそらく多くの種に存在しており、Swiss−Prot又はNR−AA(例えば、genome.jp/tools/blast/におけるワールドワイドウェブを参照のこと)等の総合データベースのBLASTサーチにより同定することができる。多くのケースで、天然の配列は、少なくとも約80%の同一性、約85%、又は約90%の同一性、又は少なくとも約95%又は100%同一性を含む、それ以上の同一性の特定の実施形態を含む、その変異体により置換され得る。例えば、比較の断片は、長さにおいてアミノ酸の約95%であってもよく、又は比較のために、アミノ酸の長さの約90%、85%、又は80%であってもよい。比較の長さは、少なくとも約20、30、40、50、55、60、65、70、又は75アミノ酸であってもよい。変異体は、一般的な天然の配列の特定の物理化学的又は機能的特徴を維持する場合があるが、他の変異体は、構造的及び機能的特徴を組み合わせて修飾されている場合がある。いくつかの実施形態では、変異体は、天然のヒトのCXCL17若しくはCXCR8配列、又は他の動物の天然のCXCL17若しくはCXCR8配列と同一の配列を含んでいない。記載されるような機能を示す、切断バージョン又は他の断片との融合体が提供される。本発明の実施形態は、構造変化に対応する機能の評価を可能にする。
ケモカインCXCL17は、ヒト(LocusタグUNQ473/PRO842)(Q6UXB2(UniParc))(NP_940879.1)、マウス(NCBI遺伝子ID:284340)(NP_705804.2)、チンパンジー(XP_001154726.1)、並びにイヌ、ゾウ及びゴリラを含む他の動物に存在している。CXCL17は、おそらく多くの種に存在しており、Swiss−Prot又はNR−AA(例えば、genome.jp/tools/blast/におけるワールドワイドウェブを参照のこと)等の総合データベースのBLASTサーチにより同定することができる。多くのケースで、天然の配列は、少なくとも約80%の同一性、約85%、又は約90%の同一性、又は少なくとも約95%又は100%同一性を含む、それ以上の同一性の特定の実施形態を含む、その変異体により置換され得る。例えば、比較の断片は、長さにおいてアミノ酸の約95%であってもよく、又は比較のために、アミノ酸の長さの約90%、85%、又は80%であってもよい。比較の長さは、少なくとも約20、30、40、50、55、60、65、70、又は75アミノ酸であってもよい。変異体は、一般的な天然の配列の特定の物理化学的又は機能的特徴を維持する場合があるが、他の変異体は、構造的及び機能的特徴を組み合わせて修飾されている場合がある。いくつかの実施形態では、変異体は、天然のヒトのCXCL17若しくはCXCR8配列、又は他の動物の天然のCXCL17若しくはCXCR8配列と同一の配列を含んでいない。記載されるような機能を示す、切断バージョン又は他の断片との融合体が提供される。本発明の実施形態は、構造変化に対応する機能の評価を可能にする。
CXCR8ケモカイン受容体(種の対応物を含む)
CXCR8ケモカイン受容体(種の対応物を含む)が記載される。本明細書において、適切な機能を有する配列の変異体が提供される。特に、変異体は、通常、天然の配列に対し、配列において、少なくとも約80%、85%、90%、及び95%又はそれ以上の同一性を維持するであろう。他の実施形態では、変異体は、異なる同一性の領域を有し、種々の長さ、例えば、特定の同一性の20、30、40、50、70、100又はそれ以上のアミノ酸の断片、例えば、基準配列に対し、100%、約95%、90%、85%、80%又はそれ以下の同一性を有していてもよい。好ましいヒトの配列は前述し、受け入れ番号:NP_001182310;Q9HC97;BC095500を含む。
CXCR8ケモカイン受容体(種の対応物を含む)が記載される。本明細書において、適切な機能を有する配列の変異体が提供される。特に、変異体は、通常、天然の配列に対し、配列において、少なくとも約80%、85%、90%、及び95%又はそれ以上の同一性を維持するであろう。他の実施形態では、変異体は、異なる同一性の領域を有し、種々の長さ、例えば、特定の同一性の20、30、40、50、70、100又はそれ以上のアミノ酸の断片、例えば、基準配列に対し、100%、約95%、90%、85%、80%又はそれ以下の同一性を有していてもよい。好ましいヒトの配列は前述し、受け入れ番号:NP_001182310;Q9HC97;BC095500を含む。
CXCL17ケモカイン及びCXCR8ケモカイン受容体対(リガンド−受容体対)
本発明の実施形態は、CXCL17ケモカインの受容体の同定を記載する。それは、現在、CXCR8と新たに命名することのできる、Gタンパク質共役受容体GPR35である。この発見の重要性は、両者が、他の機能の中でも、恒常性を維持し、これらの組織中で炎症反応を制御するマクロファージ、単球及び樹状細胞を含む免疫系の種々の細胞を動員する粘膜部で発現するタンパク質であることである。これらの組織中には、ヒトの疾患の原因となる多くの炎症性疾患があり、したがって、CXCL17/CXCR8軸を制御することは、治療効果を得るために重要である。
本発明の実施形態は、CXCL17ケモカインの受容体の同定を記載する。それは、現在、CXCR8と新たに命名することのできる、Gタンパク質共役受容体GPR35である。この発見の重要性は、両者が、他の機能の中でも、恒常性を維持し、これらの組織中で炎症反応を制御するマクロファージ、単球及び樹状細胞を含む免疫系の種々の細胞を動員する粘膜部で発現するタンパク質であることである。これらの組織中には、ヒトの疾患の原因となる多くの炎症性疾患があり、したがって、CXCL17/CXCR8軸を制御することは、治療効果を得るために重要である。
対形成機能(リガンド精製、受容体結合、シグナル伝達、エフェクター機能)
ヒトゲノム中には多数の(273個以上)クラスAのGPCRがあることを考えると、新規なケモカイン受容体を同定するのは容易でない。受容体が同定されていないいくつかのケモカインがある(他の1つはCXCL14である)(1)。最初に応答細胞により発現する全てのGPCRの同定が、次いで、CXCL17シグナル伝達を介した正しい受容体が見つかるまでそれぞれを試験する必要があるので、本発明者らは、CXCR8の同定が困難かつ明白でないと考える。CXCR8の同定は、それがシグナル伝達し、CXCL17のエフェクター機能を媒介することを、本発明者らが予測することを可能にする。CXCL17及びCXCR8の両者は、炎症性疾患の下で過剰発現し、これは、炎症反応に関与する他のケモカイン/受容体軸の共通の特徴である(16)。ケモカインのその受容体への最初の結合により引き起こされる最初のカルシウム流に続き、細胞骨格の変化をもたらし、移動反応のためにそれを調製する、多くのリン酸化ステップがある(16)。
ヒトゲノム中には多数の(273個以上)クラスAのGPCRがあることを考えると、新規なケモカイン受容体を同定するのは容易でない。受容体が同定されていないいくつかのケモカインがある(他の1つはCXCL14である)(1)。最初に応答細胞により発現する全てのGPCRの同定が、次いで、CXCL17シグナル伝達を介した正しい受容体が見つかるまでそれぞれを試験する必要があるので、本発明者らは、CXCR8の同定が困難かつ明白でないと考える。CXCR8の同定は、それがシグナル伝達し、CXCL17のエフェクター機能を媒介することを、本発明者らが予測することを可能にする。CXCL17及びCXCR8の両者は、炎症性疾患の下で過剰発現し、これは、炎症反応に関与する他のケモカイン/受容体軸の共通の特徴である(16)。ケモカインのその受容体への最初の結合により引き起こされる最初のカルシウム流に続き、細胞骨格の変化をもたらし、移動反応のためにそれを調製する、多くのリン酸化ステップがある(16)。
リガンド類似構造体、アゴニスト及びアンタゴニスト
これらのタンパク質相互作用セグメント又は結合部位に変異を導入することにより、CXCL17にCXCR8への結合を消失し得ると予測することができる。CXCR8のリガンド結合部位は、受け入れ番号NP_005292の約73〜約105残基、及び約150〜175残基を含み得る、約1〜25のNH2末端、及び細胞の外部に面するGPCRの暴露部位を含むべきである。図2Cは、CXCR8(GPR35)と、いくつかの他のヒトケモカイン受容体分子間の配列相同性を示す。コンセンサス配列、及び全ての受容体間の保存の相対的程度を示す。7つの膜貫通ドメイン(TM)等のGPCRファミリーと共通のドメイン、TxPモチーフ及びDRYボックスが示される。図14は、種々の動物由来のCXCR8の配列比較である。
これらのタンパク質相互作用セグメント又は結合部位に変異を導入することにより、CXCL17にCXCR8への結合を消失し得ると予測することができる。CXCR8のリガンド結合部位は、受け入れ番号NP_005292の約73〜約105残基、及び約150〜175残基を含み得る、約1〜25のNH2末端、及び細胞の外部に面するGPCRの暴露部位を含むべきである。図2Cは、CXCR8(GPR35)と、いくつかの他のヒトケモカイン受容体分子間の配列相同性を示す。コンセンサス配列、及び全ての受容体間の保存の相対的程度を示す。7つの膜貫通ドメイン(TM)等のGPCRファミリーと共通のドメイン、TxPモチーフ及びDRYボックスが示される。図14は、種々の動物由来のCXCR8の配列比較である。
同様に、CXCL17変異体は、ケモカインのコア内より構築することができ、ケモカインの特徴的な2つのジスルフィド架橋間の領域への突然変異により構築することができる。CXCL17は、なぜ、それが発見された最新のケモカイン(2)であるかを部分的に説明する、いくつかの独自の構造を示し、他の領域、例えば、受け入れ番号NP_940879の約23〜約49、及び約104〜約119残基の突然変異は、それをCXCR8に結合することができなくする。図15は、種々の動物由来のCXCL17の配列比較である。変異誘発法及び分析は、当業者によく知られている通常の技術であり、そのため、CXCL17及びCCR8タンパク質内の構造変異体によって機能がどのように影響されるかを経験的に同定するのに問題があってはいけない。
CXCL17変異体は、その可溶性の本質のため、アンタゴニストとして使用するのがより有利であろう(結合するが、シグナル伝達しない場合)、又はいくつかの変異体は、増強した結合及びシグナル伝達を示し、特定の応答細胞の動員において他の用途を有する可能性がある。
リガンドに対する、受容体に対する抗体構造、断片、アプタマー;非ペプチド性構造(例えば、非ペプチド結合;修飾ポリペプチド);受容体/リガンド相互作用に影響するRNAi、CRISPR、TALEN化合物;受容体結合のスクリーニング(陽性コントロールとしてリガンドを使用)、及び化合物ライブラリーは、本発明の実施形態である。
CXCR8又はCXCL17に対するアンタゴニストとしては、これらのタンパク質、並びに変異体CXCL17タンパク質に対する特定の抗体が挙げられる。FLIPR技術をベースとするもののようなカルシウム流をベースとするスクリーニングアッセイにおいて使用するためのCXCR8トランスフェクトしたBa/F3細胞を用いることにより同定し得る小分子アンタゴニストを使用することも可能である(17)。FLIPR(蛍光イメージングプレートリーダー)アッセイは、マルチウェル細胞培養プレートのトランスレーザー照射(trans−laser illumination)を使用し、上記から発光を検出する。通常、細胞は、Ca2+指標物質フルオロフォア(例えば、Fluo3)が負荷され、放出した蛍光は、照射細胞内の相対的Ca2+レベルを示す。試験化合物は、予め測定された化合物を含むマルチウェルプレートから、細胞を含むアッセイプレートに直接添加することができる。この構成は、試験化合物の添加の前後の細胞Ca2+レベルの連続測定を可能にし、試験細胞のシグナル伝達能力に関する化合物の活性の測定を可能にする。種々の化合物ライブラリーは、Merck、Lilly、Pfizer等の企業によって使用されるものを含む方法を用いてスクリーニングすることができる。例えば、enzolifesciences.com/welcome/compound−libraries/のワールドワイドウェブを参照のこと。
