JP2022533412A - 免疫療法を強化するためのブリオスタチン化合物 - Google Patents

免疫療法を強化するためのブリオスタチン化合物 Download PDF

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Abstract

本明細書では、関心対象の標的細胞における抗原の発現、移行、および／または細胞表面提示を選択的に強化して該標的細胞の免疫原性を調節するためのブリオスタチン剤の使用を提供する。方法の局面は、有効量のブリオスタチン剤を対象に投与して標的細胞の免疫原性を調節することを含む。本方法は、対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与すること、および該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与することを含む、がんを治療する方法を含む。本方法の局面は、対象の免疫系による排除に対し標的細胞を増感させるためのブリオスタチン剤の使用も含む。TIFF2022533412000057.tif103128

Description

関連出願の相互参照
本願は、2019年5月21日に出願された米国特許仮出願第62/850,905号の恩典を主張するものであり、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
連邦政府による研究助成金に関する記述
本発明は、契約番号CA031845およびAI124743として国立衛生研究所から授与された、米国政府による助成を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
序論
ブリオスタチン1は、臨床医学において、HIV/AIDS、アルツハイマー病（AD）、およびがんを含む様々な疾患、障害、および状態の治療用に進歩している。ブリオスタチンは、海洋生物フサコケムシ（Bugula neritina）から単離することができ（たとえば収率0.00014%）、生合成により少量を生産することができる。臨床開発のために十分な材料へのアクセスを提供することができる、様々な天然ブリオスタチン化合物およびブリオスタチン類似体の化学合成法が、Wender et al.によって記述されている（たとえばWO 2018067382（特許文献1）を参照）。
白血病およびリンパ腫は治療が困難ながんであり、5年生存率はおよそ60%であり、がん関連死のおよそ10%を占める。開発途中の関心対象の新治療法としては、キメラ抗原受容体-T細胞療法（CAR-T細胞療法）および様々な標的指向療法、たとえば抗体ベースの療法が挙げられる。CAR-T細胞療法には、患者本人の培養T細胞を利用する方法、養子細胞移入（ACT）の使用が含まれる。CAR-T細胞療法では、患者からT細胞が取り出され、既知のがん（たとえば腫瘍）に特異的な抗原に対しCARを発現するよう遺伝子改変されるか、またはT細胞はCARをインサイチューで発現するよう遺伝子改変されることもある。あるいは健常ドナーからT細胞が提供され、既知のがんに特異的な抗原に対するCARを発現するよう遺伝子改変される。自己細胞またはアロジェニック細胞は、十分な数になるまでエクスビボで増幅された後、注入により患者体内に戻されて、がんの抗原特異的破壊をもたらす。
HIVは、休止CD4+ T細胞内で長寿命の潜在的感染を確立する能力により、抗レトロウイルス療法（ART）で治療中の患者体内の同ウイルスの残留および間欠的な補給をもたらし、それによって同疾患の根絶を妨害する。ブリオスタチンはこれらの潜在感染細胞を活性化することができ、場合によってはウイルス媒介性細胞変性効果、宿主の免疫応答、および／またはウイルスを活発に発現する細胞を標的とする治療ストラテジーによるそれらの除去をもたらす（たとえばMarsden et al., “In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell “kick” and “kill” in strategy for virus eradication”, PLOS Pathogens 13(9): e1006575（非特許文献1）を参照）。潜在感染細胞の除去をARTと共に行って活性ウイルスを除去することは、疾患の治療、妨害、または根絶のストラテジーとなる。潜在感染細胞の除去を広域中和抗体（bNAb）と共に行って活性ウイルスを除去することも、疾患の治療、妨害、または根絶のストラテジーとなり得る（たとえばBorducchi et al., “Antibody and TLR7 agonist delay viral rebound in SHIV-infected monkeys,” Nature (2008) Nov;563(7731): 360-364（非特許文献2）を参照）。
WO 2018067382
Marsden et al., "In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication", PLOS Pathogens 13(9): e1006575 Borducchi et al., "Antibody and TLR7 agonist delay viral rebound in SHIV-infected monkeys," Nature (2008) Nov;563(7731): 360-364
概要
本開示は、ブリオスタチン1およびブリオスタチン骨格に基づく類似体（「ブリオスタチン剤」）の、細胞調節剤としての使用を提供する。本ブリオスタチン剤は、関心対象の標的細胞における抗原の発現、移行、細胞表面提示、および表面残留のうちの1つまたは複数を選択的に強化するのに用いられ得る。関心対象の標的細胞における抗原の非限定例としては、タンパク質抗原、ペプチド抗原、ネオ抗原、および標的細胞のmRNA処理から誘導される抗原が挙げられる。本明細書では、対象において標的細胞を調節する方法が提供される。方法の局面は、有効量のブリオスタチン剤を対象に投与して標的細胞の免疫原性を調節することを含む。本方法の局面は、自己細胞またはアロジェニック細胞をブリオスタチン剤とエクスビボで接触させて、該自己細胞またはアロジェニック細胞の免疫原性を調節することを含む。本方法は、免疫療法で使用するために標的細胞を調節することを含む。本方法は、疾患治療のために標的細胞を調節することを含む。本方法により治療する疾患の非限定例としては、がん、HIV、神経障害、認知症、およびアルツハイマー病が挙げられる。したがって、本方法は、がんを治療する方法を含み、該方法は、対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与すること、および該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与することを含む。本方法は、標的抗原またはネオ抗原の細胞表面提示を選択的に強化すること、および他の抗原またはネオ抗原の細胞表面提示を選択的に減少させることを含み得る。本方法の局面は、対象の免疫系による排除に対し標的細胞を増感させるためのブリオスタチン剤の使用も含む。
図1、パネルA～Dは、ブリオスタチンおよび類似体を調製するための合成ストラテジー、ならびにプロテインキナーゼC（PKC）との結合構造を例示している。パネルA: C環サブユニットのファルマコフォア要素がC1カルボニル、C19ヘミケタール、およびC26アルコールとして示されている、ブリオスタチン骨格の逆合成分析。類似体合成の関心対象エリアとしてC13を強調している（球で示す）。パネルB: PKC-ブリオスタチン-膜 三元複合体のレンダリング。ブリオスタチン1を長方形のボックス内に示す。ブリオスタチン骨格のC環サブユニットのファルマコフォア要素（図1、パネルAを参照）がPKC（ダークグレー）と直接相互作用し、A環およびB環は細胞膜（ライトグレー）に埋め込まれている。パネルC: REDOR NMRにより決定され、実験的に決定された分子内距離にフィットしている、PKCに結合したブリオスタチン骨格の代表的配座異性体。パネルD: 酸1およびエナール2からのブリオスタチン骨格の収束的な構築。C13官能基は、（図1、パネルAに示す）C環のファルマコフォア要素への干渉を避けながら、後の多様化のための万能な出発点を提供している。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図1-1の説明を参照のこと。 図2A～2Bは、がんを治療する方法の治療ストラテジーを例示している。図2Aは細胞傷害性化学療法剤の効果を示す概略図であり、図2Bは選択的mAbまたはCAR T細胞療法剤を示す概略図である。 図3、パネルA～Dは、標的細胞のCD22部位密度が、CD22 CARの機能性を制限することを例示している。パネルA: 様々なレベルのCD22を発現するように形質導入されたCRISPR/Cas9編集CD22陰性NALM6 B-ALL系におけるCD22発現のヒストグラム。NALM6は、親細胞系を指す。様々なCD22部位密度を発現するNALM6細胞系との共培養後のCD22 CAR形質導入T細胞によるインターフェロンガンマ（パネルB）およびIL-2（パネルC）の生産。一元配置分散分析（ANOVA）により、* = p<0.05、*** = p<0.005、**** = p<0.001。パネルBおよびCに示すデータは、3つの独立した実験を表す。線は、三つ組ウェルの測定の平均±標準誤差を表す。パネルD: 白血病注射後3日目に投与した6 x 106／マウス（NOD SCIDガンマ（NSG））の用量によりCD22 CAR T細胞が親NALM6を排除したこと、しかしそのCAR T細胞が、当初は白血病進行を遅延させたにもかかわらず、低いCD22部位密度を発現するNALM6は根絶できなかったことを実証する、異種移植モデル。3つの独立した実験を表す。Fry et al., Nature Medicine 2018, 24, 20-27の図4に対応している。 図３Aの説明を参照のこと。 図３Aの説明を参照のこと。 図３Aの説明を参照のこと。 図4、パネルA～Dは、ブリオスタチン1（B1）および様々な例示的ブリオスタチン剤が、NALM6、JP、および2F7細胞においてインビトロで持続的なCD22表面発現を誘導したことを示す。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図4Aの説明を参照のこと。 図5は、CD22 CAR T細胞治療と一緒にブリオスタチン1をマウスに投与すると、応答の耐久性が向上することを例示している。0日目、NSGマウスに、1 x 106個のGPF陽性NALM6腫瘍細胞を注射した。3日目、治療用に、4 x 106のモックCARまたはCD22 CARを注射した。マウスにブリオスタチン1またはDMSOを週3回、2週間にわたり与えた。IVIS（商標）技術およびルシフェリン-DのIP注射を用いてマウスを撮像した。 図6、パネルAは、共焦点顕微鏡法によりPKCδ-GFPの細胞膜への移行を観察して決定された、ブリオスタチン剤が誘導するPKCの活性化を例示している。図6、パネルB～Dは、t = 0（培地に化合物を加える直前の時点）に対し正規化し、時間に対しプロットした、サイトゾル蛍光を例示している。明瞭さを期してエラーバーは除外した。PKCδ-GFPの細胞膜への最大の移行を表2で報告する。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。 例示的ブリオスタチン剤の生物学的データを表す。
定義
例示的態様について詳述する前に、以下の定義を記載して、本明細書で使用される用語の意味および範囲を例示し定義する。
特に他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するような意味と同じ意味をもつ。とはいえ明瞭さおよび参照しやすさを期して、いくつかの用語を以下に定義する。
なお、本明細書で使用する場合、また添付の請求項では、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈からそうでないことが明白でない限り、その複数形も含むものとする。たとえば「プライマー」という用語は、1つまたは複数のプライマー、すなわち1つのプライマーおよび複数のプライマーを指す。またさらに、請求項は任意選択の要素をすべて排するように書かれ得ることに留意されたい。そこで、この記述をもって、請求項の要素の記載に関する「もっぱら」「～のみ」等の排他的な用語の使用または「ネガティブな」限定の使用の先行基礎とする。
数の範囲は、その範囲を画定する両端の数字を含む。
「アルキル」は、1～20炭素原子を有する、たとえば1～10炭素原子、または1～6、または1～5、または1～4、または1～3などの炭素原子を有する、一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、例として、直鎖および分枝ヒドロカルビル基、たとえばメチル(CH3-)、エチル(CH3CH2-)、n-プロピル(CH3CH2CH2-)、イソプロピル((CH3)2CH-)、n-ブチル(CH3CH2CH2CH2-)、イソブチル((CH3)2CHCH2-)、sec-ブチル((CH3)(CH3CH2)CH-)、t-ブチル((CH3)3C-)、n-ペンチル(CH3CH2CH2CH2CH2-)、およびネオペンチル((CH3)3CCH2-)を含む。
「置換アルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルキル基であって、アルキル鎖の1つまたは複数の炭素原子が、-O-、-N-、-S-、-S（O）n-（nは0～2）、-NR-（Rは水素またはアルキル）などのヘテロ原子で置き換えられていてもよく、かつアルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-アリール、-SO2-ヘテロアリール、および-NRaRbからなる群より選択される1～5の置換基を有するアルキルを指し、ここでR’およびR”は同じでも異なっていてもよく、かつ水素、置換されていてもよいアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、および複素環から選択される。
「アルキレン」は、直鎖または分枝の、かつ、-O-、-NR10-、-NR10C(O)-、-C(O)NR10-等から選択される1つまたは複数の基で中断されていてもよい、1～20の、いくつかの場合では1～10、または1～6、または1～3炭素原子を有する、二価の脂肪族ヒドロカルビル基を指し、ここでR10は、本明細書に定義される水素、アルキル、置換アルキル、アリール、および置換アリールから選択される。この用語は、例として、メチレン(-CH2-)、エチレン(-CH2CH2-)、n-プロピレン(-CH2CH2CH2-)、イソ-プロピレン(-CH2CH(CH3)-)、(-C(CH3)2CH2CH2-)、(-C(CH3)2CH2C(O)-)、(-C(CH3)2CH2C(O)NH-)、(-CH(CH3)CH2-)等を含む。
「置換アルキレン」は、下の「置換（された）」の定義で炭素について記載されているように、1～3水素が置換基で置き換えられているアルキレン基を指す。
「アルカン」という用語は、本明細書に定義されるアルキル基およびアルキレン基を指す。
「アルキルアミノアルキル」、「アルキルアミノアルケニル」、および「アルキルアミノアルキニル」という用語は、R’NHR”-の基を指し、ここでR’は、本明細書に定義されるアルキル基であり、R”は、本明細書に定義されるアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン基である。
「アルカリール（alkaryl）」または「アラルキル」という用語は、-アルキレン-アリールおよび-置換アルキレン-アリールの各基を指し、ここでアルキレン、置換アルキレン、およびアリールは、本明細書に定義されている。
「アルコキシ」は、-O-アルキルの基を指し、ここでアルキルは本明細書に定義されるとおりである。アルコキシは、例として、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、t-ブトキシ、sec-ブトキシ、n-ペントキシ等を含む。「アルコキシ」という用語はまた、アルケニル-O-、シクロアルキル-O-、シクロアルケニル-O-、およびアルキニル-O-の各基を指し、ここでアルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアルキニルは、本明細書に定義されるとおりである。
「置換アルコキシ」という用語は、置換アルキル-O-、置換アルケニル-O-、置換シクロアルキル-O-、置換シクロアルケニル-O-、および置換アルキニル-O-の各基を指し、ここで置換アルキル、置換アルケニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、および置換アルキニルは、本明細書に定義されるとおりである。
「アルコキシアミノ」という用語は、-NH-アルコキシの基を指し、ここでアルコキシは本明細書に定義されている。
「ハロアルコキシ」という用語は、アルキル-O-の基を指し、ここでアルキル基の水素原子の1つまたは複数がハロ基で置換されており、例としてトリフルオロメトキシ等の基を含む。
「ハロアルキル」という用語は、上述したような置換アルキル基を指し、ここでアルキル基の水素原子の1つまたは複数がハロ基で置換されている。そのような基の例としては、限定ではないが、フルオロアルキル基、たとえばトリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロエチル等が挙げられる。
「アルキルアルコキシ」という用語は、-アルキレン-O-アルキル、アルキレン-O-置換アルキル、置換アルキレン-O-アルキル、および置換アルキレン-O-置換アルキルの各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルキレン、および置換アルキレンは、本明細書に定義されるとおりである。
「アルキルチオアルコキシ」という用語は、-アルキレン-S-アルキル、アルキレン-S-置換アルキル、置換アルキレン-S-アルキル、および置換アルキレン-S-置換アルキルの各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルキレン、および置換アルキレンは、本明細書に定義されるとおりである。
「アルケニル」は、2～20炭素原子、いくつかの場合では2～10炭素原子、たとえば2～7炭素原子を有する、かつ少なくとも1つの、いくつかの場合では1～2つの二重結合不飽和部位を有する、直鎖または分枝ヒドロカルビル基を指す。この用語は、例として、bi-ビニル、アリル、およびブタ-3-エン-1-イルを含む。この用語には、シスおよびトランス異性体、またはこれらの異性体の混合体が含まれる。
「置換アルケニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、および-SO2-ヘテロアリールから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基を有する、本明細書に定義されるアルケニル基を指す。
「アレニル」は、2～20炭素原子、いくつかの場合では2～10炭素原子、たとえば2～7炭素原子を有し、かつ隣接する2つの炭素原子それぞれと二重結合不飽和を有する炭素原子を有する、直鎖または分枝ヒドロカルビル基を指す。この用語には、立体異性体、またはこれらの異性体の混合体が含まれる。
「置換アレニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、および-SO2-ヘテロアリールから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基を有する、本明細書に定義されるアルケニル基を指す。
「アルキニル」は、2～20炭素原子、いくつかの場合では2～10炭素原子、たとえば2～7炭素原子を有し、かつ少なくとも1つ、いくつかの場合では1～2つの三重結合不飽和部位を有する、直鎖または分枝の一価のヒドロカルビル基を指す。そのようなアルキニル基の例としては、アセチレニル（-C≡CH）およびプロパルギル（-CH2C≡CH）が挙げられる。
「置換アルキニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、および-SO2-ヘテロアリールから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基を有する、本明細書に定義されるアルキニル基を指す。
「アルキニルオキシ」は、-O-アルキニルの基を指し、ここでアルキニルは、本明細書に定義されるとおりである。アルキニルオキシは、例として、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等を含む。
「アシル」は、H-C(O)-、アルキル-C(O)-、置換アルキル-C(O)-、アルケニル-C(O)-、置換アルケニル-C(O)-、アルキニル-C(O)-、置換アルキニル-C(O)-、シクロアルキル-C(O)-、置換シクロアルキル-C(O)-、シクロアルケニル-C(O)-、置換シクロアルケニル-C(O)-、アリール-C(O)-、置換アリール-C(O)-、ヘテロアリール-C(O)-、置換ヘテロアリール-C(O)-、ヘテロシクリル-C(O)-、および置換ヘテロシクリル-C(O)-の各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。たとえば、アシルは、「アセチル」基CH3C(O)-を含む。
「アシルアミノ」は、-NR20C(O)アルキル、-NR20C(O)置換アルキル、NR20C(O)シクロアルキル、-NR20C(O)置換シクロアルキル、-NR20C(O)シクロアルケニル、-NR20C(O)置換シクロアルケニル、-NR20C(O)アルケニル、-NR20C(O)置換アルケニル、-NR20C(O)アルキニル、-NR20C(O)置換アルキニル、-NR20C(O)アリール、-NR20C(O)置換アリール、-NR20C(O)ヘテロアリール、-NR20C(O)置換ヘテロアリール、-NR20C(O)ヘテロ環式、および-NR20C(O)置換ヘテロ環式の各基を指し、ここでR20は水素またはアルキルであり、またアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「アミノカルボニル」、または「アミノアシル」という用語は、-C(O)NR21R22の基を指し、ここでR21およびR22は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式からなる群より選択され、またR21およびR22は、それに結合した窒素とともに互いに結合してヘテロ環式または置換ヘテロ環式基を形成してもよく、またアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「アミノカルボニルアミノ」は、-NR21C(O)NR22R23の基を指し、ここでR21、R22、およびR23は独立して、水素、アルキル、アリール、またはシクロアルキルから選択され、あるいは2つのR基が結合してヘテロシクリル基を形成する。
「アルコキシカルボニルアミノ」という用語は、-NRC(O)ORの基を指し、ここで各Rは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり、ここでアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、本明細書に定義されるとおりである。
「アシルオキシ」という用語は、アルキル-C(O)O-、置換アルキル-C(O)O-、シクロアルキル-C(O)O-、置換シクロアルキル-C(O)O-、アリール-C(O)O-、ヘテロアリール-C(O)O-、およびヘテロシクリル-C(O)O-の各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルは、本明細書に定義されるとおりである。
「アミノスルホニル」は、-SO2NR21R22の基を指し、ここでR21およびR22は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、置換ヘテロ環式からなる群より選択され、またR21およびR22は、それに結合した窒素とともに互いに結合してヘテロ環式または置換ヘテロ環式基を形成してもよく、またアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「スルホニルアミノ」は、-NR21SO2R22の基を指し、ここでR21およびR22は独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式からなる群より選択され、またR21およびR22は、それに結合した原子とともに互いに結合してヘテロ環式または置換ヘテロ環式基を形成してもよく、またアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「アリール」または「Ar」は、（フェニル基に存在するような）単環、または複数の縮合環を有する環系（そのような芳香族環系の例としては、ナフチル、アントリル、およびインダニルが挙げられる）を有する、6～18炭素原子の一価の芳香族炭素環式基を指し、該縮合環は芳香族であってもなくてもよく、ただし付着点は芳香族環の原子を介する。この用語は、例として、フェニルおよびナフチルを含む。アリール置換基の定義によりほかに制限されない限り、そのようなアリール基は、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、-SO2-ヘテロアリール、およびトリハロメチルから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基で置換されていてもよい。
「アリールオキシ」は、-O-アリールの基を指し、ここでアリールは、本明細書に定義されるとおりであり、例としてフェノキシ、ナフトキシ等を含み、本明細書で同じく定義されている置換されていてもよいアリール基を含む。
「アミノ」は、-NH2の基を指す。
「置換アミノ」という用語は、-NRRの基を指し、ここで各Rは、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロシクリルからなる群より選択され、ただし少なくとも1つのRは水素ではない。
「アジド」という用語は、-N3の基を指す。
「カルボキシル」、「カルボキシ」、または「カルボキシラート」は、-CO2Hまたはその塩を指す。
「カルボキシルエステル」もしくは「カルボキシエステル」、または「カルボキシアルキル」もしくは「カルボキシルアルキル」という用語は、-C(O)O-アルキル、-C(O)O-置換アルキル、-C(O)O-アルケニル、-C(O)O-置換アルケニル、-C(O)O-アルキニル、-C(O)O-置換アルキニル、-C(O)O-アリール、-C(O)O-置換アリール、-C(O)O-シクロアルキル、-C(O)O-置換シクロアルキル、-C(O)O-シクロアルケニル、-C(O)O-置換シクロアルケニル、-C(O)O-ヘテロアリール、-C(O)O-置換ヘテロアリール、-C(O)O-ヘテロ環式、および-C(O)O-置換ヘテロ環式の各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「（カルボキシルエステル）オキシ」または「カルボナート」は、-O-C(O)O-アルキル、-O-C(O)O-置換アルキル、-O-C(O)O-アルケニル、-O-C(O)O-置換アルケニル、-O-C(O)O-アルキニル、-O-C(O)O-置換アルキニル、-O-C(O)O-アリール、-O-C(O)O-置換アリール、-O-C(O)O-シクロアルキル、-O-C(O)O-置換シクロアルキル、-O-C(O)O-シクロアルケニル、-O-C(O)O-置換シクロアルケニル、-O-C(O)O-ヘテロアリール、-O-C(O)O-置換ヘテロアリール、-O-C(O)O-ヘテロ環式、および-O-C(O)O-置換ヘテロ環式の各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「シアノ」または「ニトリル」は、-CNの基を指す。
「シクロアルキル」は、1つの、または融合、架橋、およびスピロ環系を含む複数のサイクリック環を有する、3～10炭素原子の環式アルキル基を指す。好適なシクロアルキル基の例としては、たとえば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等が挙げられる。そのようなシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単環構造、またはアダマンタニル等の多環構造を含む。
「置換シクロアルキル」という用語は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、および-SO2-ヘテロアリールから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基を有するシクロアルキル基を指す。
「シクロアルケニル」は、単環または多環を有し、かつ少なくとも1つの二重結合、いくつかの場合では1～2つの二重結合を有する、3～10炭素原子の非芳香族環式アルキル基を指す。
「置換シクロアルケニル」という用語は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、ケト、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、および-SO2-ヘテロアリールから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基を有するシクロアルケニル基を指す。
「シクロアルキニル」は、単環または多環を有し、かつ少なくとも1つの三重結合を有する、5～10炭素原子の非芳香族シクロアルキル基を指す。
「シクロアルコキシ」は、-O-シクロアルキルを指す。
「シクロアルケニルオキシ」は、-O-シクロアルケニルを指す。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、-OHの基を指す。
「ヘテロアリール」は、環内の1～15炭素原子、たとえば1～10炭素原子、ならびに酸素、窒素、および硫黄からなる群より選択される1～10のヘテロ原子の芳香族基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（たとえばピリジニル、イミダゾリル、またはフリル）または環系の複数の縮合環（たとえばインドリジニル、キノリニル、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾリル、またはベンゾチエニルなどの基のように）を有し得、ここで環系内の少なくとも1つの環は芳香族であり、環系内の少なくとも1つの環は芳香族であり、ただし付着点は芳香族環の原子を介する。特定の態様では、ヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子は、酸化されていてもよく、N-オキシド(N→O)、スルフィニル、またはスルホニル部分を与える。この用語は、例として、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルを含む。ヘテロアリール置換基の定義によりほかに制限されない限り、そのようなヘテロアリール基は、アシルオキシ、ヒドロキシ、チオール、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、置換アルキル、置換アルコキシ、置換アルケニル、置換アルキニル、置換シクロアルキル、置換シクロアルケニル、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アシルアミノ、アルカリール、アリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロゲン、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、および-SO2-ヘテロアリール、およびトリハロメチルから選択される1～5つの置換基、または1～3つの置換基で置換されていてもよい。
「ヘテロアラルキル」という用語は、-アルキレン-ヘテロアリールの基を指し、ここでアルキレンおよびヘテロアリールは本明細書に定義されている。この用語は、例として、ピリジルメチル、ピリジルエチル、インドリルメチル等を含む。
「ヘテロアリールオキシ」は、-O-ヘテロアリールを指す。
「ヘテロ環」、「ヘテロ環式」、「ヘテロシクロアルキル」、および「ヘテロシクリル」は、単環、または融合、架橋、およびスピロ環系を含む複数の縮合環を有し、かつ3～20の環原子、たとえば1～10のヘテロ原子を有する、飽和または不飽和基を指す。これらの環原子は、窒素、硫黄、または酸素からなる群より選択され、ここで融合環系では、環の1つまたは複数がシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり得、ただし付着点は非芳香族環を介する。特定の態様では、ヘテロ環式基の窒素および／または硫黄原子は、酸化されていてもよく、N-オキシド、-S(O)-、または-SO2-部分を与える。
ヘテロ環およびヘテロアリールの例としては、限定ではないが、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタリミド、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン、4,5,6,7-テトラヒドロベンゾ[b]チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ[b]チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル(チアモルホリニルとも呼ばれる)、1,1-ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、ピロリジン、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
ヘテロ環式置換基の定義によりほかに制限されない限り、そのようなヘテロ環式基は、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアミノアシル、アジド、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、オキソ、チオケト、カルボキシル、カルボキシルアルキル、チオアリールオキシ、チオヘテロアリールオキシ、チオヘテロシクロオキシ、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、-SO-アルキル、-SO-置換アルキル、-SO-アリール、-SO-ヘテロアリール、-SO2-アルキル、-SO2-置換アルキル、-SO2-アリール、-SO2-ヘテロアリール、および融合ヘテロ環から選択される1～5つの、または1～3つの置換基で置換されていてもよい。
「ヘテロシクリルオキシ」は、-O-ヘテロシクリルの基を指す。
「ヘテロシクリルチオ」という用語は、ヘテロ環式-S-の基を指す。
「ヘテロシクレン」という用語は、本明細書に定義されるヘテロ環から形成されるジラジカル基を指す。
「ヒドロキシアミノ」という用語は、-NHOHの基を指す。
「ニトロ」は、-NO2の基を指す。
「オキソ」は、原子(=O)を指す。
「スルホニル」は、SO2-アルキル、SO2-置換アルキル、SO2-アルケニル、SO2-置換アルケニル、SO2-シクロアルキル、SO2-置換シクロアルキル、SO2-シクロアルケニル、SO2-置換シクロアルケニル、SO2-アリール、SO2-置換アリール、SO2-ヘテロアリール、SO2-置換ヘテロアリール、SO2-ヘテロ環式、およびSO2-置換ヘテロ環式の各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。スルホニルは、例として、メチル-SO2-、フェニル-SO2-、および4-メチルフェニル-SO2-を含む。
「スルホニルオキシ」は、-OSO2-アルキル、OSO2-置換アルキル、OSO2-アルケニル、OSO2-置換アルケニル、OSO2-シクロアルキル、OSO2-置換シクロアルキル、OSO2-シクロアルケニル、OSO2-置換シクロアルケニル、OSO2-アリール、OSO2-置換アリール、OSO2-ヘテロアリール、OSO2-置換ヘテロアリール、OSO2-ヘテロ環式、およびOSO2置換ヘテロ環式の各基を指し、ここでアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロ環式、および置換ヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「アミノカルボニルオキシ」という用語は、-OC(O)NRRの基を指し、ここで各Rは独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロ環式であり、ここでアルキル、置換アルキル、アリール、ヘテロアリール、およびヘテロ環式は、本明細書に定義されるとおりである。
「チオール」は、-SHの基を指す。
「チオキソ」または「チオケト」という用語は、原子(=S)を指す。
「アルキルチオ」または「チオアルコキシ」という用語は、-S-アルキルの基を指し、ここでアルキルは、本明細書に定義されるとおりである。特定の態様では、硫黄は酸化されて-S(O)-であってもよい。スルホキシドは、1つまたは複数の立体異性体として存在し得る。
「置換チオアルコキシ」という用語は、-S-置換アルキルの基を指す。
「チオアリールオキシ」という用語は、アリール-S-の基を指し、ここでアリール基は、本明細書に定義されるとおりであり、本明細書で同じく定義されている置換されていてもよいアリール基を含む。
「チオヘテロアリールオキシ」という用語は、ヘテロアリール-S-の基を指し、ここでヘテロアリール基は、本明細書に定義されるとおりであり、本明細書で同じく定義されている置換されていてもよいアリール基を含む。
