BR112016017806B1

BR112016017806B1 - Uso de células t engenheiradas para imunoterapia contra células patológicas, e método ex vivo para preparação das mesmas

Info

Publication number: BR112016017806B1
Application number: BR112016017806-8A
Authority: BR
Inventors: Philippe Duchateau; Laurent Poirot
Original assignee: Cellectis
Priority date: 2014-02-14
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2023-05-02
Also published as: RU2016136702A; PL3105317T3; US20180201901A1; JP6673838B2; EP3105317B1; EP3505623A1; US11692169B2; EP3105317A1; TR201819571T4; WO2015121454A1; MX2016010345A; US20230357719A1; ES2711498T3; NO20161276A1; IL246645B; DK3105317T3; KR20160138404A; IL246645A0; JP2017506636A; CA2937711C

Abstract

CÉLULAS IMUNES ENGENHEIRADAS, SEU MÉTODO DE PREPARAÇÃO E SEU USO, BEM COMO ENDONUCLEASE DE CORTE INCOMUM. Métodos de desenvolver células imunes geneticamente engenheiradas para imunoterapia, que podem ser dotada s com receptores de antígeno quimérico que têm como alvo um marcador de antígeno que é comum a ambas as células patológicas e referidas células imunes (ex: CD38, CS1 ou CD70), pelo fato que os genes que codificam referidos marcadores são inativados nas referidas células imunes por uma endonuclease de corte incomum, tais como TALEN, Cas9, ou argonaute.

Description

Campo da invenção

[0001] A presente invenção se relaciona a métodos de desenvolvimento de células imunes geneticamente projetadas, de preferência, células imunes não aloreativas, para imunoterapia, que são dotadas com receptores de antígeno quimérico que têm como alvo um marcador de antígeno que é comum a ambas às células patológicas e às células imunes (ex: CD38).

[0002] O método compreende expressar um CAR direcionado contra referido marcador de antígeno, e inativar os genes nas células imunes que contribuem para a presença de referido marcador de antígeno na superfície de referidas células imunes. Esta inativação é tipicamente realizada pelo uso de transgenes que codificam Endonucleases guiadas por RNA (ex: Cas9/CRISPR), meganucleases, Nucleases de dedo de zinco, ou TAL nucleases. As células imunes desenvolvidas, de preferência, células T, direcionam sua atividade imune em direção a células infectadas malignas, ou células imunes defectivas, enquanto que evita sua destruição mútua, auto estimulação ou agregação. A invenção abre o caminho para estratégias de imunoterapia padrão e adotivas acessíveis usando células imunes para tratamento de câncer, infecções e doenças autoimunes.

Antecedentes da invenção

[0003] A imunoterapia adotiva, que envolve a transferência de células imunes específicas de antígeno autólogas geradas ex vivo, é uma estratégia promissora para tratar infecções virais e câncer. As células T usadas para imunoterapia adotiva, por exemplo, podem ser geradas, ou por expansão de células T específicas de antígeno, ou redireção de células T através de engenharia genética (Park, Rosenberg et al. 2011).

[0004] Novas especificidades em células T foram geradas com sucesso através da transferência genética de receptores de célula T transgênicas ou receptores de antígeno quimérico (CARs) (Jena, Dotti et al. 2010). CARs são receptores sintéticos consistindo em uma fração de direcionamento que é associada com um ou mais domínios de sinalização em uma molécula de fusão simples. Em geral, a fração de ligação de um CAR consiste em um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo de cadeia simples (scFv), compreendendo os fragmentos leves e variáveis de um anticorpo monoclonal unidos por um vinculador flexível. As frações de ligação baseadas no receptor ou domínios de ligante foram também usados com sucesso. Os domínios de sinalização para CARs de primeira geração são derivados a partir da região citoplásmica da CD3zeta ou das cadeias de receptor gama Fc. Os CARs de primeira geração têm sido mostrado redirecionar com sucesso citotoxicidade de célula T; contudo, eles falham em proporcionar expansão prolongada e atividade antitumor in vivo. Os domínios de sinalização de moléculas coestimulatórias incluindo CD28, OX-40 (CD134), e 4-1BB (CD137) foram adicionados sozinhos (segunda geração), ou em combinação (terceira geração), para intensificar a sobrevivência e aumentar a proliferação de células T modificadas por CAR. Os CARs permitem com sucesso que as células T sejam redirecionadas contra antígenos expressos na superfície de células de tumor de várias malignidades, incluindo linfoma e tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010).

[0005] O protocolo atual para tratamento de pacientes usando imunoterapia adotiva é baseado na transferência de célula autóloga. Nesta abordagem, os linfócitos T são recuperados de pacientes geneticamente modificados ou selecionados ex vivo, cultivados em in vitro de modo a amplificar o número de células se necessário, e finalmente infundidos no paciente. Em adição à infusão de linfócitos, o hospedeiro pode ser manipulado de outros modos que suportam o enxerto das células T, ou sua participação em uma resposta imune, por exemplo, pré-condicionamento (com radiação ou quimioterapia), e administração de fatores de crescimento de linfócito (tal como IL-2). Cada paciente recebe um tratamento individualmente fabricado, usando os linfócitos do próprio paciente (isto é, uma terapia autóloga). As terapias autólogas se confrontam com barreiras técnicas e logísticas substanciais para aplicação prática, sua geração requer facilidades dedicadas custosas e pessoal perito, elas devem ser geradas em um curto tempo após uma diagnose do paciente, e, em muitos casos, o pré- tratamento do paciente resultou em função imune degradada, tal que os linfócitos do paciente podem ser pobremente funcionais e presentes em números muito baixos. Devido a estas barreiras, cada preparação de célula autóloga do paciente é efetivamente um novo produto, resultando em variações substanciais em eficácia e segurança.

[0006] Idealmente, gostar-se-ia de usar uma terapia padronizada em que células terapêuticas alogenêicas podem ser pré-manufaturadas, caracterizadas em detalhe, e disponíveis para administração imediata a pacientes. Por alogenêica é significativo que as células são obtidas de indivíduos pertencentes às mesmas espécies, mas são geneticamente dissimilares. Contudo, o uso de células alogenêicas presentemente têm muitos problemas. Em hospedeiros imune-competentes, as células alogenêicas são rapidamente rejeitadas, um processo denominado rejeição de hospedeiro versus enxerto (HvG), e isto substancialmente limita a eficácia das células transferidas. Em hospedeiros imune- incompetentes, as células alogenêicas são capazes de enxertarem, mas suas especificidades de receptores de célula T endógenos (TCR) podem reconhecer o tecido do hospedeiro estranho, resultando em doença de enxerto versus hospedeiro (GvHD), que podem conduzir a sérios danos do tecido e morte.

[0007] De modo a proporcionar células T alogenêicas, os inventores revelaram previamente um método para projetar geneticamente células T, em que genes efetores diferentes, em particular, aqueles que codificam receptores de célula T, foram inativados pelo uso de TAL- nucleases específicas, melhores conhecidos sob a marca comercial TALENTM (Cellectis, 8, rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS). Este método tem se comprovado ser altamente eficiente em células primárias usando transfecção de RNA como parte de uma plataforma que permite a produção em massa de células T alogenêicas (WO 2013/176915).

[0008] CD38 (grupo de diferenciação 38), também conhecido como ADP ribose hidrolase cíclica é uma glicoproteína encontrada na superfície de muitas células imunes (células de sangue brancas), em particular, células T, incluindo CD4+, CD8+, linfócitos B e células assassinas naturais. O CD38 também funciona na adesão de célula, transdução de sinal, e sinalização de cálcio. A informação estrutural sobre esta proteína pode ser encontrada na base de dados UniProtKB/Swiss-Prot sob referência P28907. Em humanos, a proteína de CD38 é codificada pelo gene de CD38 que se localiza no cromossomo 4. O CD38 é uma coenzima multifuncional que catalisa a síntese e hidrólise de ADP-ribose cíclica (cADPR) de NAD+ a ADP- ribose. Estes produtos de reação são, de fato, essenciais para a regulação de Ca2+ intracelular. Também, a perda de função de CD38 foi associado com respostas imunes deficientes e distúrbios metabólicos (Malavasi F., et al. (2008). "Evolution and function of the ADP ribosyl cyclase/CD38 gene família in physiology and pathology". Physiol. Rev. 88(3): 841-86).

[0009] Por outro lado, a proteína de CD38 é um marcador de infecção de HIV, leucemias, mielomas, tumores sólidos, diabetes mellitus tipo II, e metabolismo do osso, bem como algumas outras condições geneticamente determinadas. Em particular, ela tem sido usada como um marcador de prognóstico em leucemia (Ibrahim, S. et al. (2001) CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 98:181-186).

[00010] Embora as células que expressam CD38, bem como muitos outros marcadores de antígeno de tumor referidos na Tabela 1, tais como CD70 e CS1, possam estar relacionadas como alvos atrativos para CARs, o fato que tais marcadores de antígeno são também expressos na superfície de muitas células T, tem dificultado significantemente a seleção destes marcadores para realizar imunoterapia.

[00011] Os inventores aqui proporcionam estratégias para imunoterapia envolvendo células patológicas que expressam marcadores de antígeno específicos também presentes na superfície das células T, similar, por exemplo, a células B positivas CD38 malignas que causam leucemia, CD70 e CS1.

Sumário da invenção

[00012] A presente invenção revela métodos para projetar células T pretendidas para direcionar células patológicas, pelo que referidas células patológicas expressam um ou vários marcadores de antígenos que estão também presentes na superfície de células T. Exemplos de tais marcadores de antígenos são encontrados na Tabela 1. Um exemplo de tal marcador de antígeno é CD38. Outros exemplos são CD70 e CS1. Por marcador de antígeno é significativo a proteína total de um fragmento imunorreativo da mesma.

[00013] De acordo com a invenção, as células T são projetadas de modo a inativarem a expressão de genes que codificam tais marcadores de antígeno, ou envolvidas na apresentação de tal marcador de antígeno na superfície da célula.

[00014] Esta inativação é, de preferência, realizada por uma modificação de genoma, mais particularmente através da expressão na célula T de uma endonuclease de corte incomum específica capaz de direcionar um local genético diretamente ou indiretamente envolvido na produção ou apresentação de referido marcador de antígeno na superfície da célula T. Tipos diferentes de endonuclease de corte incomuns podem ser usados, tais como Meganucleases, TAL- nucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFN), ou endonucleases guiadas por RNA/DNA similares a Cas9/CRISPR ou Argonaute.

[00015] De acordo com uma concretização preferida, as células T são dotadas com pelo menos um receptor de antígeno quimérico (CAR) que permite uma ligação específica de referidas células que suportam referido marcador de antígeno alvo.

[00016] De acordo com outra concretização, as células T podem ser adicionalmente projetadas para torná-las alogenêicas, especialmente por eliminar genes envolvidos em auto reconhecimento, tais como aqueles, por exemplo, que codificam componentes de receptores de célula T (TCR), ou complexo de HLA.

[00017] A presente invenção envolve as células isoladas ou linhas de célula compreendendo as modificações genéticas colocadas na descrição detalhada, exemplos e figuras, bem como qualquer das proteínas, polipeptídeos, ou vetores, úteis para projetar referidas células T.

[00018] Como um resultado da invenção, as células T projetadas podem ser usadas como produtos terapêuticos, idealmente como um produto "pronto para uso", em métodos para tratamento ou prevenção de câncer, infecções ou doença autoimune.

[00019] As células imunes preferidas de acordo com a presente invenção são aquelas que resultam nos fenótipos:

[00020] [CAR direcionando um marcador de antígeno da Tabela 1]+[ marcador de antígeno da Tabela 1]

[00021] tais como os seguintes CARs:

[00022] [CAR CD38]+-, de preferência também negativo;

[00023] [CAR CD70]+-, de preferência também negativo;

[00024] [CAR CS1]+-, de preferência também negativo;

[00025] para seu uso como produtos terapêuticos, de preferência, produtos alogenêicos.

Breve descrição das figuras e tabelas

[00026] Figura 1: Representação esquemática de uma célula T projetada de acordo com a presente invenção rompida para CD38 e dotada com um receptor de antígeno quimérico (representada como um CAR de cadeia simples) que direciona uma célula maligna que suporte o marcador de antígeno CD38.

[00027] Figura 2: Representação esquemática de um receptor de antígeno quimérico de multi-subunidade.

[00028] Figura 3: Representação esquemática de uma estratégia terapêutica, de acordo com a invenção, combinando células T dotadas com um CAR de multi-subunidade e circulação de anticorpo bi específico. Neste aspecto particular, o receptor presente na cadeia extracelular do CAR de multi-subunidade é composto de um epítopo que é reconhecido por um anticorpo bi específico. O anticorpo bi específico é pretendido para reter referido epítopo, por um lado, e o marcador de antígeno, por outro lado, para facilitar a ligação da célula T à célula patológica.

[00029] Figura 4: Representação esquemática de uma estratégia terapêutica de acordo com a invenção combinando células T dotadas com um CAR de multi-subunidade e circulação de anticorpo monoclonal. Neste aspecto particular, o receptor presente na cadeia extracelular do CAR de multi-subunidade é composto, por exemplo, de um receptor Fc pretendido para ligar um anticorpo monoclonal que é direcionado contra o marcador de antígeno. O anticorpo monoclonal aumenta a chance das células T se ligarem às células patológicas.

[00030] Figura 5: Representação esquemática de uma estratégia terapêutica de acordo com a invenção combinando células T dotadas com um CAR de multi-subunidade que compreende dois domínios extra extracelulares e uma circulação de anticorpo bi específico. Neste aspecto particular, os domínios celulares extracelulares estão localizados em sub-unidades distintas. Estes domínios são respectivamente compostos de um epítopo que é reconhecido por um anticorpo bi específico, e de um receptor que tem como alvo um antígeno. O receptor é direcionado contra um primeiro marcador de antígeno, pelo que o anticorpo bi específico é pretendido para se ligar ao epítopo, e um segundo marcador de antígeno. Esta revelação objetiva direcionar seletivamente células patológicas que suportam em sua superfície ambos os primeiro e segundo marcadores de antígeno.

[00031] Figura 6: revelação é similar à Figura 5, mas domínios de estimulação e de coestimulação (respectivamente, domínios de proteína 4-1BB e CD3zeta) foram trocados para modular a intensidade da ativação da célula T, resultante da ligação do receptor de antígeno quimérico com a célula patológica.

[00032] Figura 7: revelação é similar à Figura 5, mas domínios de estimulação e coestimulação (respectivamente, domínios de proteína 4- 1BB e CD3zeta) foram trocados, e um domínio CD3zeta foi adicionado para aumentar a intensidade da ativação da célula T resultante da ligação do receptor de antígeno quimérico com a célula patológica.

[00033] Figura 8: Representação esquemática de uma estratégia terapêutica de acordo com a invenção combinando células T dotadas com um CAR de multi-subunidade que compreende dois domínios celulares extracelulares e uma circulação de anticorpo monoclonal. Neste aspecto particular, os domínios celulares extracelulares estão localizados em sub-unidades distintas. Estes domínios são respectivamente compostos de um domínio de ligação de antígeno tendo como alvo um marcador de antígeno e um receptor Fc pretendidos para se ligar a um anticorpo monoclonal que é direcionado contra um segundo marcador de antígeno. Esta revelação objetiva direcionar seletivamente células patológicas que suportam em sua superfície ambos os primeiro e segundo marcadores de antígeno.

[00034] Figura 9: expressão de CD38 por células T ativadas. A. expressão de CD38 por células T no dia 6 após ativação com esferas revestidas com CD3/CD28 + IL2. B. Análise longitudinal de expressão de CD38 por células T durante 17 dias após ativação.

[00035] Figura 10 Knock-out (KO) no gene de CD38: A. Posição na sequência de exon 1 de CD38 dos 3 TALEN diferentes (T2, T4 e T5) designados para abater Cd38 em célula T. B. Expressão de CD38 em células T após transfecção com o TALEN CD38ex1_T2. C. Manchamento de CD38 para controlar a purificação de células T de CD38 KO.

[00036] Figura 11: CD38 CAR : A. Representação das 3 versões de CARs designados. B. nível de expressão de CD38 pelas linhas de célula alvos.

[00037] Figura 12: Experimento de regulação para a engenharia do das células T de CAR CS1+ e KO CS1 e seu teste subsequente;

[00038] Figura 13: Construtos de T01, T02 e T03 com as repetições TAL usadas para o KO de gene de CS1;

[00039] Figura 14: Localização alvo para os TALs T01, T02 e T03 dentro do gene de CS1 (SLAMF7). T01 e T02 têm como alvo o exon 1 (Figura 14A), pelo que T03 tem como alvo o exon 2 (Figura 14B).

[00040] Figura 15A: Medição de percentagem de viabilidade de célula alvo para TALEn ou não TALEn transfectada combinada com CAR+ ou células não transduzidas: uma viabilidade de célula reduzida de células de CS1(+) mostrada quando elas foram cocultivadas com células T de CAR+, enquanto que nenhum impacto na viabilidade de célula de CS1(-) foi observada.

[00041] Figura 15B: Medição de percentagem de lise de célula específica (CS1+) calculada usando os dados de citometria de fluxo. É mostrado que lise de célula específica é 2 vezes mais alto quando as células T foram transfectadas com TALEn que tem como alvo gene de CS1 antes da transdução de CAR.

[00042] Figura 16: Resultados de análise de FACS de experimento de atividade citotóxica, que mostra que as eficiências de transdução são mais altas em células transfectadas mock do que em células que foram transfectadas com TALEn que tem como alvo o gene de CS1 (NTD: não transduzidas).