特に重要なのは、本明細書で提供される対は、スクリーニングアッセイの陽性対照として機能するということである。それは、例えば、特定の活性、及び天然の相互作用の薬理学的シグナル伝達を評価するために定量的に使用することができる。異型の特異的活性は、部分アゴニスト又は部分アンタゴニストとして評価することができる。異なる形態は、種々の治療亜集団に見られる異なる受容体変異体にわたって異なる活性スペクトルを有する可能性がある。したがって、別の変異体は、例えば、異なる受容体アイソタイプを発現する異種の標的集団に対する応答において、多かれ少なかれ変動を有する可能性がある。
結合又は他の薬理に影響し得る他の特徴としては、グリコシル化、メチル化、アセチル化、又は他の修飾が挙げられる。特定の実施形態では、ペプチド配列の非ペプチド結合が、2つのペプチドを連結するための同一の機能を達成し得る。これらには、特定の標的分子と結合するオリゴ核酸分子であるアプタマーが含まれる。CXCL17/CXCR8相互作用の他の可能な阻害剤としては、RNAi(遺伝子発現を阻害するために使用される干渉RNA)が挙げられる(例えば、Cheng,K.及びMahato R.I.Advanced delivery and therapeutic applications of RNAi,Wiley,2012を参照のこと)。細胞内に導入されたRNAi分子は、正常細胞経路を介して細胞内RNAの破壊をもたらし、それによって、DNA配列及び結果として得られるmRNAによりコードされたタンパク質の発現を防止するであろう。RNAi分子は、しばしば、生物学的研究において、標的分子の発言を低減又は排除するために使用される。治療設定においては、mRNAは、CXCR8又はCXCL17タンパク質の発現を低減又は排除し、それによってCXCL17及びCXCR8のシグナル伝達及び生物効果を低減するために使用することができる。受容体リガンド相互作用に影響する、CRISPR、TALEN化合物も使用することができる(sciencemag.org/content/341/6148/833.full のワールドワイドウェブを参照のこと)。CRISPR及びTALEN分子技術は、ゲノム中のDNA配列に対して関連したヌクレアーゼ分子を誘導するために、DNA−結合タンパク質(TALEN)又はRNA分子(CRISPR)を使用する。ヌクレアーゼは、二本鎖DNA切断を導入する。導入部位に特異的なホモロジーアームが存在する場合、変異、欠失及び挿入を標的部位に導入することができる。このような技術は、CXCR17及びCXCR8の相互作用により通常に作動するシグナル伝達を増加又は減少するための研究又は臨床背景において使用され得る。
対の診断用途;ものの標識、他のものについてのアッセイ、機能感受性等
選択的相互作用は、パートナーを検出するために使用される対の1つを使用することを可能にするであろう。ものの標識は、パートナーを同定することを可能にする。標識としては、放射活性、アイソトープ、蛍光又はその他が挙げられる。抗体は、身体、器官、及び組織分布を検出し、評価するためにも使用することができる。これらの分布は、例えば、記載される臨床的適応のための診断的評価として有用であり得る。
診断方法(例えば、ケモカイン/受容体をベースとする患者サブセット)
選択的相互作用は、パートナーを検出するために使用される対の1つを使用することを可能にするであろう。ものの標識は、パートナーを同定することを可能にする。標識としては、放射活性、アイソトープ、蛍光又はその他が挙げられる。抗体は、身体、器官、及び組織分布を検出し、評価するためにも使用することができる。これらの分布は、例えば、記載される臨床的適応のための診断的評価として有用であり得る。
診断方法(例えば、ケモカイン/受容体をベースとする患者サブセット)
CXCL17及びCXCR8は、特定の診断用途のバイオマーカーとしても有用であり得る。これらには、患者の血液中のCXCR8+細胞又はサブタイプを定量する能力が含まれ、これらの数若しくは型、又は又はELISA又は同様の方法により測定することのできる体液中のCXCL17の濃度は、種々の病理条件で変化し得る。例えば、Pagana及びPagana,Mosby's Manual of Diagnostic and Laboratory Tests、第4版、Mosby Elsevier 2013を参照のこと。CXCL17及び/又はCXCR8は、無症候性間質性肺疾患(無症候性ILD)のバイオマーカーとして使用することもできる。
ケモカイン又は受容体を使用する治療法(臨床的適応)
CXCL17/CXCR8の相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、呼吸器、消化器及び女性の生殖系の粘膜部位が含まれる、これらのタンパク質の発現パターンに基づき、種々の臨床的適応にとって有用であると期待される。これらのタンパク質は、膠芽腫若しくは他の脳のがんを含むいくつかのがん、並びに多発性硬化症の原因に関与し、それらは、おそらく血圧の制御に関与するであろう。
CXCL17/CXCR8の相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、呼吸器、消化器及び女性の生殖系の粘膜部位が含まれる、これらのタンパク質の発現パターンに基づき、種々の臨床的適応にとって有用であると期待される。これらのタンパク質は、膠芽腫若しくは他の脳のがんを含むいくつかのがん、並びに多発性硬化症の原因に関与し、それらは、おそらく血圧の制御に関与するであろう。
対象は、例えば、哺乳類、霊長類、家畜、コンパニオンアニマル、ヒト、家禽類、ウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、ヒツジ、齧歯類、イヌ、ブタ、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ウズラ、又はガチョウであってもよい。陳列(display)動物又は展示動物、例えば、ひれ足類動物、イルカ、ライオン、トラを含む、動物園の動物、又は芸をするように仕込まれた動物、及び他の獣医学の対象も治療することができる。
併用療法(他の治療との組み合わせ)
本発明の実施形態の好ましい使用は、炎症を制御することであろう。CXCL17/CXCR8相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、非ステロイド系抗炎症剤、アスピリン、又はヒュミラ、レミケード若しくはエンブレル等の抗−TNFα薬を含む、他の確立された抗−炎症剤とともに使用することができる。特に、治療用抗体との併用が提供される。他の適応は、その有効性が本明細書で提供される方法と相乗的である古典的な方法で処理することができる。
本発明の実施形態の好ましい使用は、炎症を制御することであろう。CXCL17/CXCR8相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、非ステロイド系抗炎症剤、アスピリン、又はヒュミラ、レミケード若しくはエンブレル等の抗−TNFα薬を含む、他の確立された抗−炎症剤とともに使用することができる。特に、治療用抗体との併用が提供される。他の適応は、その有効性が本明細書で提供される方法と相乗的である古典的な方法で処理することができる。
ケモカイン、類似体(組換え体、化学的結合、グリコシル化等)の作製;受容体類似体;発現構築物、プラスミド、細胞、核酸を含む動物(真核生物、原核生物)を含む、類似体をコードする核酸の作製。
リガンド、受容体及び変異体を生産及び製造する標準的方法が適用される。構築物をコードする組換え型核酸の設計を含む、組換え法を開発することができる。例えば、Thompson D.A.Cell and Molecular Biology Manual 2011を参照のこと。例えば、コード領域に操作可能に連結したプロモータを有する発現ベクターを案出することができる。原核細胞及び真核細胞を含む、ベクターを含む細胞が提供される。適合発現法も開発することができる。
通常、細胞壁分解ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞で機能的なプロモータの制御下に配置される。非常に多様なプロモータは周知であり、特定の用途に依存して、本発明の実施形態の発現ベクターで使用することができる。通常、選択されるプロモータは、プロモータが活性である細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位等の他の発現制御配列も、必要に応じて含んでもよい。1以上のこれらの制御配列を含む構築物は、「発現カセット」と呼ばれる。したがって、本発明の実施形態は、関連する機能的ポリペプチドをコードする核酸が、高いレベルの発現のために所望の宿主細胞内に導入されている発現カセットが提供される(例えば、Ream W及びField K.G.Molecular Biology Techniques.Academic Press.2012を参照のこと)。
少なくとも約70、75、80、85、90%の均一性の実質的に純粋な組成物が好ましく、92、95、98〜99%又はそれ以上の均一性が最も好ましい。精製されたポリペプチドは、例えば、抗体が免疫選択精製法において使用し得る抗体の生産のための免疫源として使用することもできる。
製剤
投与の最適経路に依存し、種々の製剤(無菌、緩衝化、持続放出、制御放出、安定剤、軟膏等)を使用することができる。例えば、Niazi S.K.Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012を参照のこと。抗炎症と同様に、CXCL17/CXCR8相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、治療成績を最適化するための他の確立された薬剤と併用して使用することができる。更に、化合物は、単一の製剤手段において他の治療薬と併用して使用することができる。所望の薬物動態学的結果(分泌、半減期、溶解性、又は最適な排泄経路)を得るために、薬理学的変形をしようすることができる。
投与の最適経路に依存し、種々の製剤(無菌、緩衝化、持続放出、制御放出、安定剤、軟膏等)を使用することができる。例えば、Niazi S.K.Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012を参照のこと。抗炎症と同様に、CXCL17/CXCR8相互作用のアゴニスト又はアンタゴニストは、治療成績を最適化するための他の確立された薬剤と併用して使用することができる。更に、化合物は、単一の製剤手段において他の治療薬と併用して使用することができる。所望の薬物動態学的結果(分泌、半減期、溶解性、又は最適な排泄経路)を得るために、薬理学的変形をしようすることができる。