「チオヘテロシクロオキシ」という用語は、ヘテロシクリル-S-の基を指し、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義されるとおりであり、本明細書で同じく定義されている置換されていてもよいヘテロシクリル基を含む。
本明細書の開示に加えて、「置換（された）」という用語は、特定の基またはラジカルを修飾するのに用いられる場合、該特定の基またはラジカルの1つまたは複数の水素原子が、それぞれ、互いに独立して、以下に定義されるような同じまたは異なる置換基で置き換えられていることも意味し得る。
本明細書で個々の用語に関し開示する基に加えて、特定の基またはラジカルの飽和炭素原子上の1つまたは複数の水素を置換する置換基（1つの炭素上の任意の2つの水素が、=O、=NR70、=N-OR70、=N2、または=Sで置き換えられ得る）は、特に明記しない限り、-R60、ハロ、=O、-OR70、-SR70、-NR80R80、トリハロメチル、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、=N2、-N3、-SO2R70、-SO2O-M+、-SO2OR70、-OSO2R70、-OSO2O-M+、-OSO2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)O-M+、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)O-M+、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 -M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70、および-NR70C(NR70)NR80R80であり、ここでR60は、置換されていてもよいアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選択され、各R70は、独立して、水素またはR60であり;各R80は、独立してR70であるか、あるいは2つのR80が、それらが結合している窒素原子とともに互いに結合して5、6、または7員ヘテロシクロアルキルを形成し、それは、O、N、およびSからなる群より選択される同じまたは異なる追加のヘテロ原子を1～4つ含んでいてもよく、そのNは、-HまたはC1～C3アルキルの置換を有し得;また、各M+は正電荷をもつ対イオンである。各M+は、独立して、たとえば、アルカリイオン、たとえばK+、Na+、Li+;アンモニウムイオン、たとえば+N(R60)4;またはアルカリ土類イオン、たとえば[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5、または[Ba2+]0.5であってもよい（“下付きの0.5は、そのような二価アルカリ土類イオンの対イオンの一方が本発明の化合物のイオン化体で、もう一方が塩化物などの典型的な対イオンであり得ることを意味し、あるいは、本明細書に開示される2つのイオン化化合物がそのような二価アルカリ土類イオンの対イオンとなり得、または本発明の二重イオン化化合物がそのような二価アルカリ土類イオンの対イオンとなり得る）。具体例として、-NR80R80は、-NH2、-NH-アルキル、N-ピロリジニル、N-ピペラジニル、4N-メチル-ピペラジン-1-イル、およびN-モルホリニルを含むものとする。
本明細書の開示に加えて、「置換」アルケン、アルキン、アリール、およびヘテロアリール基の不飽和炭素原子上の水素の置換基は、特に明記しない限り、-R60、ハロ、-O-M+、-OR70、-SR70、-S-M+、-NR80R80、トリハロメチル、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、-N3、-SO2R70、-SO3 -M+、-SO3R70、-OSO2R70、-OSO3 -M+、-OSO3R70、-PO3 -2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-CO2 -M+、-CO2R70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OCO2 -M+、-OCO2R70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 -M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70、および-NR70C(NR70)NR80R80であり、ここでR60、R70、R80、およびM+は既に定義したとおりであり、ただし置換アルケンまたはアルキンの場合は、置換基は-O-M+、-OR70、-SR70、または-S-M+ではない。
本明細書で個々の用語に関し開示する基に加えて、「置換」ヘテロアルキルおよびシクロヘテロアルキル基の窒素原子上の水素の置換基は、特に明記しない限り、-R60、-O-M+、-OR70、-SR70、-S-M+、-NR80R80、トリハロメチル、-CF3、-CN、-NO、-NO2、-S(O)2R70、-S(O)2O-M+、-S(O)2OR70、-OS(O)2R70、-OS(O)2O-M+、-OS(O)2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)(OR70)、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70C(O)OR70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70、および-NR70C(NR70)NR80R80であり、ここでR60、R70、R80、およびM+は既に定義したとおりである。
本明細書の開示に加えて、特定の態様では、置換されている基は、1、2、3、もしくは4つの置換基、1、2、もしくは3つの置換基、1もしくは2つの置換基、または1つの置換基を有する。
上記で定義したすべての置換基において、置換基自体へのさらなる置換基の定義により到達されるポリマー（たとえば、置換アリール基でさらに置換されている置換アリール基で置換されている置換アリール基を置換基として有する置換アリール、その他）を本明細書に含む意図はないことが理解される。そのような場合、そうした置換の最大数は3である。たとえば、本明細書で具体的に企図される置換されたアリール基の直列的（serial）置換は、置換アリール-（置換アリール）-置換アリールに限られる。
特に明記しない限り、本明細書で明白に定義されていない置換基の命名は、末端部分の官能基に続けて隣接する官能基を付着点に向けて命名することにより到達される。たとえば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、(アリール)-(アルキル)-O-C(O)-の基を指す。
本明細書に開示される1つまたは複数の置換基を含むどの基についても、当然ながら、そのような基は立体的に非現実的な、かつ／または合成不可能な置換または置換パターンを含まないことが理解される。加えて、本化合物は、そのような化合物の置換から生じるあらゆる立体化学異性体を含む。
「合成等価物」または「反応等価物」という用語は、特に逆合成の技術分野では、所与の「シントン」に対応する化合物（単数または複数）を指すものとして、当業者にはよく理解されている（E.J. Corey, Pure App. Chem., 1967, 14: 30-37）。任意の所与のシントンは、複数の合成等価物を有し得る。「シントン」という用語は、合成手順の基本とみなされる、合成される標的分子のコア構成要素の部分を含む化合物を指す。たとえば、シントンは、逆合成分析により特定されるフラグメント、または可能な合成手順に関連する合成構成単位を指し得る。「合成等価物」という用語は、合成ストラテジーにおいて、該ストラテジーおよび手順を実質的に変える必要なしに標的の中間体または出発物質の代替物質として利用可能な化合物を指す。合成等価物は、基本となる関心対象の標的骨格のフラグメント上と同じ配置の官能基またはその前駆物質もしくはその保護バージョンを含むことにより、標的の中間体または出発物質と関連づけられ得ることが理解される。合成等価物は、同じ化学特性を有する異なる官能基を指し得る。シントンは、逆合成分析から、たとえば標的分子の炭素間結合の解離から生じるフラグメントを指し得る。合成等価物は、標的分子に向けての合成手順で用いられる実際の基質を指し得る。いくつかの場合では、シントンという用語と合成等価物という用語は、同じ分子を指し得る。いくつかの場合では、シントンという用語は、複数の合成等価物を可能にする合成フラグメントを指す。合成等価物の定義は、当該の化学反応で使用される条件下では不安定または反応性であるような関心対象の化合物の部分が、該化学反応後に切り捨てられ得る適切な保護基により保護またはマスクされている、化合物を含む。いくつかの場合では、定義は、関心対象の化合物の部分が、当該の化学反応中に切り捨てられてインサイチューで不安定または反応性基を与えるように設計されている保護基により、保護またはマスクされている、化合物を含む。
「プロ部分（promoiety）」は、活性剤内の官能基をマスクするのに用いられると該活性剤をプロドラッグに変換する、保護基の一形態を指す。
「薬学的に許容される塩」という用語は、哺乳動物などの患者への投与が許容される塩を意味する（所与の投与計画に関して哺乳動物に対し許容される安全性を有する、対イオンを有する塩）。そのような塩は、薬学的に許容される無機または有機塩基から、および薬学的に許容される無機または有機酸から誘導され得る。「薬学的に許容される塩」は、化合物の薬学的に許容される塩を指し、そのような塩は、当技術分野では周知の様々な有機および無機対イオンから誘導され、単に例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウム等が挙げられ;また、分子が塩基性官能基を含む場合、有機または無機酸の塩、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩等、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸の塩、ならびに有機酸、たとえばパラ-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、パラ-ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、および酢酸の塩、ならびに関連の無機および有機酸の塩を含む。したがってそのような薬学的に許容される塩としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソブチル酸塩、カプリン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-ジオアート、ヘキシン-1,6-ジオアート（たとえば、3-ヘキシン-1,6-ジオアート）、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、β-ヒドロキシブチラート、グリコール酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホナート、ナフタレン-2-スルホナート、マンデル酸塩、馬尿酸塩、グルコン酸塩、ラクトビオン酸塩等の塩が挙げられる。ある具体的な態様では、薬学的に許容される酸付加塩としては、塩酸および臭化水素酸などの鉱酸を用いて形成されるもの、ならびにフマル酸およびマレイン酸などの有機酸を用いて形成されるものが挙げられる。
「その塩」という用語は、酸のプロトンが金属陽イオンまたは有機陽イオン等の陽イオンで置き換えられて形成される化合物を意味する。塩は適宜、薬学的に許容される塩であるが、患者への投与が意図されない中間体化合物の塩は、その必要はない。例として、本化合物の塩は、化合物が、無機または有機酸によりプロトン付加されて陽イオンを形成し、該無機または有機酸の共役塩基が塩の陰イオン成分となっている塩を含む。
「溶媒和物」は、溶媒分子と溶質の分子またはイオンとの組み合わせにより形成された複合体を指す。溶媒は、有機化合物、無機化合物、または両方の混合物であり得る。溶媒のいくつかの例としては、限定ではないが、メタノール、N,N-ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、および水が挙げられる。溶媒が水の場合、形成した溶媒和物は水和物である。
「立体異性体（stereoisomer）」および「立体異性体（stereoisomers）」は、原子の結合性は同じだが、原子の空間的配置が異なる化合物を指す。立体異性体としては、シス-トランス異性体、EおよびZ異性体、鏡像異性体、ならびにジアステレオマーが挙げられる。
「互変異性体」は、原子の電子的結合および／またはプロトンの位置だけが異なる分子の代替形態、たとえばエノール-ケトおよびイミン-エナミン互変異性体、または-N=C(H)-NH-環原子配置を含むヘテロアリール基の互変異性体的な形態、たとえばピラゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、トリアゾール、およびテトラゾールを指す。当業者であれば、他の互変異性体的な環原子配置も可能であると認識するであろう。
「またはその塩もしくは溶媒和物もしくは立体異性体」という用語は、塩、溶媒和物、および立体異性体のあらゆる変形、たとえば本化合物の立体異性体の薬学的に許容される塩の溶媒和物を含むことが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「治療すること」または「治療」という用語は、哺乳動物（特にヒト）などの患者の疾患または病気を治療することまたはその治療を意味し、(a)対象の予防治療など、疾患または病気が起きないようにすること;(b)患者の疾患または病気を除去する、または退縮させるなど、疾患または病気を寛解させること;(c)たとえば患者の疾患または病気の進展を緩慢化または停止させることにより、疾患または病気を抑制すること;あるいは(d)患者の疾患または病気の症状を軽減すること、を含む。
本明細書で使用する場合、「標的細胞に接触させる」という用語は、治療有効量の剤、たとえば本明細書に記載されるブリオスタチン剤を、標的細胞に投薬することを指す。
「調節された標的細胞を排除すること」または「対象の免疫系による排除」の文脈における「排除すること」または「排除」という用語は、該調節された細胞を対象から根絶することを指す。いくつかの場合では、調節された細胞を対象から排除することは、治療有効量の治療用物質を投与することにより実現される。いくつかの場合では、標的細胞を（たとえば本明細書に記載される）ブリオスタチン剤と接触させることは、調節された細胞を対象から排除するのに十分である。したがって、いくつかの場合では、標的細胞をブリオスタチン剤と接触させることは、治療効果を提供するのに十分である。
「細胞表面抗原」という用語は、細胞の細胞膜および細胞表面にある分子を指し、該分子は細胞種により細胞固有であり得、細胞を特徴決定し、同定し、かつ標的化するのに利用され得る。免疫系は、細胞表面抗原を認識することができる。細胞表面抗原は、ネオ抗原、すなわち免疫系によって過去に認識されたことがない新たに形成した抗原を含むものとする。
本明細書で交換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチド高分子体、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、この用語は、限定ではないが、一本鎖、二本鎖、もしくは多鎖DNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNA混成体、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
本明細書で交換可能に用いられる「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸高分子体を指し、遺伝コードされている、および遺伝コードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されている、または誘導体化されているアミノ酸、ならびに修飾ペプチド主鎖を有するポリペプチドを含み得る。これらの用語は融合タンパク質を含み、限定ではないが、異種のアミノ酸配列との融合タンパク質、N-末端メチオニン残基ありまたはなしの異種および同種リーダー配列との融合;免疫タグ化タンパク質等が含まれる。
本明細書で交換可能に用いられる「キメラ抗原受容体」および「CAR」という用語は、免疫細胞の活性化を誘発または阻害することができ、排他的ではなく、一般に、細胞外ドメイン（たとえばリガンド／抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数の細胞内シグナリングドメインを含む、人工多モジュール分子を指す。いくつかの場合では、細胞はT細胞であり、CAR-T細胞に変換される。他の場合では、細胞はNK細胞であり、CAR-NK細胞に変換される。CARという用語は、特にCAR分子に限定されず、CARバリアントも含む。CARバリアントとしては、CARの細胞外部分（たとえばリガンド結合部分）と細胞内部分（たとえば細胞内シグナリング部分）とが2つの別分子に存在しているスプリットCARが挙げられる。CARバリアントとしては、条件的に活性化できるCARであるON-スイッチCARも挙げられ、これらはたとえばスプリットCARを含み、該スプリットCARの2つの部分の条件的ヘテロ二量体化が薬理学的に制御されている。CARバリアントとしては二特異性CARも挙げられ、これらは一次CARの活性を増幅するかまたは阻害することができる二次CAR結合ドメインを含む。CARバリアントとしては阻害性キメラ抗原受容体（iCAR）も挙げられ、これらはたとえば二特異性CAR系の成分として使用される場合があり、二次CAR結合ドメインの結合の結果として一次CARの活性化が阻害される。CAR分子およびその誘導体（すなわちCARバリアント）は、たとえば、PCT国際出願US2014/016527; Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304に記載されており、それらの開示の全文が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用する場合、「～に発現する」は、普通、細胞内で生産され、そして該細胞の細胞膜の細胞外表面へと移行した結果として該細胞の表面に提示される、細胞部分（たとえばタンパク質またはその複合体）またはその前駆物質を記述するのに用いられ得る。
本明細書で交換可能に用いられる「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、限定ではないが、マウス類（たとえばラット、マウス）、ウサギ類（たとえばウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（たとえばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）その他を含む、哺乳動物を指す。いくつかの場合では、個体はヒトである。
本明細書で使用する場合、「ドナー」という用語は、限定ではないが、マウス類（たとえばラット、マウス）、ウサギ類（たとえばウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（たとえばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）その他を含む、哺乳動物を指し、それから標的細胞が取り出され得る（たとえばアロジェニック細胞）。いくつかの場合では、ドナーはヒトである。いくつかの場合では、ドナーは健常ドナーである。いくつかの場合では、ドナーは疾患のあるドナーである。
「治療有効量」または「効果的な量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の対象に投与したとき、そのような疾患の治療が奏功するのに十分な、1剤の量、または2剤を合わせた量を指す。「治療有効量」は、剤、疾患およびその重篤度、ならびに治療を受ける対象の年齢、体重その他によって変わる。
「特異的に結合する」または「選択的に結合する」とは、分子が、関心対象の標的に優先的に結合すること、または他の分子よりも高い親和性で標的に結合することを意味する。たとえば、DNA分子は、実質的に相補的な配列には結合するが、無関連の配列には結合しない。特異的結合は、溶液または反応混合物中の他の分子または部分よりも、ある分子に対する非共有結合的または共有結合的な優先的結合を指し得る（たとえば、結合可能な他のポリペプチドよりも、特定のポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する抗体）。いくつかの態様では、ある分子の、それが特異的に結合する別の分子に対する親和性は、10-5 M以下（たとえば、10-6 M以下、10-7 M以下、10-8 M以下、10-9 M以下、10-10 M以下、10-11 M以下、10-12 M以下、10-13 M以下、10-14 M以下、10-15 M以下、または10-16 M以下）のKD（解離定数）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いKDと相関がある。
本明細書で使用する場合、「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は交換可能に用いられ、全分子もしくはインタクト分子またはそのフラグメント、ならびに修飾および／または複合体化された、修飾抗体および／もしくは複合体化抗体またはそのフラグメントを広く指し得る。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸配列の違いに基づき、異なる5つのクラスに分けることができる。所与のクラス内の免疫グロブリンはどれも非常に似通った重鎖定常領域を有している。それらの違いは、配列調査により、またはより一般的には血清学的手段により（すなわち、そうした違いを対象とする抗体の使用により）検出することができる。免疫グロブリンのクラスには、IgG（ガンマ重鎖）、IgM（ミュー重鎖）、IgA（アルファ重鎖）、IgD（デルタ重鎖）、およびIgE（イプシロン重鎖）がある。
抗体または免疫グロブリンは、構造的に関連のある糖タンパク質の一クラスを指し得、1対の軽（L）低分子量鎖および1対の重（H）鎖の2対のポリペプチド鎖からなり、4本すべてがジスルフィド結合により相互に連結している。免疫グロブリンの構造は十分に特徴決定されており、たとえばFundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))を参照されたい。簡単に説明すると、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（VHと略す）および重鎖定常領域（CHと略す）で構成される。重鎖定常領域は、典型的には、CH1、CH2、およびCH3の3ドメインで構成される。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（VLと略す）および軽鎖定常領域（CLと略す）で構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、CLの1ドメインで構成される。VHおよびVL領域は、超可変性領域（すなわち、配列および／または構造的に画定されるループの形態が超可変であり得る超可変領域）にさらに細分することができ、これらは相補性決定領域（CDR）とも呼ばれ、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存された領域が間に挿入されている。
全抗体またはほぼインタクトな抗体は、一般に多価であり、それは、それらが抗原の2つ以上の分子に同時に結合し得ることを意味するが、抗体フラグメントは一価であり得る。免疫応答の一環として生物が生産する抗体は一般に一特異的であり、それは、それらが一般には1種の抗原に結合することを意味する。多価一特異性抗体、すなわち1種の抗原の2つ以上の分子に結合する抗体は、1つの抗原エピトープに結合することができ（たとえばモノクローナル抗体）、または複数の異なる抗原エピトープに結合することができる（たとえばポリクローナル抗体）。
複数種の抗原に結合する多特異性（たとえば二特異性）抗体は、当業者が容易に作製することができるので、本明細書では「抗体」という用語の使用に適宜包含され得る。同じく、多価抗体フラグメントは、たとえば2つの一価抗体フラグメントを連結することにより作製され得る。したがって、二価および／または多価抗体フラグメントは、「抗体」という用語の使用に適宜包含され得るが、それは、たとえば以下に記載するような、あらゆる便利かつ適切な組み合わせで連結させて多価一特異性または多特異性（たとえば二特異性）抗体フラグメントを作ることができる抗体フラグメントが、当業者には容易にわかるからである。
抗体フラグメントは、限定ではないが、エピトープ決定基に結合できる、抗原結合フラグメント（FabまたはF(ab)、たとえばFab’またはF(ab’)、(Fab)2、F(ab’)2その他）、単鎖可変フラグメント（scFvまたはFv）、「第三世代」（3G）分子、その他を含む。このような抗体フラグメントは、対象となる抗原に選択的に結合する能力をいくらか保持しており、それらの例としては、限定ではないが、以下が挙げられる:
(1)全抗体を酵素パパインで消化して1本のインタクトな軽鎖および1本の重鎖の一部分をもたらすことにより生産することができる、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメント、Fab;
(2)全抗体をペプシンで処理し、続いて短縮して、1本のインタクトな軽鎖および1本の重鎖の一部分をもたらすことにより得ることができる、抗体分子のフラグメント、Fab’; 1つの抗体分子につき2つのFab’フラグメントを得ることができる;
(3)全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後の縮小なしで得ることができる抗体のフラグメント、(Fab)2;
(4)F(ab)2は、2つのジスルフィド結合により互いに結合している2つのFab’フラグメントの二量体である;
(5)2本の鎖として発現させた、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子改変フラグメントと定義される、Fv;
(6)好適なポリペプチドリンカーにより遺伝子融合単鎖分子として連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子改変分子、と定義される、単鎖抗体(「SCA」); そのような単鎖抗体は、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ他の多量体の形態であり得、多特異的なものもあれば、そうではないものもある（たとえばWO 94/07921およびWO 98/44001を参照）、ならびに
(7)シングルドメイン（典型的には軽鎖のない可変重ドメイン）および「小型化」抗体分子（典型的には、非必須ドメインが除去されたフルサイズのAbまたはmAb）を含む、「3G」。
本明細書で使用する場合、「抗原特異的T細胞」および「抗原に特異的なT細胞」は、その細胞表面に、可変領域を含むαおよびβポリペプチド鎖などのT細胞受容体（TCR）ポリペプチドの構造が理由である抗原に特異的に結合するTCRを発現する、T細胞を指す。そのTCRがある抗原に対し特異的であるT細胞は、成熟中にTCRゲノム座位組換えを経ていてもよく、かつ／または1つもしくは複数のTCRポリペプチドもしくは改変TCR様受容体（たとえばキメラ抗原受容体）を発現するように遺伝子改変されていてもよい。
「疾患抗原」または「疾患関連抗原」は、T細胞媒介性免疫応答などの免疫応答を誘発するエピトープ（たとえば抗原性ペプチド、脂質、多糖、核酸、その他）を指す。疾患が腫瘍である場合、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞表面に発現したエピトープであり得る。腫瘍抗原は腫瘍細胞に独特であり得、身体の、特に同じ系統の他の細胞表面には通常発現しない。いくつかの場合では、腫瘍抗原は、身体の他の細胞で通常発現するエピトープであり得るが、非腫瘍コンテキストでは免疫応答を誘導しない。腫瘍抗原は、免疫系が未成熟で応答ができない胎児発生中に典型的には正常細胞表面に発現する1つまたは複数のエピトープをもち得る。腫瘍抗体は、正常細胞表面に通常は超低レベルで提示されるが、それよりもかなり高いレベルで腫瘍細胞表面に発現する、1つまたは複数のエピトープをもち得る。
本明細書を通して各用語の他の定義が登場してもよい。
詳細な説明
本開示は、ブリオスタチン1およびブリオスタチン骨格に基づく類似体（「ブリオスタチン剤」）の、細胞調節剤としての使用を提供する。本ブリオスタチン剤は、関心対象の標的細胞における抗原の発現、移行、細胞表面提示、および細胞表面残留のうちの1つまたは複数を選択的に強化するのに用いることができる。関心対象の標的細胞における抗原の非限定例としては、タンパク質抗原、ペプチド抗原、ネオ抗原、および標的細胞のmRNA処理から誘導される抗原が挙げられる。本明細書では、対象において標的細胞を調節する方法が提供される。方法の局面は、有効量のブリオスタチン剤を対象に投与して、標的細胞の免疫原性を調節することを含む。本方法の局面は、自己細胞またはアロジェニック細胞をブリオスタチン剤とエクスビボで接触させて、該自己細胞またはアロジェニック細胞の免疫原性を調節することを含む。本方法は、免疫療法で使用するために標的細胞を調節することを含む。本方法は、疾患治療のために標的細胞を調節することを含む。本方法により治療する疾患の非限定例としては、がん、HIV、神経障害、認知症、およびアルツハイマー病が挙げられる。本方法は、がんを治療する方法を含み、該方法は、対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与すること、および該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与することを含む。本方法は、標的抗原またはネオ抗原の細胞表面提示を選択的に強化すること、および他の抗原またはネオ抗原の細胞表面提示を選択的に減少させることを含む場合がある。本方法の局面は、対象の免疫系による排除に対し標的細胞を増感させるためのブリオスタチン剤の使用も含む。
本方法により調節される標的細胞の非限定例としては、疾患細胞、感染細胞、改変細胞、および正常な抗原提示細胞が挙げられ得る。いくつかの場合では、標的細胞は正常な抗原提示細胞であり、（たとえば本明細書に記載される）本方法での処理後は、より有効になり、疾患または標的細胞を排除する強化された能力を示す。たとえば本方法で、正常な抗原提示細胞を用いて、免疫応答を誘発するようなmRNAタンパク質を作り、したがって免疫系を強化することができる。特定の場合では、本方法により調節される標的細胞の非限定例として、HIV感染細胞、がん細胞、キメラ抗原受容体（CAR）-改変T細胞（CAR-T細胞）、およびキメラ抗原受容体-ナチュラルキラー細胞（CAR-NK）が挙げられ得る。本ブリオスタチン剤をキメラ抗原受容体-T細胞療法（CAR-T細胞療法）またはCAR-NK細胞療法と組み合わせて用いて、患者の応答を改善し、かつ関心対象の標的細胞表面の、低い、かつ不定の抗原発現による患者の再発を予防することができる。CARは、新進のがん療法（たとえばBおよびT細胞リンパ腫の治療）および他の悪性疾患治療を象徴している。CAR-T細胞は、たとえば関心対象の腫瘍表面に提示される既知の抗原に特異的な組み換えT細胞受容体を発現するよう修飾された、患者由来メモリーCD8+ T細胞（たとえば自己細胞）を含み得る。これに関して、T細胞を患者から取り出して、（たとえば関心対象の腫瘍表面の）特定の抗原に対するCARを発現するよう修飾することができ、あるいはCARをインビボで発現するようT細胞を修飾することもできる。CAR-T細胞はまた、たとえば関心対象の腫瘍表面に提示される既知の抗原に特異的な組み換えT細胞受容体を発現するよう修飾された、ドナー由来メモリーCD8+ T細胞（たとえばドナーから取り出されたアロジェニック細胞）を含み得る。本開示は、概して、CAR-T細胞療法をがんの治療に用いる文脈で記載されているが、そのような療法に限定されるわけではないことを理解されたい。
本発明についてさらに詳述する前に、記載される特定の態様は当然ながら変更可能なので、本発明はそうした特定の態様に限定されないことを理解されたい。また、本発明の範囲を制限するのは添付の請求項のみなので、本明細書で使用される術語は特定の態様の記述のみを目的とし、限定的な意図はないことも理解されたい。
値の範囲を提供する場合、文脈により特に明示されない限り、その範囲の上限と下限との間にある各値、およびその範囲の任意の他の値、またはその間にある値が、下限の10分の1の単位まで、本発明に包含されることが理解される。そうしたより小さい範囲の上限および下限は、該より小さい範囲に独立して含まれ得、同じく発明に包含されるが、記載された範囲において除外すると明記された端値があればそれにしたがう。記載された範囲が上限および下限の一方または両方を含む場合、そうした一方または両方の含まれる端値を除いた範囲も、本発明に含まれる。
本明細書に記載される範囲には、「約」という用語が数値に先行するものがある。本明細書では、「約」という用語は、その後に続く数そのものを文字通り補助するだけでなく、この用語の後に続く数に近いまたは近似の数を提供するためにも用いられる。具体的に記載された数にある数が近いまたは近似であるかどうかを判定する場合、該記載されていない近いまたは近似の値は、それが記載される文脈において、該具体的に記載されている数の実質的等価を提供する数であり得る。
特に他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するような意味と同じ意味をもつ。本発明の実施または試験に、本明細書に記載される方法および材料と同じまたは等価の方法および材料を用いることもできるが、代表的な例示的方法および材料を以下記述する。
本明細書で引用するすべての刊行物および特許は、それぞれの刊行物または特許が、参照により組み入れられる、と具体的かつ個別に明記されているかのように、参照により本明細書に組み入れられ、そうした刊行物の引用に関連する方法および／または材料を開示し記述するために、参照により本明細書に組み入れられる。どの刊行物の引用も、本出願日より前に開示されたものであり、先行発明に基づき本発明がそうした刊行物に先行する資格がないと認めるものとは解釈されない。さらに、刊行物の日付の記載が実際の刊行物の日付と異なることがあるかもしれず、独立して確認する必要があるかもしれない。
なお、本明細書で使用する場合、また添付の請求項では、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈からそうでないことが明白でない限り、その複数形も含むものとする。またさらに、請求項は任意選択の要素をすべて排するように書かれ得ることに留意されたい。そこで、この記述をもって、請求項の要素の記載に関する「もっぱら」「～のみ」等の排他的な用語の使用または「ネガティブな」限定の使用の先行基礎とする。
本開示を読めば当業者には明白であろうが、本明細書に記載されかつ例示されている各態様は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様の何らかの特長から容易に切り離したりそれと組み合わせたりすることができる別個の成分および特長をもつ。記載の方法はいずれも、記載の順番どおりに実行することもできるし、論理的に可能な任意の他の順番で実行することもできる。
装置および方法について、文法的な流れのために機能的な説明により記載してきた、またはこれから記載するが、請求項は、35 U.S.C. §112のもとに明確に述べられていない限り、「ミーンズ（means）」または「ステップ（step）」の限定の解釈によって必然的に限定されるとは決して解釈すべきでなく、法的な均等論のもとに、請求項により提供される定義の意味および均等物の全範囲が与えられるべきであり、請求項が35 U.S.C. §112のもとに明確に述べられている場合は、35 U.S.C. §112のもとにすべての法的均等物が与えられるべき、ということを明確に理解すべきである。
方法
上記で要約したように、本開示の方法は、関心対象の標的細胞における（たとえば本明細書に記載される）抗原の発現、移行、細胞表面提示、および残留のうちの1つまたは複数を選択的に強化するためのブリオスタチン剤の使用を提供する。本明細書に開示されるように、標的細胞としては、疾患細胞、感染細胞、改変細胞、および正常な抗原提示細胞が挙げられる。本明細書では、標的の自己細胞またはアロジェニック細胞をエクスビボで調節する方法が提供される。本明細書では、標的細胞をインビボで調節する方法が提供される。本明細書では、対象において標的細胞を調節する方法が提供される。したがって、本方法は、有効量のブリオスタチン剤を対象に投与することを含む。特定の態様では、本方法は、がんを治療する方法を含み、該方法は、対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与すること、および該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与することを含む。
本開示は、細胞表面抗原の提示および残留を調節するためのブリオスタチン剤の使用を提供する。いくつかの場合では、特定の細胞表面抗原を、選択的調節、たとえば細胞表面提示の選択的強化の標的とすることができる。本開示は、非標的抗原、たとえば全般的免疫活性化に関連する細胞表面抗原よりも、標的の細胞表面抗原およびネオ抗原を選択的に強化することを提供する。選択的調節は、標的抗原の発現または提示を強化することを含み得る。特定の場合では、抗原は、タンパク質抗原、ペプチド抗原、ネオ抗原、および標的細胞のmRNA処理から誘導される抗原から選択される。