[00043] Figura 17: Resultados de análise de FACS quando as amostras diferentes são reativadas com esferas de CD3/CD28 em D11 após transdução, mostrando as eficiências de transdução e níveis de expressão de CD8/CS1 em cada amostra. Um aumento nos níveis de CS1 após reativação é observado em células transfectadas mock, enquanto que uma baixa quantidade de células são capazes de expressar CS1 nas populações transfectadas de TALEn. Tabela 1: Programas de citopulso diferentes usados para eletroporação de células T. Tabela 2: sequências alvos apropriadas para o RNA guia usando Cas9 em células T. Tabela 3: Lista de genes que codificam proteínas de ponto de controle imune. Tabela 4: Grupo de diferenciação de (CD) marcadores de antígeno verificados para serem expressos na superfície de células T, enquanto que sendo característica de tipos diferentes de tumores. Tabela 5 a 13: Marcadores de antígeno de superfície principal expressos em células T, enquanto que sendo sobre expressos em células tumorais sólidas de vários tipos de câncer. Os marcadores de antígeno listados foram identificados conforme explanado no Exemplo 1. Tabela 5: células de tumor de cólon; Tabela 6: células de tumor de mama; Tabela 7: células de tumor de trato digestivo; Tabela 8: células de tumor do rim; Tabela 9: células de tumor do fígado; Tabela 10: células de tumor do pulmão; Tabela 11: células de tumor do ovário; Tabela 12: células de tumor do pâncreas; Tabela 13: células de tumor da próstata; Tabela 14: Marcadores de antígenos de superfície principal expressos em células T, enquanto que sendo sobre expressas em células de tumor líquidas de vários tipos de câncer (ALL, AML, CML, MDS, CLL, CTRL). Os marcadores de antígeno listados foram identificados conforme explanado no Exemplo 1. Tabela 15: Sequências do CD38 alvo testado e TALENs para inativação do antígeno de CD38; Tabela 16: Sequências de dois outros alvos de CD38 e os correspondentes TALENs para sua inativação; Tabela 17: Sequências de cadeias de VH e VL dos anticorpos de scFv anti-CD38 daratumumab e MOR202, e de CDRs específicas para cadeias de VH e VL. Tabela 18: Sequência de polipeptídeo das 3 estruturas diferentes de CARs de anti-CD38 à base de scFv daratumumab e dos componentes individuais usados; Tabela 19: Sequências de cadeias de VH e VL dos anticorpos scFv anti-CS1; Tabela 20: Sequência de polipeptídeo de CARs anti-CS1 baseada nas versões V1, V2 e V3 na Figura 11A; Tabela 21: Sequências do CS1 alvo e TALENs para sua inativação; Tabela 22: Sequências do CD70 alvo e TALENs para sua inativação; Tabela 23: Polinucleotídeo e sequências de ácido nucleico de cadeias de VH e VL dos anticorpos de scFv anti-CD70 Ab4, Ab8 e 1F6; Tabela 24: Sequência de polipeptídeo de CARs anti-CD70 baseada nas versões V1, V2 e V3 na Figura 11a.

Descrição detalhada da invenção

[00044] A menos que especificamente aqui definido, todos os termos técnicos e científicos usados têm o mesmo significado conforme comumente usado compreendido por um técnico no assunto nos campos de terapia de gene, bioquímica, genética, e biologia molecular.

[00045] Todos os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, com métodos e materiais adequados sendo aqui descritos. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerão. Adicionalmente, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente, e não são pretendidos para serem limitantes, a menos que de outro modo especificado.

[00046] A prática da presente invenção empregará, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de biologia de célula, cultura de célula, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da perícia da técnica. Tais técnicas são explanadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley e son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente dos Estados Unidos No. 4.683.195; Hibridização de Ácido Nucleico (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription AND Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells AND Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); a série, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson e M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), especificamente, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methjods In Cell AND Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

[00047] Em um aspecto geral, a presente invenção se relaciona a métodos para novas estratégias de imunoterapia adotiva no tratamento de doenças ligadas com o desenvolvimento de células patológicas, tais como câncer, infeções e doenças autoimunes.

[00048] Como um objetivo principal da invenção é a possibilidade de ter como alvo células patológicas que suportam marcadores de antígeno específicos em comum com células T. Por célula patológica é significativo quaisquer tipos de células presentes em um paciente, que estão, de fato, causando deterioração da saúde.

[00049] Em geral, as células patológicas são células malignas ou infectadas que necessitam de serem reduzidas ou eliminadas para obter remissão de um paciente.

[00050] Em uma primeira concretização, o método da invenção se refere a um método de preparação de células imunes apropriadas, de preferência, células T para imunoterapia compreendendo a etapa de: (a) Inativar ou efetuar mutação geneticamente um gene em uma célula imune, que é envolvido na expressão ou apresentação de um marcador de antígeno, referido marcador de antígeno sendo conhecido para estar presente ambos na superfície de referida célula T e a célula patológica; (b) Expressar na referida célula imune um transgene que codifica um receptor de antígeno quimérico direcionado contra referido marcador de antígeno presente na superfície de referida célula patológica.

[00051] As células imunes, de acordo com a invenção, são dotadas com um receptor de antígeno quimérico direcionado a um marcador de antígeno que é comumente expresso pelas células patológicas e células imunes, ou conhecidas por estarem presentes na superfície de referidas células T. A expressão "conhecidas por estarem presentes" significa que o marcador de antígeno é reportado para ser encontrado na superfície das células imunes crescidas em condições naturais in-vivo, especialmente no sangue, mas não necessariamente quando elas são cultivadas in-vitro. Em qualquer caso, o método da invenção resulta na ausência do marcador de antígeno na superfície da célula imune, impedindo, desse modo, o receptor de antígeno quimérico de reagir com a superfície da célula T projetada. Neste particular, o método pode incluir uma etapa adicional de purificação das células T resultantes por exclusão das células apresentando referido antígeno de marcador em sua superfície.

[00052] Conforme mostrado na Tabela 4, esta invenção se relaciona a um número importante de candidatos de marcador de antígeno reportados para serem expressos pelas células de tumor, mas também pelas células T. Algumas delas, similares a CD38, foram usadas como marcadores específicos em métodos de diagnóstico por um tempo, especialmente com relação a células patológicas de leucemia, mas não em terapia. De fato, embora estes marcadores fossem identificados na técnica como marcadores muito específicos, eles não podem ser usados como alvos para imunoterapia porque os anticorpos direcionados contra estes marcadores teriam destruído ou interferidos com as células T dos pacientes. Os presentes inventores estabeleceram que CS1 e CD70 estão também presentes na superfície de células T, e que expressam CARs direcionando CS1 e CD70 em tais células T conduzem a sua depleção (ver exemplo 2).

[00053] De acordo com uma concretização preferida da invenção, a mutação ou inativação do gene da etapa a) do método acima é realizada usando uma endonuclease de corte incomum.

[00054] Por inativação de um gene é pretendido que o gene de interesse não é expresso em uma forma de proteína funcional. Em concretizações particulares, a modificação genética do método está na expressão, nas células providas para projetar, de uma endonuclease de corte incomum, tal que a mesma catalisa clivagem em um gene direcionado inativando, desse modo, referido gene direcionado. As quebras de trançado de ácido nucleico causadas pela endonuclease são comumente reparadas através de mecanismos distintos de recombinação de união terminal homóloga ou não homóloga (NHEJ). Contudo, a NHEJ é um processo de reparo imperfeito que frequentemente resulta em mudanças à sequência de DNA no local da clivagem. Os mecanismos envolvem a reunião de o que permanece das duas extremidades de DNA através de religação direta (Critchlow and Jackson 1998), ou via a assim denominada união terminal mediada por micro-homologia (Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003). O reparo via união de extremidades não homólogas (NHEJ) resulta frequentemente em inserções ou eliminações pequenas, e pode ser usado para a criação de knockouts de gene específicos. Referida modificação pode ser uma substituição, eliminação, ou adição de pelo menos um nucleotídeo. As células em que um evento de mutagênese induzido por clivagem, isto é, um evento consecutivo de mutagênese a um evento de NHEJ, ocorreu, podem ser identificadas e/ou selecionadas por método bem conhecido na técnica.

[00055] O termo "endonuclease de corte incomum" se refere a um tipo selvagem ou enzima variante capaz de catalisar a hidrólise (clivagem) de ligações entre ácidos nucleicos dentro de uma molécula de DNA ou de RNA, de preferência, uma molécula de DNA. Particularmente, referida nuclease pode ser uma endonuclease, mais de preferência, uma endonuclease de corte incomum que é altamente específica, reconhecendo locais alvos de ácido nucleico variando de 10 a 45 pares base (pb) de comprimento, usualmente variando de 10 a 35 pares bases de comprimento, mais usualmente de 12 a 20 pares bases. A endonuclease de acordo com a presente invenção reconhece em sequências de polinucleotídeo específicas, adicionalmente referidas como "sequência alvo", e cliva ácido nucleico dentro destas sequências alvos, ou em sequências adjacentes a estas, dependendo da estrutura molecular de referida endonuclease. A endonuclease de corte incomum pode reconhecer e gerar uma quebra de fita simples ou dupla em sequências de polinucleotídeos específicas.

[00056] Em uma concretização particular, referida endonuclease de corte incomum, de acordo com a presente invenção, é uma endonuclease guiada por RNA, tal como o complexo de Cas9/CRISPR. As endonucleases guiadas por RNA constituem uma nova geração de ferramenta de engenharia de genoma onde uma endonuclease se associa com uma molécula de RNA. Neste sistema, a sequência de nucleotídeo de molécula de RNA determina a especificidade alvo e ativa a endonuclease (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013). Cas 9

[00057] Cas9, também denominada Csn1 (COG3513) é uma proteína grande que participa em ambas biogênese de crRNA e na destruição de DNA de invasão. A Cas9 foi descrita em espécies bacteriais diferentes, tais como S. thermophiles, Listeria innocua (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012) e S. Pyogenes (Deltcheva, Chylinski et al. 2011). A proteína Cas9 grande (> 1200 aminoácidos) contém dois domínios de nuclease previstos, denominados domínio de nuclease de HNH (similar a McrA) que está localizado na parte média da proteína e um domínio de nucleasse similar a RuvC dividido (RNase dobra H) (Makarova, Grishin et al. (2006).

[00058] Por "Cas9" é significativo uma endonuclease projetada ou um homólogo de Cas9 que é capaz de processar sequência de ácido nucleico alvo. Em concretização particular, Cas9 pode induzir uma clivagem na sequência alvo de ácido nucleico que pode corresponder a, ou uma quebra de trançado duplo, ou uma quebra de trançado único. A variante de Cas9 pode ser uma Cas9 endonuclease que não existe naturalmente, e que é obtida por engenharia de proteína, ou por mutagênese aleatória. As variantes de Cas9, de acordo com a invenção, podem, por exemplo, serem obtidas por mutações, isto é, eliminações de, ou inserções ou substituições de pelo menos um resíduo na sequência de aminoácido de um S. pyogenes Cas9 endonuclease (COG3513). Nos aspectos de estrutura da presente invenção, tais variantes de Cas9 permanecem funcionais, isto é, elas retêm a capacidade de processar uma sequência de ácido nucleico alvo. A variante de Cas9 pode também ser homóloga de S. pyogenes Cas9 que pode compreender eliminações de, ou inserções ou substituições de, pelo menos um resíduo dentro da sequência de aminoácido de S. pyogenes Cas9. Qualquer combinação de eliminação, inserção, e substituição pode também ser feita para chegar no construto final, provido que o construto final possui a atividade desejada, em particular, a capacidade de ligação de um RNA guia, ou sequência alvo de ácido nucleico.

[00059] O motivo de RuvC/RNaseH inclui proteínas que mostram amplo espectro de funções nucleolíticas, que agem ambos em RNA e DNA (RNaseH, RuvC, DNA transposases e retroviral integrases e domínio de PIWI de proteínas Argonaut). Na presente invenção, o domínio catalítico de RuvC da proteína de Cas9 pode ser caracterizado pelo motivo de sequência: D--G-X-X-S-X-G-W-A, no qual X representa qualquer um dos 20 aminoácidos naturais e representa isoleucina ou leucina. Em outros termos, a presente invenção se relaciona a variante de Cas9 que compreende pelo menos sequência D--G-X-X-S-X-G-W-A, no qual X representa qualquer um dos 20 aminoácidos naturais, e representa isoleucina ou leucina.

[00060] O motivo de HNH é característico de muitas nucleases que agem em DNA de trançado duplo incluindo colicinas, enzimas de restrição e endonucleases domésticas. O domínio HNH (SMART ID: SM00507, SCOP nomenclatura:família de HNH) está associado com uma faixa de proteínas de ligação de DNA, realizando uma variedade de funções de ligação e de corte. Os domínios HNH com função conhecida são envolvidos em uma faixa de processos celulares incluindo toxicidade bacterial, funções domésticas nos grupos I e II íntrons e inteins, recombinação, rearranjo de DNA de desenvolvimento controlado, acondicionamento de fago, e atividade de endonuclease de restrição (Dalgaard, Klar et al. 1997). Estas proteínas são encontradas em vírus, arquebactérias, eubactérias, e eucariócitos. Interessantemente, como com os motivos de LAGLI-DADG e de GIY- YIG, o motive de HNH é frequentemente associado com domínios de endonuclease de elementos de auto propagação similares a inteins, Grupo I, e Grupo II íntrons (Dalgaard, Klar et al. 1997). O domínio de HNH pode ser caracterizado pela presença de um resíduo conservado de Asp/His flanqueado por His conservado (amino-terminal) e resíduos de His/Asp/Glu (carboxi-terminal) a alguma distância. Um número substancial destas proteínas pode também ter um motive de CX2C em qualquer lado do resíduo central de Asp/His. Estruturalmente, o motivo de HNH aparece como um grampo central de e-trançados torcidos, que são flanqueados em cada lado por uma α hélice (Kleanthous, Kuhlmann et al. 1999). O domínio de HNH grande de Cas9 é representado por SEQ ID NO.5. Na presente invenção, o motivo de HNH pode ser caracterizado pelo motivo de sequência: Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X- D-X-S, no qual X representa qualquer um dos 20 aminoácidos naturais. A presente invenção se relaciona a uma variante de Cas9 que compreende pelo menos sequência de Y-X-X-D-H-X-X-P-X-S-X-X-X-D- X-S, no qual X representa qualquer um dos 20 aminoácidos naturais.

[00061] Esta invenção pode ser de interesse particular para facilmente fazer modificações de gene multiplex direcionadas e criar um sistema de nuclease indutível por introdução do RNA guia às células de Cas9. Para a proposta da presente invenção, os inventores estabeleceram que a proteína de Cas9 pode ser dividida em dois domínios de Cas9 RuvC e HNH divididos separados que podem processar sequência de ácido nucleico alvo junto ou separadamente com o RNA guia.

[00062] Também os domínios de RuvC e HNH de endonucleases guiadas por RNA diferentes ou homólogos de Cas podem ser montados para aperfeiçoar eficiência ou especificidade de nuclease. Os domínios de espécies diferentes podem ser ou divididos em duas proteínas, ou fundidos entre si para formar uma proteína de Cas variante. O sistema dividido de Cas9 é, de fato, particularmente adequado para um método indutível de direcionamento de genoma e para evitar o efeito tóxico potencial da sobre expressão de Cas9 dentro da célula. De fato, um primeiro domínio de Cas9 dividido pode ser introduzido na célula, de preferência, por transformação estavelmente de referida célula com um transgene que codifica referido domínio dividido. Em seguida, a parte dividida complementar de Cas9 pode ser introduzida na célula, tal que as duas partes divididas se reagrupam na célula para reconstituir uma proteína de Cas9 funcional no tempo desejado.

[00063] A redução do tamanho da Cas9 dividida comparada à Cas9 do tipo selvagem facilita a vetorização e a distribuição na célula, por exemplo, pelo uso de peptídeos de penetração de célula. Os domínios de rearranjo de proteínas de Cas diferentes, permite modular a especificidade e atividade de nuclease, por exemplo, por direcionamento de motivos de PAM que são levemente diferentes de S. pyogenes Cas9

Sistema de Cas9 dividido

[00064] A caracterização prévia dos domínios de RuvC e HNH tem incentivado os inventores a projetar proteína de Cas9 para criar proteína de Cas9 dividida. Surpreendentemente, os inventores mostraram que estas duas Cas9 divididas podem processar juntas ou separadamente a ácido nucleico alvo. Esta observação permite desenvolver um novo sistema de Cas9 usando proteína de Cas9 dividida. Cada domínios de Cas9 divididos podem ser preparados e usados separadamente. Desse modo, este sistema dividido revela várias vantagens para vetorização e distribuição da endonuclease guiada por RNA em células T, permitindo distribuição de uma proteína mais curta e/ou inativa, e é particularmente adequado para induzir engenharia de genoma em células T no tempo desejado e, desse modo, limitando a toxicidade potencial de uma nuclease de Cas9 integrada.

[00065] Por "Cas9 Dividida" é significativo aqui uma forma reduzida ou truncada de uma proteína de Cas9 ou variante de Cas9, que compreende ou um domínio de RuvC, ou domínio de HNH, mas não ambos destes domínios. Tal "Cas9 Dividida" pode ser usada independentemente com RNA guia, ou em um modo complementar, similar, por exemplo, a uma Cas9 Dividida proporcionando um domínio de RuvC, e outra proporcionando o domínio de HNH. As endonucleases guiadas por RNA dividido diferentes podem ser usadas juntas tendo ou domínio de RuvC e/ou domínio de NHN.

[00066] Cada domínio dividido de Cas9 pode ser derivado dos mesmos ou de homólogos de Cas9 diferentes. Muitos homólogos de Cas9 foram identificados em bases de dados de genoma.