正確な用量は治療の目的に依存し、公知の技術を使用し、当業者によって確認することが可能である。例えば、Ansel,ら,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery;Lieberman(1992)Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1−3),Dekker,ISBN 0824770846,082476918X,0824712692,0824716981;Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding;並びにPickar (1999)Dosage Calculationsを参照のこと。当該技術分野において知られているように、タンパク質分解、全身に対して局所的送達、及び新しいプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、一般健康状態、性別、食生活、投与の時間、薬物相互作用、及び症状の重篤度に対する調整が必要な場合があり、当業者により、日常の実験で確認可能である。
種々の薬剤的に許容できる賦形剤が当該技術分野において周知である。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される賦形剤」としては、組成物の活性成分と組み合わされた場合に、その成分が、対象の免疫系と破壊的な反応を引き起こすことなく、生物活性を保持することを可能にする物質が挙げられる。そのようなものとしては、安定剤、保存剤、塩又は糖の複合体又は結晶等を挙げることができる。例えば、Niazi S.K.Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations Informa Healthcare 2012を参照のこと。
例示的な薬学的担体としては、非水性溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルション等のエマルション、及び種々のタイプの湿潤剤等の標準的な薬学的賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機酸エステルである。水性担体としては、水、アルコール/水溶液、エマルジョン又は懸濁剤、例えば、食塩水及び緩衝化媒質が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液(Ringer's dextrose)、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、体液及び栄養分補充液(fluid and nutrient replenisher)、電解質補充液(ブドウ糖加リンゲル液に基づくもの等)等が挙げられる。他の実施形態では、組成物は、徐放性粒子、ガラスビーズ、包帯、眼上挿入物(inserts on the eye)、及び局所的形態を含む固体マトリックスに組み込まれる。投与経路としては以下のものを挙げることができる:局所的、全身、呼吸器、経口的、眼、植込、経膣、経肛門、坐剤、徐放性デバイス、舌下、頬、経鼻、吸入、非経口、臓器内、皮下、皮内、筋肉内、静脈内等。
本発明は付随する実施例を参照することでより深い理解が得られるが、その記載は例証のみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の説明は、1つ又は複数の態様、並びに特定の変形物及び修正物の説明を含むが、例えば、本開示を理解した後に当業者の技術及び知識の範囲内となり得るような他の変形物及び修正物も本発明の範囲に含まれる。本明細書で引用される出版物、特許、特許出願、Genbank番号、及びウェブサイトは全て、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
実施例1:
本発明者らは、CXCL17と反応する細胞を同定することから開始した。この目的のために、本発明者らは、トランスウェルをベースとするアッセイを使用し、組換え型CXCL17に対する複数の細胞株の反応を測定した。CXCL17により誘導される最もよい遊走反応のうちの1つは、THP−1ヒト細胞株で観察された(図1A)。THP−1細胞は、急性単球性白血病患者に由来し(18)、単球/マクロファージ研究のために広く使用されてきた。
本発明者らは、CXCL17と反応する細胞を同定することから開始した。この目的のために、本発明者らは、トランスウェルをベースとするアッセイを使用し、組換え型CXCL17に対する複数の細胞株の反応を測定した。CXCL17により誘導される最もよい遊走反応のうちの1つは、THP−1ヒト細胞株で観察された(図1A)。THP−1細胞は、急性単球性白血病患者に由来し(18)、単球/マクロファージ研究のために広く使用されてきた。
CXCL17が単球及び樹状細胞を動員することが知られている(2)ことを考えると、本発明者らは、THP−1がCXCL17受容体を発現しているに違いないと結論づけた。重要なことに、本発明者らは、プロスタグランジンE2(PGE2)を用いた処理に次いで、CXCL17に対するTHP−1の反応が増加することもわかった(図1A)。以前の報告により、PGE2処理に次ぐ、他のケモカイン(例えば、CXCL14)に対するTHP−1の遊走反応において同様の観察がなされた(19)。更に、THP−1細胞の遊走反応は、百日咳毒素(PTX)に感受性である(図1A)。PTXは、Gαi/oタンパク質シグナル伝達経路を阻害することが知られている(20〜21)。ほとんどのケモカイン受容体は、Gαi/oタンパク質を介してその反応を誘発するので、この観察により、CXCL17受容体が同じシグナル伝達経路を活性化していることが示唆された。
ケモカインのそれらの受容体への結合により、細胞質カルシウムの特徴的な増加が引き起こされ、これはその同族受容体リガンド結合に反応して細胞内で起こる最も早い生化学イベントのうちの1つを代表する(21〜22)。したがって、本発明者らは、THP−1細胞がCXCL17が媒介するCa+2流を示すはずであるとの仮説をたてた。図1Bに見られるように、本発明者らは残りの及びPGE2で処理した細胞の両方へ、強いCa+2流に次いで、CXCL17の添加を観察した。遊走反応と一致し、PGE2で処理したTHP−1細胞も、強いCa+2流シグナル伝達を誘発した(図1B)。
ケモカインに対する細胞応答は、いくつかの調節段階に支配されている。これらの調節プロセスの例としては、アゴニスト及びケモカイン受容体の合成又はケモカイン分解の両方の制御が挙げられる(23)。更に、脱感作として知られている受容体の不活性化のシグナル伝達経路の活性化を伴う迅速な機構が存在する。この現象は、アレスチン及びGタンパク質共役受容体キナーゼを含む、フィードバック阻害剤のカスケードの活性化に起因し(24)、長期の活性化の潜在的な損傷効果を防止するように設計することができる。したがって、ケモカイン受容体は、活性化後の一定期間、脱感作状態となる。
本発明者らは、THP−1細胞を用いて、CXCL17主導の(CXCL17−driven)脱感作を試験した。図1Cに示すように、CXCL17は、それ自体を脱感作するが、THP−1細胞中で強い反応を誘発する他のケモカインであるCCL2により誘発されるCa+2流を脱感作しない(25)。逆に言うと、CCL2は、CXCL17が媒介する反応を脱感作しなかった。これは、これら2種のケモカインが異なる受容体(CCL2がCCR2に結合する)を介してシグナル伝達することを示している。
以前の結果は、CXCL17が、CXCL17応答細胞により発現する未同定の受容体を介してシグナル伝達することを示す。上述したように、CXCL17は、単球及び樹状細胞の走化性を誘発する(図1A、(2))。したがって、本発明者らは、、包括的なヒト遺伝子発現マイクロアレイデータベース、『Body Index of Gene Expression』(BIGE)(26〜27)を使用し、単球によって発現するGPCRを同定した。このスクリーンは、90に近いGPCRを与え、そのうちの10個は嗅覚としてアノテーションされ、60個は公知であり(アノテーションされ)、20個はオーファンとしてアノテーションされる(既知の内在性リガンドがないGPCR)(図8、表2)。その受容体を検索するには、まずCXCL17が結合した、又はマクロファージによって発現することが知られているものを含む他の既知のケモカイン受容体を活性化するかどうかを試験した。結合及び/又はシグナル伝達試験により、CXCL17が、CCR2、CCR5、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7及びCCX−CKRと結合しないか、シグナル伝達しないことを確認した。更に、CXCL14又はCCL28はGPR35のいずれとも結合しない(図7)。したがって、本発明者らは、CXCL17が、未だに未同定のケモカイン受容体として新規でなければならないと予測した。本発明者らは、CXCL17受容体の同定を目的とした実験に着手することを決定した。
本発明者らは、オーファンGPCRに焦点を合わせ、他のケモカイン受容体との構造的類似、並びにCXCL17と類似する発現パターンを示す、これらのGPCRをスクリーニングすることを優先させた。これらの基準は、候補のリストを縮小した。本発明者らは、CXCL17を用いたCa+2流アッセイにおいて試験を行った形質転換体を製造することにより、多くのケモカイン受容体様特徴を示し、マクロファージ及びDC中で発現する(28)CCRL2、GPCRを最初にスクリーニングした。最近の報告(29)と一致し、本発明者らは、CXCL17と反応するカルシウム流を観察しなかった(データは示さず)。本発明者らの次の候補はGPR35であった。GPR35は、最初、クラスAのオーファンGPCR遺伝子として同定された(30)。GPR35は、消化管を含むいくつかの粘膜組織(31)、並びに単球(32)、好塩基球及び好酸球(33)等のいくつかの造血細胞で発現し、成人の肺で比較的高い発現を示す(34)。GPR35の上方制御は、IgE抗体で刺激した肥満細胞(33)、ベンゾ[a]ピレンで処理したヒトマクロファージ(35)及び胃がん細胞(31)で見られる。
キヌレニン酸、キヌレニン経路のトリプトファン代謝産物、2−アシルリゾホスファチン酸(2−アシル−LPA)及びいくつかのチロシン代謝産物がGPR35のアゴニストとして同定された(36〜37)。しかし、他の内在性GPR35アゴニストが存在するかどうかには議論の余地がある。
BIGEデータベース内のGPR35の発現は、最上位のGPR35発現部位/細胞が休止単球を含むことを示し(図5、表1)、予想通り、休止DCもこのリスト中に存在し、GPR35の比較的高い発現を示す(図5、表1)。これらの免疫細胞型は、CXCL17に応答して走化性を示す((2)及び未公開データ)。このリストの残りの組織での受容体発現は強く、粘膜であり、公知のCXCL17発現パターン(3)と相関する。
GPR35遺伝子は、第2染色体の2q37.3の長腕に位置する(図2A)。興味深いことに、CXCR7をコードする遺伝子は、隣接する場所に位置する。系統発生分析が、CXCR7がGPR35と密接に関連していることを示しているので、この観察は興味深い(図2B)。しかし、それはCXCR7発現細胞から125I−CXCL12を置換しないので、CXCL17はCXCR7と結合しない。その後のGPR35タンパク質配列の試験により、第2の細胞内ループでのDRYボックスの存在を明らかにした(図2C)。最も知られている機能的ケモカイン受容体の対応する位置に存在するこのモチーフは、これらの膜貫通分子へのGタンパク質結合のための主要な部位を表し(38)、また、β−アレスチンの動員規制リガンド依存性受容体の内在化と関連している(39)。更に、本発明者らは、第2の膜貫通ドメインにおいて、保存されたAsp残基及びTxp(Thr−Xaa−Pro)モチーフの存在をも検出した。これらの特徴は、ケモカイン受容体中の硬度に保存された構造決定要素であり、受容体の活性化において重要な役割を果たす(40〜41)。組織発現パターンと同様に、これらのGPR35の構造的特徴は、GPCR35がCXCL17受容体であり得ることを強く示唆した。