関心対象の標的細胞におけるタンパク質の「発現を選択的に強化する」、または関心対象の標的細胞におけるタンパク質の「細胞表面提示を選択的に強化する」という文脈における「選択的に」とは、本明細書で使用される場合、その集団の望ましい属性を有するメンバー（たとえば標的抗原またはネオ抗原）とさほど望ましくない属性をもつメンバーとを区別しやすくする、標的タンパク質集団の処理を指す。換言すると、標的細胞におけるタンパク質集団の特定のメンバーを、(たとえば発現または表面提示に関して)該集団の他のタンパク質よりも大きく優先的に強化する。
「発現を強化する」または「標的抗原の発現を強化する」とは、標的タンパク質または抗原の発現を50%以上増加させることを意味する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面提示を55%以上、たとえば60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、100%以上、またはさらに増加させる。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、発現を2倍以上、たとえば3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに強化する。「細胞表面提示を強化する」または「標的抗原の提示を強化する」とは、標的タンパク質または抗原の提示を50%以上増加させることを意味する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面提示を55%以上、たとえば60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、100%以上、またはさらに増加させる。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面提示を2倍以上、たとえば3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに増加させる。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、1つよりも多い標的抗原、たとえば2つ以上の標的抗原、3つ以上の標的抗原、4つ以上の標的抗原、5つ以上の標的抗原、またはそれより多くの提示および残留を強化することになる。
「標的細胞を調節する」または「標的細胞の免疫原性を調節する」とは、特定のタンパク質の細胞表面提示を強化すること、および標的細胞における特定のタンパク質の発現を強化することを含むものとする。標的細胞を調節することは、標的細胞における他のタンパク質の発現または細胞表面提示を減じることも含み得る。標的細胞を調節することは、細胞表面の抗原提示および細胞の抗原発現の調節を含む。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、標的抗原を選択的に調節することにより、たとえば標的抗原をアップレギュレートすることにより、標的細胞の免疫原性を調節することを含む。いくつかの態様では、本方法は、他の抗原、たとえば全般的免疫活性化に関連する抗原をダウンレギュレートすることにより、標的細胞の免疫原性を調節することを含む。「免疫原性」とは、標的細胞を対象の免疫系にとってより見えやすくする能力、または標的細胞が対象による免疫応答を引き起こす能力を意味する。
本方法をキメラ抗原受容体-T細胞療法（CAR-T細胞療法）およびキメラ抗原受容体-ナチュラルキラー細胞療法（CAR-NK）と組み合わせて用いて、患者の応答を改善し、かつ関心対象の標的細胞表面の、低い、かつ不定の抗原発現による患者の再発を予防することができる。これまでCAR-T細胞療法による治療は、部分的には、標的抗原の発現が漸減しかつ不定であること、標的抗原を発現している正常組織を標的とする抗原特異的毒性が誘導されてしまうこと、ならびにCAR-T細胞および／またはCAR-NK細胞治療法が極めて強力なせいで生命を脅かすサイトカイン放出症候群が発症すること、により制限されてきた。具体的には、T細胞受容体が大きな抗原負荷と高親和性で相互作用することにより、活性化誘導細胞死がもたらされ得ることが観察されている。
最近、急性リンパ性白血病（ALL）患者のCD22を標的指向するCAR T療法の予備第I相治験のデータから、およそ70%の患者が6カ月の中位持続期間にわたり完治を得る、という有望な結果が示された。しかしこの成功にもかかわらず、漸減した、かつ不定なCD22表面発現レベルによる患者の再発が観測された。あるマウス腫瘍異種移植モデルによると、抗CD22 CAR T細胞の活性化および腫瘍排除のためには、決定的なCD22表面活性が必要とされる（たとえばFry et. al., Nat. Med., 2017, 24, 20-28を参照）。
ブリオスタチンの活性をもたらすプロテインキナーゼC（PKC）調節因子、C1ドメインバインダー、および非C1ドメイン標的は、標的指向がん療法の有益なアジュバントとなり得る。最も多く研究されているPKC調節因子のなかでも植物由来のフォルボールエステル（PE）は、様々な細胞系で抗原提示を誘導することがわかっている。海洋マクロライドのブリオスタチン1（たとえばPettit et al. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104 (24), 6846-6848;およびKortmansky et al. Cancer Invest. 2003, 21 (6), 924-936を参照）は、腫瘍および他の細胞系において表面抗原の発現を改変してそれらをより免疫原性にし、したがってより免疫排除されやすくすることができる。本明細書に示すデータによると、ブリオスタチン剤をCAR-T細胞療法と一緒に用いて、標的細胞の細胞表面抗原の数および密度を増加させることにより、CAR T細胞の活性を強化することができる。
したがって、本明細書では、対象において標的細胞を調節する方法が提供される。方法は、
（a）標的細胞における抗原の発現、（b）標的細胞における抗原の移行、（c）標的細胞における抗原の細胞表面提示、および（d）標的細胞における抗原の細胞表面残留のうちの1つまたは複数を選択的に強化して、標的細胞の免疫原性を調節するために、標的細胞を有効量のブリオスタチン剤と接触させる工程
を含む。いくつかの態様では、抗原はタンパク質抗原である。いくつかの場合では、抗原はペプチド抗原である。いくつかの場合では、抗原はネオ抗原である。いくつかの他の場合では、抗原は標的細胞のmRNA処理から誘導される（たとえばmRNAの送達および発現から誘導される抗原）。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、標的細胞はHIV感染細胞である。特定の場合では、標的細胞は潜在HIVに感染した細胞であり、該標的細胞の免疫原性を調節することは、潜在ウイルスリザーバーのHIVの発現を活性化させることを含む。
いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、HIVの発現を10%以上、たとえば20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、またはさらに活性化させる。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、HIVの発現を2倍以上、たとえば3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに活性化させる。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、接触させる工程がインビボで実施され、かつHIVと診断された、またはHIVを有すると思われる対象にブリオスタチン剤を投与することを含む。特定の場合では、本細胞を調節する方法は、対象に、HIVの発現の活性化を有する該調節された標的細胞を排除することができる治療有効量の治療用物質を投与することをさらに含む。いくつかの場合では、調節された標的細胞を排除することができる治療用物質は、抗レトロウイルス療法（ART）である。いくつかの場合では、調節された標的細胞を排除することができる治療用物質は、広域中和抗体（bNAb）である。特定の態様では、本細胞を調節する方法は、HIVの発現の活性化を有する該調節された標的細胞を、追加の治療用物質を投与せずに排除することを含み、たとえば、ブリオスタチン自体が標的細胞を排除する能力をもち得る。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、標的細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）-改変T細胞、またはCAR-NK細胞であり、標的細胞をブリオスタチン剤と接触させることにより、CARの発現または細胞表面提示を強化する。特定の場合では、CARは、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、細胞のmRNA処理から誘導される抗原、およびその任意のフラグメントから選択される標的細胞表面抗原に対し親和性を有する。特定の場合では、改変T細胞は、末梢血単核球、臍帯血細胞、精製T細胞集団、またはT細胞系から得られる。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、接触させる工程がエクスビボで実施され、標的細胞は治療を受ける対象から取り出される（たとえば自己細胞）。他の態様では、接触させる工程がエクスビボで実施され、標的細胞はドナーから取り出される（たとえばアロジェニック細胞）。
本方法では、標的細胞をエクスビボでブリオスタチン剤と接触させることにより、標的細胞における抗原提示を強化するのと同じようにして、CAR-T細胞および（CAR）-NK細胞の生産を強化することができる。いくつかの場合では、CARの強化は、操作された認識フラグメントのより効率的な外在化である。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、標的細胞は、がん細胞、がん幹細胞、およびがん前駆細胞から選択される。特定の場合では、がん細胞は、がん、たとえば、限定ではないが、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、軟組織肉腫、リンパ腫、食道がん、子宮がん、骨がん、副腎がん、肺がん、甲状腺がん、結腸がん、グリオーマ、肝臓がん、膵臓がん、腎がん、子宮頸がん、睾丸がん、頭部頚部がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、および黒色腫に由来する。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、接触させる工程がインビボで実施され、がんを有する対象にブリオスタチン剤を投与することを含む。ブリオスタチン剤は、経口、眼内、経耳、皮下、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および吸入などの任意の便利なルートで投与することができる。
いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は皮下投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は経口投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は眼内投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は経耳投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は静脈内投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は筋内投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は皮内投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は腹腔内投与される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は吸入投与される。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、方法は、対象の免疫系による排除に対し標的細胞を増感させる。いくつかの場合では、方法は、対象の自然免疫系細胞による排除に対し標的細胞を増感させる。いくつかの場合では、方法は、対象の適応免疫系細胞による排除に対し標的細胞を増感させる。
細胞を調節する方法は、対象の免疫系による排除に対し標的細胞を増感させることにより、対象において免疫応答を誘導する。いくつかの場合では、細胞を調節する方法は、対象自体の免疫系細胞には影響しないが、抗原の発現または細胞表面提示を、対象の免疫系により排除されるよう選択的に強化することができる。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、対象は免疫細胞による排除に対し再発性であり、ブリオスタチン剤が、標的細胞集団に対するT細胞媒介性免疫応答を調節する。いくつかの場合では、対象は免疫細胞による排除に対し難治性であり、ブリオスタチン剤が、標的細胞集団に対するT細胞媒介性免疫応答を調節する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤が標的細胞集団に対するT細胞媒介性免疫応答を調節し、その結果、標的細胞集団に対する免疫応答は、無治療の対象と比べて10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、またはさらに増加する。
「再発」または「再発性」という用語は、回復後の疾病の再燃を指す。「疾患に対し難治性」という用語は、特定の疾患の治療に対し、対象が抵抗性または無応答性であることを指す。たとえば、難治性がんまたは抵抗性がんは、第一選択の、時には第二選択の化学療法薬物、生物学的剤、および／または放射線療法に対し無応答性である。難治性がんは縮小し得るが、治療が有効であると決定されるには至らない。ほとんどの場合、腫瘍は治療前と同じサイズのままである（安定疾患）か、または成長する（進行性疾患）。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、対象は、がん免疫療法を受けている。特定の場合では、対象は、腫瘍抗原ペプチドワクチンを受けている。
細胞を調節する方法のいくつかの態様では、方法は、調節された標的細胞の増殖を阻害すること、および、調節された標的細胞を排除することのうちの1つまたは複数ができる有効量の治療剤を対象に投与すること、をさらに含む。いくつかの場合では、方法は、他の療法と組み合わせて用いられ、該組み合わせは対象にとって相加的または相乗的なメリットをもたらす。
本明細書では、対象のがんを治療する方法も提供され、該方法は、対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与すること;および該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与することを含む。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、対象は、標的指向抗がん治療に対し再発性である。いくつかの場合では、対象は、標的指向抗がん治療に対し難治性である。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、ブリオスタチン剤は、治療剤による増殖阻害に対し標的がん細胞を増感させる。がんを治療する方法のいくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、治療剤による排除に対し標的がん細胞を増感させる。がんを治療する方法のいくつかの態様では、対象に有効量のブリオスタチン剤を投与する前は、標的がん細胞は、標的細胞表面に治療無効レベルの細胞表面抗原を提示している（たとえば、剤を用いて細胞傷害性を誘導するには不十分な提示レベル）。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、ブリオスタチン剤は、(a)細胞表面抗原の発現、(b)発現した細胞表面抗原の標的細胞表面への移行、および(c)細胞表面抗原の標的細胞表面での残留のうちの1つまたは複数を強化する。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、ブリオスタチン剤は、細胞表面抗原の細胞表面提示を50%以上、たとえば60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、100%以上、またはさらに強化する（増加させる）。いくつかの場合では、抗原の細胞表面提示は2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに強化される。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、標的がん細胞の細胞表面抗原提示は、ブリオスタチン剤の投与後2日以上にわたり強化される。いくつかの場合では、標的がん細胞の細胞表面抗原提示は、10時間以上、20時間以上、30時間以上、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、またはそれより長期にわたり強化される（増加する）。
したがって、がんを治療する方法のいくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、標的細胞表面の細胞表面抗原の残留を50%以上、たとえば60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、またはさらに強化する（増加させる）。いくつかの場合では、抗原の細胞表面提示は、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに強化される。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、標的細胞表面の細胞表面抗原の残留を10時間以上、20時間以上、30時間以上、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、またはそれより長い期間にわたり強化する（増加させる）。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合する治療剤は、キメラ抗原受容体発現T細胞（CAR T細胞）、キメラ抗原受容体発現ナチュラルキラー細胞（CAR-NK細胞）、抗体剤、抗体薬物複合体（ADC）、および二特異性抗体剤から選択される。いくつかの場合では、治療剤はCAR T細胞である。いくつかの場合では、治療剤はCAR-NK細胞である。いくつかの場合では、治療剤は抗体である。いくつかの場合では、治療剤はADCである。他の場合では、治療剤は二特異性抗体剤である。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、対象に治療有効量の治療剤を投与することは、該対象に、標的細胞集団で提示される細胞表面抗原に特異的に結合する治療有効量のCAR T細胞を含む組成物を投与することを含む。特定の場合では、ブリオスタチン剤は、標的細胞集団に対するT細胞媒介性免疫応答を調節する。特定の場合では、標的細胞集団は、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD52、CD80、CD86、CD137、CDK4、CDK6、OX40、およびCD340から選択される腫瘍抗原を含む。特定の場合では、標的細胞集団は腫瘍抗原CD22を含む。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合する治療剤は、キメラ抗原受容体発現T細胞（CAR T細胞）、またはCAR-NK細胞であり、CAR T細胞またはCAR-NK細胞はB細胞性悪性疾患、CLL、ALL、B-ALL、白血病、リンパ腫、または固形腫瘍の治療に有効である。特定の場合では、固形腫瘍は、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、軟組織肉腫、リンパ腫、食道がん、子宮がん、骨がん、副腎がん、肺がん、甲状腺がん、結腸がん、グリオーマ、肝臓がん、膵臓がん、腎がん、子宮頸がん、睾丸がん、頭部頚部がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、および黒色腫から選択される。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、ブリオスタチン剤を先に投与してから、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療剤を投与する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤を先に投与してから、治療有効量のCAR-T細胞を投与する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤を先に投与してから、治療有効量のCAR-NK細胞を投与する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤を先に投与してから、治療有効量の抗体剤を投与する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤を先に投与してから、治療有効量の抗体薬物複合体（ADC）を投与する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤を先に投与してから、治療有効量の二特異性抗体剤を投与する。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療剤の投与と同時に、ブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量のCAR-T細胞の投与と同時にブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量のCAR-NK細胞の投与と同時にブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量の抗体剤の投与と同時にブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量の抗体薬物複合体（ADC）の投与と同時にブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量の二特異性抗体剤の投与と同時にブリオスタチン剤を投与する。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療剤の投与に続いてブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量のCAR-T細胞の投与に続いてブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量のCAR-NK細胞の投与に続いてブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量の抗体剤の投与に続いてブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量の抗体薬物複合体（ADC）の投与に続いてブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、治療有効量の二特異性抗体剤の投与に続いてブリオスタチン剤を投与する。いくつかの場合では、mRNAの投与に続いてブリオスタチン剤を投与し、コードされたタンパク質の発現、移行、および提示を強化する。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、治療剤の投与は、対象に、細胞表面抗原に特異的に結合する治療有効量の抗体剤、ADC、二特異性抗体剤を投与することを含む。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、抗体剤は、ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を含む。特定の場合では、抗体剤は、IgG1アイソタイプまたはIgG4アイソタイプの全長抗体を含む抗体である。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合する治療剤は、細胞傷害剤を含むADCである。特定の場合では、細胞傷害剤は、サイトトキシンまたは放射性剤である。いくつかの場合では、細胞傷害剤は、ADCの抗体と、リンカーを介して複合体化されている。特定の場合では、リンカーは、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーから選択される。特定の場合では、細胞傷害剤は、カリチアマイシン、アウリスタチン、マイタンシノイド、タキソール誘導体、およびデュオカルマイシンから選択される。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合する治療剤は、イノツズマブオゾガマイシンおよびゲムツズマブオゾガマイシンから選択されるADCである。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、細胞表面抗原に特異的に結合する治療剤は、二特異性抗体剤である。特定の場合では、二特異性抗体は、抗CD20／抗CD22二特異性抗体融合タンパク質または抗CD19／抗CD22二特異性抗体融合タンパク質である。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、治療剤は、経口、眼内、経耳、皮下、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および吸入から選択されるルートにより投与される。いくつかの場合では、剤は経口投与される。いくつかの場合では、剤は眼内投与される。いくつかの場合では、剤は経耳投与される。いくつかの場合では、剤は皮下投与される。いくつかの場合では、剤は静脈内投与される。いくつかの場合では、剤は筋内投与される。いくつかの場合では、剤は皮内投与される。いくつかの場合では、剤は腹腔内投与される。いくつかの場合では、剤は吸入投与される。
本方法は、様々な異なるがんの治療に使用できる。たとえば、本開示の方法が有用であり得る代表的ながん状態および細胞種としては、黒色腫、骨髄腫、慢性リンパ性白血病（CLL）、AIDS関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、結腸直腸がん、腎がん、前立腺がん、頭部、頚部、胃、食道、肛門、または子宮頸部のがん、卵巣がん、乳がん、腹膜がん、および非小細胞肺がんが挙げられる。一態様では、がんは白血病またはB細胞性リンパ腫である。特定の場合では、B細胞性リンパ腫は非ホジキンリンパ腫である。一態様では、がんはバーキットリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病から選択される。特定の場合では、がんは、黒色腫、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、食道がん、または腎臓がんである。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、対象は哺乳動物である。いくつかの場合では、哺乳動物はヒトである。いくつかの場合では、哺乳動物はヒト以外、たとえばマウス類（たとえば、ラット、マウス）、ウサギ類（たとえば、ウサギ）、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、有蹄動物（たとえば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、その他である。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、哺乳動物対象は、細胞表面抗原標的指向治療に対し再発性または難治性である。特定の場合では、細胞表面抗原は、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD52、CD80、CD86、CD137、CDK4、CDK6、OX40、およびCD340から選択される。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、方法は、対象から得られた試料の標的がん細胞における細胞表面抗原のレベルまたは発現または提示を決定することをさらに含む。特定の場合では、患者から細胞を取り出し、標的抗原の発現または表面提示を強化するよう（たとえば本明細書に記載される）ブリオスタチン剤で処理し、それから剤で処理して、患者のがんのレベルを検出することができる。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、方法は、少なくとも1つの追加の抗がん療法を患者に施す工程をさらに含み、該追加の抗がん療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、チェックポイント阻害剤、手術、および脈管を標的とする療法から選択される。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、方法は、がんの状態をアッセイするために、対象の試料中の1つまたは複数のバイオマーカーを評価する工程をさらに含む。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、ブリオスタチン剤は、ブリオスタチン1の類似体であり、該ブリオスタチン剤の忍容用量の範囲は、ブリオスタチン1に対し相対的に50%以上向上する。特定の場合では、該ブリオスタチン剤の忍容用量の範囲は、ブリオスタチン1に対し相対的に50%以上、たとえば60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、またはさらに向上する。特定の場合では、該ブリオスタチン剤の忍容用量の範囲は、ブリオスタチン1に対し相対的に2倍以上、たとえば3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに向上する。
ブリオスタチン剤
本明細書で使用する場合、「ブリオスタチン化合物」および「ブリオスタチン剤」という用語は、基本のブリオスタチンファルマコフォアを有する化合物を指すのに交換可能に用いられ、該ファルマコフォアは、ブリオスタチン天然産物に基づき、かつ、いくつかの場合では、以下に示すブリオスタチン1の構造に例示されているように、埋め込まれた3つの6員環（たとえば、A、B、およびC環と称されるテトラヒドロピラン環）を含む大環状ラクトンを含む環を特徴とする骨格、および番号付けされたC1からC26の炭素原子の配置を有する。この骨格のラクトンは、C1カルボニルとC25ヒドロキシル基の酸素との結合により定められる。
Figure 2022533412000002
ブリオスタチン骨格は、C16とC17との間にアルケン、およびC13位およびC21位に環外アルケンを含み得る。ブリオスタチン骨格は、たとえばC3、C5、C7、C9、C11、C15、C19、C20、およびC23、C25、および／またはC26に、特定の立体中心の配置を含み得る。様々な置換基および誘導体基（たとえばエステルまたはエーテル基）が、（たとえば本明細書に記載される）本ブリオスタチン化合物に含まれ得る。もともと海洋生物の外肛動物から単離された天然ブリオスタチンは、約21の既知の化合物ファミリーを含む。「ブリオスタチン化合物」および「ブリオスタチン剤」という用語は、ブリオスタチン1などの天然ブリオスタチン化合物、ならびに生物学的活性に必要な官能基を保持している関心対象の非天然ブリオスタチン類似体および誘導体化合物を含む「ブリオスタチン類似体化合物」の両方を含むものとする。
「ブリオスタチン化合物」および「ブリオスタチン剤」という用語は、同じ基本のブリオスタチンファルマコフォア、すなわちその結合機能を提供する3つの水素結合ドナーおよびアクセプター、ならびに膜とのその結合を提供しかつそれに由来する機能を提供する脂質ドメインの三次元の空間的配置、を有する化合物を含むものとする。このブリオスタチンファルマコフォア、C1ドメインモデル、非C1ドメイン標的モデル（たとえばブリオスタチンまたはその類似体により調節される）、またはPKCファルマコフォアモデルは、1986年にWenderのチームが紹介したもので（たとえばWender, PNAS, 1986, 83, 4214-4218を参照）、それが1988年にブリオスタチンにまで及んで（たとえばWender, PNAS, 1988, 85, 7197-7201を参照）、最初のブリオスタチン類似体の設計に至った（たとえばWender, JACS, 1998, 120, 4534-4535;およびWender, PNAS, 1998, 95, 6624-6629を参照。それらの開示の全文が参照により本明細書に組み入れられる）。このファルマコフォアモデルはUS 8,735,609に記載されており、その開示の全文が参照により本明細書に組み入れられる。ブリオスタチン化合物は、本明細書では「認識ドメイン」（またはファルマコフォア領域）および比較的親油性の「スペーサードメイン」（またはリンカー領域）と呼ばれる2つの主な領域を有する、と広義に記述され得る。認識ドメインは、未変性ブリオスタチン大環の原子C19からC23により一部形成されるC環およびC1とC25との間のラクトン結合を含む、C17からC26を介しC1までの構造的特長と類似の構造的特長をもつ。他方のスペーサードメインは、未変性ブリオスタチン大環のC1からC17に対応する原子を結合して、C1原子とC17原子との間の相対的距離、およびC1C2およびC16C17結合の方向性を実質的に維持する。スペーサードメインは、認識ドメインを活性立体配座に維持する機能に加えて、任意の便利な合成手法により容易に誘導体化できる部分を与え、それによって生物学的活性を保持しながらも（たとえば副作用プロファイルを調節することにより）向上したインビボの安定性および薬理的特性を有する類似体を与える。ブリオスタチン1およびブリオスタチン類似体化合物を得るための例示的合成手順は、Wender et al. Science 2017, 358 (6360), 218-223および2017年9月28日に出願された国際公開PCT/US2017/054158に記載されており、それらの開示も参照により本明細書に組み入れられる。ブリオスタチンファミリーのリンカー領域は、ブリオスタチン様汎PKCアイソフォーム結合選択性、C1ドメインを有する他のタンパク質標的に対する結合選択性、他の非C1ドメイン標的に対する結合選択性、および親和性を保持している類似体、ならびに1つまたは複数のPKCアイソフォームだけに対する選択性および親和性を示す他の類似体を提供するよう、著しく異なることができる。したがって、多種多様のリンカーを用いて、ブリオスタチン1の結合活性を保持すること、または相補選択性を生み出すことができる。そのような選択性は、PKCおよび他の標的タンパク質の移行、ならびにPKCの治療活性のほか、オフターゲット作用にも影響する。いくつかの場合では、ブリオスタチン化合物は、6～14の鎖原子の連続鎖を含む直鎖、環式、または多環式リンカー部分である、リンカー部分Lを含み、その一態様は、C25からC1を介しC17への最短の経路を定めている。距離「d」は、（たとえばNMR分光法により実験的に決定した場合）約2.5～5.0オングストローム、好ましくは約3.5～4.5オングストローム、最も好ましくは約4.0オングストローム、たとえば約3.92オングストロームとなるべきである。したがって、Lは、C17からC1を介しC25まで連結する原子の直鎖のみからなり得るし、あるいは、C17からC1を介しC25までの連結を補助する1つまたは複数の環構造を含み得る。特定の場合では、リンカー領域は、ラクトン基（-C(=O)O-）、またはラクタム基（-C(=O)NH-）を含み、それが天然ブリオスタチンに存在するC1ラクトン部分との類似性により、認識領域のC25に連結する。加えて、リンカーは天然ブリオスタチンに見られるC3ヒドロキシルに類似のヒドロキシル基を含み得、したがってリンカーのC3ヒドロキシルと認識領域のC19ヒドロキシル基（と、任意で、未変性B環の酸素）との分子内水素結合の形成を許容する。いくつかの態様では、リンカーの終端は-CH(OH)CH2C(=O)O-であり、認識領域のC25にエステル（または環式の場合はラクトン）結合により結合する。リンカードメインを以下に例示する。
Figure 2022533412000003