[00067] Referidos domínios divididos de Cas9 (domínios de RuvC e de HNH) podem ser simultaneamente ou sequencialmente introduzidos na célula tal que referido(s) domínio(s) dividido(s) de Cas9 processa(m) a sequência de ácido nucleico alvo na célula. Referidos domínios divididos de Cas9 e RNA de guia podem ser introduzidos na célula pelo uso de peptídeos de penetração da célula ou outros métodos de transfecção conforme descrito em outro lugar.

[00068] Em outro aspecto da invenção, somente um domínio de Cas9 dividido, referido como Cas9 compacto, é introduzido na referida célula. De fato, surpreendentemente os inventores mostraram que o domínio de Cas9 dividido compreendendo o motivo de RuvC, conforme descrito acima, é capaz de clivar uma sequência de ácido nucleico alvo independentemente de domínio dividido compreendendo o motivo de HNH. Desse modo, eles podem estabelecer que o RNA guia não necessita da presença do domínio de HNH para se ligar à sequência de ácido nucleico alvo, e é suficientemente estável para estar ligado pelo domínio dividido de RuvC. Em uma concretização preferida, referido domínio de Cas9 dividido sozinho é capaz de cortar referida sequência de ácido nucleico alvo.

[00069] Cada domínio dividido pode ser fundido a pelo menos um domínio ativo na extremidade N-terminal e/ou C-terminal, referido domínio ativo pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em: nuclease (por exemplo, endonuclease ou exonuclease), polimerase, quinase, fosfatase, metilase, demetilase, acetilase, desacetilase, topoisomerase, integrase, transposase, ligase, helicase, recombinase, ativador transcricional (por exemplo, VP64, VP16), inibidor transcricional (por exemplo, KRAB), enzima de processamento final de DNA (por exemplo, Trex2, Tdt), molécula repórter (por exemplo, proteínas fluorescentes, lacZ, luciferase).

[00070] O domínio de HNH é responsável pelo corte de um trançado do DNA de trançado duplo alvo, e o domínio de dobra de RNaseH similar a RuvC é envolvido no corte do outro trançado (compreendendo o motivo de PAM) do ácido nucleico de trançado duplo alvo (Jinek, Chylinski et al. 2012). Contudo, na Cas9 tipo selvagem, estes dois domínios resultam em clivagem cega do DNA invasivo dentro da mesma sequência alvo (proto-espaçador) na vizinhança imediata do PAM (Jinek, Chylinski et al. 2012). A Cas 9 pode ser uma nickase e induz um evento de corte dentro de sequências alvos diferentes.

[00071] Como exemplo não limitante, a Cas9 ou Cas9 dividida pode compreender mutação(ões) nos resíduos catalíticos de domínios ou similares a HNH, ou similares a RuvC, para induzir um evento de corte dentro de sequências alvos diferentes. Como exemplo não limitante, os resíduos catalíticos da proteína de Cas9 são aqueles correspondentes aos aminoácidos D10, D31, H840, H868, N882 e N891, ou posições alinhadas usando método de CLUSTALW nos homólogos de membros da Família Cas. Qualquer destes resíduos podem ser substituídos por qualquer outros aminoácidos, de preferência, por resíduo de alanina. A mutação nos resíduos catalíticos significa qualquer substituição por outros aminoácidos, ou eliminação ou adição de aminoácidos que induzem a inativação de pelo menos um do domínio catalítico de cas9. (cf.. Em uma concretização particular, Cas9 ou Cas9 dividido pode compreender uma ou várias das mutações acima. Em outra concretização preferida, a Cas9 dividida compreende somente um dos dois domínios catalíticos de RuvC e HNH. Na presente invenção, a Cas9 de espécie diferente, Cas9 homóloga, Cas9 projetada, e variante funcional destas, podem ser usadas. A invenção prevê o uso de qualquer endonuclease guiada por RNA, ou endonucleases guiadas por RNA dividido variantes para realizar clivagem de ácido nucleico em uma sequência genética de interesse.

[00072] De preferência, as variantes de Cas9, de acordo com a invenção, têm uma sequência de aminoácido compartilhando pelo menos 70%, de preferência, pelo menos 80%, mais de preferência, pelo menos 90%, e ainda mais de preferência, 95% de identidade com Cas9 de S. Pyogenes (COG3513).

Meganucleases

[00073] Endonuclease de corte incomum pode também ser uma endonuclease doméstica, também conhecida sob o nome de meganuclease. Tais endonucleases domésticas são bem conhecidas na técnica (Stoddard 2005). As endonucleases domésticas são altamente específicas, reconhecendo locais alvos de DNA variando de 12 a 45 pares bases (pb) de comprimento, usualmente variando de 14 a 40 pb de comprimento. A endonuclease doméstica, de acordo com a invenção, pode, por exemplo, corresponder a uma LAGLIDADG endonuclease, a uma HNH endonuclease, ou a uma GIY-YIG endonuclease. Endonuclease doméstica preferida, de acordo com a presente invenção, pode ser uma variante I-CreI. Uma endonuclease "variante", isto é, uma endonuclease que não existe naturalmente na natureza, e que é obtida por engenharia genética, ou por mutagênese aleatória, pode ligar sequências de DNA diferentes daquelas reconhecidas por endonucleases tipo selvagem (ver pedido internacional WO2006/097854).

[00074] Referida endonuclease de corte incomum pode ser uma nucleasse de ligação de DNA modular. Por nucleasse de ligação de DNA modular é significativo quaisquer proteínas de fusão compreendendo pelo menos um domínio catalítico de uma endonuclease, e pelo menos um domínio de ligação de DNA, ou proteína que especifica uma sequência alvo de ácido nucleico. O domínio de ligação de DNA é geralmente um domínio de ligação de RNA ou de DNA formado por um peptídeo independentemente dobrado, ou domínio de proteína que contém pelo menos um motivo que reconhece polinucleotídeos de trançado único ou duplo. Muitos tais polipeptídeos foram descritos na técnica tendo a capacidade de ligar sequências de ácido nucleico específicas. Tais domínios de ligação frequentemente compreendem, como exemplos não limitantes, domínios de hélice de giro de hélice, domínios de zipper de leucina, domínios de hélice alada, domínios de hélice-loop-hélice, domínios de HMG-box, Domínios de Imunoglobina, domínio B3, ou domínio projetado de dedo de zinco.

Nucleases de dedo de zinco

[00075] Inicialmente desenvolvidas para clivar DNA in vitro, as "Nucelases de dedo de zinco" (ZFNs) são um fusão entre o domínio de clivagem da enzima de restrição tipo IIS, FokI, e um domínio de reconhecimento de DNA contendo 3 ou mais motivos de dedo de zinco C2H2. A heterodimerizaçãqo em uma posição particular no DNA de duas ZFNs individuais em orientação e espaçamento preciso conduz a uma quebra de trançado duplo (DSB) no DNA. O uso de tais endonucleases quiméricas foi extensivamente reportado na técnica conforme revisto por Urnov et al. (Genome editing com engineered zinc finger nucleases (2010) Nature reviews Genetics 11:636-646).

[00076] As ZFNs padrões se fundem ao domínio de clivagem ao C- terminal de cada domínio de dedo de zinco. De modo a permitir que os dois domínios de clivagem dimerizem e clivem DNA, as duas ZFNs individuais ligam trançados opostos de DNA com seus C-terminais a certa distância à parte. As sequências vinculadoras mais comumente usadas entre o domínio de dedo de zinco e o domínio de clivagem requerem que a borda 5' de cada local de ligação seja separada por 5 a 7 pb.

[00077] O método mais simples para gerar novas séries de dedo de zinco é combinar "módulos" menores de dedo de zinco de especificidade conhecidas. O processo de montagem modular mais comum envolve combinar três dedos de zinco separados que pode cada reconhecer uma sequência de DNA de 3 pares bases para gerar uma série de 3-finger que pode reconhecer um local alvo de 9 pares bases. Numerosos métodos de seleção foram usados para gerar séries de dedo de zinco capazes de direcionar sequências desejadas. Os esforços de seleção iniciais utilizam revelação de fago para selecionar proteínas que ligam um dado DNA alvo de uma grande reunião de séries de dedo de zinco parcialmente randomizadas. Esforços mais recentes têm utilizado sistemas de um-híbrido de levedura, sistemas de um- híbrido e dois-híbridos bacteriais, e células de mamífero.

TAL-nucleases

[00078] "TALE-nuclease" ou "MBBBD-nuclease" se referem a proteínas projetadas resultantes da fusão de um domínio de ligação de DNA tipicamente derivado de proteínas Efetoras Similares a Ativador de Transcrição (TALE), ou domínio de Ligação Base-por-Base Modular (MBBBD), com um domínio catalítico tendo atividade de endonuclease. Tal domínio catalítico usualmente vem das enzimas, tal como, por exemplo, I-TevI, ColE7, NucA e Fok-I. TALE-nuclease pode ser formada sob formas monoméricas ou diméricas, dependendo do domínio catalítico selecionado (WO2012138927). Tais TALE-nucleases projetadas são comercialmente disponíveis sob o nome comercial TALENTM (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France).

[00079] De acordo com uma concretização preferida da invenção, o domínio de ligação de DNA é derivado de uma EDfetora similar a Ativador de Transcrição (TALE), no qual a especificidade de sequência é acionada por uma série de 33-35 repetições de aminoácidos que se origina de proteínas bacteriais Xanthomonas ou Ralstonia AvrBs3, PthXo1, AvrHah1, PthA, Tal1c, como exemplos não limitantes.

[00080] Estas repetições diferem essencialmente por duas posições de aminoácidos que especificam uma interação com um par base (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009). Cada par base no DNA alvo é contatado por uma única repetição, com a especificidade resultando a partir dos dois aminoácidos variantes da repetição (o assim denominado dipeptídeo variável de repetição, RVD). Os domínios de ligação de TALE podem compreender adicionalmente um domínio de translocação N-terminal responsável pela requisição de uma primeira base de timina (T0) da sequência direcionada e um domínio C-terminal que contém sinais de localização nuclear (NLS). Um domínio de ligação de ácido nucleico TALE geralmente corresponde a um suporte de TALE de núcleo projetado compreendendo uma pluralidade de sequências de repetição de TALE, cada repetição compreendendo um RVD específico para cada base de nucleotídeos de um local de reconhecimento de TALE. Na presente invenção, cada sequência de repetição de TALE de referido suporte de núcleo é produzida de 30 a 42 aminoácidos, mais de preferência, 33 ou 34, no qual dois aminoácidos críticos (o assim denominado dipeptídeo variável de repetição, RVD) localizados nas posições 12 e 13 mediam o reconhecimento de um nucleotídeo de referida sequência de local de ligação de TALE; dois aminoácidos críticos equivalentes podem estar localizados nas posições outras do que 12 e 13 especialmente na sequência de repetição de TALE mais alta do que 33 ou 34 aminoácidos de comprimento. De preferência, RVDs associados com reconhecimento dos nucleotídeos diferentes são HD para reconhecer C, NG para reconhecer T, NI para reconhecer A, NN para reconhecer G ou A. Em outra concretização, os aminoácidos críticos 12 e 13 podem ser mutados em direção a outros resíduos de aminoácido de modo a modular sua especificidade em direção aos nucleotídeos A, T, C e G e, em particular, intensificar esta especificidade. Um domínio de ligação de ácido nucleico de TALE usualmente compreende entre 8 e 30 sequências de repetição de TALE. Mais de preferência, referido suporte de núcleo da presente invenção compreende entre 8 e 20 sequências de repetição de TALE; novamente mais de preferência, 15 sequências de repetição de TALE. Ele pode também compreender uma sequência de repetição de TALE truncada única adicional produzida de 20 aminoácidos localizados no C-terminal de referido conjunto de sequências de repetição de TALE, isto é, uma sequência de repetição de meio-TALE C-terminal adicional.

[00081] Outros domínios de ligação de DNA projetados podem ser usados como sequências alternativas para formar os assim denominados domínios de ligação de ácido nucleico específicos base- por-base modulares (MBBBD), conforme descrito em WO 2014/018601. Referido MBBBD pode ser projetado, por exemplo, de proteínas recentemente identificadas, a saber, proteínas EAV36_BURRH, E5AW43_BURRH, E5AW45_BURRH e E5AW46_BURRH a partir do genoma recentemente sequenciado do fungo endosimbionte Burkholderia Rhizoxinica (Lackner, Moebius et al. 2011). Estes polipeptídeos de ligação de ácido nucleico compreendem módulos de cerca de 31 a 33 aminoácidos que são bases específicas. Estes módulos revelam menos do que 40% de identidade de sequência com repetições comuns de Xanthomonas TALE, e apresentam mais variabilidade de sequência de polipeptídeos. Os domínios diferentes a partir das proteínas acima (módulos, N e C-terminais) de Burkholderia e Xanthomonas são úteis para projetar novas proteínas ou suportes tendo propriedades de ligação para sequências de ácido nucleico específicas, e podem ser combinados para formar proteínas TALE-MBBBD quiméricas.

[00082] Como exemplos, a presente invenção envolve um método para células T projetadas de modo a inativar a expressão dos genes que codificam marcadores de antígeno, tais como CD38, CS1 e CD70 pelo uso de TALE-nucleases específicas.

[00083] Particularmente adequadas para a realização da invenção, TALE-nucleases tais como as TALE-nucleases em SEQ ID NO: 2-3;5- 6;8-9, SEQ ID NO: 64-65;67-68;70-71 e SEQ ID NO: 73-74;76-77;79-80 para respectivamente genes de CD38, CS1 e CD70. Estas TALE- nucleases específicas, sua sequência alvo e o protocolo usado são apresentados mais completamente nos seguintes Exemplos 1-3.

Métodos de distribuição

[00084] Os inventores consideraram quaisquer meios conhecidos na técnica para permitir distribuição dentro das células ou compartimentos subcelulares de referidas células dos polinucleotídeos que expressam as endonucleases, seus possíveis coefetores (por exemplo, RNA ou DNA guia associados com Cas9 ou Argonaute nucleases), bem como os receptores de antígeno quimérico. Estes meios incluem transdução viral, eletroporação, e também meios de distribuição lipossomal, transportadores poliméricos, transportadores químicos, lipoplexes, poliplexes, dendrímeros, nanopartículas, emulsão, endocitose natural ou trajetória de fagocitose, como exemplos não limitantes.

[00085] Como uma concretização preferida da invenção, os polinucleotídeos que codificam as endonucleases da presente invenção são transfectados sob forma de mRNA de modo a obter expressão transiente, e evitar integração cromossomal de DNA estranho, por exemplo, por eletroporação. Os inventores determinaram condições ótimas diferentes para eletroporação de mRNA em célula T descritas na Tabela 1. O inventor usou a tecnologia de cytoPulse que permite, pelo uso de campos elétricos pulsados, permeabilizar transientemente células vivas para distribuição de material nas células (Patente dos Estados Unidos 6.010.613 e WO 2004/083379). A duração do pulso, intensidade, bem como o intervalo entre pulsos, podem ser modificados de modo a alcançar as melhores condições para alta eficiência de transfecção com mortalidade mínima. Basicamente, os primeiros pulsos de alto campo elétrico permitem formação de poro, enquanto que pulsos de campo elétrico mais baixo subsequentes permitem mover o polinucleotídeo na célula. Em um aspecto da presente invenção, o inventor descreve as etapas que conduzem a alcançar de >95% de eficiência de transfecção de mRNA nas células T, e o uso do protocolo de eletroporação para expressar transientemente tipo diferente de proteínas em células T. Em particular, a invenção se relaciona a um método de transformar célula T compreendendo contatar referida célula T com RNA, e aplicar a célula T uma sequência de pulso ágil consistindo em:

[00086] um pulso elétrico com uma faixa de voltagem de 2250 a 3000 V por centímetro, uma largura de pulso de 0,1 ms, e um intervalo de pulso de 0,2 a 10 ms entre os pulsos elétricos da etapa (a) e (b);

[00087] um pulso elétrico com uma faixa de voltagem de 2250 a 3000 V com uma largura de pulso de 100 ms, e um intervalo de pulso de 100 ms entre o pulso elétrico da etapa (b) e o primeiro pulso elétrico da etapa (c); e

[00088] 4 pulsos elétricos com uma voltagem de 325 V com uma largura de pulso de 0,2 ms, e um intervalo de pulso de 2 ms entre cada um dos 4 pulsos elétricos.

[00089] Em concretização particular, o método de transformar célula T compreendendo contatar referida célula T com RNA, e aplicar a uma célula T uma sequência de pulso ágil consistindo em:

[00090] um pulso elétrico com uma voltagem de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 ou 3000V por centímetro, uma largura de pulso de 0,1 ms, e um intervalo de pulso de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ms entre os pulsos elétricos da etapa (a) e (b);

[00091] um pulso elétrico com uma faixa de voltagem de 2250, de 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 ou 3000V, com uma largura de pulso de 100 ms, e um intervalo de pulso de 100 ms entre o pulso elétrico da etapa (b) e o primeiro pulso elétrico da etapa (c); e

[00092] 4 pulsos elétricos com uma voltagem de 325 V com uma largura de pulso de 0,2 ms, e um intervalo de pulso de 2 ms entre cada um dos 4 pulsos elétricos.

[00093] Qualquer valor incluído na faixa de valor descrita acima são descritos no presente pedido. O meio de eletroporação pode ser qualquer meio adequado conhecido na técnica. De preferência, o meio de eletroporação tem condutividade em uma faixa se estendendo de 0,01 a 1,0 miliSiemens. Tabela 1: Programas de citopulso diferentes usados para determinar a voltagem mínima requerida para eletroporação em células T derivadas de PBMC.