定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)を用い、本発明者らは、GPR35が休止THP−1単球中で発現し、PGE2刺激により著しく上方制御されていることを確認した(図3A)。THP−1細胞中でのGPR35の発現は、フローサイトメトリーにより確認された(図3B)。本発明者らは、GPR35を含まない細胞株に、この受容体をトランスフェクトすることにより、これまでの非応答性細胞におけるCXCL17に対する反応におけるカルシウム流を確立できることを証明しようとした。マウスプロB細胞株、Ba/F3はGPR35を発現しないので(42)、本発明者らは、これらの細胞をトランスフェクションの実験に使用した。ヒトGPR35でトランスフェクトしたマウスBa/F3細胞を組換え型ヒトCXCL17で刺激した時、本発明者らは、強いカルシウム流反応を観察した(図4A)。重要なことに、この反応は、模倣トランスフェクトコントロール細胞では検出されなかった。更に、本発明者らは、CXCL17の濃度上昇に対応する、Ca+2スパイクの増加に伴う、CXCL17用量反応パターンにも気づいた(図4B)。GPR35を他の細胞にトランスフェクトした時に、同様な結果が得られた(図6)。更に、本発明者らは、CXCL14又はCCL28等の他の粘膜発現ケモカインが、成功せずに、GPR35を介したシグナル伝達を誘発し得るかどうかを試験した(図7)。総合すれば、これらの観察は、GPR35がCXCL17の受容体であることを示している。
CXCL17は、C−X−Cケモカインサブファミリーに属し、これらのリガンドは、通常、C−X−Cケモカイン受容体に結合する(43)。7種のGPCRメンバー:CXCR1からCXCR7が、ケモカイン受容体のこのサブクラスを構成する(1)。CXCL17に機能的に反応するGPR35の能力を考慮すると、本発明者らは、GPR35ケモカイン(C−X−Cモチーフ)を受容体8(CXCR8)と名前を変更することを提案する。
最後のケモカイン結合受容体(CXCL11及びCXCL12と結合するCXCR7)は、8年以上前に報告された(44)ので、CXCL17受容体としてのCXCR8の同定はケモカインの分野にとって重要な貢献を示す。粘膜部位における、CXCL17/CXCR8軸の生理的意義は検討されていないままである。しかし、GPR35は、すでに胃腸障害の潜在的に重要な標的として同定されている(31)。重要なことに、ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、原発性硬化性胆管炎を後続の潰瘍性大腸炎と強く関連させる、ミスセンス単一ヌクレオチド多形が同定された(5)。総合すれば、これらの観察は、CXCL17/CXCR8軸が呼吸器系及び消化器系における重要なマクロファージ動員シグナルであることを強く示唆し、この軸が、消化管の炎症性疾患の原因に関与していることを更に示唆し、IPF(3)、また肺病理における強いCXCL17の上方制御を本発明者らは観察した。肺及び消化管の両方の病態における炎症の重要性を考えると、本発明者らは、CXCL17/CXCR8軸が、種々のヒトの疾患において大きく関与していると予測する。
実施例2:
細胞及び試薬
ヒトTHP−1、急性単球性白血病細胞(American Type Culture Collection,Rockville,MD)、及びIL−3−非依存性クローンのマウス骨髄由来プロB−細胞株Ba/F3細胞(Leibniz Institute DSMZ−German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany)は、完全RPMI培地(10%ウシ胎児血清、ペニシリン 1000 U/mL、ストレプトマイシン 1000 U/mL、及びグルタミン 20mmol/L、全ては、Corning−Cellgro,Manassas,VA由来)中で維持する。提示される種々の実験に使用する試薬は:精製ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)、及びポリクローナルウサギ抗−ヒトGPR35(Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI)を含む。EcoRI(5')及びXhoI(3')でpcDNA3.1+発現ベクター(Life Technologies,Carlsbad,CA)にクローニングされた、Gタンパク質共役受容体35(GPR35)(野生型)のcDNAを含む、ヒトGPR35クローンは、The Missouri S&T cDNA Resource Center(Rolla,MO)から得ることができる。オープンリーディングフレームは、ヒトゲノムDNAからPCRにより増幅した。挿入サイズ=930bp。Gene bank受け入れ番号、AY275467。
細胞及び試薬
ヒトTHP−1、急性単球性白血病細胞(American Type Culture Collection,Rockville,MD)、及びIL−3−非依存性クローンのマウス骨髄由来プロB−細胞株Ba/F3細胞(Leibniz Institute DSMZ−German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Braunschweig,Germany)は、完全RPMI培地(10%ウシ胎児血清、ペニシリン 1000 U/mL、ストレプトマイシン 1000 U/mL、及びグルタミン 20mmol/L、全ては、Corning−Cellgro,Manassas,VA由来)中で維持する。提示される種々の実験に使用する試薬は:精製ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)、及びポリクローナルウサギ抗−ヒトGPR35(Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI)を含む。EcoRI(5')及びXhoI(3')でpcDNA3.1+発現ベクター(Life Technologies,Carlsbad,CA)にクローニングされた、Gタンパク質共役受容体35(GPR35)(野生型)のcDNAを含む、ヒトGPR35クローンは、The Missouri S&T cDNA Resource Center(Rolla,MO)から得ることができる。オープンリーディングフレームは、ヒトゲノムDNAからPCRにより増幅した。挿入サイズ=930bp。Gene bank受け入れ番号、AY275467。
BIGEデータベース
BIGEデータベースの構成を説明する(3、27)。手短に言えば、人体の105の異なる部位に対応する組織又は細胞を、死後5時間以内に得た。記載したようにしてRNAを調製し、U133 2.0遺伝子アレイ(Affymetrix,Santa Clara,CA)とハイブリダイズするcDNAを調製するために使用した。得られたデータを標準化し、GPR35(210264_at)に対応するプローブセットを使用し、人体におけるGPR35の発現を測定した。
BIGEデータベースの構成を説明する(3、27)。手短に言えば、人体の105の異なる部位に対応する組織又は細胞を、死後5時間以内に得た。記載したようにしてRNAを調製し、U133 2.0遺伝子アレイ(Affymetrix,Santa Clara,CA)とハイブリダイズするcDNAを調製するために使用した。得られたデータを標準化し、GPR35(210264_at)に対応するプローブセットを使用し、人体におけるGPR35の発現を測定した。
定量的リアルタイムPCR分析
定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)データは、Universal Probe Libraryをベースとするシステム(Rocheのアノテーションはここに行く必要がある)を使用し、Roche Lightcycler 480により作成する。手短に言えば、全RNAを、Qiagen's RNeasy RNA精製キットを用いて、THP−1細胞から抽出する。cDNAを生成するために、等濃度の全RNAを、逆転写反応で使用する(Qiagen,Valencia,CA)。40サイクルのPCRの実行あたり、50ngの各cDNAを使用する。CXCL17の量を定量的に決定し、各組織試料において遺伝子を制御するために、各反応について、遺伝子特異的プライマー、及び対応するUniversal Probe Libraryを使用する。結果を処理し、GraphPad Prismソフトウェア(graphpad.com におけるワールドワイドウェブ)を使用して分析する。
定量的リアルタイムPCR(qRT−PCR)データは、Universal Probe Libraryをベースとするシステム(Rocheのアノテーションはここに行く必要がある)を使用し、Roche Lightcycler 480により作成する。手短に言えば、全RNAを、Qiagen's RNeasy RNA精製キットを用いて、THP−1細胞から抽出する。cDNAを生成するために、等濃度の全RNAを、逆転写反応で使用する(Qiagen,Valencia,CA)。40サイクルのPCRの実行あたり、50ngの各cDNAを使用する。CXCL17の量を定量的に決定し、各組織試料において遺伝子を制御するために、各反応について、遺伝子特異的プライマー、及び対応するUniversal Probe Libraryを使用する。結果を処理し、GraphPad Prismソフトウェア(graphpad.com におけるワールドワイドウェブ)を使用して分析する。
走化性アッセイ
走化性アッセイは、上部の挿入部及び下部のチャンバーを備える、24ウェルのトランスウェル遊走プレート(Corning,NY)を用いて実施する。600μLの走化性緩衝液(C−緩衝液)(不完全RPMI,Mediatech,Manassas,VA)中の200ng/mLの組換え型ケモカイン(R&D Systems,Minneapolis,MN)を、トランスウェルプレートの底部のチャンバーに加える。これらのアッセイに使用するトランスウェルプレートは、5.0μmの大きさの穴を有していた(Corning,Corning,NY)。特に指摘しない限り、0.5〜1.0×106個の細胞を、全ての細胞株の細胞の入力数として使用する。アッセイプレートの上部の挿入部にそれらを加える前に、細胞をC−緩衝液中で3回洗浄する。アッセイは、37℃及び5% CO2中で18〜20時間インキュベートする。走化性は、顕微鏡を使用して定期的に監視する。言及される場合、細胞は、走化性アッセイの開始前に、200ng/mLの百日咳毒素(PTX)(Sigma,Saint Louis,MO)、又は10μMのプロスタグランジンE2(PGE2)(Sigma)で24時間処理する。
走化性アッセイは、上部の挿入部及び下部のチャンバーを備える、24ウェルのトランスウェル遊走プレート(Corning,NY)を用いて実施する。600μLの走化性緩衝液(C−緩衝液)(不完全RPMI,Mediatech,Manassas,VA)中の200ng/mLの組換え型ケモカイン(R&D Systems,Minneapolis,MN)を、トランスウェルプレートの底部のチャンバーに加える。これらのアッセイに使用するトランスウェルプレートは、5.0μmの大きさの穴を有していた(Corning,Corning,NY)。特に指摘しない限り、0.5〜1.0×106個の細胞を、全ての細胞株の細胞の入力数として使用する。アッセイプレートの上部の挿入部にそれらを加える前に、細胞をC−緩衝液中で3回洗浄する。アッセイは、37℃及び5% CO2中で18〜20時間インキュベートする。走化性は、顕微鏡を使用して定期的に監視する。言及される場合、細胞は、走化性アッセイの開始前に、200ng/mLの百日咳毒素(PTX)(Sigma,Saint Louis,MO)、又は10μMのプロスタグランジンE2(PGE2)(Sigma)で24時間処理する。