本明細書に記載されるすべてのブリオスタチン化合物およびそれらの合成前駆物質に関し、基本のブリオスタチン骨格について上述したような大サイクリック環および付着置換基の原子に対応する原子に言及するのに、ナンバリング・スキームが用いられ得ることが理解される。関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、天然ブリオスタチン、たとえば、ブリオスタチン1、ブリオスタチン2、およびブリオスタチン3、ならびにブリオスタチン類似体、たとえばUS 8,735,609、US 7,256,286、US 8,816,122、US 9,096,550、および国際公開PCT/US2017/054158に記載されているようなものが挙げられ、それらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書には様々な新規なブリオスタチン化合物が記載されており、それらは国際公開PCT/US2017/054158に開示されている方法により入手できる。いくつかの場合では、本ブリオスタチン化合物は、プロテインキナーゼC調節因子としての活性をインビトロでもインビボでも有する。いくつかの場合では、ブリオスタチン化合物は、PKCアイソフォーム選択性を有する。特定の場合では、ブリオスタチン化合物は、PKCのC1ドメインに結合する。特定の場合では、本ブリオスタチン化合物は、C1ドメインを含むシグナリングタンパク質標的の調節因子としての活性を有する。任意の便利なC1ドメイン含有タンパク質を、本ブリオスタチン化合物による調節の標的とすることができる。例示的な関心対象のC1ドメイン含有タンパク質としては、限定ではないが、PKC、PKD、キメリン、ジアシルグリセロールキナーゼ、Unc-13およびMunc-13、グアニンヌクレオチド交換因子、筋緊張性ジストロフィーキナーゼ関連Cdc42結合キナーゼ等が挙げられる。「C1ドメイン」を有するタンパク質標的としては、AKAP13、ARAF、ARHGAP29、ARHGEF2、BRAF、CDC42BPA、CDC42BPB、CDC42BPG、CHN1、CHN2、CIT、DGKA、DGKB、DGKD、DGKE、DGKG、DGKH、DGKI、DGKK、DGKQ、DGKZ、GMIP、HMHA1、KSR1、KSR2、MYO9A、MYO9B、PDZD8、PRKCA、PRKCB1、PRKCD、PRKCE、PRKCG、PRKCH、PRKCI、PRKCN、PRKCQ、PRKCZ、PRKD1、PRKD2、PRKD3、RACGAP1、RAF1、RASGRP、RASGRP1、RASGRP2、RASGRP3、RASGRP4、RASSF1、RASSF5、ROCK1、ROCK2、STAC、STAC2、STAC3、TENC1、UNC13A、UNC13B、UNC13C、VAV1、VAV2、およびVAV3のいずれかのタンパク質が挙げられ得る。特定の場合では、本ブリオスタチン化合物は、C1ドメインを含まないシグナリングタンパク質標的の調節因子としての活性を有する。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C7エステルのバリエーションを特長とする化合物が挙げられる。特定の無水物をエステル化反応に用いることにより、またはたとえば任意の数のアルキルブロミドもしくは他の便利なエーテル化試薬を用いてエーテル化を実施することにより、任意の数のエステルまたはエーテル置換基をC7位に組み込むことができる。いくつかの場合では、本化合物は、たとえばブリオスタチン1などの標的天然ブリオスタチンと同じC7およびC9位にA環官能化を有する。
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXIVb）:
Figure 2022533412000004
を有し、式中、
W1は、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルキル、または置換アルキルであり;
「b」と示される共有結合が二重結合のときはZ2は=CR5R6または=NR7であり;「b」と示される共有結合が単結合のときはZ2は-OR8または-N(R7)2であり;
X1は、HまたはOR11であり;
Y1は、HまたはOR12であり;
R5、R6、R7、およびR8は、それぞれ独立して、H、アルキルオキシカルボニル（たとえば-CO2Me）、置換アルキルオキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルであり;
R11は、アシル、置換アシル、アルキル、または置換アルキルであり;
各R12は、独立して、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R13は、アルキルまたは置換アルキルであり;
R14およびR15は、独立して、Hまたはプロ部分であり;
R16は、H、アルキル、または置換アルキルである。
式（XXIVb）のいくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXIIb）:
Figure 2022533412000005
を有し、式中、
R4は、アルキルまたは置換アルキルであり;
「b」と示される共有結合が二重結合のときはZ2は=CR5R6または=NR7であり;
「b」と示される共有結合が単結合のときはZ2は-OR8または-N(R7)2であり;
R5、R6、R7、R8は、それぞれ独立して、H、アルコキシカルボニル（たとえば-CO2Me）、置換アルコキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルであり;
R11は、H、アシル、置換アシル、アルキル、または置換アルキルであり;
各R12は、独立して、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R13は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R14およびR15は、独立して、Hまたはプロ部分であり;
R16は、H、アルキル、または置換アルキルである。
式（XXIIb）のいくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXIIIb）:
Figure 2022533412000006
を有する。
式（XXIIb）および（XXIVb）のいくつかの場合では、R16はメチルである。式（XXIIb）、（XXIIIb）、および（XXIVb）のいくつかの場合では、R14はHまたはプロ部分である。式（XXIIb）、（XXIIIb）、および（XXIVb）のいくつかの場合では、R13はメチルである。式（XXIIb）および（XXIVb）のいくつかの場合では、R12はメチルである。式（XXIIb）および（XXIVb）のいくつかの場合では、R12はHである。式（XXIIb）、（XXIIIb）、および（XXIVb）のいくつかの場合では、R11はアセチルである。式（XXIIb）、（XXIIIb）、および（XXIVb）のいくつかの場合では、R11はHである。式（XXIIb）および（XXIIIb）のいくつかの場合では、R4はC3H7である。式（XXIIb）、（XXIIIb）、および（XXIVb）のいくつかの場合では、R15はHである。
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXI）:
Figure 2022533412000007
を有する天然ブリオスタチンの類似体、あるいはその溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ形態および／またはその塩であり、式中、
R4は、アルキルまたは置換アルキルであり;
「b」と示される共有結合が二重結合のときは、Z2はCR5R6またはNR7であり;
「b」と示される共有結合が単結合のときは、Z2はOR8またはN(R7)2であり;
R5、R6、R7、およびR8は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、アルキルオキシカルボニル、置換アルキルオキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルであり;
R11は、アシル、置換アシル、アルキル、または置換アルキルであり;
R12は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R13は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R14およびR15は、独立して、H、ヒドロキシル保護基、またはプロ部分である。
式（XXXI）のいくつかの場合では、R4はプロピルである。式（XXXI）のいくつかの場合では、R11はアルキルまたは置換アルキルである。式（XXXI）のいくつかの場合では、R11はアシルまたは置換アシルである。式（XXXI）のいくつかの場合では、R12はアルキルまたは置換アルキルである。
式（XXXI）のいくつかの場合では、「b」と示される共有結合が二重結合であり、Z2はNR7であり、R7はH、アルキルオキシカルボニル、置換アルキルオキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルである。特定の場合では、Z2はCFCO2R’であり、R’はアルキル（たとえばメチル）である。式（XXXI）のいくつかの場合では、「b」と示される共有結合が単結合であり、Z2はOR8またはN(R7)2であり、R7およびR8は、それぞれ独立して、H、アルキルオキシカルボニル（たとえば-CO2Me）、置換アルキルオキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルである。
いくつかの場合では、R13は、少なくとも2つの炭素または１つの置換アルキルを含むアルキルである。式（XXXI）のいくつかの場合では、R4は置換アルキルである。式（XXXI）のいくつかの場合では、R14はプロ部分である。
（たとえば本明細書に記載される）すべてのブリオスタチン類似体化合物は、後段の（たとえば合成シーケンスの工程の終わりに近い）C-H酸化反応により、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、アミノ、置換アミノ、アジド、またはハロゲン（たとえばF、Cl）で置換されている、主鎖（C1～C26）の脂肪族（sp3-混成）炭素を含むようにしてもよいことが理解される。いくつかの場合では、本方法は、後段のC-H酸化反応により、関心対象の置換基を骨格のC1～C26位の1つに組み込むことをさらに含む。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C19ヘミケタールのバリエーションを特長とするものが挙げられる。たとえば任意の便利なアルコール溶媒を利用することにより、任意の数のケタールを組み込むことができる。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C13位のバリエーションを特長とするものが挙げられる。C13位の可変性は、たとえばオレフィン化またはイミン形成により容易に実現され得る。いくつかの場合では、C13ケトンをアルコールに還元することができ、続いてアシル化またはエーテル化することができる。特定の場合では、C13ケトンを、任意の便利なアミノ反応物を用いて還元的アミノ化により修飾することができる。いくつかの場合では、C13エノアートのE異性体が得られ得る。特定の場合では、C13ケトンを修飾してスピロ環を形成する。特定の場合では、C13ケトンを修飾してホスファート、ヘテロ基、またはオルガノセレン基を形成する。
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXII）:
Figure 2022533412000008
を有する天然ブリオスタチンの類似体である。
C13位の可変性は、C13アルケンを改変することによっても得られ得る。いくつかの場合では、C13アルケンを、たとえばアルキルまたはハロゲン基で置換する。いくつかの場合では、C13アルケンを還元することができ、任意で、たとえばアルキル、アルコキシ、ハロゲン基等でさらに置換されていてもよい。いくつかの場合では、C13位のアルケンを、たとえばエポキシド化反応、シクロプロパン化反応、アジリジン形成、チイラン形成、環付加物形成、またはスピロ環形成により、炭素環またはヘテロ環を形成するように修飾することができる。いくつかの場合では、3つ以上の炭素、たとえば4つ以上の炭素、たとえば5つ以上の炭素、たとえば6つ以上の炭素、またはそれより多くの炭素で炭素環が形成される。いくつかの場合では、3員ヘテロ環が形成される。いくつかの場合ではより大きいヘテロ環、たとえば4員ヘテロ環、5員ヘテロ環、6員ヘテロ環、またはさらに大きいヘテロ環が形成される。
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXIA）～（XXXIC）:
Figure 2022533412000009
のいずれかにより記述される天然ブリオスタチンの類似体であり、式中、
R4は、アルキルまたは置換アルキルであり;
「b」と示される共有結合が二重結合のときはZ2は=CR5R6または=NR7であり;
「b」と示される共有結合が単結合のときはZ2は-OR8または-N(R7)2であり;
R5、R6、R7、およびR8は、それぞれ独立して、H、アルキルオキシカルボニル（たとえば-CO2Me）、置換アルキルオキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルであり;
R11は、H、アシル、置換アシル、アルキル、または置換アルキルであり;
R12は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R13は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R14は、H、またはプロ部分である。
式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれかのいくつかの場合では、R4は、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、またはオクチルから選択される。式（XXXIA）のいくつかの場合では、R4はプロピルである。式（XXXIB）のいくつかの場合では、R4はペンチルである。式（XXXIC）のいくつかの場合では、R4はヘプチルである。式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれかのいくつかの場合では、R11はアルキルまたは置換アルキルである。式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれかのいくつかの場合では、R11はアシルまたは置換アシルである。式（XXXIA）～（XXXIC）のいくつかの場合では、R12はアルキルまたは置換アルキルである。いくつかの場合では、R12は水素である。式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれかのいくつかの場合では、R13は水素である。式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれかのいくつかの場合では、R13はアルキル（たとえばメチル）である。式（XXXIA）～（XXXIC）のいくつかの場合では、R14は水素である。
式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれかのいくつかの場合では、「b」と示される共有結合は二重結合であり、Z2はCR5R6であり、R5、R6は、それぞれ独立して、H、アルキルオキシカルボニル、または置換アルキルオキシカルボニルである。いくつかの場合では、R5はHであり、R6は置換アルキルオキシカルボニルである。いくつかの場合では、R5はHであり、R6はアルキルオキシカルボニル（たとえば-CO2MeまたはCO2Et）である。いくつかの場合ではR5およびR6は両方ともHである。式（XXXIA）～（XXXIC）のいずれか1つのいくつかの場合では、「b」と示される共有結合は単結合であり、Z2はOR8であり、R8はH、アルキルオキシカルボニル（たとえば-CO2Me）、および置換アルキルオキシカルボニルから選択される。いくつかの場合では、R8は置換アルキルオキシカルボニルである。いくつかの場合では、R8はアルキルオキシカルボニル（たとえば-CO2Me）である。いくつかの場合では、R8はHである。
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXIA）のいずれかにより記述される天然ブリオスタチンの類似体である。いくつかの場合では、式（XXXIA）の構造は、次の構造のいずれかにより記述される。
Figure 2022533412000010
Figure 2022533412000011
Figure 2022533412000012
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXIB）のいずれかにより記述される天然ブリオスタチンの類似体である。いくつかの場合では、式（XXXIB）の構造は、次の構造のいずれかにより記述される。
Figure 2022533412000013
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXIC）のいずれかにより記述される天然ブリオスタチンの類似体である。いくつかの場合では、式（XXXIC）の構造は、次の構造のいずれかにより記述される。
Figure 2022533412000014
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXIII）:
Figure 2022533412000015
を有する天然ブリオスタチンの類似体であり、式中、
W1は、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アレニル、置換アレニル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール（heteoraryl）、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロ環、置換ヘテロ環、あるいは酸素もしくは窒素原子ならびに／またはシクロアルキル（cyclalkyl）、シクロアルケニル等を含む環および置換環を含む炭素鎖（たとえばPEGまたは修飾PEG基）であり;
X1は、HまたはOR11であり;
X2およびX3は、独立して、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、アシル、ヒドロキシル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアリール、ホスファート、オルガノセレン、チオ、置換チオから選択され、あるいはX2とX3とが結合して炭素サイクリック環またはヘテロサイクリック環、たとえばシクロプロパン、エポキシド、アジリジン、チイラン、4員スピロ環、5員スピロ環、もしくは6員スピロ環を形成し;
Y1は、HまたはOR12であり;
各R12は、独立して、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R13は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R16は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R14およびR15は、独立して、H、ヒドロキシル保護基、またはプロ部分;あるいはその溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ形態および／またはその塩である。
式（XXXIII）のブリオスタチン類似体の特定の態様では、X2およびX3は両方とも水素である。特定の場合では、X2またはX3の1つがヒドロキシルである。いくつかの場合では、X2およびX3は両方ともヒドロキシルである。
式（XXXIII）のブリオスタチン類似体のいくつかの態様では、該化合物は、次の構造のいずれかにより記述される。
Figure 2022533412000016
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C12もしくはC14位、またはC12およびC14位両方のバリエーションを特長とするものが挙げられる。B環の可変性は、本明細書に開示される任意の構造および式のC12もしくはC14炭素、またはC12およびC14炭素両方を改変することにより得られ得る。いくつかの場合では、C12炭素がアルキル化される。いくつかの場合では、C14炭素がアルキル化される。いくつかの場合では、C12炭素がハロゲンで置換される。いくつかの場合では、C14炭素がハロゲンで置換される。いくつかの場合では、C12またはC14位が、独立して、置換アルキル、アルコキシ、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、アシル、ヒドロキシル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアリール、ホスファート、ホスホリル、スルファート、スルホニル、オルガノセレン、チオ、置換チオからなる群より選択される基で置換される。
いくつかの態様では、ブリオスタチン化合物は、式（XXXIV）:
Figure 2022533412000017
を有する天然ブリオスタチンの類似体であり、式中、
W1は、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アレニル、置換アレニル、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、ヘテロ環、置換ヘテロ環、あるいは酸素もしくは窒素原子ならびに／またはシクロアルキル、シクロアルケニル等を含む環および置換環を含む炭素鎖（たとえばPEGまたは修飾PEG基）であり;
「b」と示される共有結合が二重結合のときはZ2はCR5R6またはNR7であり;
「b」と示される共有結合が単結合のときはZ2は、OR8、ホスファート、ホスホリル、チオ基、 スルファート、スルホニル、オルガノセレン基、またはN(R7)2であり;
R5、R6、R7、およびR8は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、アルキルオキシカルボニル、置換アルキルオキシカルボニル、アルキル、または置換アルキルであり;
X1は、HまたはOR11であり;
X4およびX5は、独立して、H、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、アミン、置換アミン、アミド、置換アミド、アシル、ヒドロキシル、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアリール、ホスファート、オルガノセレン、チオ、置換チオから選択され;
Y1は、HまたはOR12であり;
各R12は、独立して、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R13は、H、アルキル、または置換アルキルであり;
R16は、H、アルキル、または置換アルキルであり、
R14およびR15は、独立して、H、ヒドロキシル保護基またはプロ部分;あるいはその溶媒和物、水和物、もしくはプロドラッグ形態および／またはその塩である。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C26位のバリエーションを特長とするものが挙げられる。南半球フラグメントの合成の方法を改変することにより、C26アルコールにバリエーションを導入することができる。本ブリオスタチン化合物のいくつかの場合では、C26位のヒドロキシ基が化合物活性のために必要である。いくつかの場合では、C26位のバリエーションは、関心対象のブリオスタチン化合物のプロドラッグ形態を提供し、ここで該プロドラッグ形態は、インビボで遊離C26ヒドロキシル基への変換が可能である。
いくつかの態様では、本化合物をプロドラッグ形態で提供する。「プロドラッグ」は、活性剤を放出するのに体内での転換を要する、活性剤の誘導体を指す。特定の態様では、転換は、酵素的転換である。プロドラッグは、必ずしもではないが、変換により活性剤となるまでは、薬理学的に不活性であることが多い。「プロ部分」は、活性剤内で官能基をマスクするのに用いられると、該活性剤をプロドラッグへと変換させる、保護基の一形態を指す。いくつかの場合では、プロ部分を、酵素的または非酵素的手段によりインビボで切断される結合によって、薬物に付着させる。たとえばRautio et al.（“Prodrugs: design and clinical applications”, Nature Reviews Drug Discovery 7, 255-270 (February 2008)）に記載されるストラテジーおよび方法にしたがって、本化合物の任意の便利なプロドラッグ形態を調製することができる。
ブリオスタチン化合物のプロドラッグは、C26に特定のブリオスタチン類似体を含む。南半球フラグメントの合成の方法は、たとえばエステルによるC26アルコールの誘導体化を提供することができる。いくつかの場合では、C26位にエステル基が導入されると、得られるブリオスタチン誘導体を不活性化することができる。特定の態様では、C26エステル基の切断を、たとえば化学的に（たとえば特定のpHで、光化学的手段による）、または生物学的に（たとえば内在性エステラーゼの作用、ガンマもしくはイプシロンジスルフィド結合の還元、分子内トランスチオエステル化の促進、および遊離ヒドロキシル基の放出による）行って、遊離C26ヒドロキシル基を有するブリオスタチン化合物を放出することができる。このプロドラッグのストラテジーにより、関心対象のブリオスタチン化合物を、ブリオスタチンの活性を維持しながらも、そのPK（薬物動態）およびADME（吸収、分布、代謝、および排泄）特性などの薬理的特性が向上するように簡単に改変することができ、それを化合物投与後に遊離薬物として徐放させる。
切断可能な連結は、加水分解的に、酵素的に、またはそれ以外にインビボで切断され得る基を含み得る。不活性基は、アルキル基（たとえば、特定の切断速度を提供するために選択される）からオリゴペプチドまたは脂質（たとえば、細胞の吸収を強化するため）にわたり得る。修飾としては、限定ではないが、エステル、カルボナート、カルバマート、およびエーテルが挙げられ得、これらすべてがアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アミン、ヒドロキシル基、グアニジウム基、炭素環、およびヘテロ環を含み得る。
いくつかの態様では、式（XXXV）:
Figure 2022533412000018
の構造を形成するように、ブリオスタチン1を修飾する。
上記式中、R17は、エステル、カルボナート、カルバマート、およびエーテルから選択され、これらすべてが、任意で、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミン、ヒドロキシル、ジスルフィド、グアニジウム、炭素環、およびヘテロ環から選択される1つまたは複数の基で置換されていてもよい。いくつかの場合では、C7のアセタート基が、H原子、エステル、カルボナート、カルバマート、またはエーテルで置換されており、これらすべてが、任意で、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミン、ヒドロキシル、ジスルフィド、グアニジウム、炭素環、およびヘテロ環から選択される1つまたは複数の基で置換されていてもよい。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C26メチル位のバリエーションを特長とするものが挙げられる。南半球フラグメントを調製する方法は、C26メチル位に任意の便利なC26置換基を有する類似体を調製するようにしてもよい。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C20エステル位のバリエーションを特長とするものが挙げられる。任意の便利なエステル基を（たとえば本明細書に記載される）C20ヒドロキシル基上に組み込むことができる。いくつかの場合では、エステル基は、ブリオスタチン1のC20エステル位に存在するオクタジエノアートなどのオクタジエノアート基の前駆物質を含むアルキンである。南半球の合成を改変することにより、C20アルコール部分を多種多様のエステル基でエステル化することによって類似体を調製することができる。いくつかの場合では、本明細書に記載されるエステル基はすべて、C20ヒドロキシルの対応するアシルまたは置換アシル置換基といえることが理解される。いくつかの場合では、エステル基は、アルキルまたは置換アルキルエステルである。いくつかの場合では、エステル基は、アリールまたは置換アリールエステルである。いくつかの場合では、エステル基は、アルケニルまたは置換アルケニルである。いくつかの場合では、エステル基は、アルキニルまたは置換アルキニルエステルである。
関心対象のブリオスタチン化合物としては、限定ではないが、C21エノアートエステル位のバリエーションを特長とするものが挙げられる。任意の便利なエステル基を（たとえば本明細書に記載される）C20ヒドロキシル基上に組み込むことができる。
本開示の局面は、ブリオスタチン化合物、その塩（たとえば薬学的に許容される塩）、ならびに／またはその溶媒和物、水和物、および／もしくはプロドラッグ形態を含む。加えて、本明細書に記載される1つまたは複数のキラル中心を有するどの化合物も、絶対立体化学が明示されていなければ、各中心は、独立して、R配置、またはS配置、またはそれらの混合体のものであり得ることが理解される。本開示が、塩、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、および立体異性体のあらゆる変形を包含するものとすることが理解されよう。
いくつかの態様では、本ブリオスタチン化合物、またはそのプロドラッグ形態が、薬学的に許容される塩の形態で提供される。アミン、イミン、または窒素含有基を含む化合物は、塩基性の性質であり得、したがってあらゆる数の無機および有機酸と反応して薬学的に許容される酸付加塩を形成することができる。
いくつかの態様では、本化合物、そのプロドラッグ、立体異性体、または塩が、溶媒和物（たとえば水和物）の形態で提供される。本明細書で使用する場合、「溶媒和物」という用語は、1つまたは複数の溶質、たとえばプロドラッグまたはその薬学的に許容される塩の分子と、1つまたは複数の溶媒分子とで形成された複合体または凝集体を指す。そのような溶媒和物は、典型的には、実質的に固定した溶質対溶媒のモル比を有する、結晶質の固体である。代表的な溶媒としては、例として、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸等が挙げられる。溶媒が水の場合、形成した溶媒和物は水和物である。
細胞表面抗原
本明細書に記載される場合、細胞表面抗原とは、ネオ抗原およびmRNAの送達または発現から誘導される抗原を含むものとする。特定の場合では、細胞表面抗原は内在性である。特定の場合では、細胞表面抗原は内在性ネオ抗原である。特定の場合では、細胞表面抗原は、mRNAの投与から誘導され、そして発現して、抗原を生産するタンパク質（たとえば、mRNAメッセージに対応する）を生産する。この点において、mRNAを用いてどのタンパク質を発現させてもよく、そしてそのタンパク質の外在化により、新規な抗原を作ることができる。生産されるタンパク質は、抗原を生産するどのタンパク質であってもよく、そして本ブリオスタチン剤は、発現した抗原の細胞表面への移行および提示を強化するよう作用することができ、かつ該抗原の細胞表面での残留を延長させることができる。
いくつかの態様では、治療剤は、以下：
Figure 2022533412000019
Figure 2022533412000020
からなる群より選択される抗原に結合する。
強化されたCAR-T細胞療法の方法
本開示は、CAR-T細胞療法およびブリオスタチン剤を使って、対象において標的細胞集団に対するT細胞媒介性免疫応答を調節する方法を企図している。本開示はまた、CAR-NK細胞療法およびブリオスタチン剤を使って、対象において標的細胞集団に対するNK細胞媒介性免疫応答を調節する方法を企図している。特定の態様は、対象において標的細胞集団に対するT細胞媒介性またはNK細胞媒介性免疫応答を調節する方法を企図しており、該方法は、（a）キメラ抗原受容体を発現するよう遺伝子改変された治療有効性の複数の細胞を対象に導入する工程であって、該キメラ抗原受容体は、該標的細胞集団に結合することができる少なくとも1つの抗原特異的標的指向領域を含み、該キメラ抗原受容体標的指向領域が該標的細胞集団に結合すると、活性化誘導細胞死を誘発することができる、工程;および（b）該活性化誘導細胞死を防止または制限するのに十分な治療有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与する工程、を含む。特定の態様では、CARは、CD22標的細胞集団を特異的に認識する抗原結合ドメインを含む。本開示の特定の態様では、ブリオスタチン剤は、活性化したメモリーCD8+ T細胞の機能を強化する。他の態様では、ブリオスタチン剤の投与量は、細胞傷害性機能を強化するのに十分である。特定の場合では、ブリオスタチン剤の投与量は、標的細胞の細胞表面抗原の数を増加させることにより、CAR T細胞の活性を強化するのに十分である。
ブリオスタチン剤が、治療有効性の複数の細胞の投与よりも先に、同時に、または続いて投与される態様が企図される。本開示の特定の態様では、ブリオスタチン剤を皮下投与する。
特定の場合では、ブリオスタチン剤を、対象に投与する前に、エクスビボで複数の細胞と接触させる。特定の態様では、エクスビボでブリオスタチン剤と接触させる細胞は、治療を受ける対象から取り出される（たとえば自己細胞）。他の態様では、エクスビボでブリオスタチン剤と接触させる細胞は、ドナーから取り出される（たとえばアロジェニック細胞）。
本開示のキメラ抗原受容体は、2つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。いくつかの態様では、受容体は、T細胞受容体（TCR）である。いくつかの態様では、TCRは、1つまたは複数のCD3ポリペプチド、たとえば1つまたは複数のCD3ζポリペプチドを含む。いくつかの態様では、細胞表面受容体は、プロテアーゼ切断部位を含むTCRであって、該プロテアーゼ切断部位は、アルファ鎖の可変領域（αv）とアルファ鎖の定常領域（αc）との間;アルファ鎖の定常領域（αc）とアルファ鎖の膜貫通領域（αt）との間;ベータ鎖の可変領域（βv）とベータ鎖の定常領域（βc）との間;ベータ鎖の定常領域（βc）とベータ鎖の膜貫通領域（βt）との間;CD3ζポリペプチドが存在する場合はCD3ζポリペプチドの膜貫通ドメインとCD3ζポリペプチドの細胞質ドメインとの間に配置されており;またはTCRが2つ以上のプロテアーゼ切断部位をもつ場合はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの場合では、1つまたは複数のプロテアーゼ切断部位（および任意で、1つまたは複数の対応するプロテアーゼ）が、（1）アルファ鎖の可変領域（αv）とアルファ鎖の定常領域（αc）との間;（2）アルファ鎖の定常領域（αc）とアルファ鎖の膜貫通領域（αt）との間;（3）ベータ鎖の可変領域（βv）とベータ鎖の定常領域（βc）との間;（4）ベータ鎖の定常領域（βc）とベータ鎖の膜貫通領域（βt）との間;および（5）CD3ζの膜貫通領域とCD3ζの細胞質ドメインとの間に配置され得る。いくつかの態様では、本開示のTCRは、たとえばリンカー内に存在する、切断部位およびプロテアーゼ（シス配置）を含む。いくつかの態様では、細胞表面受容体がTCRの場合、プロテアーゼがトランスで供給され、つまり該プロテアーゼは切断部位を含むポリペプチド鎖の一部ではない。いくつかの態様では、プロテアーゼがトランスで供給される場合、該プロテアーゼはTCRの別の鎖に繋がれている。たとえば、切断部位がα鎖内に配置される場合、プロテアーゼはβ鎖上に供給され、逆もまた然りである。また、例として、切断部位は、CD3鎖（イプシロン、ガンマ、デルタ、またはゼータ）の1つの中に配置されてもよく、プロテアーゼは別のCD3鎖内に供給されてもよい。
本開示の改変受容体（たとえばCARまたは改変TCR）の細胞外結合ドメインは、抗原、たとえば細胞表面抗原、たとえばがん細胞表面の抗原またはMHC分子関連抗原性ペプチドに特異的に結合し得る。細胞外結合ドメインは、それがたとえば約105 M-1よりも高い、またはそれに等しい親和性またはKa（つまり、1/Mの単位の、特定の結合相互作用の平衡会合定数）で抗原に結合する、または抗原と結合する場合、該抗原に「特異的に結合する」。特定の態様では、細胞外結合ドメインは、約106 M-1、107 M-1、108 M-1、109 M-1、1010 M-1、1011 M-1、1012 M-1、または1013 M-1よりも高い、またはそれに等しいKaで抗原に結合する。「高親和性」結合は、少なくとも107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも109 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも1013 M-1、またはそれよりも高いKaでの結合を指す。あるいは、親和性は、Mの単位の、特定の結合相互作用の平衡解離定数（KD）（たとえば、10-5 M～10-13 M、またはそれよりも低い）と定義され得る。いくつかの態様では、特異的結合は、細胞外結合ドメインが、約10-5 Mよりも低い、もしくはそれに等しい、約10-6 Mよりも低い、もしくはそれに等しい、約10-7 Mよりも低い、もしくはそれに等しい、約10-8 Mよりも低い、もしくはそれに等しい、約10-9 M、10-10 M、10-11 M、または10-12 M、あるいはそれよりも低いKDで標的分子に結合することを意味する。標的抗原に対する細胞外結合ドメインの結合親和性は、従来の技法により、たとえば、競合ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、平衡透析法、表面プラズモン共鳴（SPR）法の使用（たとえばBIAcore 2000機、メーカーが概説している一般手順による）;放射免疫測定法等により、容易に決定することができる。
細胞外結合ドメインは、関心対象の標的抗原、たとえば標的細胞の表面の特定の抗原に結合する。細胞外結合ドメインは、抗体（たとえばscFvなどの単鎖抗体）、受容体(たとえば可変性リンパ球受容体)、受容体フラグメント（たとえばFc受容体フラグメント）、リガンド、サイトカイン、DARPin、アドネクチン（adnectin）、ナノボディ、およびペプチドを含み得る、またはそれからなり得る。