Transdução viral

[00094] De acordo com a presente invenção, o uso de vetores retrovirais e, mais de preferência, de vetores lentivirais, é particularmente adequado para expressar os receptores de antígeno quimérico nas células T. Métodos para transdução viral são bem conhecidos na técnica (Walther et al. (2000) Viral Vectors for Gene Transfer. Drugs. 60(2):249-271). Os vetores virais integrativos permitem a integração estável dos polinucleotídeos no genoma das células T e expressarem os receptores de antígeno quimérico por um período mais longo de tempo.

Células T não aloreativas

[00095] Embora o método da invenção possa ser efetuado in-vivo como parte de uma terapia de gene, por exemplo, pelo uso de vetores virais que direcionam células T na circulação do sangue, que incluiria sequências genéticas que expressam uma endonuclease de corte incomum específica junto com outras sequências genéticas que expressam um CAR, o método da invenção é mais geralmente pretendido para ser praticado ex-vivo em células T cultivadas obtidas de pacientes ou doadores. As células T projetadas ex-vivo podem ser, ou reimplantadas em um paciente de onde elas se originam, como parte de um tratamento autólogo, ou serem usadas como parte de um tratamento alogenêico. Neste último caso, é preferível projetar adicionalmente as células para torná-las não aloreativas para assegurar seu correto enxerto. Consequentemente, o método da invenção pode incluir etapas adicionais de procurar as células T de um doador, e inativar genes deste envolvidos no reconhecimento de MHC e ou sendo alvos de fármacos imunossupressivos, tal como descrito, por exemplo, no WO 2013/176915.

[00096] Os receptores de célula T (TCR) são receptores de superfície de célula que participam na ativação de células T em resposta à apresentação de antígeno. O TCR é geralmente produzido de duas cadeias, alfa e beta, que se reúnem para formar um heterodímero e se associa com as subunidades de transdução de CD3 para formar o complexo de receptor de célula T presente na superfície da célula. Cada cadeia alfa e beta do TCR consiste em uma região variável (V) e constante (C) N-terminal similar à imunoglobulina, um domínio de transmembrana hidrofóbica, e uma região citoplásmica curta. Como para a molécula de imunoglobulina, a região variável das cadeias alfa e beta são geradas por recombinação de V(D)J, criando uma grande diversidade de especificidades de antígeno dentro da população de células T. Contudo, em contraste a imunoglobulinas que reconhecem antígeno intacto, as células T são ativadas por fragmentos de peptídeo processados em associação com uma molécula de MHC, introduzindo uma dimensão extra para reconhecimento de antígeno pelas células T, conhecida como restrição de MHC. O reconhecimento das disparidades de MHC entre o doador e recipiente através do receptor de célula T conduz a proliferação de célula T, e ao desenvolvimento potencial de GVHD. Foi mostrado que a expressão de superfície normal do TCR depende da síntese coordenada e da montagem de todos os sete componentes do complexo (Ashwell and Klusner 1990). A inativação de TCRalfa ou TCRbeta pode resultar na eliminação do TCR a partir da superfície das células T, impedindo reconhecimento de aloantígeno e, desse modo, GVHD.

[00097] Desse modo, ainda de acordo com a invenção, o enxerto das células T pode ser aperfeiçoado por inativação de pelo menos um gene que codifica um componente de TCR. O TCR é tornado não funcional nas células por inativação de gene de TCR alfa e/ou gene(s) TCR beta.

[00098] Com relação ao uso de sistema de Cas9/CRISPR, os inventores determinaram sequências alvos apropriadas dentro dos 3 exons que codificam TCR, permitindo uma redução significante de toxicidade em células vivas, enquanto que retém a eficiência de clivagem. As sequências alvos preferidas são notadas na Tabela 2 (+ para proporção mais baixa de células negativas de TCR, ++ para proporção intermediária, +++ para proporção mais alta). Tabela 2: sequências alvos apropriadas para o RNA de guia usando Cas9 em células T

[00099] Os antígenos de MHC são também proteínas que desempenham um papel maior nas reações de transplantação. A rejeição é mediada por reação de células T à antígenos de histocompatibilidade na superfície de tecidos implantados, e o grupo maior destes antígenos é os antígenos de maior histocompatibilidade (MHC). Estas proteínas são expressas na superfície de todos vertebrados mais altos e denominados antígenos de HLA (para antígenos de leucócito humanos) em células humanas. Similares a TCR, as proteínas de MHC servem a um papel vital na estimulação de célula T. As células de apresentação de antígeno (frequentemente células dendríticas) revelam peptídeos que são os produtos de degradação na superfície de célula no MHC. Na presença de um sinal coestimulatório, a célula T torna-se ativada, e agirá em uma célula alvo que também revela aquele mesmo complexo de peptídeo/MHC. Por exemplo, uma célula ajudante T estimulada direcionará um macrófago revelando um antígeno em conjunto com seu MHC, ou uma célula T citotóxica (CTL) agirá em uma célula viralmente infectada que revela peptídeos virais estranhos.

[000100] Desse modo, de modo a proporcionar células T menos aloreativas, o método da invenção pode adiciomalmente compreender a etapa de inativar ou efetuar mutação de um gene de HLA.

[000101] O grupo de gene de HLA de classe I em humanos compreende três locais maiores, B, C e A, bem como vários locais menores. O grupo de HLA de classe II também compreende três locais maiores, DP, DQ e DR, e ambos os grupos de gene de classe I e classe II são polimórficos, em que existem vários alelos diferentes de ambos os genes de classe I e II dentro da população. Existem também várias proteínas acessórias que desempenham um papel no funcionamento de HLA também. As subunidades de Tapl e Tap2 são partes do complexo de transportador de TAP que é essencial no carregamento de antígenos de peptídeo nos complexos de HLA de classe I, e as subunidades de proteossoma LMP2 e LMP7 desempenham papéis na degradação proteolítica de antígenos nos peptídeos para revelação no HLA. A redução na LMP7 foi mostrada reduzir a quantidade de MHC de classe I na superfície da célula, talvez através de uma falta de estabilização (Fehling et al. (1999) Science 265:1234-1237). Em adição a TAP e LMP, existe o gene de tapasin, cujo produto forma uma ponte entre o complexo de TAP e as cadeias de HLA de classe I, e intensifica o carregamento de peptídeo. A redução na tapasin resulta em células com montagem de MHC de classe I prejudicada, expressão de superfície de célula reduzida do MHC de classe I, e respostas imunes prejudicadas (Grandea et al. (2000) Immunity 13:213-222 and Garbi et al. (2000) Nat. Immunol. 1:234-238). Qualquer dos genes acima podem ser inativados como parte da presente invenção conforme descrito, por exemplo, no WO 2012/012667.

[000102] Método de projeto de células T resistentes à fármaco:

[000103] Para aperfeiçoar a terapia de câncer e enxerto seletivo das células T alogenêicas, a resistência à fármaco pode ser conferida às células T projetadas para protege-las dos efeitos colaterais tóxicos da quimioterapia ou agentes imunossupressivos. De fato, os inventores observaram que muitos pacientes foram tratados com quimioterapia e agentes de depleção imunes como um padrão de cuidado, antes do recebimento da imuterapia de célula T. Também eles verificaram que eles podem levar vantagem destes tratamentos para ajudar na seleção das células T projetadas, ou por adição de fármacos de quimioterapia no meio de cultura para expansão das células ex-vivo antes do tratamento, ou por obtenção de uma expansão seletiva das células T projetadas in-vivo em pacientes sob tratamentos de quimioterapia ou imunossupressivo.

[000104] Também a resistência ao fármaco de células T também permite seu enriquecimento in ou ex vivo, as células T que expressam o gene de resistência ao fármaco, sobreviverão e multiplicarão relativas às células sensíveis ao fármaco. Em particular, a presente invenção se relaciona a um método de projetar células T alogenêicas e de resistência à fármaco resistentes para imunoterapia compreendendo: (a) Proporcionar uma célula T; (b) Selecionar pelo menos um fármaco; (c) Modificar a célula T para conferir resistência ao fármaco a referida célula T; (d) Expandir referida célula T projetada na presença de referido fármaco, e opcionalmente as etapas precedentes podem ser combinadas com as etapas dos métodos conforme anteriormente descritas.

[000105] A resistência ao fármaco pode ser conferida a uma célula T por inativação de um ou mais gene(s) responsáveis pela sensibilidade da célula ao fármaco (gene(s) de sensibilização do fármaco), tal como o gene hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HPRT) (Banco de Genes: M26434.1). Em particular, HPRT pode ser inativado em células T projetadas para conferir resistência a um metabólito citoestático, a 6- tioguanina (6TG) que é convertida pelo HPRT a nucleotídeo de tioguanina citotóxico, e que é atualmente usado para tratar pacientes com câncer, em particular, leucemias (Hacke, Treger et al. 2013). Outro exemplo se a inativação da CD3 normalmente expressa na superfície da célula T pode conferir resistência a anticorpos anti-CD3, tal como teplizumab.

[000106] A resistência ao fármaco pode também ser conferida a uma célula T por expressão de um gene de resistência ao fármaco. Referida resistência ao fármaco gene se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica "resistência" a um agente, tal como um agente quimioterapêutico (por exemplo, metotrexato). Em outras palavras, a expressão do gene de resistência ao fármaco em uma célula permite proliferação das células na presença do agente a uma extensão maior do que a proliferação de uma célula correspondente sem o gene de resistência ao fármaco. Um gene de resistência ao fármaco da invenção pode codificar resistência a antimetabólito, metotrexato, vinblastina, cisplatina, agentes de alquilatação, antraciclinas, antibióticos citotóxicos, anti-imunofilinas, seus análogos ou derivados, e similares.

[000107] Os alelos variantes de vários genes, tais como di-hidrofolato reductase (DHFR), inosina monofosfato de-hidrogenase 2 (IMPDH2), calcineurina ou metilguanina transferase (MGMT), foram identificados para conferir resistência ao fármaco a uma célula. Referido gene de resistência ao fármaco pode ser expresso na célula, ou por introdução de um transgene que codifica referido gene na célula, ou por integração de referido gene de resistência ao fármaco no genoma da célula por recombinação homóloga. Vários outros genes de resistência ao fármaco foram identificados que podem potencialmente serem usados para conferir resistência ao fármaco às células direcionadas (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007).

[000108] A DHFR é uma enzima envolvida na regulação da quantidade de tetra-hidrofolato na célula, e é essencial para a síntese de DNA. Análogos de folato, tais como metotrexato (MTX) inibem DHFR e são, desse modo, usados como agentes antineoplásticos em clínicas. Formas de mutantes diferentes de DHFR que têm resistência aumentada para inibição por antifolatos usados na terapia foram descritas. Em uma concretização particular, o gene de resistência ao fármaco, de acordo com a presente invenção, pode ser uma sequência de ácido nucleico que codifica uma forma de mutante de DHFR tipo selvagem humano (Banco de Genes: AAH71996.1) que compreende pelo menos uma mutação que confere resistência a um tratamento de antifolato, tal como metotrexato. Em concretização particular, a forma de mutante de DHFR compreende pelo menos um aminoácido mutado na posição G15, L22, F31 ou F34, de preferência, nas posições L22 ou F31 ((Schweitzer, Dicker et al. 1990); pedido Internacional WO 94/24277; patente US 6.642.043).

[000109] Conforme aqui usado, "agente antifolato" ou "análogos de folato" se refere a uma molécula direcionada a interferir com a trajetória metabólica de folato em algum nível. Exemplos de agentes antifolato incluem, por exemplo, metotrexato (MTX); aminopterina; trimetrexato (Neutrexin™); edatrexato; ácido N10-propargil-5,8- dideazafólico (CB3717); ZD1694 (Tumodex), ácido 5,8-dideazaisofólico (IAHQ); ácido 5,10- dideazatetra-hidrofólico (DDATHF); ácido 5-deazafólico; PT523 (N alfa-(4-amino-4- deoxipteroil)-N delta-hemiptaloil-L-ornitina); 10-etil-10- deazaaminopterina (DDATHF, lomatrexol); piritrexim; 10-EDAM; ZD1694; GW1843; Pemetrexato e PDX (10-propargil-10- deazaaminopterina).

[000110] Outro exemplo de gene de resistência ao fármaco pode também ser um mutante ou forma modificada de ionisina-5’- monofosfato de-hidrogenase II (IMPDH2), uma enzima limitante de taxa no de novo síntese de nucleotídeos de guanosina. O mutante ou forma modificada de IMPDH2 é um gene de resistência de inibidor de IMPDH. Os inibidores de IMPDH podem ser ácido micofenólico (MPA) ou seu profármaco micofenolato mofetil (MMF). O mutante IMPDH2 pode compreender pelo menos uma, de preferência, duas mutações no local de ligação de MAP do IMPDH2 humano tipo selvagem (NP_000875.2) que conduz a uma resistência significantemente aumentada a inibidor de IMPDH. As mutações estão, de preferência, nas posições T333 e/ou S351 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013). Em uma concretização particular, o resíduo de treonina na posição 333 é substituído com um resíduo de isoleucina, e o resíduo de serina na posição 351 é substituído com um resíduo de tirosina.

[000111] Outro gene de resistência ao fármaco é a forma mutante de calcineurina. A calcineurina (PP2B) é uma fosfatase de proteína serina/treonina ubiquamente expressa que é envolvida em muitos processos biológicos, e que é central à ativação de célula T. A calcineurina é um heterodímero composto de uma subunidade catalítica (CnA; três isoformas), e uma subunidade regulatória (CnB; duas isoformas). Após engajamento do receptor de célula T, a calcineurina defosforilata o fator de transcrição NFAT, permitindo que o mesmo transloque para o núcleo e gene alvo chave ativo, tal como IL2. O FK506 no complexo com FKBP12, ou ciclosporina A (CsA) no complexo com CyPA bloco NFAT acessa ao local ativo de calcineurina, impedindo sua defosforilação e, desse modo, inibindo a ativação de célula T (Brewin, Mancao et al. 2009). O gene de resistência ao fármaco da presente invenção pode ser uma sequência de ácido nucleico que codifica uma forma mutante de calcineurina resistente a inibidor de calcineurina, tal como FK506 e/ou CsA. Em uma concretização particular, referida forma mutante pode compreender pelo menos um aminoácido mutado do heterpdímero de calcineurina tipo selvagem nas posições: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360, de preferência, mutações duplas nas posições T351 e L354 ou V314 e Y341. Correspondência de posições de aminoácido aqui descrita é frequentemente expressa em termos das posições dos aminoácidos da forma de heterodímero de calcineurina humana tipo selvagem (Banco de Genes: ACX34092.1).

[000112] Em outra concretização preferida, referida forma mutante pode compreender pelo menos um aminoácido mutado do heterodímero de calcineurina tipo selvagem b nas posições: V120, N123, L124 ou K125, de preferência, mutações duplas nas posições L124 e K125. Correspondência de posições de aminoácido aqui descrita é frequentemente expressa em termos das posições dos aminoácidos da forma de polipeptídeo b de heterodímero de calcineurina humana tipo selvagem (Banco de Genes: ACX34095.1).

[000113] Outro gene de resistência ao fármaco é 0(6)-metilguanina metiltransferase (MGMT) que codifica alquil guanina transferase humana (hAGT). AGT é uma proteína de reparo de DNA que confere resistência aos efeitos citotóxicos de agentes de alquilatação, tais como nitrosoureias e temozolomida (TMZ). 6-benzilguanina (6-BG) é um inibidor de AGT que potencializa a toxicidade de nitrosoureia, e é coadministrada com TMZ para potencializar os efeitos citotóxicos deste agente. Várias formas mutantes de MGMT que codificam variantes de AGT são altamente resistentes a inativação por 6-BG, mas retêm sua capacidade de reparar dano do DNA (Maze, Kurpad et al. 1999). Em uma concretização particular, a forma de mutante de AGT pode compreender um aminoácido mutado da AGT topo selvagem posição P140 (UniProtKB: P16455).

[000114] Outro gene de resistência ao fármaco pode ser gene de proteína de resistência ao multifármaco 1 (MDR1). Este gene codifica uma glicoproteína de membrana, conhecida como P-glicoproteína (PGP) envolvida no transporte de subprodutos metabólicos através da membrana da célula. A proteína P-Gp revela ampla especificidade em direção a vários agentes de quimioterapia estruturalmente não relacionados. Desse modo, a resistência ao fármaco pode ser conferida às células pela expressão de sequência de ácido nucleico que codifica MDR-1 (NP_000918).

[000115] O gene de resistência ao fármaco pode também ser antibióticos citotóxicos, tais como gene ble ou gene mcrA. A expressão ectópica de gene ble ou mcrA em uma célula imune dá uma vantagem seletiva quando exposta ao agente quimioterapêutico, respectivamente a bleomicina ou a mitomicina C.

[000116] As células T podem também serem tornadas resistentes a agentes imunossupressivos. Um agente imunossupressivo é um agente que suprime função imune por um de vários mecanismos de ação. Em outras palavras, um agente imunossupressivo é um papel desempenhado por um composto que é exibido por uma capacidade de diminuir a extensão e/ou voracidade de uma resposta imune. Como exemplo não limitante, um agente imunossupressivo pode ser um inibidor de calcineurina, um alvo de rapamicina, um bloqueador de cadeia- α de interleucina-2, um inibidor de inosina monofosfato de- hidrogenase, um inibidor de ácido di-hidrofólico reductase, um corticosteroide, ou um antimetabólito imunossupressivo. Imunossupressores citotóxicos clássicos agem por inibição de síntese de DNA. Outros podem agir através de ativação de células T, ou por inibição da ativação de células ajudantes. O método, de acordo com a invenção, permite conferir resistência imunossupressiva às células T para imunoterapia por inativação do alvo do agente imunossupressivo nas células T. Como exemplos não limitantes, alvos para agente imunossupressivo podem ser um receptor para um agente imunossupressivo tal como: CD52, receptor de glicocorticoide (GR), um membro de gene da família FKBP e um membro de gene da família ciclofilina.