フローサイトメトリーによる、走化性の定量
このプロトコルは、Proudfootら(45)から適応される。手短に言えば、走化性アッセイの終了時に、走化性細胞をプレートの底部のチャンバーから収集し、FACSチューブに遠心沈殿し、200μLの1×PBSに再懸濁する。標準は、200μLの1×PBS中の1.0×106〜1.0×102細胞の範囲の細胞の10倍希釈により生成することができる。標準及び全ての走化性細胞の細胞カウントは、30秒内にカウントされたイベントの数として記録される。細胞の正確な数は規格として知られているので、それらの細胞のカウントは、標準曲線を作成するために使用される。この標準曲線から得られた近似曲線及び式は、分析される各細胞株又は初代細胞の走化性細胞の相対数を計算するために使用される。これら定量実験のために、FACSCaliburマシン(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)が使用される。
このプロトコルは、Proudfootら(45)から適応される。手短に言えば、走化性アッセイの終了時に、走化性細胞をプレートの底部のチャンバーから収集し、FACSチューブに遠心沈殿し、200μLの1×PBSに再懸濁する。標準は、200μLの1×PBS中の1.0×106〜1.0×102細胞の範囲の細胞の10倍希釈により生成することができる。標準及び全ての走化性細胞の細胞カウントは、30秒内にカウントされたイベントの数として記録される。細胞の正確な数は規格として知られているので、それらの細胞のカウントは、標準曲線を作成するために使用される。この標準曲線から得られた近似曲線及び式は、分析される各細胞株又は初代細胞の走化性細胞の相対数を計算するために使用される。これら定量実験のために、FACSCaliburマシン(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)が使用される。
GPR35トランスフェクションアッセイ
Ba/F3細胞をCytomix緩衝液(120mM KCl、0.15mM CaCl2、25mM HEPES/KOH、pH 7.6、2mM EGTA、5mM MgCl2)に、2×107細胞/mLの最終密度で再懸濁し、500μLの懸濁液を、0.4cmのエレクトロポレーションキュベット(USA Scientific,Ocala,FL)に移す。次いで、20μgのpcDNA3.1+/GPR35 DNAを細胞にトランスフェクトする。キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドDNAを加え、ゆっくりとピペッティングすることにより混合する。次いで、混合物を、Bio−Rad(Hercules,CA)パルスシステムを用い、960μFの静電容量で300Vの単一の電気パルスに曝す。収集前に、細胞を、完全培地中、37℃(5% CO2雰囲気)中で48時間回復させ、Ca+2動員アッセイを実施する。
Ba/F3細胞をCytomix緩衝液(120mM KCl、0.15mM CaCl2、25mM HEPES/KOH、pH 7.6、2mM EGTA、5mM MgCl2)に、2×107細胞/mLの最終密度で再懸濁し、500μLの懸濁液を、0.4cmのエレクトロポレーションキュベット(USA Scientific,Ocala,FL)に移す。次いで、20μgのpcDNA3.1+/GPR35 DNAを細胞にトランスフェクトする。キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドDNAを加え、ゆっくりとピペッティングすることにより混合する。次いで、混合物を、Bio−Rad(Hercules,CA)パルスシステムを用い、960μFの静電容量で300Vの単一の電気パルスに曝す。収集前に、細胞を、完全培地中、37℃(5% CO2雰囲気)中で48時間回復させ、Ca+2動員アッセイを実施する。
カルシウム動員アッセイ
THP−1又はトランスフェクトしたBa/F3細胞におけるカルシウム試験のために、5×107細胞/mLに、カルシウムグリーン−1−AM及びfura−red−AM(Life Technologies,Carlsbad,CA)を、両者とも10μmol/Lの最終線量濃度で、補充していないRPMI1640中、37℃で30分間負荷する。負荷した細胞を、0.14g/LのCaCl2を含むハンクスのバランス塩溶液(HBSS,Corning−Cellgro)で1度洗浄し、HBSS中、1.5×106細胞/mLで再懸濁し、光から保護しながら、すぐに氷上に置く。活性化の前に、細胞を37℃で15分間加温する。30秒間のデータ獲得に次ぎ、種々の量のヒト組換え型CXCL17(R&D Systems,Minneapolis,MN)を加えることにより細胞を刺激し、陽性対象−刺激を表す、分析される全ての細胞群の生存率を決定するための最終段階で、100μMのイオノマイシン(Sigma,Saint Louis,MO)による刺激を用いる。個々の細胞のfura red蛍光に対するカルシウムグリーンの比を、活性化剤の添加の前後に、FACSCaliburフローサイトメータ(Becton Dickinson)を用いて測定し、FlowJo FACSソフトウェア(Tree Star Inc.)を用いて分析する。データは、時間に対する蛍光の関数(相対的細胞内カルシウム)のような任意の単位で示す。
THP−1又はトランスフェクトしたBa/F3細胞におけるカルシウム試験のために、5×107細胞/mLに、カルシウムグリーン−1−AM及びfura−red−AM(Life Technologies,Carlsbad,CA)を、両者とも10μmol/Lの最終線量濃度で、補充していないRPMI1640中、37℃で30分間負荷する。負荷した細胞を、0.14g/LのCaCl2を含むハンクスのバランス塩溶液(HBSS,Corning−Cellgro)で1度洗浄し、HBSS中、1.5×106細胞/mLで再懸濁し、光から保護しながら、すぐに氷上に置く。活性化の前に、細胞を37℃で15分間加温する。30秒間のデータ獲得に次ぎ、種々の量のヒト組換え型CXCL17(R&D Systems,Minneapolis,MN)を加えることにより細胞を刺激し、陽性対象−刺激を表す、分析される全ての細胞群の生存率を決定するための最終段階で、100μMのイオノマイシン(Sigma,Saint Louis,MO)による刺激を用いる。個々の細胞のfura red蛍光に対するカルシウムグリーンの比を、活性化剤の添加の前後に、FACSCaliburフローサイトメータ(Becton Dickinson)を用いて測定し、FlowJo FACSソフトウェア(Tree Star Inc.)を用いて分析する。データは、時間に対する蛍光の関数(相対的細胞内カルシウム)のような任意の単位で示す。
実施例3:
「エピトープ」という用語は、抗体又は骨格をベースとする、又は受容体タンパク質の1以上のループのような、結合ドメインに特異的に結合することのできるタンパク質決定因子を意味する。
「エピトープ」という用語は、抗体又は骨格をベースとする、又は受容体タンパク質の1以上のループのような、結合ドメインに特異的に結合することのできるタンパク質決定因子を意味する。
これらのエピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性並びに特異的な電荷特性を有する。立体配座及び非立体配座エピトープは、前者への結合が後者ではないが、変性溶媒又は熱処理の存在下で失われる点で区別される。
立体構造エピトープは、標的分子の直鎖状配列の異なる部分からのアミノ酸が3次元空間に近接して一緒になるときに起こる、標的分子の立体的折りたたみから生じる。
ケモカインは、保存された3次元構造、分子内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基によって安定化された、いわゆるIL8様ケモカイン折りたたみを共有する。
興味深いことに、活褶曲を維持しながら、CXCL17の予測されるIL8様ケモカイン構造は、3次元構造における非標準領域中のジスルフィド結合を明らかにする。既知のケモカインのものとは異なる他の既知のファミリーのメンバーとそのシステインパターンとの低い配列類似性は、ケモカインCXCL17が、標準的な配列に基づく方法によって、アノテーションを免れた理由である(2)。
ケモカイン受容体の活性には、ケモカインN−ループと受容体N−末端残基との相互作用、及びケモカインN−末端と受容体細胞外/膜貫通残基を必要とし(46)、これは、この相互作用の立体配座状態が非常に重要であることを示している。
そこで、組換え型CXCL17調製物を加熱し(95℃、10分間)、その後の即座の熱ショック(4℃、5分間)により、本発明者らは、ケモカインを変性させ、活性立体構造への再生を防止することができる。これを実施することにより、タンパク質の元の3次元構造が破壊されるが、アミノ酸配列により定義される、タンパク質の一次構造は無傷のままのはずである。ポリペプチド及び配列が無傷のままであることを証明するために、無傷のポリペプチドを、SDS−PAGE又は他の分析法により評価してもよい。
元の「立体的に活性な」CXCL17を、予めCa+2感受染料(Fura Red及びカルシウムグリーン)を負荷して、CXCR8でトランスフェクトした細胞に添加すると、蛍光比の増加により測定される細胞内Ca+2濃度の増加は、フローサイトメトリーにより検出することができる。同じアッセイに熱変性したCXCL17を加えた場合、Ca+2シグナル伝達が存在しないことにより示されるように、細胞は応答性でない。この反応は、CXCL17自体によるポリペプチド配列がCXCR8との結合及び機能的活性化の原因でないが、それは立体的に完全な天然型であることを示している。
実施例4:
CXCL17/CXCR8相互作用は、消化器の炎症性疾患において重要な役割を果たしている可能性がある(31)。重要なことに、ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、原発性硬化性胆管炎を後続の潰瘍性大腸炎と強く関連させる、CXCR8/GPR35ミスセンス単一ヌクレオチド多形が同定された(5)。この種の情報は、おそらく消化器の炎症性疾患においてCXCL17/CXCR8の関与を生じる。CXCL17/CXCR8相互作用のアゴニスト及び/又はアンタゴニストの効果は、胃腸障害の前臨床マウスモデルを用いてアッセイすることができる。2種の大腸炎の優勢なマウスのモデルが、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)(47〜48)、又は2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)(49〜51)を用いて誘発される。それは急性又は慢性の形態のいずれかで誘導することができるので、DSSモデルは、より多くのTNBSモデルよりも、ヒト大腸炎を模倣する(47〜49)。