いくつかの態様では、CARの細胞外結合ドメインとしては、単鎖抗体が挙げられ、その非限定例としては、単鎖可変フラグメント（scFv）が挙げられる。単鎖抗体は、（たとえば本明細書に記載されるような）モノクローナル単鎖抗体、キメラ単鎖抗体、ヒト化単鎖抗体、完全ヒト単鎖抗体等であり得る。好適な細胞外結合ドメインとしては、Labanieh et al. (2018) Nature Biomedical Engineering 2:377-391に記載されているものが挙げられ、その開示の全文があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様では、CARの細胞外結合ドメインは、治療用（たとえば、患者において特定の疾患関連細胞の抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を誘導する、等）抗体としての使用に関し米国食品医薬品局および／または欧州医薬品庁（EMA）に承認された抗体、または標的分子に結合する能力を保持しているそのフラグメント（たとえば、そのような抗体の単鎖バージョン、たとえば該抗体のscFvバージョン）である。
別の局面では、CARの細胞外結合ドメインは、標的細胞の表面の分子に特異的に結合する。標的細胞は、関心対象の任意の細胞種であり得る。たとえば、標的細胞は、遺伝子的におよび／または表現型的に正常な細胞であり得る。他の態様では、標的細胞は、遺伝子的におよび／または表現型的に異常な細胞であり得る。関心対象の異常細胞としては、限定ではないが、がん細胞、腫瘍微小環境の細胞（たとえば腫瘍間質細胞）、たとえばがん関連線維芽細胞（CAF）、骨髄系由来サプレッサー細胞（MDSC）、腫瘍関連マクロファージ（TAM）、腫瘍内皮細胞（TEC）等が挙げられる。たとえば、Labanieh et al. (2018) Nature Biomedical Engineering 2:377-391を参照されたい。「がん細胞」とは、腫瘍性の細胞の表現型を示す細胞を意味し、たとえば、異常な細胞増殖（growth）、異常な細胞増殖（proliferation）、密度依存性増殖阻害の喪失、非足場依存性増殖の潜在能力、免疫低下非ヒト動物モデルにおける腫瘍の増殖および／もしくは発生を促進する能力、ならびに／または細胞転換の任意の適切な指標のうちの1つまたは複数を特徴とし得る。「がん細胞」は、本明細書では「腫瘍細胞」、「悪性細胞」、または「がん性細胞」と交換可能に用いられ、固形腫瘍、半固形腫瘍、血液学的悪性疾患（たとえば白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、その他）、一次腫瘍、転移性腫瘍等のがん細胞を包含する。
特定の態様では、CARを発現するT細胞またはNK細胞は、B細胞性悪性疾患、CLL、ALL、B-ALL、白血病、リンパ腫、または固形腫瘍を治療するのに有効である。いくつかの場合では、固形腫瘍は、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、軟組織肉腫、リンパ腫、食道がん、子宮がん、骨がん、副腎がん、肺がん、甲状腺がん、結腸がん、グリオーマ、肝臓がん、膵臓がん、腎がん、子宮頸がん、睾丸がん、頭部頚部がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、および黒色腫から選択される。
CARは、抗原に結合する（たとえばscFvなどの抗体）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含み得る。
いくつかの態様では、CARは、様々なドメイン間に1つまたは複数のリンカー配列を含む。「可変領域連結配列」はアミノ酸配列であって、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、かつこれら2つのサブ結合ドメインの相互作用と両立するスペーサー機能を提供するので、得られるポリペプチドは、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持している。特定の局面では、リンカーが、1つまたは複数の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、同時刺激ドメイン、および／または一次シグナリングドメインを隔てている。特定の態様では、CARは、1、2、3、4、もしくは5、またはそれ以上のリンカーを含む。特定の態様では、リンカーは、約1～約25アミノ酸長、約5～約20アミノ酸長、もしくは約10～約20アミノ酸長、またはそれらの間の任意のアミノ酸長である。いくつかの態様では、リンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、またはそれ以上のアミノ酸長である。
いくつかの態様では、CARの結合ドメインに1つまたは複数のスペーサードメインが続いており、それが抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面（たとえばCARを発現するT細胞の表面）から離れさせて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および／または活性化を可能にする。スペーサードメイン（および本明細書に記載される任意の他のスペーサードメイン、リンカー等）は、天然、合成、半合成、または組み換えソースのどれに由来してもよい。特定の態様では、スペーサードメインは、限定ではないが、1つまたは複数の重鎖定常領域、たとえばCH2およびCH3を含む、免疫グロブリンの一部分である。スペーサードメインは、天然免疫グロブリンのヒンジ領域または改変された免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。一態様では、スペーサードメインは、IgG1、IgG4、またはIgDのCH2および／またはCH3を含む。本明細書に記載されるCARに好適に使用される例示的スペーサードメインとしては、CD8αおよびCD4などの1型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、それはそうした分子またはそのバリアントに由来する野生型ヒンジ領域であり得る。特定の局面では、ヒンジドメインは、CD8αヒンジ領域を含む。いくつかの態様では、ヒンジはPD-1ヒンジまたはCD152ヒンジである。
「膜貫通ドメイン」（TMドメイン）は、CARの一部分であって、細胞外結合部分と細胞内シグナリングドメインとを融合させ、かつ細胞（たとえば免疫エフェクター細胞）の細胞膜にCARを係留する。Tmドメインは、天然、合成、半合成、または組み換えソースのどれに由来してもよい。いくつかの態様では、Tmドメインは、T細胞受容体のアルファまたはベータ鎖、CD35、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、およびPD-1の に由来する（たとえば少なくともその膜貫通領域または機能性部分を含む）。
一態様では、CARは、CD8αに由来するTmドメインを含む。特定の局面では、CARは、CD8αに由来するTmドメイン、およびCARのTmドメインと細胞内シグナリングドメインとを連結する、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長の間の短いオリゴまたはポリペプチドリンカーを含む。そのようなリンカーとして、たとえばグリシン-セリンリンカーが使用され得る。
CARの「細胞内シグナリング」ドメインは、CARの標的分子／抗原との結合から免疫エフェクター細胞内部へのシグナル伝達に関与するCARの一部を指し、このシグナル伝達によってエフェクター細胞機能、たとえば活性化、サイトカイン生産、増殖および／または細胞傷害性活性、たとえばCARが結合している標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または標的分子／抗原と細胞外CARドメインとの結合により誘発されるその他の細胞応答を誘発する。したがって、「細胞内シグナリングドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、かつ細胞が特別な機能を実施するよう指令する、タンパク質の一部分を指す。細胞内シグナリングドメインの切断型部分が使用される場合は、そのような切断型部分がエフェクター機能シグナルを伝達するかぎり、それを全長細胞内シグナリングドメインの代わりに使用することができる。細胞内シグナリングドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを十分に伝達できる細胞内シグナリングドメインの任意の切断型部分を含むものとする。
T細胞を完全に活性化するには、T細胞受容体（TCR）を通じて生成されるシグナルだけでは不十分なので、二次または同時刺激シグナルも必要である。したがって、T細胞の活性化は、TCR（たとえばTCR／CD3複合体）による抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナリングドメイン、および抗原に依存せず作用して二次または同時刺激シグナルを与える同時刺激シグナリングドメインの、2つの別個のクラスの細胞内シグナリングドメインに媒介される。したがって、本開示のCARは、1つまたは複数の「同時刺激シグナリングドメイン」および1つの「一次シグナリングドメイン」を含む細胞内シグナリングドメインを含み得る。
一次シグナリングドメインは、TCR複合体の一次活性化を刺激により、または阻害により制御する。刺激により作用する一次シグナリングドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（または「ITAM」）として知られるシグナリングモチーフを含み得る。本開示のCARに好適に使用されるITAMを含む一次シグナリングドメインの非限定例としては、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79α、CD79β、およびCD66δに由来するものが挙げられる。特定の態様では、CARは、1つのCD3ζ一次シグナリングドメイン、および1つまたは複数の同時刺激シグナリングドメインを含む。細胞内一次シグナリングドメインおよび同時刺激シグナリングドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に機能的に連結されている。
いくつかの態様では、CARは、CARを発現するT細胞の効力および増殖（expansion）を強化するため、1つまたは複数の同時刺激シグナリングドメインを含む。本明細書で使用する場合、「同時刺激シグナリングドメイン」または「同時刺激ドメイン」という用語は、同時刺激分子またはその活性フラグメントの細胞内シグナリングドメインを指す。特定の態様で企図される、CARに好適に使用される同時刺激分子の例としては、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54（ICAM）、CD83、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD278（ICOS）、DAP10、LAT、KD2C、SLP76、TRIM、およびZAP70が挙げられる。いくつかの態様では、CARは、4-1BB、CD28、CD137、およびCD134からなる群より選択される1つまたは複数の同時刺激シグナリングドメイン、およびCD3ζ一次シグナリングドメインを含む。
特定の局面では、本開示のCARは、関心対象の抗原に結合する抗原結合部分（たとえばscFvなどの単鎖抗体）;CD4、CD8α、CD154、およびPD-1からなる群より選択されるポリペプチド由来の膜貫通ドメイン;4-1BB、CD28、CD134、およびCD137からなる群より選択されるポリペプチド由来の1つまたは複数の細胞内同時刺激シグナリングドメイン;ならびにFcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79α、CD79β、およびCD66δからなる群より選択されるポリペプチド由来の細胞内シグナリングドメインを含む。そのようなCARは、抗原結合部分と膜貫通ドメインとの間にスペーサードメイン、たとえばCD8アルファヒンジをさらに含み得る。
強化された標的指向抗がん方法
本開示は、ブリオスタチン剤を利用して標的がん細胞を調節し、該がん細胞における抗原の発現または細胞表面提示を選択的に強化する、標的指向抗がん療法を強化する方法を企図している。特定の態様は、対象のがんを治療する方法を企図しており、該方法は、（a）標的がん細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する（たとえば本明細書に記載される）治療有効量のブリオスタチン剤を対象に導入する工程;および（b）該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与する工程を含む。特定の態様では、対象は、標的指向抗がん療法に対し再発性または難治性である。
本開示の特定の態様では、標的がん細胞は、ブリオスタチン剤での治療の前に、該標的細胞表面に治療無効レベルの細胞表面抗原を提示している。本ブリオスタチン剤は、細胞表面に提示される細胞表面抗原が治療有効レベルで提示されるように強化することができる。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面抗原の発現を強化する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、発現した細胞表面抗原の標的細胞表面への移行を強化する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面抗原の標的細胞表面での残留を強化する。したがって、ブリオスタチン剤の投与量は、表面抗原の細胞傷害性機能を強化するのに十分である。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、ブリオスタチン剤は、細胞表面抗原の細胞表面提示を50%以上強化する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面提示を55%以上、たとえば60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、100%以上、またはさらに強化する。いくつかの場合では、ブリオスタチン剤は、細胞表面提示を2倍以上、たとえば3倍以上、4倍以上、5倍以上、またはさらに強化する。
がんを治療する方法のいくつかの態様では、標的がん細胞の細胞表面抗原の残留が、ブリオスタチン剤の投与後2日以上にわたり強化される。特定の場合では、標的がん細胞の細胞表面抗原提示が、ブリオスタチン剤の投与後3日以上、たとえば4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、またはそれより長期にわたり強化される。
ブリオスタチン剤が、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療有効量の治療剤の投与よりも先に、同時に、または続いて投与される態様が企図される。本開示の特定の態様では、ブリオスタチン剤を皮下投与する。
いくつかの態様では、標的細胞ががん細胞である場合、治療剤の抗原結合部分が結合するがん細胞の表面の分子は、腫瘍関連細胞表面分子または腫瘍特異的細胞表面分子である。「腫瘍関連細胞表面分子」とは、悪性細胞に発現するが正常な組織の細胞では発現が限られている細胞表面分子、正常細胞と比べて悪性細胞にはるかに高い密度で発現する細胞表面分子、または発生的に発現する細胞表面分子を意味する。
標的細胞ががん細胞である場合、該がん細胞は、その表面に腫瘍関連分子または腫瘍特異的分子を発現させる場合があり、それに治療剤の抗原結合部分が結合する。特定の態様では、標的がん細胞は、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD30、CD34、CD40、CD52、CD80、CD86、およびCD340から選択される腫瘍抗原を含む。特定の態様では、そのような腫瘍関連分子または腫瘍特異的分子は、HER2、B7-H3（CD276）、CD19、CD20、GD2、CD22、CD30、CD33、CD56、CD66/CEACAM5、CD70、CD74、CD79b、CD123、CD133CD138、CD171、ネクチン-4、メソテリン、膜貫通糖タンパク質NMB（GPNMB）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、SLC44A4、CA6、チロシン-プロテインキナーゼMet（c-Met）、上皮増殖因子受容体バリアントIII（EGFRvIII）、ムチン1（MUC1）、エフリンA型受容体2（EphA2）、グリピカン2（GPC2）、グリピカン3（GPC3）、fms様チロシンキナーゼ3（FLT3）、葉酸受容体アルファ（FRα）、IL-13受容体アルファ2（IL13Rα2）、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、B細胞成熟抗原（BCMA）、デルタ様3（DLL3）、κ軽鎖、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、栄養膜糖タンパク質（TPBG）、未分化リンパ腫キナーゼ（ALK）、CA-IX、インテグリン、C-X-Cケモカイン受容体4型（CXCR4）、ニューロピリン-1（NRP1）、マトリプターゼ、および他の関心対象の腫瘍関連または腫瘍特異的分子から選択される。
特定の態様では、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療剤は、抗体剤である。本開示に関連して阻害剤として用いられ得る抗体は、限定ではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二特異性抗体、Fab抗体フラグメント、F(ab)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント（たとえばVHまたはVL）、単鎖Fv抗体フラグメント、およびdsFv抗体フラグメントを包含し得る。さらに、抗体分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。本開示に関連して用いられ得る抗体は、成熟または未処理の、任意の免疫グロブリン定常領域に連結される、任意の抗体可変領域を含み得る。抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のマイナーなバリエーションは、そうしたアミノ酸配列のバリエーションが配列の75%以上、たとえば80%以上、90%以上、95%以上、または99%以上を維持しているならば、本開示に包含される。具体的には、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、側鎖が互いに関連しているアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。アミノ酸の変更が機能性ペプチドを生じるかどうかは、そのポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることにより決定することができる。
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分、たとえばインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント;ジアボディ;直鎖抗体（Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)）;単鎖抗体分子;ならびに複数の抗体フラグメントで形成された多特異性抗体が挙げられる。抗体をパパイン消化すると、「Fab」フラグメントと呼ばれる、それぞれが1つの抗原結合部位をもつ2つの同一の抗原結合フラグメントと、その残りの、容易に結晶化する能力を反映した呼称の「Fc」フラグメントとが生じる。ペプシン処理によりF(ab’)2フラグメントが生じ、これは2つの抗原結合部位をもち、なおも抗原に架橋結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識・結合部位を含む、最小の抗体フラグメントである。この領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインとが非共有結合によりしっかりと結合した、二量体からなる。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位を画定するのがこの構成である。6つのCDRが共同で、抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、可変ドメイン1つ（または抗原に特異的なCDRを3つしか含まない、Fvの半分）でも抗原を認識し結合する能力があるとはいえ、全結合部位よりは親和性が低い。
「Fab」フラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1定常ドメイン（CH1）も含む。FabフラグメントがFab’フラグメントと異なる点は、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域の1つまたは複数のシステインを含む、少数の残基が付加されていることである。本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）が遊離チオール基を担持するFab’を、Fab’-SHと呼ぶ。F(ab’)2抗体フラグメントは、もともとFab’フラグメントの対が間にヒンジのシステインを有するものとして生産された。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
あらゆる脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる2つの明確に異なる型の一方に割り当てられ得る。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの主要なクラスは、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つであり、これらのいくつかは、たとえばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、およびIgA2のサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられ得る。
「単鎖Fv」または「sFv」抗体フラグメントは、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは1本のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの態様では、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、該リンカーはsFvが抗原に結合する望ましい構造を形成することを可能にする。sFvの総説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照されたい。
したがって、本開示に関連して用いられ得る抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二特異性抗体、Fab抗体フラグメント、F(ab)2抗体フラグメント、Fv抗体フラグメント（たとえばVHまたはVL）、単鎖Fv抗体フラグメント、およびdsFv抗体フラグメントを包含し得る。さらに、抗体分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの態様では、抗体分子はモノクローナル完全ヒト抗体である。
本開示に関連して用いられ得る抗体は、成熟または未処理の、任意の免疫グロブリン定常領域に連結される、任意の抗体可変領域を含み得る。軽鎖可変領域が定常領域に連結される場合、それはカッパ鎖定常領域であり得る。重鎖可変領域が定常領域に連結される場合、それはヒトガンマ1、ガンマ2、ガンマ3、またはガンマ4定常領域、より好ましくは、ガンマ1、ガンマ2、またはガンマ4、より好ましくはガンマ1またはガンマ4であり得る。
抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のマイナーなバリエーションは、そうしたアミノ酸配列のバリエーションが、配列の少なくとも75%以上、たとえば少なくとも80%以上、90%以上、95%以上、または99%以上を維持しているならば、本開示に包含される。具体的には、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、側鎖が互いに関連しているアミノ酸ファミリー内で生じる置換である。アミノ酸の変更が機能性ペプチドを生じるかどうかは、そのポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることにより決定することができる。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメント（または類似体）は、当業者であれば容易に調製することができる。フラグメントまたは類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界付近にある。構造的および機能性ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列データを公開または非公開の配列データベースと比較することにより特定され得る。好ましくは、コンピューターによる比較方法を使って、既知の構造および／または機能をもつ他のタンパク質に生じる配列モチーフまたは予測タンパク質立体配座ドメインを特定する。既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を特定する方法は公知である。配列モチーフおよび構造的立体配座を用いて、本発明の構造的および機能性ドメインを定義することができる。
本開示を使用し得る抗体の非限定例としては、アデカツムマブ、アスクリンバクマブ（Ascrinvacumab）、シズツムマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ（Duligotumab）、デュルバルマブ、デュシギツマブ（Dusigitumab）、エンホルツマブ、エノチクマブ（Enoticumab）、フィギツムマブ（Figitumumab）、ガニツマブ、グレンバツムマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イクルクマブ、レクサツムマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、ナルナツマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ（Nesvacumab）、オファツムマブ、オララツマブ、パニツムマブ、パトリツマブ、プリツムマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、ロバツムマブ、セリバンツマブ、タレクスツマブ（Tarextumab）、テプロツムマブ、トベツマブ、バンチクツマブ（Vantictumab）、ベセンクマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、フランボツマブ、アルツモマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、ベクツモマブ、ブリナツモマブ、デツモマブ、イブリツモマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナプツモマブ、ノフェツモマブ、ペムツモマブ、ピンツモマブ、ラコツモマブ、サツモマブ、ソリトマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、トシツモマブ、トレメリムマブ、アバゴボマブ（Abagovomab）、イゴボマブ（Igovomab）、オレゴボマブ、カプロマブ、エドレコロマブ、ナコロマブ、アマツキシマブ、バビツキシマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、デルロツキシマブ（Derlotuximab）、ジヌツキシマブ、エンシツキシマブ（Ensituximab）、フツキシマブ（Futuximab）、ギレンツキシマブ（Girentuximab）、インダツキシマブ（Indatuximab）、イサツキシマブ、マルゲツキシマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、ウブリツキシマブ、エクロメキシマブ（Ecromeximab）、アビツズマブ（Abituzumab）、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ（Bivatuzumab）、ブロンチクツズマブ、カンツズマブ、カンツズマブ、シタツズマブ（Citatuzumab）、クリバツズマブ（Clivatuzumab）、ダセツズマブ、デミシズマブ、ダロツズマブ、デニンツズマブ、エロツズマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エノブリツズマブ、エトラシズマブ、ファーレツズマブ、フィクラツズマブ、ゲムツズマブ、イムガツズマブ、イノツズマブ、ラベツズマブ、リファスツズマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルムレツズマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ニモツズマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オトラーツズマブ（Otlertuzumab）、オナルツズマブ、オポルツズマブ、パラサツズマブ、ペルツズマブ、ピナツズマブ、ポラツズマブ、シブロツズマブ、シムツズマブ、タカツズマブ、ティガツズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ（Tucotuzumab）、バンドルツズマブ（Vandortuzumab）、バヌシズマブ（Vanucizumab）、ベルツズマブ、ボルセツズマブ（Vorsetuzumab）、ソフィツズマブ（Sofituzumab）、カツマキソマブ、エルツマキソマブ（Ertumaxomab）、デパツキシズマブ（Depatuxizumab）、オンツキシズマブ（Ontuxizumab）、ブロンツベトマブ（Blontuvetmab）、タムツベトマブ（Tamtuvetmab）、またはその抗原結合バリアントが挙げられる。本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、特定の同族抗原に結合する（たとえばHER2はトラスツズマブ）が、親抗体よりも少ないかもしくは多くのアミノ酸を有する抗体、親抗体に対し相対的に1つもしくは複数のアミノ酸置換を有する抗体、親抗体の単鎖バリアント（たとえばscFvバリアント）である抗体、またはその任意の組み合わせを指す。
特定の態様では、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療剤は、細胞傷害剤と複合体化された(たとえば本明細書に記載される)抗体である。特定の態様では、細胞傷害剤はサイトトキシンまたは放射性剤である。特定の場合では、細胞傷害剤は、カリチアマイシン、アウリスタチン、マイタンシノイド、タキソール誘導体、およびデュオカルマイシンから選択される。
特定の場合では、細胞傷害剤は化学療法剤である。関心対象の具体的な化学療法剤としては、限定ではないが、ゲムシタビン、ドセタキセル、ブレオマイシン、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、トラメチニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トラスツズマブ、アド-トラスツズマブエムタンシン、リツキシマブ、イピリムマブ、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、メトトレキサート、ドキソルビシン、アブラキサン、フォルフィリノックス、シスプラチン、カルボプラチン、5-フルオロウラシル、テイスモ（Teysumo）、パクリタキセル、プレドニゾン、レボチロキシン、ペメトレキセド、ナビトクラクス、およびABT-199が挙げられる。ペプチド化合物も使用され得る。関心対象のがん化学療法剤としては、限定ではないが、ドラスタチンならびにその活性類似体および誘導体;ならびにアウリスタチンならびにその活性類似体および誘導体（たとえば、モノメチルアウリスタチンD（MMAD）、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）等）が挙げられる。たとえばWO 96/33212、WO 96/14856、およびU.S. 6,323,315を参照されたい。好適ながん化学療法剤としては、マイタンシノイドならびにその活性類似体および誘導体（たとえばEP 1391213;およびLiu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623を参照）;デュオカルマイシンならびにその活性類似体および誘導体（たとえば合成類似体、KW-2189およびCB1-TM1を含む）;ベンゾジアゼピンならびにその活性類似体および誘導体（たとえばピロロベンゾジアゼピン（PBD））;カリチアマイシンならびにその活性類似体および誘導体（たとえば、カリチアマイシンを用いる抗体薬物複合体としては、ゲムツズマブオゾガマイシンおよびイノツズマブオゾガマイシンが挙げられる）も挙げられる。いくつかの態様では、ADCは、イノツズマブオゾガマイシンおよびゲムツズマブオゾガマイシンから選択される。
ADCの特定の態様では、細胞傷害剤は、抗体と、リンカーを介して複合体化される。本ADCでは任意の便利な連結基が利用され得る。「リンカー」、「連結」、および「連結基」という用語は交換可能に用いられ、2つ以上の化合物を（たとえば抗体と関心対象の細胞傷害剤とを）共有結合により接続する連結部分を指す。いくつかの場合では、リンカーは二価である。特定の場合では、リンカーは分枝または三価連結基である。いくつかの場合では、リンカーは、200以下の原子（たとえば100以下の原子、80以下の原子、60以下の原子、50以下の原子、40以下の原子、30以下の原子、または20以下の原子）の長さの直鎖または分枝主鎖をもつ。連結部分は、2つの基を接続する共有結合、または1～200原子長、たとえば約1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、100、150、もしくは200炭素原子長の直鎖もしくは分枝鎖であり得、ここでリンカーは、直鎖、分枝、環式、または1個の原子であり得る。特定の場合では、リンカー主鎖の1、2、3、4、または5以上の炭素原子が、任意で、硫黄、窒素、または酸素ヘテロ原子で置換されていてもよい。特定の場合では、リンカーがPEG基を含む場合、リンカー主鎖のそのセグメントの原子が2つおきに酸素で置換されている。主鎖の原子間の結合は飽和でも不飽和でもよく、普通はリンカー主鎖に存在する不飽和結合は1つだけ、2つ以下、または3以下である。リンカーは、1つまたは複数の置換基、たとえばアルキル、アリール、またはアルケニル基を含み得る。リンカーは、限定ではないが、オリゴ(エチレングリコール）、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、カルボナート、カルバマート、三級アミン、アルキル（直鎖または分枝であり得る）、たとえば、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル（イソ-プロピル）、n-ブチル、n-ペンチル、1,1-ジメチルエチル（t-ブチル）等を含み得る。リンカー主鎖は、環式基、たとえばアリール、ヘテロ環、またはシクロアルキル基を含み得、ここで環式基の2つ以上の原子、たとえば、2、3、または4つの原子が主鎖に含まれる。リンカーは、切断可能でも切断不可能でもよい。リンカーは、ペプチド、たとえば残基の連結配列であり得る。リンカーは、ヒドラジンリンカーであり得る。リンカーはジスルフィドリンカーであり得る。
特定の態様では、細胞表面抗原に特異的に結合して対象のがんを治療する治療剤は、二特異性抗体である。特定の場合では、二特異性抗体は、抗CD20／抗CD22二特異性抗体融合タンパク質である。特定の場合では、二特異性抗体は、抗CD19／抗CD22二特異性抗体融合タンパク質である。
強化された標的指向抗がん方法の特定の態様では、対象の自然免疫系が、該対象のがんを治療する治療剤として有効に作用する。強化された標的指向抗がん方法の特定の場合では、対象の適応免疫系が、該対象のがんを治療する治療剤として有効に作用する。この点において、特定の態様は、対象のがんを治療する方法を企図しており、該方法は、（a）標的がん細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示を強化する（たとえば本明細書に記載される）治療有効量のブリオスタチン剤を該対象に導入すること;および（b）強化された細胞表面抗原またはネオ抗原の該対象の免疫系による排除によって該対象のがんを治療することを含む。
組成物
本発明の局面は、組成物、たとえば関心対象のブリオスタチン剤を含む組成物も含む。