[000117] Em hospedeiros imunocompetentes, as células alogenêicas são normalmente rapidamente rejeitadas pelo sistema imune do hospedeiro. Foi demonstrado que, leucócitos alogenêicos presentes em produtos de sangue não irradiados persistirão por não mais do que 5 a 6 dias. Desse modo, para impedir rejeição de células alogenêicas, o sistema imune do hospedeiro deve ser efetivamente suprimido. Glucocorticoidesteroides são amplamente usados terapeuticamente para imunossupressão. Esta classe de hormônios esteroides se liga ao receptor de glicocorticoide (GR) presente no citosol de células T resultando na translocação no núcleo e a ligação de motivos de DNA específicos que regulam a expressão de um número de genes envolvidos no processo imunológico. O tratamento de células T com esteroides de glicocorticoide resulta em níveis reduzidos de produção de citocina que conduz a energia de célula T, e interferindo na ativação da célula T. Alemtuzumab, também conhecido como CAMPATH1-H, é um anticorpo monoclonal humanizado que direciona CD52, um 12 aminoácido glicosilfosfatidil-inositol- (GPI) ligado glicoproteína (Waldmann and Hale, 2005). O CD52 é expresso em altos níveis em linfócitos T e B e níveis mais baixos em monócitos, enquanto que estando ausentes nos granulócitos e precursores de medula óssea. O tratamento com Alemtuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado direcionado contra CD52, foi mostrado induzir uma rápida depleção de circulação de linfócitos e monócitos. Ele é frequentemente usado no tratamento de linfomas de célula e, em certos casos, como parte de um regime de condicionamento para transplante. Contudo, no caso de imunoterapia adotiva, o uso de fármacos imunossupressores também terá um efeito prejudicial nas células T terapêuticas introduzidas. Portanto, para usar efetivamente uma abordagem de imunoterapia adotiva nestas condições, as células introduzidas necessitariam de ser resistentes ao tratamento imunossupressivo.

[000118] Como uma concretização preferida das etapas acima, referido gene da etapa (b), específico para tratamento imunossupressivo, é CD52, e o tratamento imunossupressivo da etapa (d) compreende um anticorpo humanizado que direciona antígeno de CD52. Como outra concretização, referido gene da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressivo, é um receptor de glicocorticoide (GR), e o tratamento imunossupressivo da etapa d) compreende um corticosteroide tal como dexametasona. Como outra concretização, referido gene alvo da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressivo, é um membro de gene da família FKBP, ou uma variante deste, e o tratamento imunossupressivo da etapa (d) compreende FK506 também conhecido como Tacrolimus ou fujimycin. Como outra concretização, referido membro de gene da família FKBP é FKBP12, ou uma variante deste. Como outra concretização, referido gene da etapa (b), específico para um tratamento imunossupressivo, é um membro de gene da família ciclofilina, ou uma variante deste, e o tratamento imunossupressivo da etapa (d) compreende ciclosporina.

[000119] Em uma concretização particular da invenção, a etapa de modificação genética do método ocorre na inativação de dois genes selecionados a partir do grupo consistindo em CD52 e GR, CD52 e TCR alfa, CDR52 e TCR beta, GR e TCR alfa, GR e TCR beta, TCR alfa e TCR beta. Em outra concretização, a etapa de modificação genética do método ocorre na inativação de mais do que dois genes. A modificação genética é, de preferência, operada ex-vivo usando pelo menos dois guias de RNA que direciona os genes diferentes.

[000120] Por inativação de um gene, é pretendido que o gene de interesse não é expresso em uma forma de proteína funcional.

[000121] Projeto de células T altamente ativas para imunoterapia

[000122] De acordo com a presente invenção, as células T podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em linfócitos T inflamatórios, linfócitos T citotóxicos, linfócitos T regulatórios, ou linfócitos T auxiliadores. Em outra concretização, referido célula pode ser derivada a partir do grupo consistindo em linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+. Elas podem ser extraídas de sangue ou derivadas de células troncos. As células troncos podem ser células tronco adultas, células tronco embriônicas, mais particularmente, células tronco não humanas, células tronco de sangue umbilical, células progenitoras, células tronco da medula óssea, células tronco pluripotentes induzidas, células tronco totipotentes, ou células tronco hematopoiéticas. As células humanas representativas são células CD34+. Antes da expansão e modificação genética das células da invenção, uma fonte de células pode ser obtida de um indivíduo através de uma variedade de métodos não limitantes. As células T podem ser obtidas de um número de fontes não limitantes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido do gânglio linfático, sangue umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascite, efusão pleural, tecido do baço, e tumores. Em certas concretizações da presente invenção, qualquer número de linhas de célula T disponíveis e conhecidas àqueles técnicos no assunto, pode ser usado. Em outra concretização, referida célula pode ser derivada de um doador saudável, de um paciente diagnosticado com câncer, ou de um paciente diagnosticado com uma infecção. Em outra concretização, referida célula é parte de uma população misturada de células que apresentam características fenotípicas diferentes. No escopo da presente invenção é também envolvido uma linha de célula obtida de uma célula T transformada de acordo com o método anteriormente descrito.

[000123] Como um aspecto adicional da invenção, as células T de acordo com a invenção podem ser adicionalmente projetadas, de preferência, geneticamente projetadas, para intensificar sua atividade e/ou ativação, especialmente por modulação da expressão de proteínas envolvidas na regulação total da célula T, referido como "postos de controle imunes".

Postos de controle imune

[000124] Será compreendido por aqueles técnicos no assunto que "postos de controle imune" significa um grupo de moléculas expressas por células T. Estas moléculas servem efetivamente como "brakes" para modular ou inibir uma resposta imune. As moléculas de posto de controle imune incluem, mas não são limitadas a Morte Programada 1 (PD-1, também conhecida como PDCD1 ou CD279, número de acesso: NM_005018), Antígeno de Linfócito-T Citotóxico 4 (CTLA-4, também conhecido como CD152, Número de acesso no Banco de Genes AF414120.1), LAG3 (também conhecido como CD223, número de acesso: NM_002286.5), Tim3 (também conhecido como HAVCR2, Número de acesso no Banco de Genes: JX049979.1), BTLA (também conhecido como CD272, número de acesso: NM_181780.3), BY55 (também conhecido como CD160, Número de acesso no Banco de Genes: CR541888.1), TIGIT (também conhecido como lVSTM3, número de acesso: NM_173799), LAIR1 (também conhecido como CD305, Número de acesso no Banco de Genes: CR542051.1, {Meyaard, 1997 N° 122}), SIGLEC10 (Número de acesso no Banco de Genes: AY358337.1), 2B4 (também conhecido como CD244, número de acesso: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7 {Nicoll, 1999 N° 123}, SIGLEC9 {Zhang, 2000 N° 124;Ikehara, 2004 N° 125}, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF {Quigley, 2010 N° 121}, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, que inibem diretamente células imunes. Por exemplo, CTLA-4 é uma proteína de superfície de célula expressa em certas células T CD4 e CD8; quando engatadas por seus ligantes (B7-1 e B7-2) em células de apresentação de antígeno, ativação de célula T e função efetoras são inibidas. Desse modo, a presente invenção se relaciona a um método de projeto de células T, especialmente para imunoterapia, compreendendo células T geneticamente modificadas por inativação de pelo menos uma proteína envolvida no posto de controle imune, em particular, PD1 e/ou CTLA-4, ou quaisquer proteínas de posto de controle imune referidas na Tabela 3. Tabela 3: Lista de genes que codificam proteínas de ponto de controle imune.

Células T projetadas que expressam receptores de antígeno quimérico contra células patológicas

[000125] Os receptores de antígeno quimérico introduzidos às Células T, de acordo com a invenção, podem adotar desenho diferente, tal como CARs de cadeia simples ou de multicadeia. Estes desenhos diferentes permitem várias estratégias para aperfeiçoar especificidade e eficiência de ligação em direção a células patológicas. Algumas destas estratégias são ilustradas nas figuras do presente pedido. Os CARs de cadeia simples são a versão mais clássica na técnica. As arquiteturas de CAR multicadeia foram desenvolvidas pela requerente como permitindo modulação da atividade de células T em termos de especificidade e intensidade. As subunidades múltiplas podem abrigar domínios de coestimulação adicionais, ou manter tais domínios a uma distância, bem como outros tipos de receptores, onde arquitetura de cadeia simples clássica pode, as vezes, estar relacionada como muito mais sensível e menos permissiva a interações multiespecíficas.

CAR de Cadeia Simples

[000126] A imunoterapia adotiva, que envolve a transferência de células T específicas de antígeno autólogas geradas ex vivo, é uma estratégia promissora para tratar infecções virais e câncer. As células T usadas para imunoterapia adotiva podem ser geradas, ou por expansão de células T específicas de antígeno, ou redireção de células T através de engenharia genética (Park, Rosenberg et al. 2011). A transferência de células T específicas de antígeno viral é um procedimento bem estabelecido usado para o tratamento de infecções virais associadas a transplante e malignidades relacionadas virais raras. Similarmente, o isolamento e transferência de células T específicas de tumor foram mostrados serem com sucesso no tratamento de melanoma.

[000127] Novas especificidades nas células T foram bem sucedidamente geradas através da transferência genética de receptores de célula T transgênica ou receptores de antígeno quimérico (CARs) (Jena, Dotti et al. 2010). Os CARs são receptores sintéticos consistindo em uma fração de direcionamento que é associada com um ou mais domínios de sinalização em uma molécula de fusão simples. Em geral, a fração de ligação de um CAR consiste em um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo de cadeia simples (scFv), compreendendo os fragmentos leves e variáveis de um anticorpo monoclonal unido por um vinculador flexível. As frações de ligação baseadas no receptor ou domínios de ligante foram também usadas com sucesso. Os domínios de sinalização para CARs de primeira geração são derivados a partir da região citoplásmica do CD3zeta ou das cadeias gama de receptor Fc. Os CARs de primeira geração foram mostrados para redirecionar com sucesso citoxicidade de célula T. Contudo, eles falham em proporcionar expansão prolongada e atividade antitumor in vivo. Os domínios de sinalização de moléculas coestimulatórias incluindo CD28, OX-40 (CD134), e 4-1BB (CD137) foram adicionados sozinhos (segunda geração), ou em combinação (terceira geração) para intensificar a sobrevivência e aumentar a proliferação de células T modificadas por CAR. Os CARs permitem com sucesso que as células T sejam redirecionadas contra antígenos expressos na superfície de células de tumor de várias malignidades incluindo linfomas e tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010).

[000128] Em adição ao CAR que direciona o marcador de antígeno, que é comum às células patológicas e às células T, tal como CD38, é considerado expressar CARs adicionais direcionados em direção a outros marcadores de antígeno não necessariamente expressos pelas células T, de modo a intensificar a especificidade das células T.

[000129] Exemplos de receptor de antígeno quimérico que podem ser adicionalmente expressos pelas células T para criar células multiespecíficas são receptores de antígeno direcionados contra mieloma múltiplo ou marcadores de antígeno de leucemia linfoblástica, tais como TNFRSF17 (UNIPROT Q02223), SLAMF7 (UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D (UNIPROT Q9NZD1), FKBP11 (UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8 (UNIPROT P53708), e FCRL5 (UNIPROT Q68SN8).

[000130] Como exemplos adicionais, o antígeno do alvo pode ser de qualquer grupo de moléculas de diferenciação (por exemplo, CD16, CD64, CD78, CD96,CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123 e CD138), um antígeno de superfície associado a tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antígeno carcinoembriônico (CEA), molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM), receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, disialogangliosida GD2, mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glicosfingolipídeos, antígeno associado a glioma, gonadotropina coriônica β-humana, alfafetoproteína (AFP), lectina-reativa AFP, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptase reversa humana telomerase, RU1, RU2 (AS), esterase carboxil intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostase, antígeno específico de prostase (PSA), PAP, NY-ESO- 1, LAGA-1a, p53, prosteina, PSMA, sobrevivência e telomerase, antígeno-1 de tumor de carcinoma de próstata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, neutrofil elastase, efrina B2, CD22, fator de crescimento de insulina (IGF1)-I, receptor IGF-II, receptor IGFI, mesotelina, uma molécula de complexo de histocompatibilidade maior (MHC) apresentando um epítopo de peptídeo específico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antígenos estromal de tumor, o domínio extra A (EDA) e domínio extra B (EDB) de fibronectina, e o domínio A1 de tenascin-C (TnC A1) e proteína associada a fibroblasto (fap); um antígeno específico de linhagem ou específico de tecido, tal como CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GM-CSF, receptores de citocina, endoglina, uma molécula de complexo de histocompatibilidade maior (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17), ou um antígeno de superfície específico de vírus, tal como um antígeno específico de HIV (tal como HIV gp120); um antígeno específico de EBV, um antígeno específico de CMV, um antígeno específico de HPV, um antígeno específico de Lasse Virus, um antígeno específico de Vírus Influenza, bem como qualquer derivado ou variante destes marcadores de superfície. Os antígenos não são necessariamente antígenos de marcadores de superfície, mas podem ser também antígenos pequenos endógenos apresentados por classe I de HLA na superfície das células.

[000131] Como exemplos, a presente invenção envolve CARs de cadeia simples que direcionam especificamente marcador de superfície de célula, tal como CD38, CS1 e/ou CD70, conforme descrito nos exemplos, junto com uma inativação dos genes que codificam respectivamente CD38, CS1 e/ou CD70 nas células que expressam referidos CARs.

[000132] Como um exemplo específico, as cadeias de VH e VL do scFv anti-CD38 compartilham pelo menos 80%, de preferência, 90% e, mais de preferência, 95%, de identidade com respectivamente SEQ ID NO:10 e 12 e SEQ ID NO: 11 e 13.

[000133] Como um exemplo específico, o anticorpo ou ligação de epítopo no antígeno de CD38, caracterizado em que referido anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, no qual referida cadeia pesada compreende três regiões de determinação de complementaridade sequencial tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOS: 14-17, e no qual referida cadeia leve compreende três regiões de determinação de complementaridade sequencial tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOS: 21-23.

[000134] Como um outro exemplo específico, o anticorpo ou ligação de epítopo no antígeno de CD38, caracterizado em que referido anticorpo ou fragmento de ligação de epítopo deste compreende pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, no qual referida cadeia pesada compreende três regiões de determinação de complementaridade sequencial tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOS: 18-20, e no qual referida cadeia leve compreende três regiões de determinação de complementaridade sequencial tendo sequências de aminoácido representadas por SEQ ID NOS: 24-26.

[000135] Como outro exemplo específico, as cadeias de VH e VL do scFv anti-CS1 compartilham pelo menos 80%, de preferência, 90% e, mais de preferência, 95% da identidade com respectivamente SEQ ID NO:38-40-42-44-46 e SEQ ID NO: 39-41-42-45-46.

[000136] Como ainda outro exemplo específico, as cadeias de VH e VL do scFv anti-CD70 compartilham pelo menos 80%, de preferência, 90%, e mais de preferência, 95% de identidade do polinucleotídeo ou nível de ácido nucleico com respectivamente SEQ ID NO:81-82; 85-86; 89-91 e SEQ ID NO: 83-84; 87-88; 91-92.

[000137] Em uma concretização, a invenção envolve um polinucleotídeo que codifica um CAR anti-CD38 simples que compartilha pelo menos 80%, de preferência, 90%, e, mais de preferência, 95% de identidade com SEQ ID NO: 35-37. Em outra concretização, a invenção envolve um polinucleotídeo que codifica um CAR anti-CS1 simples que compartilham pelo menos 80%, de preferência, 90% e, mais de preferência, 95% da identidade com SEQ ID NO: 48-62.

[000138] Em ainda outra concretização, a invenção envolve um polinucleotídeo que codifica um CAR anti-CD70 simples que compartilha pelo menos 80%, de preferência, 90%, e, mais de preferência, 95% de identidade com SEQ ID NO: 93-101.

[000139] A presente invenção é, mais particularmente, direcionada a células imunes que são dotadas com um CAR apresentando alguma identidade com aqueles descritos no presente pedido, e que suportaria mutações induzidas por endonuclease de corte incomum em um gene que codifica o marcador de célula direcionado por referido CAR (isto é, o CAR revela afinidade com o produto de referidos genes inativados). Por identidade é significativo pelo menos 70%, de preferência, 80%, mais de preferência, 90%, e ainda mais de preferência, 95% de identidade de polinucleotídeo ou de polipeptídeo conforme determinado pelo software tal como FASTA, ou BLAST, que estão disponíveis como uma parte do pacote de análise de sequência GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.). "Identidades" BLASTP mostra o número e fração de resíduos totais nos pares de sequência de alta classificação que são idênticos. As sequências de aminoácido tendo estes graus de identidade ou similaridade, ou qualquer grau intermediário de identidade de similaridade às sequências de aminoácido aqui descritas são contempladas e envolvidas por esta revelação. O mesmo se aplica com relação a sequências de polinucleotídeo usando BLASTN.

CAR de multi-subunidade

[000140] Os receptores de antígeno quimérico da técnica anterior introduzidos em células T foram formados em polipeptídeos de cadeia simples que necessitam de anexo em série de domínios de sinalização. Contudo, pelo movimento dos domínios de sinalização de sua posição de justamembrana natural pode-se interferir com sua função. Para superar este problema, a requerente recentemente designou um CAR de multicadeia derivado de FcεRI para permitir posição de justamembrana normal de todos os domínios de sinalização relevantes. Nesta nova arquitetura, o domínio de ligação de IgE de alta afinidade de cadeia alfa FcεRI é substituído por um domínio de ligação de ligante extracelular, tal como scFv para redirecionar especificidade de célula T contra alvos de célula, e as caudas N e/ou C-terminais de cadeia beta FcεRI são usados para colocar sinais coestimulatórios em posições de justamembrana normal.