CXCL17/CXCR8相互作用は、消化器の炎症性疾患において重要な役割を果たしている可能性がある(31)。重要なことに、ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、原発性硬化性胆管炎を後続の潰瘍性大腸炎と強く関連させる、CXCR8/GPR35ミスセンス単一ヌクレオチド多形が同定された(5)。この種の情報は、おそらく消化器の炎症性疾患においてCXCL17/CXCR8の関与を生じる。CXCL17/CXCR8相互作用のアゴニスト及び/又はアンタゴニストの効果は、胃腸障害の前臨床マウスモデルを用いてアッセイすることができる。2種の大腸炎の優勢なマウスのモデルが、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)(47〜48)、又は2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)(49〜51)を用いて誘発される。それは急性又は慢性の形態のいずれかで誘導することができるので、DSSモデルは、より多くのTNBSモデルよりも、ヒト大腸炎を模倣する(47〜49)。
これらのモデルは十分に確立されており、一貫して再現性のある結果をもたらすことが示されている。したがって、これらのシステムにアゴニスト又はアンタゴニストを加えることの効果は、アゴニスト/アンタゴニスト処理及び未処理マウスの応答を、治療範囲内の選択された薬理学的投与において比較した場合に、アッセイ読み出しにおいて検出するのが容易であるべきである。特に、疾患の病因及び重症度は、動物の2つのコホート間で比較されることになる。アゴニスト/アンタゴニストの理想的な投与量及び送達経路は、容易に変化することもあり、試験することもでき、最終的にこれらのモデルを使用して決定することもできる。
CXCL17/CXCR8欠損(ノックアウト)マウス株は、胃腸障害におけるアンタゴニストの効果を予測するために使用することもできる。これらのマウス株は、リガンド又は受容体のいずれかの発現を欠くため、アンタゴニストで処理した野生型(WT)マウスと同様に挙動する。大腸炎の前臨床マウスモデルに対する、CXCL17/CXCR8欠損マウスの応答は、野生型マウスの応答と比較することができ、特異的なアンタゴニストの効果に関する結論を出すことができる。動物モデルは、ケモカイン又は受容体の評価が、用量及び治療方針を決定するために特定の動物の診断又は治療サブセットを提供し得るかどうかを確立するために使用することができる。
1つの実施例では、CXCL17に対して標的とするモノクローナル抗体を、大腸炎の急性マウスDSSモデル(52)に使用する。抗体は、図面に示すように、CXCR8でトランスフェクトされたBa/F3細胞で観察されたカルシウム流を阻害することにより、抗体がCXCL17/CXCR8相互作用を阻害することを確認するために選択される。実験は、マウスの4種のコホート、例えば、アイソタイプ対照抗体を受ける1つのコホート、抗−CXCL17抗体を受ける1つのコホート、アイソタイプ対照抗体とDSSとを受ける1つのコホート、及び抗−CXCL17抗体とDSSとを受ける最終のコホートを使用することができる。実験期間にわたり、DSSを受けるマウスは、1日及び5日に飲料水中に投与され;対象マウスは、単にオートクレーブ処理された飲料水が与えられる。抗−CXCL17抗体又はアイソタイプ対照抗体は、DSS処理の間、3回(DSS処理開始前に1回の注射、DSS処理の間に2回の注射)、腹腔(i.p.)又は静脈内(i.v.)注射を介して適切な用量でマウスに与えられる。
抗−CXCL17抗体の効果は、マウスの体重の変化、胃腸症状、例えばDSS処理の経過の際の下痢/血便の発生を分析することにより、アッセイすることができる(52)。結腸の炎症のレベルは、例えば、Q−PCR、免疫組織化学的検査(IHC)、及び/又は個々の免疫細胞集団の免疫表現型を用い、実験終了時に分析する(52)。
例は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は他の疾患のような胃腸障害を有するヒトを含む他の対象で使用することができる。例えば、Hauser,S.C.Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review,第4版、Mayo Clinic Scientific Press,2013;Hawkeyら,Clinical and Gastroenterology and Hepatology,第2版、Wiley−Blackwell,2012;並びにYamada T.ら、Yamada's Handbook of Gastroenterology,第3版、Wiley−Blackwell,2013を参照のこと。遺伝的モデル、例えばノックアウトマウスは、治療試験のための試験対象として特に有用である。
実施例5:
CXCL17/CXCR8相互作用の標的におけるアゴニスト又はアンタゴニストの効果は、呼吸器疾患の前臨床マウスモデルを使用して示すことができる。ヒト特発性肺線維症(IPF)のマウスブレオマイシンモデルが、動物におけるIPFを調査するために使用されている(53〜55)。例えば、Models of Lung Disease,edited by Joan Gil,copyright 1990;及びFishman's Pulmonary Diseases and Disorders,Fishmanら,copyright 2008を参照のこと。
CXCL17/CXCR8相互作用の標的におけるアゴニスト又はアンタゴニストの効果は、呼吸器疾患の前臨床マウスモデルを使用して示すことができる。ヒト特発性肺線維症(IPF)のマウスブレオマイシンモデルが、動物におけるIPFを調査するために使用されている(53〜55)。例えば、Models of Lung Disease,edited by Joan Gil,copyright 1990;及びFishman's Pulmonary Diseases and Disorders,Fishmanら,copyright 2008を参照のこと。
動物の2つのコホート(未処理に対するアゴニスト/アンタゴニスト処理)を用い、両コホートにおける疾患の進行及び重症度を比較する。適切な治療用量及び治療処置が動物に適用される。アゴニスト/アンタゴニストに関する結論は、これらの実験結果の分析後に行われる。更に、アゴニスト/アンタゴニストの量及び送達経路を、このモデルを使用して比較する。
CXCL17/CXCR8欠損(ノックアウト)マウス株は、呼吸器疾患におけるアンタゴニストの効果を予測するために使用される。これらのマウス株は、リガンド又は受容体のいずれかの発現を欠き、それ故、アンタゴニストで処理した野生型(WT)マウスと同様の挙動をする。IPFの前臨床マウスモデルに対するCXCL17/CXCR8欠損マウスの応答を、WTマウスの応答と比較し、特定のアンタゴニストの効果に関する結論がなされる。
1つの例は、IPFのマウスブレオマイシンモデルにおいて、リガンドアンタゴニストとして、CXCR8を標的とするモノクローナル抗体を使用する。抗体は、それが、図示されるようにCXCR8でトランスフェクトされたBa/F3細胞において観察されるカルシウム流を阻害することにより、CXCL17/CXCR8相互作用を阻害することを確認するために試験をされる。実験は、例えば4つのコホート:アイソタイプ対照抗体を受ける1つのコホート、抗−CXCR8抗体を受ける1つのコホート、アイソタイプ対照抗体とブレオマイシンとを受ける1つのコホート、及び抗−CXCR8抗体とブレオマイシンとをふける最終のコホートを使用することができる。実験期間にわたり、ブレオマイシンを受けるマウスは、例えば、腹腔内(i.p.)又は器官内(i.t.)滴下(22294226)を介して投与を受ける。肺の繊維化を達成するため、2〜3週間にわたってブレオマイシンが複数回投与され、その後、肺の繊維化を評価する。抗CXCR8抗体又はアイソタイプ対照抗体は、ブレオマイシン処理の間、3回、腹腔(i.p.)又は静脈内(i.v.)注射を介してマウスに与えられる。1回の注射はブレオマイシン処理前であり、2回の注射はブレオマイシン処理の間である。
抗−CXCR8抗体の効果は、DSS処理の経過の際のマウスの体重の変化を分析することにより、アッセイする(56)。肺の炎症は、例えば、肺のコラーゲン及び/又はヒドロプリン含量を測定し、及び/又は免疫組織化学的検査(IHC)により、実験終了時に分析される(56)。
類似の例は、例えば、特発性肺線維症又は他の呼吸器疾患の影響を受けているヒトを含む、他の対照に適用可能である。例えば、Judd,S,J,Respiratory Disorders Sourcebook,第2版、Health Reference Series,2012;及びLechner,A.Respiratory,An integrated approach to disease;McGrawHill LANGE,2012を参照のこと。
実施例6:
多発性硬化症(MS)は、若年成人における身体障害の最も一般的な非外傷性の原因である、ヒトの中枢神経系(CNS)の免疫媒介性脱髄疾患である。Holland,N.ら、Multiple Sclerosis,第4版、demos Health 2012を参照のこと。それは、損傷部位へのT細胞及びマクロファージの活性化及び動員、並びに脱髄性抗体の産生を特徴とする(57)。
多発性硬化症(MS)は、若年成人における身体障害の最も一般的な非外傷性の原因である、ヒトの中枢神経系(CNS)の免疫媒介性脱髄疾患である。Holland,N.ら、Multiple Sclerosis,第4版、demos Health 2012を参照のこと。それは、損傷部位へのT細胞及びマクロファージの活性化及び動員、並びに脱髄性抗体の産生を特徴とする(57)。
実験的自己免疫性脳髄膜炎(EAE)は、MSの動物モデルである(58)。それは、注入されたミエリンタンパク質に対する自己免疫応答の誘導に基づいている。
EAEは、ミエリン抗原に対するT細胞の受動伝達によっても誘導することができる。種々の免疫プロトコルを用い、急性及び慢性−再発性EAEモデルを誘導することができる。
EAEの原因における、種々のケモカイン及びケモカイン受容体の役割は、広く研究されてきた。CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CXCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL11、及びCXCL16ケモカインは、EAEモデルのCNSで発現することが報告された。CCL2ケモカイン(単球走化性タンパク質−1)は、CCR2受容体と結合することにより、単球、活性化T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、及びミクログリアで作用する。CCL2は、星状細胞、ミクログリア、内皮細胞、及びマクロファージにより産生され得る。興味深いことに、CCL2欠損マウスはEAEの誘発に対して著しく耐性であり、CNSへのマクロファージ動員を著しく減少させる(59)。更に、CCR2ノックアウトマウスは疾患の臨床兆候を発生せず、CNSにおけるCCL2ケモカイン及びCCR2受容体の両方の上方制御は、EAEの再発と関連している(60−61)。
結果は、CCR1ノックアウトマウスが、減衰形態の疾患を発生し得ることも示す(62)。CCR1リガンドの中に、CCL3(MIP1−a、マクロファージ炎症性タンパク質−1)、及びCCL5(RANTES、活性化時に調節される、発現及び分泌された正常T細胞)、EAEのCNS障害において発現するケモカインがある。抗−CCL3抗体による処理EAEの発症を阻害し、CNSにおける単球細胞の蓄積が減少することがわかった(63)。