本明細書で論じる組成物は、任意の便利な賦形剤、試薬、および方法を用いて製剤することができる。組成物は薬学的に許容される賦形剤とともに製剤として提供される。当技術分野では多種多様の薬学的に許容される賦形剤が公知であり、本明細書で詳述する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、たとえばA. Gennaro (2000) “Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.を含む様々な刊行物に広く記載されている。
ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手できる。さらに、pH調節・緩衝剤、浸透圧調節剤、安定剤、湿潤剤等の薬学的に許容される補助物質が一般に容易に入手できる。
いくつかの態様では、ブリオスタチン剤を水性バッファー中で製剤する。好適な水性バッファーとしては、限定ではないが、5 mMから100 mMまでのさまざまな強度の、酢酸、コハク酸、クエン酸、およびリン酸バッファーが挙げられる。いくつかの態様では、水性バッファーは、等張液を与える試薬を含む。そのような試薬としては、限定ではないが、塩化ナトリウム;およびたとえばマンニトール、デキストロース、スクロース等の糖類が挙げられる。いくつかの態様では、水性バッファーは、ポリソルベート20または80などの非イオン性界面活性剤をさらに含む。任意で、製剤は、保存料をさらに含み得る。好適な保存料としては、限定ではないが、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等が挙げられる。多くの場合、製剤は約4℃で保存される。製剤を凍結乾燥する場合もあり、そのような場合、製剤は、概して、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、マンニトール等の抗凍結剤を含む。凍結乾燥製剤は、環境温度でも長期保存が可能である。いくつかの態様では、本化合物は持続性放出用に製剤される。
いくつかの態様では、ブリオスタチン剤と、（たとえば本明細書に記載される）細胞表面抗原に特異的に結合する第2の治療剤、たとえばキメラ抗原受容体を発現するT細胞（CAR T細胞）、抗体剤、抗体薬物複合体（ADC）、および二特異性抗体剤、その他（たとえば本明細書に記載されるようなもの）とを、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤（たとえば同剤または別剤）として個体に投与する。いくつかの態様では、製剤を少なくとも1つの追加の抗がん療法と併せて患者に投与し、ここで追加の抗がん療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、チェックポイント阻害剤、手術、および脈管を標的とする療法から選択される。特定の態様では、チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性T-リンパ球関連抗原4（CTLA-4）阻害剤、プログラム死1（PD-1）阻害剤、またはPD-L1阻害剤から選択される。
別の局面では、ブリオスタチン剤、またはその薬学的に許容される塩、異性体、互変異性体、もしくはプロドラッグを含む、または本質的にそれからなる、かつ関心対象の1つまたは複数の追加の抗がん剤をさらに含む、薬学的組成物が提供される。本方法では本化合物と一緒に任意の便利な抗がん剤を利用することができる。本化合物は、単位剤形として投与され得、当技術分野で周知の任意の方法により調製され得る。そのような方法は、本化合物を、1つまたは複数の補助成分を構成する薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることを含む。薬学的に許容される担体は、選択される投与ルートおよび標準的な薬学的慣例をもとに選択される。各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、かつ対象に対し傷害性ではない、という意味で「薬学的に許容され」なくてはならない。この担体は、固体でも液体でもよく、そのタイプは一般に、使用されている投与のタイプをもとに選択される。
好適な固形担体の例としては、ラクトース、スクロース、ゼラチン、寒天、およびバルク粉末が挙げられる。好適な液体担体の例としては、水、薬学的に許容される油脂、アルコール類もしくはその他の有機溶媒、たとえばエステル、エマルジョン、シロップもしくはエリキシル、懸濁液、溶液および／もしくは懸濁液、および溶液、ならびに／または非発泡性顆粒から再構成された懸濁液、および発泡性顆粒から再構成された発泡性調製物が挙げられる。そのような液体担体は、たとえば、好適な溶媒、保存料、乳化剤、懸濁剤、希釈剤、甘味料、増粘剤、および溶解剤を含有し得る。好ましい担体は、可食油、たとえばコーン油またはキャノーラ油である。ポリエチレングリコール、たとえばPEGもよい担体である。
本開示の投与計画を提供する任意の薬物送達デバイスまたはシステムを用いることができる。多種多様の送達デバイスおよびシステムが、当業者には公知である。
必要ないかもしれないが、本明細書に記載される化合物および剤は、任意で、任意の既知の標的化手段を用いて、がん部位を標的とすることができる。本開示の化合物は、化合物をがん部位に向けることが実証されている多種多様の化合物といっしょに製剤することができる。「がん部位に向ける」および「がん標的指向」という用語は、化合物をがんの部位に向けることを指し、したがって対象に投与された化合物の少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、もしくは少なくとも約90%、またはそれ以上ががん部位に侵入することを指す。
投与量および投与
いくつかの態様では、「治療有効量」とは、個体に単剤療法または併用療法で1つまたは複数の用量を投与したとき、該対象において標的細胞におけるタンパク質の発現を、ブリオスタチン剤での治療をしない標的細胞における該タンパク質の発現と比べて、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%強化するのに有効な、本ブリオスタチン剤の量である。他の態様では、「治療有効量」とは、個体に単剤療法または併用療法で1つまたは複数の用量を投与したとき、該対象において標的細胞におけるタンパク質の表面提示を、ブリオスタチン剤での治療をしない標的細胞における該タンパク質の表面提示と比べて、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%強化するのに有効な、本ブリオスタチン剤の量である。
いくつかの態様では、ブリオスタチン剤の有効量は、約50 ng/ml～約50 μg/ml（たとえば、約50 ng/ml～約40 μg/ml、約30 ng/ml～約20 μg/ml、約50 ng/ml～約10 μg/ml、約50 ng/ml～約1 μg/ml、約50 ng/ml～約800 ng/ml、約50 ng/ml～約700 ng/ml、約50 ng/ml～約600 ng/ml、約50 ng/ml～約500 ng/ml、約50 ng/ml～約400 ng/ml、約60 ng/ml～約400 ng/ml、約70 ng/ml～約300 ng/ml、約60 ng/ml～約100 ng/ml、約65 ng/ml～約85 ng/ml、約70 ng/ml～約90 ng/ml、約200 ng/ml～約900 ng/ml、約200 ng/ml～約800 ng/ml、約200 ng/ml～約700 ng/ml、約200 ng/ml～約600 ng/ml、約200 ng/ml～約500 ng/ml、約200 ng/ml～約400 ng/ml、または約200 ng/ml～約300 ng/ml）の範囲の量である。
いくつかの態様では、ブリオスタチン剤の有効量は、約10 pg～約100 mg、たとえば、約10 pg～約50 pg、約50 pg～約150 pg、約150 pg～約250 pg、約250 pg～約500 pg、約500 pg～約750 pg、約750 pg～約1 ng、約1 ng～約10 ng、約10 ng～約50 ng、約50 ng～約150 ng、約150 ng～約250 ng、約250 ng～約500 ng、約500 ng～約750 ng、約750 ng～約1 μg、約1 μg～約10 μg、約10 μg～約50 μg、約50 μg～約150 μg、約150 μg～約250 μg、約250 μg～約500 μg、約500 μg～約750 μg、約750 μg～約1 mg、約1 mg～約50 mg、約1 mg～約100 mg、または約50 mg～約100 mgの範囲の量である。この量は、1回の用量の場合もあるし、1日の総量の場合もある。1日の総量は、10 pg～100 mgの範囲であり得、または100 mg～約500 mgの範囲であり得、または500 mg～約1000 mgの範囲であり得る。
いくつかの態様では、ブリオスタチン剤の1回の用量が投与される。他の態様では、複数の用量が投与される。一定の期間にわたり複数の用量が投与される場合、化合物は、一定の期間にわたり、1日2回（bid）、毎日（qd）、1日おき（qod）、2日おき、3回／週（tiw）、または2回／週（biw）投与され得る。たとえば、化合物が、1日～約2年以上にわたり、bid、qd、qod、tiw、またはbiwで投与される。たとえば、1週間、2週間、1カ月間、2カ月間、6カ月間、1年間、もしくは2年間、またはそれ以上にわたり、様々な要因に応じて、上記の頻度のいずれかでブリオスタチン剤が投与される。いくつかの態様では、化合物は、他にも投与ルートは複数あるが、経口、眼内、経耳、皮下、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および吸入により投与され得る。いくつかの態様では、化合物は、複数のコースで投与され得、1～7日間にわたり得る「休薬日」が可能である。
特定の態様では、ブリオスタチン剤の用量は、たとえば本明細書に記載されるブリオスタチン剤のプロドラッグである。
キット
本開示のブリオスタチン剤を含むキットも提供される。本開示のキットは、1つまたは複数の投与量のブリオスタチン剤、および任意で、1つまたは複数の投与量の1つまたは複数の追加の治療剤を含み得る。いくつかの態様では、キットは、1つまたは複数の投与量の（たとえば本明細書に記載される）ブリオスタチン剤;細胞表面抗原に特異的に結合する、1つまたは複数の投与量の治療有効量の（たとえば本明細書に記載される）治療剤を含む。製剤は、単位剤形として便利に提供され得る。そのようなキットは、製剤、たとえば単位用量を収容する容器に加えて、本発明の方法における本製剤の使用を記載した情報の添付文書、たとえば該単位用量を用いて病原体血管新生に関連する細胞状態を治療する指示書を含む。キットという用語は、パッケージ化された活性剤（単数または複数）を指す。いくつかの態様では、本システムまたはキットは、ある用量の（たとえば本明細書に記載される）本化合物、およびある用量の（たとえば本明細書に記載される）第2の活性剤を、対象の（たとえば本明細書に記載される）血管新生関連の疾患または状態を治療するのに有効な量として含む。
上述の構成要素に加えて、本キットは、たとえば本方法を実施するために該キットの構成要素を使用するための指示書をさらに含み得る。指示書は、一般に、好適な記録媒体に記録されている。たとえば、指示書は、紙またはプラスチックその他の基体に印刷され得る。したがって、指示書は、添付文書としてキットに、（すなわちパッケージングまたはサブパッケージングと関連して）キットまたはその構成要素の容器の表示その他に存在し得る。他の態様では、指示書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、たとえばCD-ROM、DVD-ROM、ブルーレイ、ディスケット、ハードディスクドライブ（HDD）、ポータブル・フラッシュ・ドライブその他に、電子記憶データファイルとして存在し得る。さらに他の態様では、実際の指示書はキット内に存在せず、遠隔ソースから、たとえばインターネットを介して指示書を入手する手段が提供される。この態様の一例は、指示書を閲覧できる、および／または指示書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様、指示書を入手するこの手段は、好適な基体に記録されている。
いくつかの態様では、キットは、ブリオスタチン剤を含む本薬学的組成物の第1の投与量、および関心対象の治療剤を含む本薬学的組成物の第2の投与量を含む。
用途
本方法は、関心対象の標的細胞におけるタンパク質の発現または細胞表面提示を選択的に強化して、該標的細胞の活性を調節するのに使用される。本方法は、治療、診断、および研究の用途を含む、関心対象の細胞の調節が望ましい様々な用途に使用され得る。
本方法は、HIV/AIDSおよびがんの根絶を含む、有効な治療法のない疾患の治療に使用され得る。本方法はまた、自然または適応免疫系細胞による排除に対し関心対象の標的細胞を増感させることにも使用され得る。本方法はまた、標的指向抗がん療法に対し再発性または難治性である対象の治療にも使用され得る。
本方法は、疾患（たとえばがん）の状態をアッセイするために、対象の試料中の1つまたは複数のバイオマーカーを評価する工程を含み、診断用途に使用され得る。
以下の各例は、限定としてではなく、例示として提供される。
以下の各例は、本発明をいかにしてなし、そして使用するかについて、当業者に完全に開示しかつ説明するために記載するものであって、本発明者らが発明と考えるものの範囲を制限する意図もなければ、以下の実験が本発明者らが実施したすべてのまたは唯一の実験であるとする意図もない。用いた数値（たとえば量、温度、その他）については正確を期するよう努めたが、多少の実験誤差および偏差は斟酌されたい。特に明記しない限り、部とは重量部であり、分子量とは重量平均分子量であり、温度とは摂氏温度であり、圧力とは大気圧またはほぼ大気圧である。
分子・細胞生化学の一般的な方法はMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997);およびCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)などの標準的な教科書に記載されており、その開示が参照により本明細書に組み入れられる。本開示で言及する、または本開示に関連する方法の試薬、クローニングベクター、細胞、およびキットはBioRad, Agilent Technologies, Thermo Fisher Scientific, Sigma-Aldrich, New England Biolabs (NEB), Takara Bio USA, Inc.等の民間業者から、ならびにたとえばAddgene, Inc., American Type Culture Collection (ATCC)等のリポジトリーから入手可能である。
緒言
モノクローナル抗体（mAb）、抗体薬物複合体（ADC）、二特異性抗体（biAb）、およびキメラ抗原受容体（CAR）T細胞を含む、がん治療用の標的指向性生物学的製剤および細胞療法の開発が、腫瘍学に変革をもたらしている。腫瘍特異的細胞表面抗原およびネオ抗原を標的指向することにより、こうした療法は細胞傷害性化学療法に伴う全身性の毒性を回避しつつも効率的かつ選択的に悪性細胞を排除できることから、従来の治療選択肢とは一線を画すメリットを提供することができる。mAb、ADC、biAb、およびCAR T療法は、多種多様な作用機構に依存し、また異なる宿主生体系を活用して腫瘍を排除するが、いずれも基本的には共通する要件、具体的には十分かつ持続的な標的抗原提示という要件に基づいている。がん免疫学におけるこうした最近の進歩は医学的に有望であるものの、標的抗原の表面発現の減少による腫瘍エスケープおよび抵抗性獲得が、これらのアプローチの効力および範囲を限定してしまう。実際に、いくつかの適応にわたって、不定かつ減少した抗原発現と関連のある応答の持続性の低さおよび患者の再発が観測されている。たとえばLim et al. Cell 2017, 168(4), 724-740; June et al. Science 2018, 359 (6382), 1361-1365; Sharma et al. Cell 2017, 168 (4), 707-723; Loganzo et al. Mol. Cancer Ther. 2016, 15 (12), 2825-2834; Fry et al. Nat. Med. 2017;およびMajzner et al. Cancer Discov. 2018, 8 (10), 1219-1226を参照されたい。標的抗原の表面発現を強化し持続させるアジュバントを特定すれば、そうしたアジュバントを標的指向性生物学的製剤および細胞療法と組み合わせて用いて応答性の患者数および応答の持続時間の両方を増加させることができるため、この問題に広く取り組むことができ、かつこうしたアプローチの効力を改善することができよう。
海洋性マクロライドであり、かつ強力なPKC調節因子であるブリオスタチン1(たとえばPettit et al. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104 (24), 6846-6848;およびKortmansky et al. Cancer Invest. 2003, 21 (6), 924-936を参照）は、腫瘍および他の細胞系の表面抗原の発現を改変してそれらをより免疫原性にすること、したがってより免疫排除しやすくすることができる。いくつかの前臨床および臨床試験の報告によると、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、および非ホジキンリンパ腫（NHL）において、ブリオスタチン1は免疫表現型を改変でき、かつがん細胞の免疫原性を増加させることができる（たとえばHammond et al. J. Immunother. 2005, 28 (1), 28-39; Katib et al. Hematol. 1993, 21 (1), 61-64; Varterasian et al. J. Clin. Oncol. 1998, 16 (1), 56-62; Al Katib et al. J. Immunother. 1993, 14, 33-42; Varterasian et al. Clin. Cancer Res. 2000, 6 (3), 825-828;およびShaha et al. Clin. Exp. Immunol. 2009, 158 (2), 186-198を参照）。設計されたブリオスタチン類似体（ブリオロジー（bryology）または「ブリオスタチン剤」）が、ブリオスタチン1のように、慢性リンパ性白血病（CLL）細胞で細胞表面抗原の提示を増加させることができることも実証されている（Hammond et al. J. Immunother. 2005, 28 (1), 28-39;およびKatib et al. J. Immunother. 1993, 14, 33-42）。
さらに、ブリオスタチン1およびその類似体の一部は、潜在性HIV感染CD4+ T細胞の細胞表面の活性化マーカーであるCD69の提示を誘導することができ、したがってHIV根絶に向けての「キック・アンド・キル」アプローチの前臨床リードになり得ることも見出されている（DeChristopher et al. Nat. Chem. 2012, 4 (9), 705-710; Marsden et al. PLOS Pathog. 2017, 13 (9), e1006575;およびAlbert et al. Sci. Rep. 2017, 7 (1), 7456）。
臨床評価の抗原標的指向ストラテジーのなかでも、CAR T細胞療法は、近年、B細胞悪性疾患の非常に有効な治療として台頭している。にもかかわらず、抵抗性獲得および患者の再発の主要な促進要因として、抗原の喪失が観測されている。本発明者らは、ブリオスタチン1および例示的類似体を抗CD22 CAR T療法と組み合わせて用いることで、悪性細胞が有効に排除される十分なレベルのCD22の表面発現を確実に維持でき、それによって患者転帰を改善できることを発見した。
この分野の研究の大半は、ほんの少数の天然産物、より具体的にはブリオスタチン1に焦点を当てている。タキサンおよびアベルメクチンに関する研究からも明白であるように、天然産物の直近の合成前駆物質および誘導体、いわゆる「至近」類似体は、優れた臨床性能を提供することが多い（Omura et al. Nat. Rev. Microbiol. 2004, 2 (12), 984-989;およびPazdur et al. Cancer Tret. Rev. 1993, 19 (4), 351-386）。ところが、ブリオスタチン1の場合、そうした類似体の利用は、合成誘導体を作るのに必要な入手可能な材料の不足により妨げられており、極めて複雑なブリオスタチン骨格の修飾に伴う内在的な困難がそれに追い打ちをかけている。当初の「選りすぐり」のブリオスタチンは臨床使用の材料を提供したが、生体供給源のフサコケムシ14トンから18グラムしか生産されず（収率0.00014%）、今はそれも尽きようとしている（Schaufelberger et al. J. Nat. Prod. 1991, 54 (5), 1265-1270）。天然ブリオスタチンの入手可能性は薄く、不定でもあるので、この海洋性供給源からの再収集は環境的な懸念を生むことになろう（Keough, J. Biol. Bull. 1989, 177 (2), 277-286）。養殖（「水槽」および「外洋」）および工学的生合成が模索されたが、前者は資本化に直面して問題が生じ、後者はブリオスタチン1の生産に必要な相利共生細菌の培養の困難に直面した（Mendola, D. Biomol. Eng. 2003, 20 (4-6), 441-458）。本発明者らは最近、この問題に対する解決策を報告した。それはブリオスタチン1の実用的な化学合成であって、必要に応じてのこの天然産物のグラムスケール量への持続可能なアクセスが初めて可能になり、したがってその継続的な評価が確実に行える（Wender et al. Science 2017, 358 (6360), 218-223）。さらに、この化学合成法は、ブリオスタチン類似体を開発するための、およびブリオスタチン大環状骨格の周りの様々な位置における構造と活性との関係を探究するためのプラットフォームにもなり得、したがってヒト疾患の研究および治療のためのブリオスタチンをヒントとする次世代小分子の設計および合成が可能になる。ブリオスタチン1がアルツハイマー病の治療、HIV/AIDSの根絶、多発性硬化症、ニーマン・ピック病、脆弱X、および強化された免疫療法を含む多数の適応に関して前臨床および臨床試験されていることから、またこうした適応の多くに種々のPKCアイソフォームが関与していることから、種々の類似体が、それらの相異なる選択性および忍容性によって、種々の適応にわたり優れた活性を示し得ることが示唆される。
実施例1： ブリオスタチン類似体の設計
ここでは例示的ブリオスタチン類似体の設計、合成、および評価について開示する。設計ストラテジーの主眼は、化合物のPKCに対する親和性に大きく影響することは見込めずとも、PKCの機能に影響を及ぼすことができ、かつ必要に応じて製剤およびADME（吸収、分布、代謝、および排泄）の特徴の調整にも場合によっては使えるような化学的修飾をブリオスタチン骨格に施すことであった（図1、パネルA）。18の類似体を調製した。
図1.（パネルA）C環サブユニットのファルマコフォア要素がC1カルボニル、C19ヘミケタール、およびC26アルコールとして示されている、ブリオスタチン骨格の逆合成分析。類似体合成の関心対象エリアとしてC13を強調している（球で示す）。（パネルB）PKC-ブリオスタチン-膜三元複合体のレンダリング。ブリオスタチン1を長方形のボックス内に示す。ブリオスタチン骨格のC環サブユニットのファルマコフォア要素（図1、パネルAを参照）がPKC（ダークグレー）と直接相互作用し、A環およびB環は細胞膜（ライトグレー）に埋め込まれている。ACS Cent. Sci. 2018, 4, 89-96を参照されたい。（パネルC）REDOR NMRにより決定された、実験的に決定された分子内距離にフィットしているPKCに結合したブリオスタチン骨格の代表的配座異性体。ACS Cent. Sci. 2018, 4, 89-96を参照されたい。（パネルD）酸1およびエナール2からのブリオスタチン骨格の収束的な構築。C13官能基は、（上記で図1、パネルAについて記載したように）C環のファルマコフォア要素への干渉を避けながら、後段の多様化の万能出発点を提供している。
これらの化合物は、本発明者らのオリジナルのファルマコフォアモデルでPKC結合用に提案されたファルマコフォアの官能基を保持するよう設計した。そのモデルとも合致して、本明細書に開示される例示的類似体のほとんどが、代表的PKCアイソフォームに対し、ブリオスタチン1に匹敵する一桁のナノモル親和性を示した（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986, 83 (12), 4214-4218;およびWender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85 (19), 7197-7201）。それに対し、細胞フリー結合親和性データとは関係なく、生細胞でPKC活性化を測定する機能アッセイでは多岐にわたる活性プロファイルが観測され、施した各修飾が特異な生物学的機能を実際に誘発し得ることが示された。重要なことに、抗原標的指向療法に関連して、インビトロのALLモデルで、例示的類似体がCD22表面発現を増加させる能力も調査した。いくつかの例示的類似体はブリオスタチン1と同様の活性を示すことが見出され、それらの化合物がより入手しやすく、効果的な、より忍容される、がん免疫療法および他の適応のアジュバントとなり得ることが示唆された。
例示的ブリオスタチン類似体の設計ストラテジーは、本発明者らが以前提案したブリオスタチンファルマコフォアモデル（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85 (19), 7197-7201）によって導かれ、膜微小環境でPKCに結合したブリオスタチン1および標識化類似体の分子動態シミュレーション（Ryckbosch et al. Nat. Commun. 2017, 8 (1), 6）およびREDOR NMR研究（Yang et al. ACS Cent. Sci. 2018, 4 (1), 89-96）によってさらに増強された。PKCは、そのサブドメイン構造に基づき従来型（α、β、γ）または新型（δ、ε、η、θ）に分類される、7つの同種シグナリングキナーゼのファミリーである（Newton, A. C. J. Biol. Chem. 1995, 270 (48), 28495-28498）。PKCの個々のアイソフォーム、アイソフォームの組み合わせ、および変異体アイソフォームが、いくつもの疾患病理に関与している（Newton, A. C. AJP Endocrinol. Metab. 2010, 298 (3), E395-E402;およびNewton, A. C. Semin. Cancer Biol. 2018, 48, 18-26）。PKCの成熟および活性化は、リン酸化、立体配座の変化、そして最終的に細胞膜へ移行し、そこで多数の下流シグナリングタンパク質のリン酸化を引き起こす、というしっかりと編成された流れに支配されている（Newton, A. C. J. Biol. Chem. 1995, 270 (48), 28495-28498;およびNewton, A. C. Chem. Rev. 2001, 101 (8), 2353-2364）。リガンド誘導性PKC活性化の特質は、細胞膜と、リガンドと、PKCとの三元複合体の形成である（図1、パネルB）。この文脈で、ブリオスタチン骨格は、別個であるが相互依存する機能をもつ、2つのサブユニットと考えることができる。ある数のPKC調節因子間の類似性を探った本発明者ら独自のコンピューター調査によると、ブリオスタチン骨格のC環サブユニットの、またはその近位の水素結合性官能基、具体的にはC1カルボニル、C26ヒドロキシル、およびC19ヘミケタールは、北サブユニットのA環およびB環によって、PKCの内在性リガンドDAGと似た結合性立体配座になるよう、予め空間的にまとめられていることがわかった（図1、パネルAおよびC）（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85 (19), 7197-7201; Ryckbosch et al. Nat. Commun. 2017, 8 (1), 6; Yang et al. ACS Cent. Sci. 2018, 4 (1), 89-96;およびWender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 1998, 95 (12), 6624-6629)。実際、重要な研究で、C1、C26、およびC19官能基の修飾または欠失によりPKC結合が減少するか、または皆無となるが、A環およびB環の変更は概して結合にほとんどまたはまったく影響しないことが明らかになり、例示的ブリオスタチン類似体のこれらのサブユニットに変更を加えることで、機能および体内分布を変えられる可能性が示唆された（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998, 95 (12), 6624-6629; Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85 (19), 7197-7201; Wender et al. In Natural Products in Medicinal Chemistry; Wiley-VCH, 2014; pp 473-544; Wender et al. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (21), 6658-6659; Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108 (17), 6721-6726; およびDeChristopher et al. Nat. Chem. 2012, 4 (9), 705-710）。
北サブユニットは、ブリオスタチンのC環サブユニットのファルマコフォア要素を生産的なPKC結合性立体配座に空間的に制限することに加えて、最近の長時間尺度（400～500 μs）分子動態シミュレーションによれば、PKCの移行効率のほか、膜におけるリガンドPKC複合体の深度および配向性にも影響すると考えられる（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85 (19), 7197-7201; Ryckbosch et al. Nat. Commun. 2017, 8 (1), 6; Yang et al. ACS Cent. Sci. 2018, 4 (1), 89-96;および Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 1998, 95 (12), 6624-6629）。具体的には、膜-サイトゾル界面での水分子によるA環およびB環における酸素付加の相互作用が、ブリオスタチンPKC複合体に、膜に対し浅い傾斜した向きをとらせると推測される（図1、パネルB）（Ryckbosch et al. Nat. Commun. 2017, 8 (1), 6; Yang et al. ACS Cent. Sci. 2018, 4 (1), 89-96）。この配向はブリオスタチン1-PKC複合体に独特であることが見出され、フォルボール二酪酸（PDBu）およびプロストラチンなどの他の有力なPKCリガンドをモデルした場合はそうはならなかったので、それらがPKC結合の競合力はあるが下流の活性はしばしば対照的であることの説明がつく。別の研究では、REDOR NMRと分子動態シミュレーションとの組み合わせによって、PKC結合ブリオスタチン配座異性体の分布が特定されたが（図1、パネルC）、それはブリオスタチン骨格に独特な特長であって、フォルボールエステル誘導体では観測されなかった（Yang et al. ACS Cent. Sci. 2018, 4 (1), 89-96）。これらの研究を総合すると、ブリオスタチン骨格が利用できる複数のPKC結合配座異性体は、活性化したPKCリガンド複合体の特異な配向を生むことができ、かつPKCと下流エフェクタータンパク質との相互作用に影響し得ることが示唆され、したがってブリオスタチンの独特な生物学的活性の説明がつく。そこから示唆されるのは、ブリオスタチン骨格のA環およびB環に対する修飾は、ブリオスタチン骨格の立体配座のエネルギー地勢に、ひいては活性PKCシグナリング複合体の配向に影響を及ぼすことによって、化合物の機能に影響し得ることである。この規範の枠組みを用いて、ブリオスタチンC環のファルマコフォア要素は保持できるがブリオスタチンB環C13に一連の系統的修飾を含む、一連の化合物を設計した。この部位を選択したのは、コンピューター調査から、この位置の修飾はPKC結合親和性を保持するが、機能に影響を与え得ると示唆されたためである。後段の合成中間体に見られるこの位置の独特な反応性を利用することで、この位置に多様な化学的官能性をもつ例示的ブリオスタチン類似体を生成することができ、膜結合、輸送、および下流シグナリング成果に影響を与えることにより、北半球の様々な置換パターンが化合物の機能にいかに影響し得るかを探ることができた。
実施例2： ブリオスタチン類似体の合成
本発明者らは以前、収束型の短工程のブリオスタチン1の合成について報告しており、多様化可能なブリオスタチン大環骨格（exo-オレフィン3、図1、パネルD）を、ほぼ同じ複雑度の2つの構成単位から最長の直線型シーケンス15工程、全25工程で組み立てることを可能にした（図1、パネルD）。たとえばWender et al. Science 2017, 358 (6360), 218-223;および2017年9月28日に出願された国際公開PCT/US2017/054158を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。図1、パネルDを参照すると、山口エステル化によって、カルボン酸1とエナール2とを収率82%で互いに結合させる。続いてプリンス大環状化によりブリオスタチンのB環が形成され、大環が閉環する。重要なことに、プリンス環化反応によりexo-オレフィン3が生じ、それはこの重要中間体（advanced intermediate）の後段の多様化の化学ハンドルとなることが期待された。exo-オレフィン3は、新たなB環官能基を直接組み込むように選択的に修飾してもよいし、本発明者らのチームが開発した化学量論的オゾン分解手順により対応するケトン4に変換してもよい。これらの2つの官能基は、複雑で繊細なブリオスタチン骨格を装飾するその他の官能基に対し主として直交する化学反応性を与える。したがって本発明者らは、ブリオスタチンのB環に対する修飾が化合物の機能にいかに影響し得るかを探る出発点として、これらの基を用いようと考えた。
C13のケミカルスペースの探究初期には、C13 exo-オレフィンの独特な反応性を利用して一連の例示的構造的類似体を生成しようと努めた。過去のブリオスタチン骨格の合成作業では、この重要中間体に見られる4つのパイ系のうち、このオレフィンの反応性がおそらく最も高いことが示された（Wender et al. Science 2017, 358 (6360), 218-223）。C13 exo-オレフィンの化学選択的官能化の例示的合成スキームを以下に示す（スキーム1）。
Figure 2022533412000021
スキーム1. C13 exo-オレフィンの化学選択的官能化
スキーム1を参照すると、SUW200のジヒドロキシル化により、C16/C17アルケン、C20アルキノアート、およびC21ジエノアートの存在下、近接ジオール5がきれいに得られた。それに対し、exo-オレフィン3およびブリオスタチン1のDMDOおよびmCPBAによるエポキシ化は制御し辛いことが判明したが、興味深いことに、異なる化学選択性が提供された。H2および触媒Pd/Cを用いてC13オレフィンを還元する試みも制御しにくく、還元産物の混合物が得られることが多かった。それでも本発明者らは、C21エノアートもC16/17オレフィンも還元することなく、C13 exo-オレフィンおよびC20アルキノアートのきれいな還元を達成することができ、化合物5を生じ、これを次に脱保護してSUW226を得た。また、以前記述したようにしてオレフィン3を直接脱保護してSUW200を得ることもできる（Wender et al. Science 2017, 358 (6360), 218-223）。
C13オレフィンを修飾する努力に続いて着目したのは、C13ケトン4の修飾であった。この重要中間体が理想的な多様化ポイントとなったのは、C13ケトンはこの一連の重要中間体に見られるその他の官能基に対し直交する化学反応性を示すので、いくつかの他のパイ系の存在下で3のC13 exo-オレフィンの選択的修飾から生じる諸問題を回避できるからである。C13ケトン4の化学選択的官能化の例示的合成スキームを以下に示す（スキーム2）。
Figure 2022533412000022
スキーム2. C13ケトンのホーナー・ワズワース・エモンズオレフィン化によるC13エノアートの合成
スキーム2を参照すると、合成は、C13位の一連のアルキルエノアートの合成から開始した。ケトン4から様々なエステル基を有する一連の化合物を生成して、置換基のサイズおよびエノアートの幾何形状が化合物の機能にいかに影響するかを探った。望ましいアルコールとジエチルホスホノ酢酸との直接のカップリングにより調製した対応するホーナー・ワズワース・エモンズ（HWE）試薬を用いてのケトン4のHWEオレフィン化により、エステル誘導体を得た。本発明者らのブリオスタチン1の合成で報告された二重結合の幾何形状を制御するためのキラルHWE試薬の使用とは異なり、オレフィン化産物6の(E)および(Z)異性体の両方を得るために、これらの反応を単純な非立体選択的HWE試薬を用いて実施することを選んだ。続いてエノアートジアステレオマーの全脱保護（global deprotection）およびHPLC分離を行い、例示的類似体を得た。