[000141] Consequentemente, o CAR expresso pela célula T projetada de acordo com a invenção pode ser um receptor de antígeno quimérico de multicadeia (CAR) particularmente adaptado para a produção e expansão de células T projetadas da presente invenção. Tais CARs de multicadeia compreendem pelo menos dois dos seguintes componentes: a) um polipeptídeo compreendendo o domínio de transmembrana de cadeia alfa FcεRI e um domínio de ligação de ligante extracelular, b) um polipeptídeo compreendendo uma parte de cauda citoplásmica N- e C- terminal e o domínio de transmembrana de cadeia beta FcεRI e/ou c) pelo menos dois polipeptídeos compreendendo cada uma parte de cauda intracitoplásmica e o domínio de transmembrana de cadeia gama FcεRI, pelo que polipeptídeos diferentes multimerizam juntos espontaneamente para formar CAR dimérico, trimérico ou tetramérico.

[000142] De acordo com tais arquiteturas, os domínios de ligação de ligante e domínios de sinalização são desenvolvidos em polipeptídeos separados. Os polipeptídeos diferentes são ancorados na membrana em uma proximidade permitindo interações entre si. Em tais arquiteturas, o domínio de sinalização e domínio coestimulatório podem estar em posições de justamembrana (isto é, adjacentes à membrana de célula no lado interno dele), que é, de fato, para permitir função aperfeiçoada de domínio coestimulatórios. A arquitetura de multi-subuni- dade também oferece mais flexibilidade e possibilidades de designação de CARs com mais controle na ativação da célula T. Por exemplo, é possível incluir vários domínios de reconhecimento de antígeno extracelular tendo especificidade diferente para obter uma arquitetura de CAR multiespecífica. É também possível controlar a proporção relativa entre as subunidades diferentes no CAR de multicadeia. Este tipo de arquitetura foi recentemente descrito pela requerente no PCT/US2013/058005 (WO2014/039523).

[000143] A montagem das cadeias diferentes como parte de um CAR de multicadeia simples é tornada possível, por exemplo, pelo uso das cadeias alfa, beta e gama diferentes do receptor de alta afinidade para IgE (FcεRI) (Metzger, Alcaraz et al. 1986) ao qual são fundidos o domínio de sinalização e domínio coestimulatório. A cadeia gama compreende uma região de transmembrana e cauda citoplásmica contendo um motivo de ativação à base de imunorreceptor tirosina (ITAM) (Cambier 1995).

[000144] O CAR de multicadeia pode compreender vários domínios de ligação de ligante extracelular, para ligar simultaneamente elementos diferentes em alvo, aumentando, desse modo, a ativação e função da célula imune. Em uma concretização, os domínios de ligação de ligante extracelular podem ser colocados em tandem no mesmo polipeptídeo de transmembrana, e, opcionalmente, podem ser separados por um vinculador. Em outra concretização, referidos domínios de ligação de ligante extracelular diferentes podem ser colocados em polipeptídeos de transmembrana diferente que compõem o CAR de multicadeia. Em outra concretização, a presente invenção se relaciona a uma população de CARs de multicadeia compreendendo cada domínios de ligação de ligante extracelular diferentes. Em um particular, a presente invenção se relaciona a um método de projetar células imunes compreendendo proporcionar uma célula imune, e expressar na superfície de referida célula uma população de CAR de multicadeia, cada um compreendendo domínios de ligação de ligante extracelular diferentes. Em outra concretização preferida, a presente invenção se relaciona a um método de projetar uma célula imune compreendendo proporcionar uma célula imune, e introduzir na referida célula polinucleotídeos que codificam polipeptídeos que compõem uma população de CAR de multicadeia, cada um compreendendo domínios de ligação de ligante extracelular diferentes. Em uma concretização particular, o método de projetar uma célula imune compreende expressando na superfície da célula pelo menos uma parte de cadeia beta FcεRI e/ou cadeia gama fundidas a um domínio de transdução de sinal, e várias partes de cadeias alfa FcεRI fundidas a domínios de ligação de ligante extracelular diferentes. Em uma concretização mais particular, referido método compreende introduzir na referida célula pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma parte de cadeia beta FcεRI e/ou cadeia gama fundidas a um domínio de transdução de sinal e várias cadeias alfa FcεRI fundidas a domínios de ligação de ligante extracelular diferentes. Por população de CRAs de multicadeia, é significativo pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis ou mais CARs de multicadeia, cada um compreendendo domínios de ligação de ligante extracelular diferentes. Os domínios de ligação de ligante extracelular diferentes, de acordo com a presente invenção, podem, de preferência, ligar simultaneamente elementos diferentes no alvo, aumentando, desse modo, a ativação e função da célula.

[000145] A presente invenção também se relaciona a uma célula imune isolada que compreende uma população de CARS de multicadeia, cada um compreendendo domínios de ligação de ligante extracelular diferentes.

[000146] O domínio de transdução de sinal, ou domínio de sinalização intracelular do CAR de multicadeia da invenção é responsável pela sinalização intracelular após a ligação de domínio de ligação de ligante extracelular ao alvo resultante na ativação da célula imune e resposta imune. Em, outras palavras, o domínio de transdução de sinal é responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune em que o CAR de multicadeia é expresso. Por exemplo, a função efetora de uma célula T pode ser uma atividade citolítica ou atividade auxiliadora, incluindo a secreção de citocinas.

[000147] No presente pedido, o termo "domínio de transdução de sinal" se referee porção de uma proteína que transduz o sinal de função de sinal efetor e direciona a célula para realizar uma função especializada.

[000148] Exemplos preferidos de domínio de transdução de sinal para uso em CAR de cadeia simples ou de multicadeia podem ser a sequência citoplásmica do receptor Fc ou receptor de célula T, e correceptores que agem em concerto para iniciar transdução de sinal após o engajamento do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante destas sequências e qualquer sequência sintética que conforme a mesma capacidade funcional. O domínio de transdução de sinal compreende duas classes distintas de sequência de sinalização citoplásmica, aquelas que iniciam ativação primária dependente de antígeno, e aquelas que agem em uma maneira independente de antígeno para proporcionar um sinal secundário ou coestimulatório. A sequência de sinalização citoplásmica primária pode compreender motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação à base de imunorreceptor tirosina de ITAMs. ITAMs são bem motivos de sinalização definidos encontrados na cauda intracitoplásmica de uma variedade de receptores que servem como locais de ligação para tirosina quinases classe syk/zap70. Exemplos de ITAM usados na invenção podem incluir como exemplos não limitantes aqueles derivados de TCRzeta, FcRgama, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gama, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b e CD66d. Em uma concretização preferida, o domínio de sinalização de sinal do CAR de multicadeia pode compreender o domínio de sinalização de CD3zeta, ou o domínio intracitoplásmico das cadeias FcεRI beta ou gama.

[000149] Em concretização particular, o domínio de transdução de sinal do CAR de multicadeia da presente invenção compreende uma molécula de sinal coestimulatório. Uma molécula coestimulatória é uma molécula de superfície de célula outra do que um receptor de antígeno, ou seus ligantes que é requerido para uma resposta imune eficiente.

[000150] Os domínios de ligação de ligante podem ser qualquer receptor de antígeno previamente usado, e referido a, com relação a CAR de cadeia simples referido a na literatura, em particular, scFv de anticorpos monoclonais. CARs bi-específicos ou multiespecíficos conforme descritos em WO 2014/4011988 são incorporados por referência.

[000151] Similarmente conforme descrito antes com relação a CARs de cadeia simples, a presente invenção envolve células imunes dotadas com CARs de multicadeia que têm como alvo especificamente um marcador de superfície de célula, tal como CD38, CS1 ou CD70. De acordo com uma concretização preferida da invenção, os CARs descritos acima são expressos em células imunes, onde inativação dos genes endógenos que codificam referido marcador(es) de superfície é induzida por expressão de uma endonuclease de corte incomum.

Ativação e expansão de Células T

[000152] O método, de acordo com a invenção, geralmente inclui a etapa adicional de ativar e/ou expandir as células T. Isto pode ser feito antes de ou após modificação genética das células T, usando os métodos conforme descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20060121005. De acordo com estes métodos, as células T da invenção podem ser expandidas por contato com uma superfície tendo fixado a estas um agente que estimula um sinal associado de complexo de CD3 TCR e um ligante que estimula uma molécula coestimulatória na superfície das células T.

[000153] Em particular, as populações de célula T podem ser estimuladas in vitro, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou fragmento de ligação de antígeno deste, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície, ou por contato com um ativador de proteína cinase C (por exemplo, briostatina) em conjunto com um ionóforo de cálcio. Para coestimulação de uma molécula acessório na superfície das células T, um ligante que liga a molécula acessória é usado. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3, e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimulação de proliferação das células T. Para estimular proliferação de ou células T CD4+, ou células T CD8+, um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Por exemplo, os agentes que proporcionam tal sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Conforme aqueles técnicos no assunto podem prontamente apreciar, a proporção de partículas para células pode depender do tamanho da partícula relativo à célula alvo. Em concretizações adicionais da presente invenção, as células, tais como células T, são combinas com esferas revestidas de agente, as esferas e as células são subsequentemente separadas, e, em seguida, as células são cultivadas. Em uma concretização alternativa, antes da cultura, as esferas revestidas de agente de célula não são separadas, mas são cultivadas juntas. As proteínas de superfície de célula podem ser ligadas por permitir que esferas paramagnéticas as quais anti-CD3 e anti-CD28 sejam fixadas (esferas 3x28) para contatar as células T. Em uma concretização, as esferas de células (por exemplo, 4 a 10 células T) (por exemplo, esferas paramagnéticas de DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T a uma proporção de 1:1) são combinadas em um tampão, de preferência, PBS (com cátions divalentes tais como, cálcio e magnésio). Novamente, aqueles técnicos no assunto podem prontamente apreciar que qualquer concentração de célula pode ser usada. A mistura pode ser cultivada por várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor inteiro de hora em hora entre. Em outra concretização, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. As condições apropriadas para cultura de célula T incluem um meio apropriado (por exemplo, Minimal Essential Media ou RPMI Media 1640 ou, X-vivo 5, (Lonza)) que pode conter fatores necessários para proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, bovino fetal ou soro humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, e TNF- ou qualquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos aos técnicos no assunto. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não são limitados a, surfactante, plasmanato, e agentes de redução, tais como N-acetil-cisteína e 2-mercaptoetanol. O meio pode incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio, e vitaminas, ou livres de soro ou suplementados com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma), ou um conjunto definido de hormônios, e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e expansão de células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos somente em culturas experimentais, não em culturas de células que são para serem infundidas em um indivíduo. As células T alvos são mantidas sob condições necessárias para suporta crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37°C) e atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2). As células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem exibir características diferentes.

[000154] Em outra concretização preferida, referidas células podem ser expandidas por cocultivo com tecido ou células. Referidas células podem também serem expandidas in vivo, por exemplo, no sangue do indivíduo após administração de referida célula no indivíduo.

Aplicações terapêuticas

[000155] As células T obtidas por métodos diferentes descritos acima são pretendidas para serem usadas como medicamento para tratamento, entre outros, de câncer, infecções ou doenças imunes em um paciente em necessidade deste.

[000156] Referido tratamento pode ser melhorado, curativo ou profilático. Ele pode ser ou parte de uma imunoterapia autóloga, ou parte de um tratamento de imunoterapia alogênico. Por autólogo, é significativo que as células T, linha de célula, ou população de células usadas para tratamento de pacientes estão se originando de referido paciente, ou de um doador compatível de Antígeno de Leucócito Humano (HLA). Por alogenêico é significativo que as células ou população de células usadas para tratamento de pacientes não estão se originando de referido paciente, mas de um doador.

[000157] As células T projetadas de acordo com um dos métodos anteriores podem ser reunidas, congeladas, e administradas a um ou vários pacientes. Quando elas são produzidas não aloreativas, elas são disponíveis como um produto terapêutico "pronto para uso", que significa que elas podem ser universalmente infundidas em pacientes em necessidade destas.

[000158] Referido tratamento são principalmente pretendidos para pacientes diagnosticados com câncer, infecção viral, distúrbios autoimunes, ou Doença de Enxerto versus Hospedeiro (GvHD). Os cânceres são, de preferência, leucemias e linfomas, que têm tumores líquidos, mas pode também se referir a tumores sólidos. Tipos de cânceres a serem tratados com os CARs da invenção incluem, mas não são limitados a, carcinoma, blastoma, e sarcoma, e certa leucemia ou malignidades de linfóide, tumores benigno e maligno, e malignidades, por exemplo, sarcomas, carcinomas, e melanomas. Tumores/cânceres de adulto, e tumores/cânceres pediátricos, são também incluídos.

[000159] A presente invenção proporciona nas Tabelas 4 a 14 com exemplos de marcadores de antígeno, que podem ser direcionados com as células projetadas da invenção para tratamento de tipos diferentes de câncer.

[000160] Marcadores de antígeno preferidos usados para a imunoterapia da presente invenção são mais particularmente CD38, CD319 (CS1) e CD70.

[000161] As presentes células T, quando armadas com CARs específicos direcionados contra as próprias células imunes do paciente, especialmente células T, permitem a inibição ou regulação de referidas células, que é uma etapa chave para tratamento de doenças autoimunes, tais como poliartrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, escleroderma, fibromialgia, miosite, espondilite anquilosante, diabetes dependente de insulina de tipo I, tireoidite de Hashimoto, doença de Addison, doença de Crohn, doença de Celiac, esclerose lateral amiotrófica (ALS), e esclerose múltipla (MS). Consequentemente, a presente invenção envolve um método para tratamento de uma doença imune por direcionamento de células T projetadas conforme anteriormente descrito contra as células T do próprio paciente.

[000162] Os tratamentos acima podem ocorrer em combinação com uma ou mais terapias selecionadas a partir do grupo de terapia de anticorpos, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia de célula dendrítica, terapia de gene, terapia de hormônio, terapia de luz de laser, e terapia de radiação.

[000163] As células T projetadas conforme anteriormente descritas, quando elas são tornadas resistentes a fármacos de quimioterapia e fármacos imunossupressivos, que são usados como padrões de cuidado, especialmente metotrexato e a combinação de fludarabina e Ciclofosfamida, são particularmente adequadas para tratamento de várias formas de câncer. De fato, a presente invenção, de preferência, ocorre nas células ou população de células. Neste aspecto, é esperado que o tratamento de quimioterapia e/ou de imunossupressivo deve ajudar a seleção e expansão das células T projetadas in-vivo.

[000164] Em certas concretizações da presente invenção, células são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente, ou após) qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo, mas não limitadas a, tratamento com agentes, tais como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, Citarabina (também conhecida como ARA-C), ou tratamento com nataliziimab para pacientes com MS, ou tratamento com efaliztimab para pacientes com psoríase, ou outros tratamentos para pacientes com PML. Em concretizações adicionais, as células T da invenção podem ser usadas em combinação com quimioterapia, radiação, agentes imunossupressivos, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, e FK506, anticorpos, ou outros agentes imunoablativos, tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3, ou outras terapias de anticorpo, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteróides, FR901228, citocinas, e irradiação. Estes fármacos inibem ou a calcineurina fosfatase dependente de cálcio (ciclosporina e FK506), ou inibem a p70S6 cinase que é importante para sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). Em uma concretização adicional, as composições de célula da presente invenção são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente, ou após), transplante de medula óssea, terapia ablativa de célula T usando quaisquer agentes de quimioterapia tais como, fludarabina, terapia de radiação de feixe externo (XRT), ciclofosfamida, ou anticorpos, tais como OKT3 ou CAMPATH. Em outra concretização, as composições de célula da presente invenção são administradas após terapia ablativa de célula B, tais como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em uma concretização, os indivíduos podem suportar tratamento padrão com quimioterapia de alta dose seguida por transplante de célula tronco de sangue periférico. Em certas concretizações, após o transplante, os indivíduos receberam uma infusão das células imunes expandidas da presente invenção. Em uma concretização adicional, as células expandidas são administradas antes ou após a cirurgia. Referidas células modificadas obtidas por qualquer um dos métodos aqui descritos podem ser usadas em um aspecto particular da invenção para tratamento de pacientes em necessidade deste contra rejeição de Hospedeiro versus Enxerto (HvG) e Doença de Enxerto versus Hospedeiro (GvHD); portanto, no escopo da presente invenção, está um método de tratamento de pacientes em necessidade deste contra rejeição de Hospedeiro versus Enxerto (HvG), e Doença de Enxerto versus Hospedeiro (GvHD) compreendendo o tratamento do referido paciente por administração a referido paciente de uma quantidade efetiva de células modificadas compreendendo genes de TCR alfa inativados, e/ou genes TCR beta.

[000165] De acordo com uma concretização, referidas células T da invenção podem suportar expansão de célula T robusta in vivo após administração a um paciente, e podem persistirem nos fluidos corpóreos por uma quantidade prolongada de tempo, de preferência, por uma semana, mais de preferência, por 2 semanas, ainda mais de preferência, por pelo menos um mês. Embora as células T, de acordo com a invenção, sejam esperadas persistirem durante estes períodos, suas expectativas de vida no corpo do paciente são pretendidas não excederem um ano, de preferência, 6 meses, mais de preferência, 2 meses, e ainda mais de preferência, um mês.

[000166] A administração das células ou população de células, de acordo com a presente invenção, pode ser efetuada em qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação de aerosol, injeção, ingestão, transfusão, implante ou transplante. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente subcutaneamente, intradermalmente, intratumoralmente, intranodalmente, intramedular, intramuscularmente, por injeção intravenosa ou intralinfática, ou intraperitonealmente. Em uma concretização, as composições de célula da presente invenção são, de preferência, administradas por injeção intravenosa.