CXCL17/CXCR8軸は、単球/マクロファージの主要な走化性決定基(CXCL17/CXCR8)であるので、MSの処理は、ケモカイン又はCNSに対するこれらの細胞の受容体誘発性動員のいずれかを遮断する治療を含める必要がある。この実施例における遮断薬(アンタゴニスト)は、CXCR8と結合するがシグナル伝達しないCXCL17ムテインである。これは、ネイティブ(非変異)CXCL17により誘導されるCXCR8におけるCXCL17により誘導されるカルシウム流を阻害する能力により示される。CXCL17ムテインが、CXCR8トランスフェクタントにおけるカルシウム流を誘発しないことも示されている。マウスは、それに対する免疫応答を誘導し、動物における実験的アレルギー性脳脊髄炎を誘発するアジュバント中のミエリン塩基性タンパク質が投与される。対象群は、プラセボを投与され、実験群はCXCL17ムテインを投与される。CXCL17ムテインの効果は、例えば、プラセボ又はCXCL17ムテインを投与されたマウスにおけるEAEの進行を追跡することにより評価される。実験マウスへのムテインの投与により、EAEの進行が減少する。
実施例7:
本発明の実施形態の他の使用は、CXCL17/CXCR8相互作用又は模倣CXCL17(CXCR8のアゴニストである)を拮抗する化合物を同定することである。この目的を達成するため、CXCL17の能力を阻害し、CXCR8トランスフェクタント内でカルシウム流を誘発する化合物のための化合物ライブラリーをスクリーニングするために、上述したFLIPRのような技術を使用することが可能である。他の戦略においては、トランスフェクタント内でカルシウム流を誘発するが、対応するトランスフェクトしていない細胞では誘発しない化合物を同定するために、CXCR8を使用することができる。後者の化合物はCXCR8のアゴニストである。
本発明の実施形態の他の使用は、CXCL17/CXCR8相互作用又は模倣CXCL17(CXCR8のアゴニストである)を拮抗する化合物を同定することである。この目的を達成するため、CXCL17の能力を阻害し、CXCR8トランスフェクタント内でカルシウム流を誘発する化合物のための化合物ライブラリーをスクリーニングするために、上述したFLIPRのような技術を使用することが可能である。他の戦略においては、トランスフェクタント内でカルシウム流を誘発するが、対応するトランスフェクトしていない細胞では誘発しない化合物を同定するために、CXCR8を使用することができる。後者の化合物はCXCR8のアゴニストである。
他の実施形態では、本発明は、CXCL17/CXCR8相互作用を阻害する抗体を同定するために使用することもできる。この目的を達成するため、抗体は、リガンド(CXCL17)に対するものであっても、受容体(CXCR8)に対するものであってもよい。しかし、本発明者らは、これらのタンパク質に対する抗体のサブセットのみが、CXCL17の、CXCR8を介したシグナル伝達をする能力を阻害することができると予測することができる。これらの阻止抗体を同定するために、本発明者らは、CXCR8トランスフェクタント内でCXCL17によって誘導されるカルシウム流を阻害するそれらの能力について、抗体を試験することができる。これを実施するため、本発明者らは、CXCR8トランスフェクタントを試験すべき抗体と一緒に配置した後、種々の機器(蛍光光度計、蛍光標示式細胞分取器等)によって検出可能なカルシウム流を誘導するためにCXCL17を加える。カルシウム流を阻害する抗体は阻止抗体(CXCL17/CXCR8アンタゴニスト)を表す。抗体は、CXCL17又はCXCR8のいずれかで免役した動物(マウス、ラット、ハムスター、ウサギ)から製造することができる。力価を測定すると、脾臓を、ハイブリドーマを生産するために骨髄腫細胞パートナーと融合するために使用することができ、又はファージディスプレイライブラリーを製造することができる。いずれかの技術により、CXCL17又はCXCR8のいずれかと結合する抗体の同定を導くことができ、CXCR8を介したシグナル伝達を阻害する、それらの能力は、カルシウム流の阻害により測定することができる。
実施例8:
種々の走化性受容体の放射性リガンド置換試験を実施した。放射性リガンドアッセイのために、それぞれのケモカイン受容体を一時的に発現するHEK293T細胞由来の膜を、約50pmolの125I−ケモカインとインキュベートし、ケモカイン(対照)又はCXCL17の濃度を上昇させた。細胞を、4℃で3時間インキュベートし、0.5M NaClを含む結合緩衝液で2回洗浄した。溶解緩衝液で試料を収集した後、残った細胞結合放射活性をカウントした。図9(表3)の結果は、CXCL17がそれぞれの受容体由来の種々のリガンドを示さないことを示す(n.d.=検出できない)。
種々の走化性受容体の放射性リガンド置換試験を実施した。放射性リガンドアッセイのために、それぞれのケモカイン受容体を一時的に発現するHEK293T細胞由来の膜を、約50pmolの125I−ケモカインとインキュベートし、ケモカイン(対照)又はCXCL17の濃度を上昇させた。細胞を、4℃で3時間インキュベートし、0.5M NaClを含む結合緩衝液で2回洗浄した。溶解緩衝液で試料を収集した後、残った細胞結合放射活性をカウントした。図9(表3)の結果は、CXCL17がそれぞれの受容体由来の種々のリガンドを示さないことを示す(n.d.=検出できない)。
β−アレスチン動員アッセイは、酵素相補に基づき、ケモカイン誘導β−アレスチン動員を監視するために、β−アレスチン細胞を発現するPathHunter(商標)CCR5又はCXCR2 (DiscoveRx(Fremont,CA))を用いて実施した。図10(表4)の結果は、CXCL17が細胞で効果を有していないことを示す。
実施例9:
サルモネラ感染マウスにおけるCXCR8及びCXCL17の発現を測定した。サルモネラに感染した野生型C57BL/6マウス由来の小腸を、実験終了時(1週目)に収集した。RT−qPCRによる遺伝子発現解析のために、各腸からRNAを抽出した。図11に示すように、感染を模倣したマウスと比較し、サルモネラ感染したマウスで、CXCR8及びCXCL17の発現が増加していた。これらの結果は、CXCR8及びCXCL17の両方の発現が、炎症状態により腸内に誘導され、これは、CXCR8/CXCL17の消化管炎症における役割を示唆している。
サルモネラ感染マウスにおけるCXCR8及びCXCL17の発現を測定した。サルモネラに感染した野生型C57BL/6マウス由来の小腸を、実験終了時(1週目)に収集した。RT−qPCRによる遺伝子発現解析のために、各腸からRNAを抽出した。図11に示すように、感染を模倣したマウスと比較し、サルモネラ感染したマウスで、CXCR8及びCXCL17の発現が増加していた。これらの結果は、CXCR8及びCXCL17の両方の発現が、炎症状態により腸内に誘導され、これは、CXCR8/CXCL17の消化管炎症における役割を示唆している。
実施例10:
潰瘍性大腸炎のマウスモデルで、CXCR8レベルを調査した。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を、野生型(C57B1/6)マウスにおける潰瘍性大腸炎モデルとしての消化管炎症を誘導させるために使用した。処理の7日後、遺伝子発現分析のために、DSS処理したマウス、及び模倣処理したマウスからクローンを収集した。図12に示すように、H2Oで処理したマウスと比較し、DSS処理したマウスでは、CXCR8の発現が増加していた。これらの結果は、消化管の炎症性疾患の原因における、CXCR8/CXCL17軸の役割を示唆している。
潰瘍性大腸炎のマウスモデルで、CXCR8レベルを調査した。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を、野生型(C57B1/6)マウスにおける潰瘍性大腸炎モデルとしての消化管炎症を誘導させるために使用した。処理の7日後、遺伝子発現分析のために、DSS処理したマウス、及び模倣処理したマウスからクローンを収集した。図12に示すように、H2Oで処理したマウスと比較し、DSS処理したマウスでは、CXCR8の発現が増加していた。これらの結果は、消化管の炎症性疾患の原因における、CXCR8/CXCL17軸の役割を示唆している。
実施例11:
CXCR8:CXCL17の走化性活性を、確立され、十分に特徴付けられたマクロファージ走化性軸である、CCR2:CCL2の走化性活性と比較した。底部チャンバーに100ngの組換え型ヒトケモカインを負荷したトランスウェル走化性プレートの上部チャンバーに、1×10^6個のTHP−1細胞を負荷した。20時間後、底部チャンバーに移動した細胞をカウントすることにより、走化性を測定した。百日咳毒素(PTX)を使用して走化性反応を阻害し、それがG−タンパク質シグナル伝達に関与することを確認した。プロスタグランジンE2(PGE2)は、CXCL17及びCCL2の両方に対して走化性を高める。図13に示すように、CXCR8:CXCL17により媒介される走化性は、CCL2と匹敵していた。
CXCR8:CXCL17の走化性活性を、確立され、十分に特徴付けられたマクロファージ走化性軸である、CCR2:CCL2の走化性活性と比較した。底部チャンバーに100ngの組換え型ヒトケモカインを負荷したトランスウェル走化性プレートの上部チャンバーに、1×10^6個のTHP−1細胞を負荷した。20時間後、底部チャンバーに移動した細胞をカウントすることにより、走化性を測定した。百日咳毒素(PTX)を使用して走化性反応を阻害し、それがG−タンパク質シグナル伝達に関与することを確認した。プロスタグランジンE2(PGE2)は、CXCL17及びCCL2の両方に対して走化性を高める。図13に示すように、CXCR8:CXCL17により媒介される走化性は、CCL2と匹敵していた。
実施例12:
トランスウェル移動アッセイを用いて、組換え型ヒトCXCL17に対する走化性応答について、THP−1細胞を試験した。プロスタグランジンE2(PGE2)、百日咳毒素(PTX)による24時間の前処理の後、又はグルタルアルデヒドによる処理後に、細胞を単独で試験した。PTXは、ケモカイン受容体(Gαi G−タンパク質共役受容体(GPCR))を介したシグナル伝達を阻害するので、THP−1細胞は、CXCL17に反応して遊走することができない。細胞生存度を低下させることなく、それらの走化性能力を消失させる、THP−1細胞の全ての膜タンパク質を架橋するために、0.05%グルタルアルデヒドを使用した。CCL2は、陽性対照として使用した。走化性を誘発するために、200ng/mLのケモカインを使用した。架橋の結果を図16に示す。結果は、膜タンパク質の穏やかな架橋がCXCL17に対する走化性を排除することを示す。
トランスウェル移動アッセイを用いて、組換え型ヒトCXCL17に対する走化性応答について、THP−1細胞を試験した。プロスタグランジンE2(PGE2)、百日咳毒素(PTX)による24時間の前処理の後、又はグルタルアルデヒドによる処理後に、細胞を単独で試験した。PTXは、ケモカイン受容体(Gαi G−タンパク質共役受容体(GPCR))を介したシグナル伝達を阻害するので、THP−1細胞は、CXCL17に反応して遊走することができない。細胞生存度を低下させることなく、それらの走化性能力を消失させる、THP−1細胞の全ての膜タンパク質を架橋するために、0.05%グルタルアルデヒドを使用した。CCL2は、陽性対照として使用した。走化性を誘発するために、200ng/mLのケモカインを使用した。架橋の結果を図16に示す。結果は、膜タンパク質の穏やかな架橋がCXCL17に対する走化性を排除することを示す。
参考文献
1.Zlotnik, A., and O. Yoshie. 2012. The chemokine superfamily revisited. Immunity 36:705−716.