ケトンから誘導される不飽和エステルに加えて、C13にアルコールを組み込むことが、エステル化により後段の多様化に便利な官能性ハンドルを提供すること、およびC13のハイドリダイゼーション（hydridization）がいかに機能に影響するかを探る機会を提供することが期待された。これは、水素化ホウ素によるケトン4の還元によって容易に達成された。C13アルコールを得て、ある数のエステル基を標準的なエステル化手順により組み込むことができ（スキーム3）、C13アルコール、脂肪族エステル、インドイルエステル、カルバミン酸フェニル、ならびに陽イオン部分および陰イオン部分の両方を含む、構造的に多様な一式の化合物が生み出された。
Figure 2022533412000023
スキーム3. C13ケトンの還元およびエステル化によるC13エステルの合成。EDC = 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
合成手順
化合物は、任意の便利な方法を用いて合成することができる。本開示の化合物の調製に使用するようにされ得る方法としては、Wender et al. Science 2017, 358 (6360), 218-223、および2017年9月28日に出願された国際公開PCT/US2017/054158に記載されている例示的な合成法が挙げられる。本開示の化合物の合成に有用な、広く知られている化学合成スキームおよび条件を提供する多くの一般的なリファレンスも利用可能である（たとえばSmith and March, March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001;またはVogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978を参照）。各反応は、薄層クロマトグラフィー（TLC）、LC/MS、ならびにLC/MSおよび1H NMRにより特徴決定される反応産物により、観察することができる。中間体および終産物は、シリカゲルクロマトグラフィーまたはHPLCにより精製することができる。
特に他に記載しない限り、どの反応も、窒素またはアルゴン雰囲気下、オーブン乾燥または火炎乾燥したガラス器具中で実施した。特に他に記載しない限り、反応生成物は、減圧下、回転蒸発器で濃縮した。市販の試薬は、そのまま使用したか、または本明細書に記載する方法を用いて精製して使用した。ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ペンタン、テトラヒドロフラン、およびトルエンは、窒素圧によりアルミナ乾燥カラム（Solv-Tek Inc.）を通過させた;酢酸エチル、ヘキサン、および石油エーテルは、Fisher Scientificから入手した。分析用薄層クロマトグラフィー（TLC）は、250 μmシリカゲル 60Gプレートで、蛍光指示薬F254（EMD Millipore）を用いて実施した。プレートをUV光で、かつp-アニスアルデヒド、モリブデン酸アンモニウムセリウム、または過マンガン酸カリウムで処理しゆっくり加熱し発色させることで、可視化した。Fischer Scientificから購入したシリカゲル（230～400メッシュ、グレード60、粒径40～63 μm）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを実施した。シリカに10重量%、pH 7のリン酸バッファーを加え、約12時間回転することにより、pH 7緩衝シリカゲルを調製した。Varian INOVA 600、Varian INOVA 500、またはVarian 400磁気共鳴分光計で、NMRスペクトルを取得した。1H化学シフトは、残留溶媒ピーク（CHCl3 = 7.26 ppm、C6H6 = 7.16 ppm）に対し相対的に、次のように報告される:化学シフト（δ）、多重度（app = アパレント、b = ブロード、s = シングレット、d = ダブレット、t = トリプレット、q = カルテット、m = マルチプレット、またはそれらの組み合わせ）、カップリング定数（Hz）、積分。13C化学シフトは、残留溶媒ピーク（CHCl3 = 77.16 ppm、C6H6 = 128.06 ppm）に対し相対的に報告される。赤外スペクトルをNicolet iS 5 FT-IR分光計（Thermo Fisher）で取得した。光学回転をP-2000デジタル旋光計（Jasco）で取得した。高分解能質量スペクトル（HRMS）をスタンフォード大学Vincent Coates Foundation Mass Spectrometry Laboratoryで取得した。
SUW200の合成手順
Figure 2022533412000024
磁気撹拌棒を備える15 mLポリプロピレン製ファルコンチューブに、化合物3（15 mg、0.0124 mmol、1当量）および3:1 THF／H2O（1 mL）を加えた。このファルコンチューブを4℃の低温室に移した。HF-ピリジン（0.32 mL）を加えた（終濃度約0.01 M）。96時間後、反応混合物を室温に温めた。さらに64時間後（合計約6.5日）、NaHCO3（20 mL）およびEtOAc（20 mL）の飽和水溶液の入った分液漏斗に反応混合物の溶液をゆっくり注入することによって、該反応混合物をクエンチした。層を分け、水層をEtOAc（4 x 20 mL）で抽出した。合わせた有機層を0.5 M HCl（10 mL）で洗ってピリジンを除去し、水層をEtOAc（2 x 20 mL）で逆抽出した。合わせた有機層をNa2SO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（25～65% EtOAc/Hex）により精製を行って、SUW200（6.6 mg、収率63%）を白色固体として得た。化合物の純度をTLC（1スポット）分析により確立した。TLC Rf = 0.56（60% EtOAc/Hex、UV活性、p-アニスアルデヒドで濃い紫色のスポット）;
Figure 2022533412000025
SUW203の合成手順
Figure 2022533412000026
1ドラムバイアルに、アセトン（0.27 mL）中のSUW200（6.6 mg、0.0078 mmol、1当量）を加えた。NMO（1.4 mg、0.0117 mmol、1.5当量）およびOsO4（30 μLの0.01 M 水溶液、0.00031 mmol、0.04当量）を連続的に加え、得られた混合物を24時間撹拌した。反応混合物をEtOAcおよびsat. Na2S2O3で希釈し、EtOAc（2 x）で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4を用いて乾燥し、濃縮して白色のペーストにした。フラッシュクロマトグラフィー（ピペットカラム、5～10% MeOH/DCM）により精製して、ジオールSUW203を白色粉末（4 mg、収率60%）として得た。TLC: Rf = 0.1（80% EtOAc/ヘキサン、UV活性、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）
Figure 2022533412000027
SUW226の合成手順
Figure 2022533412000028
水素添加:磁気撹拌棒を備える8ドラムバイアルに、プリンス産物SI-1（Science, 2017, 358, 218 - 223）（50 mg）、EtOAc（500 uL）、およびパラジウム担持炭素（50 mg）を加えた。バイアルを水素雰囲気下に置いた（バルーン）。2時間後、TLC分析は、出発物質が完全に変換されたことを示した。反応混合物をセライトの入ったピペットで濾過し、直接濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（25% EtOAc/ペンタン）により精製を行って、物質40 mgを得た。
全脱保護:冷却（0℃）したこの物質（40 mg）の1:1 THF／ピリジン（800 uL）溶液に70% HF-ピリジン（400 uL）を加え、1:2:2 HF-pyr／THF／ピリジン溶液を得た。反応混合物を放置して室温まで温めた。36時間後、H2O（400 uL）を加え、反応混合物を40℃に加熱した。40℃で3時間後、反応混合物を0℃まで冷却し、EtOAc（10 mL）で希釈し、気泡が出なくなるまでNaHCO3飽和水溶液の滴加によりゆっくりクエンチした。層を分け、水層を80% EtOAc/Hex（5 x 10 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（33～67% EtOAc/Hex）により精製を行って、SUW226およびそのC9-フッ化物の混合物を得た（24 mg、2工程合わせて収率62%）。次に、このジアステレオマー混合物15 mgをRP-HPLC（70～100% MeCN/H2O）に供し、SUW226およびそのC9-フッ化物の純粋な試料を得た。2D-ROESYデータからC13の立体化学を割り当てた（C13CH3とC11Hとの間、およびC13CH3とC15Hとの間にクロスピークを観測）。TLC Rf = 0.31（50% EtOAc/Hex、UV活性、p-アニスアルデヒドで濃い紫色のスポット）;
Figure 2022533412000029
SUW201を得る手順
SUW201は、ブリオスタチン1のC13 (E)-エノアート異性体である。HWEオレフィン化によりC13異性体の約10:1混合物が生じるので、RP-HPLCでブリオスタチン1からSUW201を分離することができる。合成および精製の条件についてはScience, 2017, 358, 218-223を参照されたい。
Figure 2022533412000030
修飾C13エノアートの合成:C13ケトンのHWEオレフィン化
ジエチルホスホノ酢酸からのHWE試薬の調製:
Figure 2022533412000031
化学物質:
ジエチルホスホノ酢酸（Aldrich、精製せずに使用）
DMAP（4-ジメチルアミノピリジン）（Aldrich）:ヘキサンから再結晶化
EDCI（1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド）(Chem-Impex):精製せずに使用
磁気撹拌棒を備える火炎乾燥した8ドラムバイアルに、DCM（約0.2 M）中のジエチルホスホノ酢酸（1.0当量）を加えた。対応するアルコール（1.1当量）を加えてから、DMAP（0.5当量）を一度に加えた。次にEDCI（2.0当量）を一度に加え、反応生成物を室温で30分撹拌し、TLCはこの時点で、出発物質が完全に変換されたことを示した。反応混合物を直接水で希釈し、3 x EtOAcで抽出した。合わせた有機層を塩水で洗い、Na2SO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の80～90% EtOAc）により精製して所望のホスホナートを得、それを次のHWEオレフィン化に用いた。化合物純度をTLC（1スポット）分析で確立した。特徴決定データは、Lloyd et al.（アリルホスホナート（allyl phosponate）、Organic and Biomolecular Chemistry 2016, 14, 8971 - 8988.）およびO’Leary et al.（ベンジルホスホナート、JACS 2001, 123, 11519-33）に報告される文献中の値と一致した。
なお、調製したホスホナートの正確な量は様々であったが、手順は概して約200 mgスケールで実施した。
C13ケトンのHWEオレフィン化:
Figure 2022533412000032
化学物質:
NaHMDS（THF中1 M ナトリウムヘキサメチルジシラジド、Aldrich）:精製せずに使用
トリエチルホスホン酸（Aldrich）:精製せずに使用
上記の手順により調製した代替ホスホアート
磁気撹拌棒を備える火炎乾燥した8ドラムバイアルに、THF中の対応するホスホナート（ベンゼン中共沸混合 x 2）を加えた。この溶液を0℃まで冷却し、NaHMDSを滴加した。反応混合物を0℃で30分撹拌させると、その時点で明るい黄色になった。それとは別に、磁気撹拌棒を備える火炎乾燥した8ドラムバイアルに、THF中のケトン4（ベンゼン中共沸混合 x 2）を加えた。この溶液を-78℃まで冷却し、脱プロトン化ホスホナートのアリコートをTHF溶液として滴加した。反応生成物を-78℃で5分撹拌させ、その時点で低温室へ移し、4℃で約2時間撹拌すると、その時点でTLCは出発物質が完全に消費されたことを示した。次に反応混合物をピペットでsat. aq. NH4Clに加え、3 x Et2Oで抽出した。合わせた有機層をNa2SO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の15～25% EtOAc;TLC Rf = 60% EtOAc/ヘキサン中0.52、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）により精製して、所望のC13エノアートをシリカゲルでは分離できない（Z）異性体と（E）異性体との混合物として得た。この幾何学的異性体の混合物を次の全脱保護にそのまま移した。
修飾C13エノアートの合成:全脱保護
Figure 2022533412000033
化学物質:
70% HF-ピリジン（Sigma-Aldrich）:精製せずに使用
ピリジン（Sigma-Aldrich）:使用前にCaH2から蒸留
磁気撹拌棒を備える15 mLポリプロピレン製ファルコンチューブに、THF中のエノアート7を加えた。この溶液を0℃まで冷却し、ピリジンを滴加した。次にHF-ピリジンを滴加し、HF-ピリジン/THF/ピリジンの1:2:2混合物中0.0075 M エノアート7の溶液を得、得られた反応混合物を40℃のオイルバスに直接移した。反応生成物を20時間撹拌させ、その時点でH2O（HF-ピリジンと等量）を滴加した。反応混合物をさらに2時間40℃で撹拌させた。次に反応混合物を予冷したEtOAc/sat. aq. NaHCO3混合物の水層に直接注入した。水層を3 x EtOAcで抽出し、合わせた有機層を1 M HClで、続いて塩水で洗った。次に、合わせた有機層をNa2SO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。この産物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の10～35～45～50～60% EtOAc）により精製してC13幾何学的異性体の混合物を得、次にそれをHPLCにより分離した。
分取HPLC
C13エノアート異性体の約1:1のZ:E混合物を、Shimadzu LC-20AP Prominence分取液体クロマトグラフ装置を用い、検出器は254および280 nmに設定して、分取HPLCによりさらに精製した。分離は、Restek Ultra C18カラム（5 μm粒径、250 mm x 10 mm）を用いて実施した。移動相は、75% MeCN/H2O～100% MeCN/H2Oを30分間、次いで100% MeCNを10分間のグラジエント溶出液（流量5 mL/min）であった。試料を1:1 MeCN/MeOHに溶解してロードした。2つの画分を収集し、ジアステレオマー的に純粋な(Z)-および(E)-エノアート異性体の試料を、ふわふわした白色粉末として得た（画分1:(Z)エノアート、画分2:(E)エノアート）。SUW218のC13エノアートの立体化学はROESY NMRにより確認された（以下にさらに詳述する）。さらに、HPLC保持時間および相対的C30 1H化学シフトは、ブリオスタチン1/SUW201のC13 (Z)および(E)-メチルエノアートで観測されたパターンと一致した（Science 2017, 358, 218-223）。
SUW217～SUW220、SUW229、およびSUW230の特徴決定データを以下に提供する。
SUW217の特徴決定データ:TLC Rf = 0.31（60% EtOAc/ペンタン、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000034
SUW218の特徴決定データ:TLC Rf = 0.31（60% EtOAc/ペンタン、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000035
SUW219の特徴決定データ:TLC:Rf = 0.32（50% EtOAc/ペンタン、UV活性、p-アニスアルデヒド染色により紫色のスポット);
Figure 2022533412000036
SUW220の特徴決定データ:TLC:Rf = 0.38（50% EtOAc/ペンタン、UV活性、p-アニスアルデヒド染色により紫色のスポット）;
Figure 2022533412000037
SUW229の特徴決定データ:TLC Rf = 0.38（60% EtOAc/ヘキサン、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000038
SUW230の特徴決定データ:TLC Rf = 0.46（60% EtOAc/ヘキサン、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000039
SUW204の合成手順
Figure 2022533412000040
還元:冷却（-20℃）したSI-2（14 mg、0.012 mmol、1当量）のMeOH（1.15 mL、0.01 M）溶液に、ナトリウム水素化ホウ素（0.5 mg、0.013 mmol、1.15当量）を加えた。2時間後、TLC分析は、出発物質が完全に変換されたことを示した。この黄色い反応混合物を、-20℃で、NH4Cl（2 mL）飽和水溶液の滴加により、クエンチした。層を分け、水層を50% EtOAc/Hex（5 x 3 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーで、1.7 x 6 cmシリカゲルカラムを用い、15～25% EtOAc/Hexで溶出して精製を行い、4 mLの画分を収集した。画分（Frxns）#20～26は11.6 mg（収率83%）のSI-3を与え、画分#27～31はそのC13ジアステレオマー（構造は図示せず）2 mg（収率14%）を与えた。C13アセチル化によりSUW206およびSUW207をそれぞれ得た後、C13の相対的な立体化学を割り当てた。SI-3のTLC:Rf = 0.44（30% EtOAc/Hex、UV活性）;SI-3のC13ジアステレオマーのTLC:Rf = 0.63（30% EtOAc/Hex、UV活性）。
全脱保護:冷却（0℃）したSI-3（11.6 mg、0.01 mmol、1当量）の3:1 THF/H2O（1 mL、0.01 M）溶液に70% HF-ピリジン（300 uL）を加えた。反応混合物を放置して室温まで温めた。48時間後、TLC分析は脱保護が不完全であることを示したので、追加で70% HF-ピリジン（150 uL;全450 uL）を加えた。さらに24時間後（全反応時間は72時間）、反応混合物を0℃まで冷却し、50% EtOAc/Hex（5 mL）で希釈し、気泡が出なくなるまでNaHCO3飽和水溶液の滴加によりゆっくりクエンチした。層を分け、水層を80% EtOAc/Hex（5 x 5 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（25% EtOAc/Hexによりシラノール除去、次いで50～100% EtOAc/Hex）、続いてRP-HPLC（70～100% MeCN/H2O）により精製を行ってSUW204（4.8 mg、収率59%）を得た。ジエノアート4で同じ還元／脱保護シーケンスを繰り返して、SI-4を、そして最終的にSUW205を得た。
SUW204の特徴決定データ:TLC Rf = 0.27（100% EtOAc、UV活性なし、CAM染色）;
Figure 2022533412000041
SUW206およびSUW207の合成手順
Figure 2022533412000042
アシル化:アルコールSI-4（19 mg、C13で約4:1 dr、0.016 mmol、1当量）のCH2Cl2（156 uL、0.1 M）溶液に、DMAP（1結晶）、および無水酢酸（2滴）を連続的に加えた。3時間後、TLC分析は、出発物質が完全に変換されたことを示した。反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（20～30% EtOAc/Hex）により直接フラッシュし、C13-OAc（quant., C13で約4:1 dr）を得た。
全脱保護:冷却（0℃）したこのエステル（19 mg、C13で約4:1 dr、0.016 mmol、1当量）の1:1 THF/ピリジン溶液に、70% HF-ピリジンを加えた（1:2:2 HF-pyr/THF/ピリジンの約0.0075 M 溶液）。反応混合物を放置して室温まで温めた。20時間後、H2O（HF-ピリジンと等量）を加え、反応混合物を40℃に加熱した。3時間後、反応混合物を0℃まで冷却し、EtOAcで希釈し、気泡が出なくなるまでNaHCO3飽和水溶液の滴加によりゆっくりクエンチした。層を分け、水層を50% EtOAc/Hexで抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（20% EtOAc/Hexによりシラノール除去、次いで50～80% EtOAc/Hex）、続いてRP-HPLC（70～100% MeCN/H2O）により精製を行って、SUW206（6.6 mg、収率47%）およびSUW207（1.4 mg、収率10%）を得た。C13の相対的立体化学は、アキシアルプロトンはエクアトリアルプロトンよりも高磁場側にあることを実証する数々の文献例に基づいており、たとえばSUW206では、C13でアキシアルプロトンが4.97 ppmで観測されたが、SUW207ではエクアトリアルプロトンが5.13 ppmで観測された。
SUW206の特徴決定データ（メジャーなC13ジアステレオマー）:TLC Rf = 0.58（75% EtOAc/Hex、UV活性、p-アニスアルデヒドで濃青色のスポット）;
Figure 2022533412000043
SUW207の特徴決定データ（マイナーなC13ジアステレオマー）:TLC Rf = 0.43（75% EtOAc/Hex、UV活性、p-アニスアルデヒドで濃青色のスポット）;
Figure 2022533412000044
SUW208の合成手順
Figure 2022533412000045
参考文献: A. B. Smith et al., Design, Synthesis, and Evaluation of Carbamate-Substituted Analogues of (+)-Discodermolide. Org. Lett. 2005, 7, 311-314.
アシル化:SI-4（15 mg、0.012 mmol、1当量）の2:1 CH2Cl2/ピリジン（1.23 mL、0.01 M）溶液に、イソシアン酸フェニル（40 uL、0.369 mmol、30当量）を加えた。48時間後、NH4Cl飽和水溶液（2 mL）の滴加により、反応混合物をクエンチした。層を分け、水層を80% EtOAc/Hex（3 x 5 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（20% EtOAc/Hex）により精製を行ってC13カルバマート（定量的収率を想定）を得た。LRMSのC74H105NNaO17Si2 [M+Na]+理論値:1358.7;実測値1359.0（TOF ESI+）。
全脱保護:冷却（0℃）したこのカルバマート（想定0.012 mmol、1当量）の1:1 THF/ピリジン（1.31 mL）溶液に、70% HF-ピリジン（328 uL）を加え、1:2:2 HF-pyr/THF/ピリジンの0.0075 M 溶液を得た。反応混合物を放置して室温まで温めた。20時間後、H2O（328 uL）を加え、反応混合物を40℃に加熱した。2時間後、反応混合物を0℃まで冷却し、50% EtOAc/Hex（5 mL）で希釈し、気泡が出なくなるまでNaHCO3飽和水溶液の滴加によりゆっくりクエンチした。層を分け、水層を80% EtOAc/Hex（5 x 5 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（25～50% EtOAc/Hex）、続いてRP-HPLC（60～100% MeCN/H2O）により精製を行って、SUW208（6.6 mg、2工程で収率55%）を得た。
SUW208の特徴決定データ: TLC Rf = 0.36（60% EtOAc/Hex、UV 活性、CAM染色）;
Figure 2022533412000046
SUW209の合成手順
Figure 2022533412000047
アシル化:アルコールSI-4（10 mg、0.0082 mmol、1当量）のCH2Cl2（1 mL）溶液に、1-アダマンタン酢酸（8 mg、0.041 mmol、5当量）、EDC-HCl（7.9 mg、0.041 mmol、5当量）、そしてDMAP（1結晶）を連続的に加えた。20時間後、TLC分析は、出発物質が完全に変換されたことを示した。反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（10% EtOAc/Hex）により直接フラッシュし、C13-アダマンチルエステルを定量的収率で得た。
全脱保護:冷却（0℃）したこのエステル（1当量）の1:1 THF/ピリジン（1.5 mL）溶液に、70% HF-ピリジン（375 uL）を加え、1:2:2 HF-pyr/THF/ピリジン溶液を得た。反応混合物を放置して室温まで温めた。24時間後、H2O（300 uL）を加え、反応混合物を30℃に加熱した。4時間後、反応混合物を0℃まで冷却し、EtOAc（10 mL）で希釈し、気泡が出なくなるまでNaHCO3飽和水溶液の滴加によりゆっくりクエンチした。層を分け、水層を80% EtOAc/Hex（5 x 10 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（40～100% EtOAc/Hex）、続いてRP-HPLC（70～100% MeCN/H2O）により精製を行って、SUW209（4.5 mg、収率54%）を得た。
SUW209の特徴決定データ: TLC Rf = 0.33（50% EtOAc/Hex、UV活性、p-アニスアルデヒドで濃青色のスポット）;
Figure 2022533412000048
SUW210の合成手順
Figure 2022533412000049
アシル化:アルコールSI-4（10 mg、0.008 mmol、1当量）のCH2Cl2（0.5 mL）溶液に、インドール-3-プロピオン酸（8 mg、0.041 mmol、5当量）、EDC-HCl（8 mg、0.0041 mmol、5当量）、そしてDMAP（1結晶）を連続的に加えた。24時間後、反応混合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（20% EtOAc/Hex）により直接フラッシュし、C13-インドールエステル（定量的収率を想定）を得た。
全脱保護:冷却（0℃）したこのエステル（想定0.008 mmol、1当量）の1:1 THF/ピリジン（400 uL）溶液に、70% HF-ピリジン（200 uL）を加え、1:2:2 HF-pyr/THF/ピリジン溶液を得た。反応混合物を放置して室温まで温めた。36時間後、H2O（200 uL）を加え、反応混合物を40℃に加熱した。4時間後、反応混合物を0℃まで冷却し、EtOAc（10 mL）で希釈し、気泡が出なくなるまでNaHCO3飽和水溶液の滴加によりゆっくりクエンチした。層を分け、水層を80% EtOAc/Hex（5 x 10 mL）で抽出した。合わせた有機層をNaSO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（50～80% EtOAc/Hex）、続いてRP-HPLC（60～100% MeCN/H2O）により精製を行って、SUW210（1.6 mg、2工程で19%）を得た。
SUW210の特徴決定データ:TLC Rf = 0.53（75% EtOAc/Hex、UV活性、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000050
SUW211の合成手順
Figure 2022533412000051
アシル化:DCM（0.5 mL）中のSI-4（16 mg、0.016 mmol、1当量）の入ったバイアルに、ジメチルグリシン（8.4 mg、0.082 mmol、5当量）、EDCI（16 mg、0.016 mmol、5当量）、およびDMAP（10 mg、.082 mmol、5当量）を加えた。室温で16時間撹拌後、混合物はDCMと飽和NaHCO3とに分配された。DCM（2 x）で抽出後、合わせた有機物をNa2SO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（30～40% EtOAc/ヘキサン）によりグリシナートSI-5（10 mg、収率58%、quant. brsm）を白色残渣として得、それを次の反応に用いた。
脱保護:ポリプロピレン製バイアル中、グリシナートSI-5を1:1 THF:ピリジン（0.6 mL）に溶解させた。HF:ピリジン（0.2 mL）を加え、反応混合物を40℃で20時間撹拌し、それから水（0.2 mL）を加え、得られた混合物を同じ温度で2.5時間撹拌した。反応生成物をsat. NaHCO3でクエンチし、EtOAc（2 x）で抽出し、合わせた有機物をNa2SO4を用いて乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー（5～10% MeOH/DCM）により、SUW211（6 mg、収率83%）を白色残渣として得た。
SUW211の特徴決定データ:TLC Rf = 0.5（10% MeOH/DCM、UV活性、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000052
SUW212の合成手順
Figure 2022533412000053
アシル化:DCM（0.5 mL）中のSI-4（11 mg、0.011 mmol、1当量）がチャージされたバイアルに、無水コハク酸（3.4 mg、0.034 mmol、3当量）およびDMAP（4.1 mg、0.034 mmol、3当量）を加えた。16時間撹拌した後、反応生成物はDCMと飽和NH4Clとに分配された。DCM（2 x）で抽出後、合わせた有機物をNa2SO4を用いて乾燥し、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（50% EtOAc/ヘキサン）により、スクシナートSI-6（8 mg）を白色残渣として得た。
脱保護:ポリプロピレン製チューブ中、スクシナートSI-6を1:1 THF:ピリジン（0.48 mL）に溶解させた。HF-ピリジン（0.12 mL）をチューブの内壁を伝わせて加えた。反応混合物をオイルバスで40℃で20時間加熱し、その時点でH2O（0.1 mL）を加えた。40℃でさらに2.5時間撹拌した後、反応生成物はH2OとEtOAcとに分配された。EtOAc（3 x）での抽出後、合わせた有機物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（10% MeOH/DCM）により精製して、SUW212（2.7 mg、2工程で26%）を得た。
SUW212の特徴決定データ:TLC Rf = 0.6（10% MeOH/DCM、UV-活性、p-アニスアルデヒドで紫色のスポット）;
Figure 2022533412000054
実施例3： PKC結合アッセイ
C13に多様な官能基をもつ化合物パネルを得て、本発明者らは、こうした修飾がいかに生物学的機能に影響するかについての探究を開始した。PKC経路が関与する前提条件が、PKCとの結合であるため、まず、トリチウム標識したフォルボール二酪酸（[3H]-PDBu）を用いた細胞フリー競合結合アッセイで、化合物のPKC親和性について評価した。アッセイは、従来型および新型のPKCファミリーの代表メンバー、PKCα（従来型）およびPKCδ（新型）を用いて実施した。続いて、アイソフォーム移行アッセイにより、生細胞中のPKC活性化について、化合物をアッセイした。細胞膜への移行はPKC活性化の特質であり、したがって、PKCδ-GFP融合タンパク質の細胞内局在を共焦点顕微鏡法により光学的に観察することが、化合物が細胞内に移入し、そのPKCアイソフォーム標的に係合するかどうかを決定するアッセイとして用いられ得る（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108 (17), 6721-6726）。
PKC結合アッセイのプロトコル
ブリオスタチン1およびブリオスタチン類似体のプロテインキナーゼC（PKC）親和性を、以下に記載するように、3H-フォルボール-12,13-ジブチラート（3H-PDBu）との競合により実施した。この手順は、グラスファイバーろ過法により、結合した放射性リガンドを決定することを伴う。
PKC結合アッセイバッファーの調製
50 mL ポリプロピレン製チューブに、トリス-HCl（pH 7.4、1 M、1 mL）、KCl（1 M、2 mL）、CaCl2（0.1 M、30 μL）、およびウシ血清アルブミン（BSA、40 mg、Sigma-Aldrich）を加えた。この混合物を脱イオン化H2Oで20 mLまで希釈し、そっと混合した。このバッファーを使用するまで氷中で保管した。これらの構成要素の終濃度を表1に示す。
（表1）PKC結合アッセイバッファーの組成
Figure 2022533412000055
ホスファチジルセリン（PS）小胞の調製
2回のアッセイごとに、3.5 mg ホスファチジルセリン（Avanti Polar Lipids、ブタ、25 mg/mL CHCl3溶液）を、窒素流下、次いで減圧により、クロロホルムを除去することで濃縮した。調製したてのPKC結合アッセイバッファー（3.5 mL）中、小胞としての固形PSを、6回、30秒間の超音波処理を、各超音波処理の間に30秒間の休止を入れて実施して、懸濁させた（Branson Sonifier 250、パワー = 2、50% デューティーサイクル）。得られた白濁混合物（1 mg/mL）を、使用するまで氷中で保管した。
PKCアイソフォーム溶液の調製
表示の組み換えヒトPKCアイソフォーム（Invitrogen）の4 μg アリコートを11.6 mLのPKC結合アッセイバッファー（この量はアッセイ2回に十分）に溶解させて、アッセイPKCを調製した。希釈したPKCは氷中で保管し、すぐに使用した。
3H-PDBu溶液の調製
3H-PDBu（American Radiolabeled Chemicals, Inc.;1 mCi/mL アセトン溶液;比放射活性:20 μCi/mmol）をDMSOで10倍に希釈した。得られた500 nM ストック溶液をDMSOでさらに30 nMまで希釈した。
類似体化合物希釈物の調製
化合物希釈物を、選択した「高」濃度から3倍または4倍に系列希釈して調製した。各類似体化合物について7つの濃度を用いて阻害曲線を画定した（すなわちSUW200の場合、用いた類似体濃度は、3000 nM、750 nM、188 nM、46.9 nM、11.7 nM、2.93 nM、および0.73 nMであった）。
「マスターミックス」溶液
ポリプロピレン製チューブに、3.3 mLの1 mg/mL PS小胞溶液、11 mLのPKCアイソフォーム溶液、および1.1 mLの30 nM 3H-PDBu溶液を加えた。得られた溶液をボルテックスして混合し、氷中で保管した。
PKC結合アッセイのプロトコル
材料:
・グラスファイバー製フィルター（Whatman GF/B）は、それらを水性ポリエチレンイミン（10体積%、18 mL）の脱イオン化水（600 mL）溶液に1時間以上浸漬することにより準備した。
・インキュベーション中およびアッセイのそれ以外の間、pH 7.4の20 mM トリスの「リンス用バッファー」500 mLを氷中で冷却した。
各類似体濃度について、三つ組のデータポイントを得た。各データポイントにつき、指定濃度の280 μLの「マスターミックス」溶液および20 μLの類似体化合物を、ポリプロピレン製チューブに加えた。類似体化合物を無標識PDBu（20 μLの75 μMストック液、アッセイ濃度:5 μM）で置き換えることにより、非特異的3H-PDBu結合を三つ組で評価した。類似体化合物を20 μL DMSOで置き換えることにより、最大3H-PDBu結合を三つ組で評価した。各溶液をボルテックスして混合し、37℃で10分間インキュベートし、そして氷中で少なくとも30分間インキュベートしてから濾過した。各ポリプロピレン製チューブのアッセイ内容物を、Brandel Harvesterを用いてポリエチレンイミン浸漬フィルターで真空濾過し、リンス用バッファー（3 X）で洗い、最初に真空中で5分間乾燥した後、周囲条件で≧2時間乾燥した。得られたフィルターは、各データポイントで円形の穿孔を有しており、それをピンセットで取り外してシンチレーションバイアルに入れた。シンチレーションバイアルにBio-Safe IIシンチレーション液（5 mL）を満たし、Beckman LS 6000SCシンチレーションカウンターで放射活性を測定した。毎分あたりのカウント（cpm）を各三つ組希釈物で平均した。GraphPad SoftwareのPrism（登録商標）を用いてデータをプロットし（cpm対log（濃度））、同プログラムに組み込まれた1サイト競合最小二乗回帰機能によりIC50を決定した。Ki値は、式：Ki = IC50/(1 + ([3H-PDBu]/Kd)により計算した。PKCアイソフォームの3H-PDBuのKdは、同一条件の飽和結合実験で別途測定した。
PKCδ-GFP移行アッセイのプロトコル
細胞培養