[000167] A administração das células ou população de células pode consistir da administração de 104-109 células por kg de peso corpóreo, de preferência, 105 a 106 células/kg de peso corpóreo incluindo todos os valores inteiros de números de célula dentro destas faixas. As células ou população de células podem ser administradas em uma ou mais doses. Em outra concretização, referida quantidade efetiva de células são administradas como uma dose única. Em outra concretização, referida quantidade efetiva de células são administradas como mais do que uma dose por um período de tempo. A regulação da administração está dentro do julgamento do médico gerenciador, e depende da condição clínica do paciente. As células ou população de células podem ser obtidas de qualquer fonte, tal como de um banco de sangue, ou de um doador. Enquanto que as necessidades individuais variam, a determinação de faixas ótimas de quantidades efetivas de um dado tipo de célula para uma doença particular ou condições dentro da técnica. Uma quantidade efetiva significa uma quantidade que proporciona um benefício terapêutico ou profilático. A dosagem administrada será dependente da idade, saúde e peso do recipiente, tipo de tratamento concorrente, se houver, frequência de tratamento, e da natureza do efeito desejado.

[000168] Em outra concretização, referida quantidade efetiva de células ou composição compreendendo aquelas células são administradas parenteralmente. Referida administração pode ser uma administração intravenosa. Referida administração pode ser diretamente feita por injeção no interior de um tumor.

[000169] Identificação de marcador de antígeno de superfície expresso na superfície de células T, enquanto que sendo sobre-expres- sas em tumores sólidos envolvidos em tipos diferentes de câncer (Tabelas 5 a 13).

[000170] Nós usamos dados de BioGPS microarray de um painel de dados de microarray de câncer de tecidos normais (Human U133A/GNF1H Gene Atlas) que também podem ser descarregados de dados de uniprot de BioGPS (Human Primary Tumors (U95)) que contêm a localização subcelular.

[000171] Observou-se a distribuição de valores provenientes de tecidos normais, e determinamos um valor limite de 5 para a expressão relativa.

[000172] Observou-se todos os genes ensaiados com microarranjos (44.000 sondas representando cerca de 13 000 genes), e verificamos sua localização na membrana (proteínas não referidas como sendo uma proteína de membrana foram descartadas). A expressão de células T de CD8+ foi verificada a partir da base de dados BioGPS. Os genes foram listados de acordo com o tipo de câncer onde a expressão correspondente foi a mais alta (Tabelas 5 a 13).

[000173] Identificação de marcador de antígeno de superfície expresso na superfície de células T, enquanto que sendo sobre expressas em tumores de sangue líquidos diferentes (Tabela 14)

[000174] Para este estudo, nenhum dado de RNA-seq foi disponível e, desse modo, nós usamos dados de microarranjo que foram obtidos de um grande estudo a partir do consórcio MILE (Microarray Innovations in Leukemia), envolvendo 11 laboratórios (http://www.ngrl.org.uk/ wessex/downloads/tm08/TM08-S4-1 KenMills.pdf-Haferlach et al. 2010, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20406941). Estes dados brutos incluem resultados para ALL (leucemia linfoblástica aguda), AML (leucemia mielógena aguda), CLL (leucemia linfoblástica crônica) e CML (leucemia mielógena crônica), e MDS (síndrome mielodisplástica). Nós também usamos dados uniprot para localização subcelular conforme usual.

[000175] Nós primeiro projetamos a distribuição total de valores de todos os genes em todos os tecidos estudados. Em seguida, temos uma ideia do nível necessário para expressão, nós tomamos uma lista de genes que são expressos em alguns tumores líquidos e para qual anticorpos terapêuticos são disponíveis (CD52, CD 20, CD33, CD19, CD25, CD44, CD47, CD96, CD116, CD117, CD135, TIM-3). Para cada gene, observou-se o valor obtido no tumor no qual ele é expresso. Em seguida, nós computamos a média para cada tumor e par de genes para qual o gene parece dar uma proteína de membrana de célula (localização + descrição da membrana de célula de pelo menos um domínio de transmembrana na proteína). Nós descartamos os genes para qual a expressão em todos os tecidos foi abaixo deste limite de 0,15. Nós listamos e classificamos na Tabela 14 aqueles genes que expressam relativos em células T foi acima de 0,2. Desse modo, a Tabela 4 proporciona candidatos de marcador de antígeno putativos para direcionamento de células de tumor líquido como por a invenção, em particular, para tratamento de ALL, AML, CLL, CML e MDS. Exemplo de etapas para projetar células T de acordo com a invenção para imunoterapia

[000176] Para uma melhor compreensão da invenção, é provido abaixo um exemplo das etapas para produzir células T direcionadas contra células positivas CD38 de leucemia:

[000177] Provisão de células T de uma cultura de célula ou de uma amostra de sangue de um paciente individual ou de banco de sangue, e ativação de referidas células T usando esferas ativadoras anti- CD3/C28 (Dynabeads®). As esferas proporcionam ambos os sinais primários e coestimulatórios que são requeridos para ativação e expansão de células T.

[000178] Transdução de referidas células com um vetor retroviral compreendendo um transgene que codifica um receptor de antígeno quimérico consistindo da fusão de domínio de ativação CD3zeta, domínio de coestimulação 4-1BB, um domínio de transmembrana e uma articulação de CD28 fundida a uma sequência que codifica a cadeia variável de um anticorpo anti-CD38. Para aperfeiçoamento da segurança das célula T transformadas, um gene suicida sensível a rituximab pode adicionalmente ser introduzido conforme descrito em WO 2013/153391 no vetor lentiviral separado por sequências de divisão de T2A.

[000179] (Opcionalmente) Engenharia não aloreativa e/ou células T resistentes: a) É possível Inativar TCR alfa nas referidos células para eliminar o TCR a partir da superfície da célula, e impedir reconhecimento de tecido de hospedeiro como estranho por TCR de alogênico e, desse modo, evitar GvHD por seguir os protocolos colocados em WO 2013/176915. b) É também possível inativar um gene que codifica alvo para um agente imunossupressivo ou um fármaco de quimioterapia para tornar referidas células resistentes a tratamento imunossupressivo ou de quimioterapia para impedir rejeição de enxerto sem afetar células T transportadas. Neste exemplo, o alvo de agentes imunossupressivos é CD52, e o agente imunossupressivo é um anticorpo humanizado monoclonal anti-CD52 (ex: Alemtuzumab), conforme descrito em WO 2013/176915.

[000180] Inativação de Gene é realizada por eletoporação de células T com mRNA que codifica TAL-endonuclease específica (TALENTM - Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, France). As células T inativadas são classificadas usando esferas magnéticas. Por exemplo, as células T que ainda expressam o gene alvo (por exemplo, CD38, CD70 e CD70), podem ser removidas por fixação em uma superfície sólida, e células inativadas não são expostas ao estresse de serem passadas através de uma coluna. Este método brando aumenta a concentração de células T corretamente projetadas.

[000181] Expansão in vitro de células T projetadas antes da administração a um paciente ou in vivo após administração a um paciente através de estimulação de complexo de CD3. Antes da etapa de administração, os pacientes podem ser submetidos a um tratamento imunossupressivo, tal como CAMPATH1-H, um anticorpo monoclonal humanizado anti-CD52.

[000182] Opcionalmente expõe referidas células com anticorpos bi específicos ex vivo antes da administração a um paciente ou in vivo após administração a um paciente para trazer as células projetadas em proximidade a um antígeno alvo.

[000183] Análise funcional das células T projetadas eletroporadas com um mRNA monocistrônico que codifica para um receptor de antígeno quimérico de cadeia simples anti-CD38 (CD38 de CAR):

[000184] Para verificar que a engenharia de genoma não afeta a capacidade das células T projetadas apresentarem atividade antitumor, especialmente quando providas com um receptor de antígeno quimérico (CAR CD38), as células T projetadas foram incubadas por 4 horas com células Daudi que expressam CD38 na sua superfície. A regulação ascendente da superfície de célula de CD107a, uma marcador de liberação de grânulo citotóxico por linfócitos T (denominado degranulação) foi medida por análise de citometria de fluxo (Betts, Brenchley et al. 2003).

[000185] 24 horas pós eletroporação, as células foram manchadas com um corante de viabilidade fixável eFluor-780 e um fragmento IgG F(ab’)2 de antiratinho de cabra conjugado a PE específico para avaliar a expressão da superfície da célula do CAR nas células do fígado. A vasta maioria das células T do fígado geneticamente rompidas para CD38 expressa o CAR em sua superfície. As células T foram cocultivadas com células Daudi (CD38+) por 6 horas e analisadas por citometria de fluxo para detectar a expressão do marcador de degranulação CD107a em sua superfície (Betts, Brenchley et al. 2003).

[000186] Os resultados mostram que células T rompidas por CD38 T mantêm a mesma capacidade de degranular em resposta a PMA/ionomicina (controle positivo) ou células de CD38+ Daudi. A regulação ascendente de CD107 é dependente da presença de uma CD38+. Estes dados sugerem que a engenharia de genoma das presentes células T não tem impacto negativo na capacidade de células T montarem uma resposta antitumor controlada. Tabela 4: Grupo de diferenciação (CD) marcadores de antígeno de

Tabela 5: marcadores de antígeno expressos na superfície de ambas células de tumor do cólon e células T

Tabela 6: marcadores de an tígeno expressos na superfície de ambas

Tabela 7: marcadores d e antígeno expressos na superfície de ambas

Tabela 8: marcadores de antígeno expressos na superfície de ambas células de tumor do rim e células T

Tabela 9: marcadores de antígeno expressos na superfície de ambas células de tumor do fígado e células T

Tabela 10: marcadores de antígeno expressos na superfície de ambas células de tumor de pulmão e células T

Tabela 11: marcadores de antígeno expressos na superfície de ambas células de tumor de ovário e células T;

Tabela 12: marcadores de antígeno expressos na superfície de ambas células de tumor de pâncreas e células T

Tabela 13: marcadores de an tígeno expressos na superfície de ambas células de tumor de próstata e células T

Tabela 14: marcadores de antígeno expressos na superfície de células T e sobre-expressos em células de tumor líquidas (ALL, AML, CML, MDS, CLL, CTRL)

Exemplo 1 - KNOCK OUT (KO) EM GENE DE CD38 & EXPRESSÃO DE CAR ANTI-CD38 Apresentação do CD38 alvo-ADP ribose hidrolase cíclica

[000187] CD38 é uma glicoproteína encontrada na superfície de muitas células, incluindo células de mieloma múltiplo (MM) que expressam um altro nível de CD38 em uma grande maioria de pacientes. A CD38 é um alvo validado para MM a medida que muitos estudos têm mostrado morte eficiente de células de MM de CD38+ de pacientes, e linhas de célula de MM de CD38+ usando anti-CD38 mAbs por CDC e ADCC (Ellis, J. H. K. et al, Journal of Immunology, 1995, 155 (2), 925-937). Daratumumab é um anticorpo monoclonal de CD38 humano terapêutico que induz morte de mieloma múltiplo e outros tumores hematológicos (De Weers, M. et al, J Immunol 2011 186:18401848). Em alguns estudos, tem sido mostrado que CD38 é também altamente expresso por células T ativadas (Sandoval-Montes CJ et a:, 2005, Leukoc Biol. 77(4):513-21).

Expressão de CD38 por Células T

[000188] A expressão de CD38 por células T após esferas de CD3/CD28 e estimulação de IL-2 foi analisada por FACS todo 3-4 dias durante 17 dias. Foi observado que mais do que 90% de células T expressam entre o dia 6 e o dia 17 após ativação (Figura 10B).

[000189] Desse modo, de modo a evitar morte de células T ativadas por expressão de superfície de células T anti-CD38 CAR+ CD38 em células T necessita ser impedida. Isto pode ser efetuado pela inativação do gene de CD38 usando TALE-nucleases. TALEN é uma marca cedida pela requerente (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 PARIS) designando formato personalizado de TAL nucleases.

Estratégia para o knock-out de CD38 (KO)

[000190] TALE-nuclease heterodimérico que direciona duas sequências de 17-pb de comprimento separadas por um espaçador de 13-pb dentro do gene de CD38 foram designados e produzidos. Cada meio alvo é reconhecido pelas repetições do meio TALE-nucleases listadas na seguinte Tabela 15 e Figura 10A.

[000191] As sequências de repetição do TALEN esquerdo para o CD38ex1_T2 alvo foi NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-NN-NG-NG-NN-NN- HD-NN-NI-NG, e as sequências de repetição para o TALEN direito foi NN-NG-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NI-NN-NG-NN-HD-HD-HD-NG. Tabela 15: Sequências do CD38 alvo testado e TALENs para inativação do antígeno de CD38.

[000192] Cada constru to de TALE-nuclease foi subclonado usando digestão de enzima de restrição em um vetor de expressão de mamífero sob o controle do promotor T7. O mRNA que codifica TALE-nuclease que cliva CD38 foi sintetizado de plasmídeos que transportam a sequência de codificação à jusante do promotor T7.

[000193] As células T purificadas ativadas durante 72 horas com esferas revestidas com anti CD3/CD28 e IL-2 recombinante foram transfectadas por eletroporação (Citopulso) com cada dos 2 mRNAs (10μg cada) que codificam ambos meio CD38ex1_T2 TALE-nucleases. Para investigar o KO CD38, a percentagem de células T negativas de CD38 foi avaliada por citometria de fluxo no dia 3, 6, 10 e 13 após transfecção de TALEN mRNA. Foi observado que 15% de células T transfectadas foram deficientes de CD38 (Figura 10 C), e esta deficiência foi estável durante 13 dias após transfecção.

[000194] Em adição, duas TALE-nucleases alternativas que direcionam o gene de CD38 foram designadas. Cada meio alvo é reconhecido por repetições do das meias TALE-nucleases listadas na seguinte Tabela 16 e Figura 10A. As sequências de repetição do TALEN esquerdo para o CD38ex1_T4 alvo foi NG-NN-HD-NN-NI-NN-NG-NG- HD-NI-NN-HD-HD-HD-NN-NN-NG, e as sequências de repetição para o TALEN direito foram NG-NN-HD-NG-NN-HD-HD-NN-NN-HD-NG-HD- NG-HD-NG-NI. As sequências de repetição do TALEN esquerdo para o CD38ex1_T5 alvo foram NG-NN-NI-NG-HD-HD-NG-HD-NN-NG-HD- NN-NG-NN-NN-NG, e as sequências de repetição para o TALEN direito foram HD-NN-NI-NN-NN-NG-NN-NN-HD-NN-HD-HD-NI-NN-HD-NI. Tabela 16: Sequências de dois outros CD38 alvos e os correspondentes TALENs para sua inativação

Estratégia para a expressão do CAR anti-CD38 Estrutura e composição de CARs anti-CD38

[000195] Na Tabela 17 são apresentadas cadeias de VH e VL de scFv anti-CD38. SEQ ID NO:10-11 corresponde ao anticorpo humanizado anti-CD38 daratumumab (Genmab), e SEQ ID NO: 12-13 ao MOR202 (ou MOR03087), tal como descrito na Patente dos Estados Unidos 8.263.746B.

[000196] SEQ ID NO:14-20 e SEQ ID NO:21-26 correspondem à sequência de CDR para respectivamente a cadeia de VH (HCDR) e a cadeia de VL (LCDR), tal como descrito no pedido WO 2008/047242. Tabela 17: Sequências de cadeias de VH e VL dos anticorpos scFv anti- CD38 daratumumab, MOR202, e de CDRs específicas para cadeias de VH e VL.

[000197] Para os construtos de 3 CARS de daratumumbab scFv diferentes (GMB005-V1&V2&V3) foram designados tais como apresentados na Figura 11A e sua sequência descrita na seguinte Tabela 18. Todos os três construtos compartilham os mesmos componentes, em termos de peptídeo de sinal (CD8a), vinculador GS (entre as cadeias de scFv VH e VL), domínio de transmembrana (TM), domínio coestimulatório 4-1BB, e CD3Z; domínio de ativação (sequências descritas na seguinte Tabela 18). Suas diferenças vêm a partir da escolha da articulação (Tabela 18): VI: articulação FcRlla V2: articulação CD8a V3: articulação IgGl Tabela 18: Sequência de polipeptídeo das 3 estruturas diferentes de CARs anti-CD38 à base de scFv daratumumab e dos componentes individuais usados.

[000198] CD38 TALENs serão transfectados no dia 4 após ativação. 3 dias após as células deficientes de CD38 serem classificados por seleção negativa e transfectadas 3 dias após com anti-CD38 CAR mRNAs. As moléculas de CAR geradas serão, em seguida, classificadas para expressão e atividade de degranulação em direção a expressão de CD38 de linhas de célula alvos após transfecção de mRNA transiente de CAR. As linhas de célula alvo que expressam níveis de expressão diferentes de CD38 (Figura 11B) serão usadas pata teste de atividade: - U266 CD38+ e U266 CD38- obtidas por separação magnética usando microesferas anti-CD38. - L363, uma linha de célula de mieloma múltiplo que expressa níveis intermediários de CD38. - Daudi, uma linha de célula derivada de linfoma de Burkitt que expressa altos níveis de CD38. - K562, uma linha de célula CD38 linha de célula negativa derivada de leucemia mielógena crônica.