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本発明は、好ましい実施形態に関して記載されているが、修正及び変動が、本発明の原理及び範囲を逸脱することなく利用されてもよく、当業者はこのことを容易に理解するものである。従って、そのような修正は、本発明及び以下の特許請求の範囲内にて実施されてもよい。
Claims (64)
- 対象において、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド17(CXCL17)による受容体CXCR8の活性化を阻害することを含む、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)受容体8(CXCR8)シグナル伝達の増加と関連する障害について対象を治療する方法。
- 前記阻害が、CXCL17がCXCR8に結合することを阻害する物質を対象に投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記障害が、胃腸障害、呼吸器障害、代謝障害、感染症、又は腫瘍障害である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記障害が、肺、消化器又は生殖系炎症性疾患である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、クローン病(CD)、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は過敏性大腸症候群(IBS)、潰瘍、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病(celiacs disease)、気管支肺異形成症、特発性肺線維症、過敏性肺炎、非特異的間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、肺炎、喘息、気管支炎、肺気腫、無症候性間質性肺疾患(無症候性ILD)、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、子宮内膜症、平滑筋腫、腺筋症、細菌性膣症、又は尿道の感染若しくは炎症である、請求項4に記載の方法。
- 前記物質が、CXCL17若しくはCXCR8と結合する抗体、CXCL17のポリペプチド配列変異体、CXCL17の非ペプチド結合変異体、CXCL17若しくはCXCR8と結合する小分子、又はCXCL17若しくはCXCR8と結合するアプタマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記障害が、胃腸障害、呼吸器障害、代謝障害、感染症、又は腫瘍障害であり、前記物質がCXCL17のアンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、
a)CXCR8と結合する抗体又はその断片;
b)CXCL17変異体;又は
c)小分子化合物
から選択される、請求項7に記載の方法。 - CXCR8シグナル伝達の増加と関連する前記胃腸障害が:
a)クローン病(CD)、潰瘍性大腸炎、セリアック病、又は過敏性大腸症候群(IBS)、虚血性大腸炎、放射性大腸炎、セリアック病;
b)胃がん、膵臓がん、結腸直腸がん、又は肝細胞がん、食堂がん、肝臓がん、胆嚢がん、胆管がん、胃腸間質性腫瘍;
c)自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の(非自己免疫性)肝硬変、原発性硬化性胆管炎、肝線維症;並びに
d)C型肝炎ウイルス(HCV)が媒介する肝硬変、及びヘリコバクターピロリが原因の消化管潰瘍
からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。 - CXCR8シグナル伝達の増加と関連する前記代謝障害が、1型糖尿病又は2型糖尿病である、請求項7に記載の方法。
- 前記腫瘍障害が、白血病又はリンパ腫である、請求項7に記載の方法。
- 前記白血病又はリンパ腫がCXCR8を発現する、請求項11に記載の方法。
- 前記腫瘍障害が、膠芽腫又は関連脳腫瘍である、請求項7に記載の方法。
- CXCR8シグナル伝達の増加と関連する前記呼吸系障害が:
a)小細胞肺がん若しくは非小細胞肺がんを含む肺がん、又は中皮腫(悪性);
b)特発性肺線維症、過敏性肺炎、若しくは非特異的間質性肺炎;
c)自己免疫疾患様関節リウマチ、若しくは強皮症を含む間質性肺疾患と関連する呼吸器疾患;
d)慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気管支肺異形成症(BPD)、喘息;及び
e)他の呼吸器がん
からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。 - 他の呼吸系がんが、気管がん、喉頭のがん、気管支のがん、鼻腔/副鼻腔がんである、請求項14に記載の方法。
- 前記投与が:
a)局所投与、局所性投与、若しくは全身投与;
b)エアロゾル若しくはミストとしての吸入;又は
c)他の治療法との組み合わせである、請求項14に記載の方法。 - 対象において上昇した血圧を媒介させる方法であって、適当量のCXCR8アゴニストを投与して前記血圧を媒介させることを含む、前記方法。
- 前記上昇した血圧が高血圧である、請求項17に記載の方法。
- 前記アゴニストが:
a)組換え型ヒトCXCL17;
b)ヒトCXCL17のポリペプチド変異体;及び
c)CXCL17の非ペプチド結合変異体
からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。 - アテローム性動脈硬化症又は多発性硬化症を治療又は予防する方法であって、
a)CXCR8アンタゴニスト;若しくはCXCR8発現の阻害剤;又は
b)CXCL17アンタゴニスト;若しくはCXCL17発現の阻害剤
の有効量を投与することを含む、前記方法。 - 前記CXCR8アンタゴニストが:
a)CXCR8又はCXCR8変異体と結合する抗体;
b)CXCL17のポリペプチド配列変異体;
c)CXCL17の非ペプチド結合変異体;
d)小分子アンタゴニスト候補;及び
e)アプタマー
からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。 - 前記CXCR8発現の阻害剤が、RNAi、CRISPR、又はTALEN化合物を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記CXCL17アンタゴニストが:
a)CXCL17又はCXCL17変異体と結合する抗体;
b)CXCL17のポリペプチド配列変異体;
c)CXCL17の非ペプチド結合変異体;
d)小分子アンタゴニスト;及び
e)アプタマー
からなる群から選択される、請求項20に記載の方法。 - 前記CXCL17発現の阻害剤が、RNAi、CRISPR、又はTALEN化合物を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記方法が、アテローム性動脈硬化症の治療又は予防法である、請求項20に記載の方法。
- 前記方法が、多発性硬化症の治療又は予防法である、請求項20に記載の方法。
- ヒトの疾患の原因に関与する細胞のマーカーとしてCXCR8を同定する方法であって、前記疾患が、胃腸障害、代謝疾患、若しくは呼吸器疾患、又はがんである、前記方法。
- 前記CXCR8が、白血病、リンパ腫、胃がん、結腸直腸がん、若しくは膵臓がんの転移細胞のマーカーであるか、又は無症候性間質性肺疾患(無症候性間質性ILD)のバイオマーカーである、請求項27に記載の方法。
- 前記CXCR8が、小細胞肺がん若しくは非小細胞肺がんを含む肺がん又は悪性中皮腫の転移細胞のバイオマーカーである、請求項27に記載の方法。
- 前記CXCR8が、消化器がん、又は呼吸器系がんに浸潤する細胞の予後バイオマーカーである、請求項27に記載の方法。
- 受容体CXCR8とリガンドCXCL17との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
CXCR8を発現する細胞にCXCL17を添加すること、及び
前記物質の存在下、細胞中でのCXCR8シグナル伝達の減少を測定することを含む、前記方法。 - 前記物質が、CXCL17若しくはCXCR8と結合する抗体、CXCL17のポリペプチド配列変異体、CXCL17の非ペプチド結合変異体、CXCL17若しくはCXCR8と結合する小分子、又はCXCL17若しくはCXCR8と結合するアプタマーである、請求項31に記載の方法。
- 受容体CXCR8とリガンドCXCL17との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
CXCR8にCXCL17を添加すること、及び
前記物質の存在下、CXCL17のCXCR8への結合の減少を測定することを含む、前記方法。 - 前記物質が、CXCL17若しくはCXCR8と結合する抗体、CXCL17のポリペプチド配列変異体、CXCL17の非ペプチド結合変異体、CXCL17若しくはCXCR8と結合する小分子、又はCXCL17若しくはCXCR8と結合するアプタマーである、請求項33に記載の方法。
- a)CXCR8をCXCL17アンタゴニストと:
b)CXCL17を遮断薬と;又は
c)CXCR8を発現する細胞を細胞シグナル伝達の遮断薬と
接触させることを含む、CXCR8を介したCXCL17シグナル伝達の阻害方法。 - 前記CXCL17アンタゴニストが:
a)CXCR8又はCXCR8変異体と結合する抗体又はその断片;
b)CXCL17変異体;及び
c)小分子化合物
からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。 - 前記遮断薬が:
a)CXCL17又はCXCL17変異体と結合する抗体又はその断片;
b)CXCR8受容体断片、及び
c)小分子化合物
からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。 - 前記細胞シグナル伝達の遮断薬が:
a)シグナル伝達経路メンバーのRNAi、CRISPR、又はTALEN化合物;
b)シグナル伝達経路を遮断する抗体;又は
c)シグナル伝達経路の小分子遮断薬である、請求項35に記載の方法。 - 請求項35の前記CXCL17アンタゴニストのスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR)又は関連検出器を含む細胞をベースとするアッセイを含む、前記方法。
- 前記スクリーニングが、
a)CXCL17又はCXCL17変異体と結合する抗体;
b)CXCL17のポリペプチド配列変異体;
c)CXCL17の非ペプチド結合変異体;
d)小分子アンタゴニスト候補;又は
e)アプタマーライブラリー
を含む1種以上の化合物で行われる、請求項39に記載の方法。 - 請求項35の前記遮断薬のスクリーニング方法であって、前記スクリーニングが、蛍光イメージングプレートリーダー(FLIPR)又は関連検出器を含む細胞をベースとするアッセイを含む、前記方法。
- 前記スクリーニングが、
a)CXCR8又はCXCR8変異体と結合する抗体;
b)CXCL17のポリペプチド配列変異体;
c)CXCL17の非ペプチド結合変異体;
d)小分子アンタゴニスト候補;又は
e)アプタマーライブラリー
を含む1種以上の化合物で行われる、請求項41に記載の方法。 - Ba/F3細胞株のCXCR8形質転換体が、CXCR8/CXCL17相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするために使用される、請求項41に記載の方法。
- CXCR8の発現を阻害するRNAi、CRISPR、又はTALEN化合物を使用してCXCR8受容体を減少させることを含む、CXCR8を介したCXCL17の阻害方法。
- CXCL17の発現を阻害するRNAi、CRISPR、又はTALEN化合物を使用してCXCL17を減少させることを含む、CXCR8を介したCXCL17の阻害方法。
- CXCR8シグナル伝達の誘発方法であって、前記受容体を、その同族リガンドと接触させることを含む、前記方法。
- 前記同族リガンドがCXCL17又はそのアゴニストである、請求項46に記載の方法。
- 前記アゴニストが、CXCL17のポリペプチド配列変異体、又はCXCL17の非ペプチド結合変異体である、請求項47に記載の方法。
- 抗−CXCR8抗体を、末梢血単核細胞調製物と混合すること、及び前記抗体によりCXCR8陽性細胞を分離することを含む、CXCR8発現細胞の分離方法。
- 前記抗−CXCR8抗体が、モノクローナル抗体、中和抗体、若しくはヒト化抗体、又はそれらの組み合わせである、請求項49に記載の方法。
- 前記分離が蛍光標識細胞分取による、請求項49に記載の方法。
- 前記分離が磁気ビーズ分離による、請求項49に記載の方法。
- CXCR8受容体と選択的に結合する、CXCR8のリガンド。
- 前記リガンドが:
a)前記受容体を介してシグナル伝達し;
b)ヒトCXCL17の90%未満をシグナル伝達し;
c)CXCR8のインバースアゴニストであり;
d)CXCR8のアロステリック調節因子であり;
e)ヒトCXCL17のポリペプチド配列変異体であり;
f)ヒトCXCL17と少なくとも97%の同一性を示す少なくとも17個のアミノ酸部分を含み;又は
g)霊長類のCXCR8受容体と結合する、請求項53に記載のリガンド。 - 前記リガンドが:
a)無菌組成物中にあり;
b)全身投与用に製剤化され;
c)治療用組成物中にあり;
d)単回投与容器中にあり;又は
e)ヒトCXCL17のポリペプチド配列変異体である、請求項53に記載のリガンド。 - 請求項53に記載のリガンドと選択的に結合し:
a)前記CXCR8受容体との結合を阻害し;又は
b)CXCR8受容体によるシグナル伝達を阻害する抗体。 - CXCR8である、ヒトCXCL17の受容体。
- 前記受容体が:
a)前記ヒトCXCL17の結合により更にシグナル伝達し;
b)CXCL17の結合により、ヒトCXCR8と比較して少なくとも80%のシグナルをシグナル伝達し;
c)ヒトCXCR8と少なくとも95%の同一性を有し;又は
d)霊長類のCXCL17と結合する、請求項57に記載の受容体。 - CXCL17アゴニスト、又はCXCR8の正のアロステリック調節因子を含むワクチン。
- ヒトワクチン又は非ヒトワクチンにおいて、抗原を対象とする、請求項59に記載のワクチン。
- ワクチンが、B型肝炎、ヒトパピローマウイルス、DPT、他のヒトワクチンである、請求項60に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、腫瘍関連抗原、分散性白血病(disperse leukemia)又はリンパ腫に対するワクチンである、請求項59に記載のワクチン。
- 前記腫瘍が、肺がん、膵臓がん、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞がん、軟部組織肉腫、又は膠芽腫由来である、請求項62に記載のワクチン。
- 請求項59に記載のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
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