[000199] Esta primeira classificação será seguida por uma segunda etapa de classificação em que um número de candidatos selecionados será testado por sua capacidade de induzir degranulação, liberação de IFNY, e atividade citotóxica específica em direção às linhas de célula alvos selecionadas. A seleção do candidato será, em seguida, estreitada, e alguns candidatos selecionados para produção de vetor lentivirus, e atividade de CAR será avaliada em células T CD38 KO que expressam estavelmente os CARs. EXEMPLO 2 ATIVIDADE DE CAR ANTI-CS1 NO CONTEXTO DE CS1 KO Apresentação de CS1 alvo

[000200] O mieloma múltiplo (MM) é uma malignidade de célula B caracterizada pela expansão clonal aberrante de células de plasma (PCs) dentro da medula óssea, com uma estimativa de 21.700 novos casos, e 10.710 mortes de MM identificadas nos Estados Unidos em 2012 (Siegel R, et al. Cancer J Clin 2012 62:10-29). Em 2013, foi estimado que 22.350 indivíduos serão recentemente diagnosticados com MM nos Estados Unidos, e 10.710 pessoas morrerão do mesmo, montando em 20% das mortes de todas as malignidades hematológicas. Apesar do uso de inibidores de proteasome e fármacos de imuno-modulação, que tem sobrevivência total aperfeiçoada (Palumbo A, et al. Leukemia 2009 23:449-456), o MM permanece uma malignidade incurável (Podar K, et al. Leukemia 2009 23:10-24) para qual novas abordagens terapêuticas são urgentemente necessárias.

[000201] A glicoproteína de superfície de célula CS1 (também referida na literatura como SLAMF7, CD319 ou CRACC - Sequência de Referência NCBI: NP_067004.3) é altamente e ubiquamente expressa na superfície de células de mieloma (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). A CS1 é expressa em níveis muito baixos na maioria de células efetuadoras imunes, incluindo células assassinas naturais (NK), alguns subconjuntos de células T, e células B normais, e é quase indetectável em células mieloide (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84). Notavelmente, a CS1 é insignificantemente expressa em células tronco hematopoiética humana (Hsi ED, et al. Clin Cancer Res 2008 14:2775-84), que podem ser usadas para transplante de célula tronco para tratar malignidades hematológicas, incluindo MM. As funções da CS1 em MM permanecem incompletamente compreendidas, e foi documentado que a CS1 pode desempenhar um papel na adesão de célula de mieloma, crescimento clonogênico, e tumorigenicidade (Benson DM Jr, et al. J Clin Oncol 2012 30:2013-5; Tai YT, et al. Blood 2009 113:4309-18). Estrutura do CAR anti-CS1

[000202] As mesmas estruturas V1, V2 e V3 são designadas tal como no Exemplo 1 para a cadeia simples CAR de antígeno de anti-CD38, com os mesmos componentes em termos de articulação, domínio de transmembrana, domínios de coativação e de transdução (tal como representado na Figura 11A, e sequências mostradas na Tabela 18).

[000203] Na Tabela 19 são apresentadas as cadeias de VH e VL de scFv anti-CS1. SEQ ID NO:38-40-42-44-46 e SEQ ID NO:39-41-43-45- 47 correspondem a respectivamente a cadeia de VH e a cadeia de VL da murina scFv Luc63, Luc90, Luc34, LucX1 e LucX2.

[000204] Na Tabela 20 são apresentados CARs anti-CS1 com o scFv acima; estes CARs sendo baseados nas versões V1, V2 e V3 da Figura 11A, no qual respectivamente a articulação de FCERY curta, a articulação de CD8α média, e a articulação de IgG1 longa, são usadas. As partes sublinhadas correspondem às cadeias de scFv VH e VL ligadas por um vinculador. Tabela 19: Sequências de cadeias de VH e VL dos anticorpos scFv anti- CS1

Tabela 20: Sequência de polipeptídeo de CARs anti-CS1 baseada nas versões V1, V2 e V3 na Figura 11a

Estratégia para engenharia de CAR CS1+ e KO CS1

[000205] O CS1 é expresso em altos níveis em células plasmacitoide de pacientes com Mieloma Múltiplo, tornando este um alvo interessante para desenvolvimento de CAR. As células T, especialmente o subconjunto CD8, expressam baixos níveis de CS1, que é um problema para desenvolvimento de CAR célula-T, visto que eles podem ser mortos quando se expressa um anti-CS1 CAR.

[000206] Neste exemplo, nós avaliamos a atividade do Luc90-v2 CAR (sequência mostrada na Tabela 20) em células T humanas que foram, ou mock transfectadas, ou transfectadas com um TALEN que direciona o gene CS1 (SLAMF7), para ver se a atividade de CAR foi intensificada quando o gene CS1 foi rompido nas células T CAR+. O curso do experimento é mostrado na Figura 12.

[000207] As células T foram purificadas de amostras buffy-coat e ativadas usando esferas revestidas com CD3/CD28. As células foram cotransfectadas 72 horas após ativação com 10 μg de mRNA que codifica o T01_ esquerdo TAL e 10 μg do mRNA que codifica o T01_ direitot TAL. As sequências dos TALs são mostradas na seguinte Tabela 21 e os construtos de plasmídeo (T01, T02 e T03) com as repetições TAL mostrados na Figura 13.

[000208] A Figura 14 mostra a localização alvo para os TALs T01, T02 e T03 dentro do gene CS1 (SLAMF7): T01 e T02 direcionam o exon 1 (Figura 14A), onde T03 direciona o exon 2 (Figura 14B). Tabela 21: Sequências do CS1 alvo e TALENs para sua inativação

[000209] 3 dias após transfecção de TALEn, as células foram transduzidas com um vetor lentiviral recombinante que aciona expressão do L90-v2 CAR fora de um promotor EF1a. O vetor lentiviral é construído em um modo que a expressão CAR é acoplada com expressão de BFP (Blue Fluorescent Protein) através de um peptídeo de salto ribossomal. O L90-v2 CAR é constituído por um domínio de ligação extracelular que reconhece o CS1 alvo (scFv L90), seguido pela articulação e regiões de transmembrana derivadas a partir da proteína hCD8α. A porção intracelular da molécula contém um domínio coestimulatório derivado de 41BB, seguido pelo domínio de sinalização de CD3Y (sequências descritas na Tabela 18-19-20 anterior para componentes individuais, sequências scFv e CAR respectivamente).

[000210] A eficiência de transdução foi avaliada 6 dias após transdução por citometria de fluxo, pela seguinte expressão de BFP. As células foram também manchadas com anticorpos anti-CD8 e anti-CS1.

Resultados Expressão de CAR CS1 +

[000211] Os resultados da Figura 16 mostram que as eficiências de transdução são mais altas em células transfectadas mock do que em células que foram transfectadas com TALEn que direciona o gene CS1. Isto é provavelmente devido a morte de célula específica de CS1 não transduzido que expressa células T, enquanto que esta população não é afetada quando as células não mais expressam CS1 como uma consequência de rompimento de gene acionado por TALEN.

[000212] Nenhuma diferença significante nos níveis de CS1 é observada neste ponto de tempo entre TALEN ou células transfectadas mock (controle negativo- transfecção sem plasmídeo), visto que os níveis de CS1 diminuem com o tempo após ativação inicial de células T. Por outro lado, uma diminuição significante na % de células CD8+ é observada em CAR transfectado mock que expressa células comparadas a células CAR+ transfectadas TALEN, indicando que uma alta proporção de células CD8+ foi eliminada pelas células T CAR+.

Avaliação da atividade citotóxica

[000213] A atividade citotóxica destas células foi avaliada 8 dias após transdução de CAR, por cocultura da mesma quantidade de células T, ou com uma linha de célula que expressa CS1 (células L363), ou uma linha de célula de controle negativo que carece de expressão de CS1 (MOLM13). A viabilidade das linhas de célula alvos foi medida por citometria de fluxo 4 horas após início de coculturas de célula. Os resultados mostrados na Figura 15A mostram viabilidade de célula reduzida de células CS1(+) quando elas foram cocultivadas com células T CAR+, enquanto que nenhum impacto na viabilidade de célula CS1(- ) foi observado. A lise celular específica foi calculada usando os dados de citometria de fluxo, e ela foi 2 vezes mais alta do que células T que foram transfectadas com TALEn que direciona o gene CS1 antes da transdução de CAR (Figura 15B). Deve ser considerado que o impacto pode ser ainda mais alto, visto que a quantidade de células T CAR+ presente nas coculturas é mais alta quando as células foram mock transfectadas (ver dados de citometria de fluxo da Figura 16). Os resultados a partir do experimento são os seguintes: - para a amostra Mock/NTD, a % de células BFP+ é 0,1%, e a quantidade de células CD8+ é 53,9%; - para a amostra TALEn/NTD, a % de células BFP+ é 0,2%, e a quantidade de células CD8+ é 49,5%; - para a amostra Mock/L90-2, a % de células BFP+ é 94%, e a quantidade de células CD8+ é 1,8%; - para a amostra TALEn/L90-2, a % de células BFP+ é 61%, e a quantidade de células CD8+ é 8,3%.

[000214] As eficiências de transdução são mais altas em células transfectadas mock do que em células que foram transfectadas com TALEn que direciona o gene CS1 (NTD: não transduzido).

Reativação após transdução

[000215] De modo a confirmar que o gene CS1 foi rompido nas células T transfectadas de TALEn, as amostras diferentes foram reativadas com esferas de CD3/CD28 a D11 após transdução. 72 horas após reativação, as células foram manchadas com anticorpos anti-CD8 e anti- CS1, e a expressão analisada por citometria de fluxo.

[000216] A Figura 17 mostra as eficiências de transdução e níveis de expressão de CD8/CS1 em cada amostra. Conforme mostrado no painel inferior, um aumento nos níveis de CS1 após reativação é observado em células transfectadas mock, enquanto que uma baixa quantidade de células são capazes de expressar CS1 nas populações transfectadas de TALEn.

[000217] Os resultados a partir do experimento são os seguintes: - para a amostra de Mock/NTD, a % de células BFP+ é 0,01%, CS1 é expresso em 65,2% de células, e a quantidade de células CD8+ é 80,7%; - para a amostra de TALEn/NTD, a % de células BFP+ é 0,2%, o CS1 é expresso em 9,7% de células, e a quantidade de células CD8+ é 78,8%; - para a amostra de Mock /L90-2e, a % de células BFP+ é 94%, o CS1 é expresso em 37,5% de células, e a quantidade de células CD8+ é 16%. - para a amostra de TALEn /L90-2, a intensidade de BFP é 61%, a expressão de CS1 é 8,5%, e a expressão de CD8 é 68,5%.

[000218] Um aumento nos níveis de CS1 após reativação é observado em células transfectadas mock, enquanto que uma baixa quantidade de células são capazes de expressar CS1 nas populações transfectadas de TALEn.

[000219] Embora estes resultados indiquem que o gene CS1 é rompido em células T transfectadas TALEn, e que isto intensifica a atividade citotóxica de células anti-CS1 CAR+, principalmente pela preservação das células T citotóxicas. Exemplo 3: CD70 ALVO Apresentação de CD70 alvo

[000220] O CD70 é uma citocina que se liga a CD27, e é parte da família TNF (Goodwin R.G. et al, 1993, Cell 73:447-456). Esta proteína tem um papel nas respostas de célula T adaptivas, induz a proliferação de células T coestimuladas e intensificam a geração de células T citolíticas. Seu número de acesso é P32970 (Uniprot). Alguns estudos, tais como em Schürch, C. et al. (J. Clin. Invest., 2012; doi:10.1172/JCI45977) sugerem que bloqueio das interações de CD27CD70 pode ajudar a tratar leucemia mielógena crônica (CML). Estratégia para CD70 KO

[000221] A mesma estratégia para o KO de gene CD70 será realizada, tal como no Exemplo 1 e Exemplo 2. O direcionamento de TALE- nuclease heterodimérico de duas sequências de 49-pb de comprimento separadas por um espaçador de 15pb dentro do gene CD70 e um direcionamento de TALE-nuclease de uma sequência de 57-pb de comprimento separada por um espaçador de 23pb, foram designadas e produzidas. Cada meio alvo é reconhecido por repetições das meias TALE-nucleases listadas na seguinte Tabela 22. Tabela 22: Sequências do CD70 alvo e TALENs para sua inativação

Estratégia para a expressão de CAR anti-CD70

[000222] A mesma estratégia para expressão de um CAR anti-CD70 será realizada, tal como no Exemplo 1 e no Exemplo 2.

[000223] As mesmas estruturas V1, V2 e V3 são designadas, tal como no Exemplo 1-2 com os mesmos componentes em termos de peptídeo de sinal, vinculador entre as cadeias de VH e VL, domínio de transmembrana, domínios de coativação e transdução (arquiteturas gerais mostradas na Figura 11A, e sequências para componentes individuais mostrados na Tabela 18). Somente a articulação difere entre as 3 versões V1, V2 e V3, no qual respectivamente a articulação de FcERY curta, a articulação de CD8α média, e a articulação de IgG1 longa, são usadas.

[000224] Na Tabela 23 são apresentadas uma cadeia de VH e VL de scFv anti-CD70. SEQ ID NO:81-82, 85-86, 89-90 e SEQ ID NO:83- 84,87-88,91-92 correspondem a respectivamente a cadeia de VH e a cadeia de VL do scFv Ab4, Ab8, de AMGEN e 1F6, de Seattle Genetics.

[000225] Na Tabela 24 são apresentados os CARs anti-CD70 com o scFv acima; estes CARs sendo baseados nas versões V1, V2 e V3, de acordo com a Figura 11A, no qual respectivamente uma articulação de FcEY curta, uma articulação de CD8 média, e uma articulação de IgG1 longa, são usadas. Tabela 23: Polinucleotídeo e sequências de ácido nucleico de cadeias de VH e VL para os anticorpos scFv anti-CD70 Ab4, Ab8 e 1F6

Tabela 24: Sequências de polipeptídeo de CARs anti-CD70 baseadas nas versões V1, V2 e V3 de acordo com a Figura 11A

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Claims

1. Método ex vivo para preparação de células T para imunoterapia contra células patológicas, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: (a) Inativar geneticamente um gene em uma célula T, que é envolvido na expressão ou apresentação de um marcador de antígeno, o referido marcador de antígeno estando presente em ambas a superfície da referida célula T e da célula patológica; (b) Expressar na referida célula T um transgene que codifica um receptor de antígeno quimérico direcionado contra o referido marcador de antígeno presente na superfície da referida célula patológica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido marcador de antígeno é selecionado do grupo consistindo em: CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16a, CD16b, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD31, CD33, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD52, CD53, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD63, CD68, CD69, CD70, CD74, CD79a, CD79b, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD86, CD87, CD90, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD103, CD107a, CD107b, CD109, CD123, CD146, CD154, CD158a, CD158b, CD163, CD164, CD168, CD171, CD177, CD178, CD180, CD182, CD185, CD191, CD193, CD196, CD197, CD200, CD209, CD227, CD231, CD246, CD254, CD263, CD272, CD273, CD276, CD277, CD279, CD298, CD300a, CD300c, CD304, CD305, CD314, CD317 e CD319.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido marcador de antígeno é CD38, CD70 ou CD319 (CS1).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a Etapa (a) é realizada usando uma endonuclease de corte incomum.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida endonuclease é expressa por RNAm transfectado.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que inclui uma etapa adicional de inativar um gene que codifica um componente do receptor de célula T (TCR).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que inclui uma etapa adicional de inativar um gene que codifica um componente de HLA, um gene que codifica β2m, um gene que codifica uma proteína de ponto de controle imune selecionada dentre CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2 e GUCY1B3, ou um gene que confere sensibilidade das células imunes a quimioterapia ou fármacos imunossupressores.

8. Uso de células T engenheiradas, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente diagnosticado para a presença de células patológicas apresentando marcadores de antígeno específicos em comum com células imunes, sendo que as referidas células T engenheiradas são obteníveis pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo que um gene envolvido na expressão ou apresentação de um marcador de antígeno, que está presente tanto na superfície da referida célula T quanto em uma célula patológica, é geneticamente inativado, resultando assim na ausência do referido marcador de antígeno na superfície da referida célula T; e sendo que a referida célula T expressa ainda um receptor de antígeno quimérico dirigido contra o referido marcador de antígeno presente na superfície da referida célula patológica.

9. Uso de células T engenheiradas, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer, uma doença imune ou uma infecção em um paciente em necessidade do mesmo, sendo que as referidas células T engenheiradas são obteníveis pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo que um gene envolvido na expressão ou apresentação de um marcador de antígeno, que está presente tanto na superfície da referida célula T quanto em uma célula patológica, é geneticamente inativado, resultando assim na ausência do referido marcador de antígeno na superfície da referida célula T; e sendo que a referida célula T expressa ainda um receptor de antígeno quimérico dirigido contra o referido marcador de antígeno presente na superfície da referida célula patológica.

10. Uso de células T engenheiradas, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para o tratamento de linfoma ou leucemia, sendo que as referidas células T engenheiradas são obteníveis pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo que um gene envolvido na expressão ou apresentação de um marcador de antígeno, que está presente tanto na superfície da referida célula T quanto em uma célula patológica, é geneticamente inativado, resultando assim na ausência do referido marcador de antígeno na superfície da referida célula T; e sendo que a referida célula T expressa ainda um receptor de antígeno quimérico dirigido contra o referido marcador de antígeno presente na superfície da referida célula patológica.

11. Uso de células T engenheiradas, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de leucemia linfocítica crônica (CLL), sendo que as referidas células T engenheiradas são obteníveis pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, sendo que um gene envolvido na expressão ou apresentação de um marcador de antígeno, que está presente tanto na superfície da referida célula T quanto em uma célula patológica, é geneticamente inativado, resultando assim na ausência do referido marcador de antígeno na superfície da referida célula T; e sendo que a referida célula T expressa ainda um receptor de antígeno quimérico dirigido contra o referido marcador de antígeno presente na superfície da referida célula patológica.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que as referidas células T apresentam o fenótipo [CAR CD38]+[CD38]-.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que as referidas células T apresentam o fenótipo [CAR CD70]+[CD70]-.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que as referidas células T apresentam o fenótipo [CAR CS1]+[CS1]-.