チャイニーズハムスター卵巣因子K1（CHO-k1、ATCC）細胞を、F-12 Kaighn’s培地（Hyclone、10% ウシ胎仔血清、1% ペニシリン／ストレプトマイシン添加、以下ではF-12 +/+と呼ぶ）中、インキュベーター（5% CO2）で、37℃で培養した。細胞培養物は、以下のように、（2～3日に一度）細胞が約75～100%コンフルエンスに達すると1:3で植え継ぐことにより維持した。
（接着細胞を傷つけないよう注意しながら）培地を吸引し、3 mLの0.25%トリプシンEDTA（Gibco）を用いて細胞を培養フラスコ（T75、Falcon）から取り出した。次に1 mLの細胞浮遊液を9 mLの新鮮F-12 +/+に加え、この試料をコンフルエンスに達するまで継代培養した（約2～3日間）。
細胞プレーティング
コンフルエントなCHO-k1細胞の培養物を3 mLの0.25% トリプシンEDTAを用いてT75フラスコから剥離させた。Countess II Automated Cell Counter（Fisher）で細胞を計測した。細胞浮遊液を新鮮F-12 +/+で24万細胞/mLまで希釈し、この希釈ストック液2.5 mLを6ウェルプレートの1つのウェルに加えた。そして細胞を24時間培養した。
形質移入
細胞は、McKinlay et al.（PNAS 2017, 114, E448-E456）が既述しているように、リポフェクタミン2000試薬（Invitrogen）またはDA 13:11をチャージ比10:1で用いて形質移入した。
リポフェクタミン2000
F-12 +/+を吸引し、F-12 -/-で細胞を洗った。次に、接着細胞を傷つけないよう注意しながら、2 mLの新鮮F-12 -/-を各ウェルに加えた。CHO-k1細胞の各ウェル用に、ポリプロピレン製チューブ中250 μLのOpti-MEM低血清培地（Invitrogen）に12.5 μLのリポフェクタミン2000試薬（Invitrogen）を加え、室温で20分間インキュベートした。また、各ウェル用に、別のポリプロピレン製チューブに4 μgのPKCδ-GFP pDNAおよび250 μLのOpti-MEM低血清培地を加えた。このDNA懸濁液に250 μLのリポフェクタミン2000懸濁液を加え、該溶液を室温で30分間インキュベートした。500 μLのリポフェクタミン／DNA懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルに加えた。そして37℃（5% CO2）で約24時間、細胞をインキュベートした。
DA 13:11
F-12 +/+を吸引し、細胞をF-12 -/-で洗った。次に、接着細胞を傷つけないよう注意しながら、2.4 mLの新鮮F-12 -/-を各ウェルに加えた。PKCδ-GFP pDNAの4 μgアリコートをPBSに加えた（pH 5.5、終体積100 μL）。次に、このDNA溶液に5.6 μLのDA 13:11（DMSO中の2 mMストック液）を加え、混合物を（フリッキングにより）20秒間そっと混合し、その時点でこれを6ウェルプレートの各ウェルに直接加えた。そして37℃（5% CO2）で約24時間、細胞をインキュベートした。
チェンバー状カバーガラススライドへのプレーティング
インキュベーション後、培地を吸引し、細胞をPBS（2.0 mL）で洗い、トリプシン処理した（500 μL）。次に、細胞浮遊液を2.0 mLのF-12 +/+で希釈した。アリコート200 μLを、Lab-Tek II 4ウェルチェンバー状カバーガラススライド（Fisher）の3ウェルに加え、それぞれが細胞3ウェルを有するスライドを全部で4つ作った。細胞浮遊液を追加のF-12 +/+ 600 μLで直接希釈した。得られた試料を約24時間インキュベートしてから、撮像を行った。
投与およびデータ取得
Leica SP8 White Light Confocal顕微鏡およびLeica AFソフトウェアパッケージを用いて蛍光画像を取得した。分析に先立ち、培地を吸引し、グルコース（10 mM）を補充した800 μLのPBS（Hyclone、Ca2+もMg2+もなし）を、チェンバー状カバーガラススライドの各ウェルに加えた。ブリオスタチンおよびブリオスタチン類似体を、PBS中の10 mM グルコース200 μLで適切な濃度に希釈した。撮像する細胞を定め、各ウェルの所定の位置でアダプティブフォーカス制御を用いて撮像し、3ウェル並行でデータを記録した。細胞を、化合物添加（t = 0に設定）後、30秒間隔で20～40分間撮像した。データは室温で記録した。画像を.lifファイル形式でエクスポートし、FIJI（NIH）ソフトウェアを用いて蛍光強度を分析した。移行を観察するために、各細胞で関心対象の小さなサイトゾル領域を選択し、バックグラウンドを引いて正規化した後、蛍光強度値を時間に対しプロットした。グラフ化したデータは、最少の反復の平均を表す。
この一連の生物学的アッセイから、B環の置換が化合物機能に及ぼす影響について、重要な知見がもたらされた。図6、パネルA～B、および表2にデータをまとめる。
Figure 2022533412000056
表2からわかるように、化合物のPKC結合親和性について、PKCアイソフォームファミリーの従来型および新型のメンバー、それぞれPKCαおよびPKCδで、[3H]-フォルボール二酪酸との競合結合アッセイで評価した。インビトロでの生細胞における細胞内移入および化合物のPKCアイソフォームとの結合を、PKC-GFP融合タンパク質のサイトゾルから細胞膜への移行を観察することにより決定した。代表的な画像を図6、パネルAに示す。
*は、PKC-GFPの膜移行を誘導するのに必要な最小有効濃度を示す。
** 1 nMで、DMSO対照に対し相対的。
***は、観測されたごく短時間の移行を示す（図6、パネルDを参照）。
ND = 未確定。
図6、パネルA。PKCδ-GFPの細胞膜への移行を共焦点顕微鏡法により観察して決定された、ブリオログ（bryolog）により誘導されたPKCの活性化。図6、パネルB～D。サイトゾル蛍光をt = 0（培地に化合物を加える直前の時間）に対して正規化し、時間に対しプロットした。明瞭さを期してエラーバーは除外した。PKCδ-GFPの細胞膜への最大の移行を表2に報告する。
目標は、細胞フリーPKC親和性と細胞内PKC移行とに相関があるかどうか、そして結合および移行が下流機能（たとえばCD22誘導）にいかに影響するかを決定することであった。予想通り、本発明者らのファルマコフォアモデルを用いて設計された化合物のほぼすべてが、ブリオスタチン1の報告値に匹敵する、強力なPKC結合親和性（<10 nm）を保持していた（表2）。しかし、特定のC13官能基は、PKC結合親和性を減少させた。たとえば、C13の電荷をもつ置換基（SUW211、SUW212）は、PKCに対する親和性を約20～100倍減少させており（表2）、ホスファチジルセリン（PS）小胞複合体（細胞フリー結合アッセイで用いた膜代替物）におけるこれらの基のさほど有効ではない分配と合致する。さらに、C13メチル-(Z)-エノアートをベンジル-(Z)-エノアートで置換した結果、効力が約30倍減少した。これと同様の結合親和性の減少は、大きい、比較的疎水性である置換基（SUW209、SUW210、表2）を担持する、より立体配座的にフレキシブルなリンカーを有するC13エステルでは観測されなかった。こうした例外を除けば、試験した化合物の大半がPKCに対して一桁のナノモル結合親和性を示したことから、本発明者らが提案するファルマコフォアモデルの予測価値がさらに実証され、これらの化合物をより高度なインビトロのPKC移行アッセイへと進めることにもなった。
PKCは、不活性状態のときはサイトゾル内にある。それに対し、その内在性リガンドDAG、またはフォルボールエステルおよびブリオスタチンなどの外在性小分子リガンドと結合すると、得られたPKCリガンド複合体は、細胞膜の内葉に存在する（Newton, A.C. AJP Endocrinol. Metab. 2010, 298 (3), E395-E402）。このPKCの移行はPKC活性化の前提条件であり、したがって最下流の活性である。実験的研究および分子動態シミュレーションの両方が示唆するところでは、PKCリガンド複合体は複数の結合状態をとり得、おそらくは足場タンパク質の特異な結合、および下流エフェクタータンパク質のリン酸化に影響し、それによって多様なシグナリング成果をもたらす（Newton et al. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2018, 53 (2), 208-230; Ryckbosch et al. Nat. Commun. 2017, 8 (1), 6; Newton, A. C. J. Biol. Chem. 1995, 270 (48), 28495-28498;およびNewton, A. C. Chem. Rev. 2001, 101 (8), 2353-2364）。このPKCシグナリングシナプスの動的な性質が理由で、PKCは多様な生物学的意味をもつ様々なシグナルを伝達することができる（Newton, A.C. AJP Endocrinol. Metab. 2010, 298 (3), E395-E402）。したがって、本発明者らの目標は、活性シグナリング複合体と細胞膜との種々の相互作用を確立することにより、特異なシグナリング成果を誘発するような修飾をブリオスタチン骨格のB環に有する化合物を開発することであった。生細胞内のPKCδ-GFP融合体の膜移行の観察は、化合物の機能および細胞透過性の便利なインビトロアッセイであり、的確な化合物活性の質的差異をリアルタイムで決定することも可能にしてくれる（Wender et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011, 108 (17), 6721-6726）。本発明者らの例示的ブリオスタチン類似体の設計ストラテジー（上記参照）が理由で、この位置の置換基がPKC活性化の動態にいかに影響するかを調査することができた。
本明細書における研究は、PKC結合の熱力学とリガンドの細胞移入のキネティクスとPKCの移行とがしばしば切り離されることを示しており、この知見をアイソフォーム選択的シグナリング制御に活かすことができる。陽性比較対照として、全PKCアイソフォームの一桁ナノモルのバインダーであるブリオスタチン1は、濃度200 nMで約70%のサイトゾルPKCδ-GFPを5分以内に細胞膜に移行させる（表2、図6、パネルC）。C13に親水性置換基を導入する（SUW203、SUW204）ことで、従来型および新型両方のPKCアイソフォームと一桁ナノモルの親和性で結合する化合物が生じたが、これらの類似体は、移行アッセイではブリオスタチン1とは異なる振る舞いを示した（図6、パネルB～C）。SUW204は、200 nMで、約25%のサイトゾルPKCを20分で細胞膜に移行させたが、SUW203は約50%のサイトゾルPKCを移行させるのに1000 nMの濃度を要した。同様に、C13に電荷をもつ置換基（SUW211、SUW212）を有する化合物は、最大1000 nMでも持続的なPKCの移行を達成しなかった（表2、図6、パネルD）。このことは、化合物の機能にとって、膜とブリオスタチンB環上の官能基との相互作用が重要であること、そしてPKC結合は必要であるが、インビトロでは化合物の活性にとって十分ではないことを示している。C13に親水性のまたは電荷を有する修飾をもつ化合物は、おそらく細胞膜に効果的に埋め込まれることができず、そのためPKC機能の減衰を示すのであろう。
本発明者らは、C13の親水性官能基の効果を探ることに加えて、サイズや疎水性が異なる、構造的モチーフも様々な（アリール、ヘテロアリール、アルキル、アダマンチル）、一連のC13エステルも調査し、それらはすべて、対応するC13アルコールから効率よく得ることができた（たとえばスキーム3を参照）。PKC結合親和性という点でこの位置の多様な官能基が許容されることがわかったが、本発明者らの類似体ライブラリーは、機能アッセイで広く異なるプロファイルを示した。遊離アルコールSUW204とは対照的に、C13ヒドロキシル基をより小さい疎水性置換基でキャップすると、PKC移行に関してブリオスタチン1に匹敵するほど有効な化合物が生じた（図6、パネルD）。C13アセタートの2つのジアステレオマー（SUW206およびSUW207）は、互いに、またブリオスタチン1とも、ほぼ同一の振る舞いを示した。C13カルバミン酸フェニルSUW208は200 nMでPKCを細胞膜へ有効に移行させたが、移行に要した約15分という時間は同アッセイで活性であった他の類似体よりも長く（図6、パネルD）、この位置のサイズおよび／または極性の小さな変化が、リガンド媒介性PKC活性化およびシグナリング、ならびに／または細胞移入のキネティクスおよび効力に影響し得ることが示された。
C13のサイズ要件が比較的似ている化合物の合成を補完するために、本発明者らは、大いに異なる官能基を有する、天然産物に見られるものよりも大きい置換基もこの位置に組み込んだ。C13アダマンチルエステルSUW209およびC13インドイルエステルSUW210は、それぞれ、増加した局在疎水性により膜相互作用の可能性が強化されるように、および細胞膜内葉の陽イオン性脂質頭部基により陽イオン-パイ接触を捕らえる能力が強化されるように、設計した。本発明者らは、これらの2つの膜結合モードによって膜におけるPKCリガンド複合体の配向を差別的に偏らせることができ、したがって下流シグナリング成果に影響することができる、と仮定した。どちらの化合物も高親和性PKCバインダーであるが（表2）、PKC移行アッセイでは200 nMでは不活性であり、約70%のサイトゾルPKCを約5分で細胞膜に移行させるには1000 nMを要することがわかった（図6、パネルD）。
次に、C13官能基がバルク化合物特性に、および化合物の疎水性（cLogPで測定）と活性（200 nMでのPKC移行）との相関に、いかに影響し得るかを調査した。cLogPを200 nMでの膜結合PKCδ-GFPのパーセンテージに対しプロットすると（図7Aおよび7B）、効率的な移行に必要なcLogP値の有効ウィンドウが判明した。1.00～4.00のcLogP値を有する化合物は200 nMで活性であり、ブリオスタチン骨格のB環に対する修飾を検討する際は、効果的に親油性のバランスをとるべきであることが示唆された。親油性が有効範囲内にある化合物の間でPKC活性化の様々な動態が観測されたことも、特筆に値する。ほとんどの化合物が対数活性化曲線を示したが、選抜された化合物は、遅延活性化パターン（SUW208、図6、パネルD）、またはより持続性の線形活性化動態（SUW218、SUW229、図6、パネルC）を示した。これらのPKCリガンド結合のキネティクスおよび該複合体の細胞内分布に関する観測結果は、極性の高い化合物ほど低速で細胞に移入し、細胞膜と安定複合体を形成する能力も限られる、というリガンドの細胞移入のタイミング、および移入後のリガンド制御によるPKCリガンド複合体の細胞膜とサイトゾルへの分配によって、合理的に説明できる。このことは、PKC活性化の動態が下流シグナリング成果に重大な結果を及ぼし得ることは周知なので、潜在的に重要である（Alfonso, S. I. et al., Sci. Signal. 9, ra47, https://doi.org/10.1126/scisignal.aaf6209 (2016); Newton, A. C., AJP Endocrinol. Metab. 298, E395-E402 (2010)）。
ベンジルエノアートSUW219およびSUW220を除き、(Z)および(E)両方の幾何形状のC13アルキルエノアートが良好に許容された。興味深いことに、ベンジルエノアートSUW219は約2倍減少した親和性によりPKCと結合し、おそらくは(Z)オレフィン幾何形状が、C13置換基の向きを、南半球のファルマコフォア要素の立体配座に影響するよう配置し得ることが示唆された。とはいえ、より小さい直鎖アルキルエノアートは概して、インビトロではPKCの強力なバインダーであり、かつ活性なリガンドである（表2、図6、パネルC）。C13アリルエノアートは、この位置のオレフィンクロスメタセシス反応により、この単置換アルケンをブリオスタチン多様化の最終工程に使用できるようになるので、合成の有力な関心対象である（たとえばスキーム2を参照）。
実施例4: CD22表面発現アッセイ
最後に、本発明者らは、NALM6細胞において化合物がCD22発現に及ぼす影響もインビトロで決定した。NALM6細胞は、以前、CD22を標的指向するCAR T細胞療法に関連して研究されたALL細胞系である（Fry et al. Nat. Med. 2018, 24 (1), 20-28;およびRamakrishna et al. Blood 2017, 130 (Suppl 1)）。例示的ブリオスタチン類似体のメンバーの概して高い親和性、ならびにそれらのPKC移行キネティクス、および動態の程度を確立したのに続いて、本発明者らは、ブリオスタチンおよびその類似体をアジュバントとして用いて標的指向がん免疫療法を強化する臨床使用に関連するアッセイで、それらの例示的類似体を評価しようと努めた。CD22を標的指向するCAR T細胞療法によるALL患者の治療が報告されているが、この治療が効かない患者は、CD22の表面密度が低めであると考えられる。Fry et al.は、インビトロでの抗CD22 CAR T細胞の活性化（Nguyen, S. et al., J. Clin. Oncol. 34, 10536-10536 (2016)）、およびマウス腫瘍異種移植モデルにおける腫瘍排除（Fry et al. Nat. Med. 2017）には、CD22表面密度の臨界閾値が必要であることを明確に実証した。本発明者らは、CD22を標的指向するCAR T療法のアジュバントリードとしてのブリオスタチン1およびブリオスタチン類似体を調査するために、NALM6細胞を用いて、ALLにおけるブリオスタチン誘導性CD22表面発現の増加のインビトロモデルを開発した。
CD22表面発現のプロトコル
細胞培養
NALM6、クローンG5細胞（ATCC）を、RPMI-1640（Hyclone、+ L-グルタミン、+ 10 mM HEPES、10%ウシ胎仔血清添加、1%ペニシリン／ストレプトマイシン添加、以下特に断らない限りRPMI-1640と呼ぶ）中、インキュベーター（5% CO2）で37℃で培養した。細胞培養物は、業者の指示書にしたがい4 x 105～3 x 106細胞/mLに維持した。
プレーティングおよび投与
コンフルエントなT75フラスコ（Fisher）内の細胞浮遊液を15 mLファルコンチューブに移し、1100 rpmで7分間遠心機にかけた。上清を吸引してから、細胞ペレットを約5 mLの新鮮RPMI-1640に再び浮遊させた。Countess II Automated Cell Counter（Fisher）で細胞を計測した。細胞浮遊液のアリコートを追加のRPMI-1640で希釈することにより、1 x 106細胞/mLのストック液5.2 mLを調製した。このストック液199 μLを96ウェルプレートの24ウェルに加えた（8つの異なる実験条件の三つ組測定に十分）。DMSO、ブリオスタチン1、およびブリオスタチン類似体に三つ組で投与を行った。各実験にDMSO（陰性対照）、10 nM ブリオスタチン1（陽性対照）、および無処理試料（陰性対照）を含めた。各ウェルに1 μLのDMSOまたは適切なDMSO中化合物ストック溶液を加えた。細胞を24時間インキュベートし、その時点で細胞浮遊液を1.5 mLエッペンドルフチューブに移し、1.0 mLのPBS（Hyclone、Ca2+もMg2+もなし）で希釈した。試料を室温、2000 rpmで5分間遠心機にかけた。上清を吸引し、細胞ペレットを400～600 μLのRPMI-1640に再び浮遊させた。2 x 105～3 x 106細胞/mLの細胞を24ウェルプレートでさらに24時間～7日間継代培養し、その時点でCD22表面発現をフローサイトメトリーでアッセイした。
フローサイトメトリー
1ウェルの細胞をCountess II Automated Cell Counter（Fisher）で計測した。各ウェルの約20万～30万個の細胞をPBSの入った1.5 mLエッペンドルフチューブに加えた（終体積約1.2 mL）。細胞浮遊液を、4℃、1500 rpmで7分間遠心機にかけた。上清を吸引し、細胞ペレットを99 μLの予冷したFACSバッファー（PBS中0.5% w/v BSA）に再び浮遊させた。1 μLのPEマウス抗ヒトCD22（5 μL/1 x 106細胞の試験、BD Biosciences、カタログ番号562859）を加え、溶液を4℃で30～45分間インキュベートした。次いで試料をさらに1.0 mLのFACSバッファーで希釈し、4℃、1500 rpmで7分間遠心機にかけた。上清を吸引し、細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再び浮遊させ、得られた浮遊液をFACSチューブ（Fisher、カタログ番号352058）に移した。細胞をDAPI染色し、Stanford Shared FACS FacilityのFACScan AnalyzerでCD22表面発現を分析した。データ分析は、FlowJoおよびMicrosoft Excelを用いて実施した。
本発明者らは、このアッセイを用いて、ブリオスタチン1およびブリオスタチン類似体が、CD22を標的指向するCAR T細胞媒介性腫瘍排除に必要なCD22表面発現の十分なアップレギュレーションを達成できるかどうか、決定しようと努めた。NALM6細胞をブリオスタチン1およびブリオスタチン類似体といっしょに24時間インキュベートし、その時点で試験化合物を培地から洗い出し、細胞のCD22表面発現をフローサイトメトリーで分析した。本発明者らは、ブリオスタチン1がCD22表面密度の>2倍の増加を誘導したことを見出した（図4、パネルA～B）。興味深いことに、ブリオスタチンにより促進されたCD22表面発現の増加は、処理後最大7日間持続し（図4、パネルA）、ブリオスタチン1に続いて抗CD22 CAR Tを注入する連続投与が、患者の再発の要因と思われるCD22lo腫瘍細胞を排除する実行可能なストラテジーとなり得ることが示唆された（Fry, T. J. et al., Nat. Med. 24, 20-28 (2018)）。
重要なことには、C13修飾ブリオスタチン類似体はCD22誘導アッセイで、ある範囲の活性を示したが、選抜された化合物は非常に有効であり、本発明者らのアッセイではブリオスタチン1に匹敵する（図4、パネルB）。驚くべきことに、C13エノアート幾何形状が化合物機能に及ぼす顕著な効果をC13メチルおよびアリルエノアートの両方で観測した（図4、パネルB）。(Z)-エノアートは、対応する(E)-エノアートよりもかなり活性が高く、ブリオスタチン骨格のB環に対する修飾によりPKCシグナリングの動態を調節できることが、さらに示唆された。前述したように、最も高性能だったSUW229は、ブリオスタチン1とは異なるPKC活性化プロファイルを示し、特異なPKC活性化動態が生物学的に重要な下流シグナリング成果に影響し得る可能性を示唆している。
CD22表面発現のプロトコル JBおよび2F7細胞
培養条件
AIDS-NHL細胞系を、10%ウシ胎仔血清（FBS、Omega Scientific）、100単位/mLのペニシリン、および100 μg/mlのストレプトマイシン（Invitrogen）を含有するIMDM培地（Life technologies）からなるIF10培地中でインキュベートした。細胞は37℃で、5% CO2中でインキュベートした。
AIDS-NHL細胞系の活性化手順
AIDS-NHL細胞を、丸形ボトムの96ウェル組織培養プレートで、表示の等モル濃度のブリオスタチン1、SUW201、またはSUW229を含有する体積200 μLのIF10培地中、20万細胞／ウェルの細胞密度で培養した。細胞を化合物に24時間または48時間曝露してから染色し、受容体レベルのフローサイトメトリック分析を行った。
フローサイトメトリー
各ウェルの細胞を2% FBS含有リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗い、次いで233 xgで9分間遠心機にかけ、リン酸緩衝食塩水（PBS）:ヒトAB血清（Sigma）の1:1希釈液50 μLに再び浮遊させた。細胞を抗ヒトCD22（Biolegend、クローンS-HCL-1、363506）で染色し、4℃で25分間インキュベートしてから洗い、2% パラホルムアルデヒドで固定した。染色された試料を4℃で保存した。フローサイトメトリー試料をFACSCelesta（BD Biosciences）フローサイトメーターで分析し、FlowJoソフトウェア（バージョン10）を用いてデータを分析した。
このアッセイを用いて、（たとえば上記で概説した）NALM6細胞で観測された結果が他の細胞系にも当てはまるかどうかを決定するために、AIDS関連リンパ腫細胞系のJPおよび2F7細胞を、合成ブリオスタチン1、SUW201、およびSEQ229といっしょにインキュベートした（図4、パネルC～D）。JBは、もとはHIV+の個体から取り出された骨髄試料から増殖させたエプスタイン・バーウイルス（EBV）陰性AIDS-リンパ腫細胞系であって、バーキットリンパ腫転座を有する（Moses, A. V et al., Nat. Med. 3, 1242-1249 (1997)）。2F7は、バーキット亜型のAIDS関連非ホジキンリンパ腫細胞系であり、EBV陽性である（Widney, D. P. et al. Levels of Murine, but Not Human, CXCL13 Are Greatly Elevated in NOD-SCID Mice Bearing the AIDS-Associated Burkitt Lymphoma Cell Line, 2F7. PLoS One 8, e72414, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072414 (2013)）。バーキットリンパ腫はAIDS非ホジキンリンパ腫の最も一般的な亜型に数えられ、ホジキンリンパ腫と同じく、AIDS患者にとっては細胞性免疫が損なわれているためリスクが一般集団よりもかなり高くなる（Guech-Ongey, M. et al., Blood 116, 5600-5604 (2010)）。重要なことに、合成ブリオスタチン1ならびに類似体SUW201およびSUW229は、試験した各細胞系においてCD22表面発現を約2倍アップレギュレートし（図4、パネルC～D）、PKC調節因子をCD22を標的指向するがん免疫療法の強化に一般的に使用できる可能性がさらに強調された。
図4、パネルA～D:ブリオスタチンに促進されたCD22細胞表面発現を示す。パネルAは、合成ブリオスタチン1がCD22の表面発現の増加を促進することを例示している。NALM6細胞を10 nM ブリオスタチン1といっしょに24時間インキュベートした。化合物を洗い出し、細胞を表示の時間にわたり継代培養した。次いでCD22表面発現をフローサイトメトリーでアッセイした（n = 3つの生物学的反復;データは平均値±SEとして表示）。パネルB:NALM6細胞を1 nM（左側のバー）または10 nM（右側のバー）の化合物といっしょに24時間インキュベートした。化合物を洗い出し、細胞を24時間継代培養した。次いでCD22表面発現をフローサイトメトリーでアッセイした（n = 3つの生物学的反復;データは平均値±SEとして表示）。パネルC:JB細胞を1 nM（左側のバー）または10 nM（右側のバー）の化合物といっしょに48時間インキュベートした。次いでCD22表面発現をフローサイトメトリーでアッセイした（n = 6つの生物学的反復;データは平均値±SEとして表示）。パネルD:2F7細胞を1 nM（左側のバー）または10 nM（右側のバー）の化合物といっしょに48時間インキュベートした。次いでCD22表面発現をフローサイトメトリーでアッセイした（n = 6つの生物学的反復;データは平均値±SEとして表示）。
これは、これまでにないブリオスタチン類似体のコレクションであり、ブリオスタチンと結合親和性、移行、およびCD活性化活性が似たものも含むが、他は、同じく有効な親和性を有するが、選択性に何らかのバリエーションがあり、優れたCDアクチベーターであって、動物試験でより良好に忍容される。
まとめ
本明細書に示した結果は、天然産物にヒントを得た創薬における設計および化学合成の重要性を強調するものである。複雑すぎて実用的な方法では作れないと最近考えられていた化合物、ブリオスタチン1を、効率よく合成して得ることによって、その直近の前駆物質および誘導体を得ることも可能になった。ほとんどの例示的類似体が、ブリオスタチン様PKC親和性を示す。PKCと似た（たとえば本明細書に記載される）C1ドメインをもつ他のタンパク質標的も、ブリオスタチン剤の活性の潜在的な媒介因子となり得る。しかし、異なる親和性を示すものもある。こうした例示的類似体のなかには、より合成しやすいものがあり、それは臨床医学で候補を選別するのに影響し得る要因である。より重要なことに、いくつかの類似体は、移行アッセイでブリオスタチンに匹敵する、またはより優れている場合もあり、また選抜された類似体は、ブリオスタチン1が示すCD22誘導と互角かまたはそれ以上であり得る。重要なことに、いくつかの類似体は、動物試験でより良好に忍容される。重要なことに、これらの研究はまた、ブリオスタチンを特定領域において修飾できること、およびそうした変更は、親和性を保存しつつ、相異なる移行およびCD22誘導効果をもたらし得ることを示している。
ここまで本発明を明瞭に理解できるように例示および例により詳しく記載してきたが、本発明の教示に鑑み、添付の請求項の趣旨および範囲から逸脱することなく特定の変更および改造が加えられ得ることは、当業者には容易に明らかになる。
したがって、上記は本発明の原理を例示しているにすぎない。当業者であれば、本明細書に明白に記載または表示されていなくても、本発明の諸原理を具現化する、かつその趣旨および範囲に含まれる、様々な調整を考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に記載されるすべての例および条件付き言語の主たる意図は、本発明の原理および本発明者らが当技術分野の推進のために寄与する概念を読者が理解する助けとなることであり、そのような具体的に記載される例および条件を限定するものではないと解釈すべきである。また、本発明の原理、局面、および態様、ならびにその具体例を記載する本明細書の記述はいずれも、その構造的均等物および機能的均等物の両方を包含するものとする。さらに、そうした均等物は、現在公知の均等物および将来開発される均等物の両方、すなわち構造にかかわらず同じ機能を果たす開発されるあらゆる要素を含むものとする。また、本明細書の開示はいずれも、そうした開示が請求項で明示されていようがいまいが、一般向けを意図したものではない。
したがって本発明の範囲は、本明細書に示されかつ記載されている例示的態様に限定されるものではない。本発明の趣旨および範囲が具現化されるのは、添付の請求項によってである。請求項においては、35 U.S.C. §112(f)または35 U.S.C. §112(6)は、請求項における限定について、そうした請求項中の限定の冒頭に「means for」という文言そのもの、または「step for」という文言そのものが記載されている場合にのみ援用されると明確に定義されており、請求項中の限定にそうした文言そのものが使用されていなければ、35 U.S.C. § 112 (f)または35 U.S.C. §112(6)は援用されない。
添付の請求項にかかわらず、本明細書に記載される本開示は、以下の項によっても記載される。
項1. 対象において標的細胞を調節する方法であって、該方法は、以下：
（a）該標的細胞における抗原の発現、（b）該標的細胞における抗原の移行、（c）該標的細胞における抗原の細胞表面提示、および（d）該標的細胞における抗原の細胞表面残留
のうちの1つまたは複数を選択的に強化して、標的細胞の免疫原性を調節するために、標的細胞を有効量のブリオスタチン剤と接触させる工程
を含む。
項2. 該抗原が、
タンパク質抗原、ペプチド抗原、ネオ抗原、および標的細胞のmRNA処理から誘導される抗原
から選択される、項1記載の方法。
項3. 該標的細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）改変T細胞またはキメラ抗原受容体-ナチュラルキラー細胞（CAR-NK細胞）であり、
該標的細胞をブリオスタチン剤と接触させる前記工程が、該CARの発現または細胞表面提示および残留を強化する、項1または2記載の方法。
項4. 該CARが、
ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、腫瘍細胞関連抗原（TAA）、疾患細胞関連抗原、および該細胞のmRNA処理から誘導される抗原、ならびにその任意のフラグメントから選択される標的細胞表面抗原
に対し親和性を有する、項3記載の方法。
項5. 該改変T細胞が、末梢血単核球、臍帯血細胞、精製T細胞集団、またはT細胞系から得られる、項4記載の方法。
項6. 該接触させる工程がエクスビボで実施され、該標的細胞が該対象から取り出される（自己細胞である）、項3～5のいずれか一項記載の方法。
項7. 該接触させる工程がエクスビボで実施され、該標的細胞がドナーから取り出される（アロジェニック細胞である）、項3～5のいずれか一項記載の方法。
項8. 該標的細胞が、がん細胞、がん幹細胞、およびがん前駆細胞から選択される、項1記載の方法。
項9. 該接触させるがインビボで実施され、がんを有する対象に該ブリオスタチン剤を投与することを含む、項8記載の方法。
項10. 該対象の免疫系による排除に対し該標的細胞を増感させる、項8または9記載の方法。
項11. 該対象が免疫細胞による排除に対し再発性または難治性であり、該ブリオスタチン剤が該標的細胞集団に対するT細胞媒介性免疫応答を調節する、項8記載の方法。
項12. 該対象ががん免疫療法を受けている、項9～11のいずれか一項記載の方法。
項13. 該調節された標的細胞の増殖を阻害すること、または該調節された標的細胞を排除することのうちの1つまたは複数ができる有効量の治療剤を該対象に投与する工程
をさらに含む、項9記載の方法。
項14. 該標的細胞がHIV感染細胞である、項1記載の方法。
項15. 該標的細胞が、潜在HIVに感染した細胞であり、該標的細胞の免疫原性を調節することは、HIVの発現を活性化させることを含む、項14記載の方法。
項16. 該接触させる工程がインビボで実施され、かつHIVと診断された、またはHIVを有すると思われる対象に該ブリオスタチン剤を投与することを含み、
該接触させる工程は、治療効果を有することができる、項1記載の方法。
項17. HIVの発現の活性化を有する該調節された標的細胞を排除することができる治療有効量の治療用物質を該対象に投与することをさらに含む、項15記載の方法。
項18. 対象のがんを治療する方法であって、該方法は、
（a）対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示および残留を強化するために、有効量のブリオスタチン剤を該対象に投与する工程、および
（b）該細胞表面抗原に特異的に結合して該対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を該対象に投与する工程
を含む。
項19. 該対象が、標的指向抗がん療法に対し再発性または難治性である、項18記載の方法。
項20. 該ブリオスタチン剤が、該治療剤による増殖阻害に対し該標的がん細胞を増感させる、項18記載の方法。
項21. 該ブリオスタチン剤が、該治療剤による排除に対し該標的がん細胞を増感させる、項18記載の方法。
項22. 工程（a）の前は、該標的がん細胞は、該標的細胞表面に治療無効レベルの細胞表面抗原を提示している、項18記載の方法。
項23. 該ブリオスタチン剤が、
（a）細胞表面抗原の発現、（b）発現した細胞表面抗原の該標的細胞表面への移行、および（c）細胞表面抗原の該標的細胞表面での残留
のうちの1つまたは複数を強化する、項18記載の方法。
項24. 該ブリオスタチン剤が、該細胞表面抗原の細胞表面提示を50%以上強化する、項18記載の方法。
項25. 該標的がん細胞の細胞表面抗原提示が、該ブリオスタチン剤の投与後2日以上にわたり強化される、項23または24記載の方法。
項26. 該治療剤が、キメラ抗原受容体発現T細胞（CAR T細胞）、CAR-ナチュラルキラー細胞（CAR-NK細胞）、抗体剤、抗体薬物複合体（ADC）、および二特異性抗体剤から選択される、項18～25のいずれか一項記載の方法。
項27. 工程（b）が、標的細胞集団で提示される細胞表面抗原に特異的に結合する治療有効量のCAR T細胞またはCAR-NK細胞を含む組成物を該対象に投与することを含む、項26記載の方法。
項28. 該ブリオスタチン剤が、該標的細胞集団に対するT細胞媒介性またはNK細胞媒介性免疫応答を調節する、項27記載の方法。
項29. 該標的細胞集団が、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD52、CD80、CD86、CD137、CDK4、CDK6、OX40、およびCD340から選択される腫瘍抗原を含む、項27～28のいずれか一項記載の方法。
項30. 該キメラ抗原受容体発現T細胞またはNK細胞が、B細胞性悪性疾患、CLL、ALL、B-ALL、白血病、リンパ腫、または固形腫瘍の治療に有効である、項27～29のいずれか一項記載の方法。
項31. 該固形腫瘍が、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、軟組織肉腫、リンパ腫、食道がん、子宮がん、骨がん、副腎がん、肺がん、甲状腺がん、結腸がん、グリオーマ、肝臓がん、膵臓がん、腎がん、子宮頸がん、睾丸がん、頭部頚部がん、卵巣がん、神経芽細胞腫、および黒色腫から選択される、項30記載の方法。
項32. 該ブリオスタチン剤の投与が、該治療有効量のCAR-T細胞またはCAR-NK細胞の投与よりも先である、項27～31のいずれか一項記載の方法。
項33. 該ブリオスタチン剤の投与が、該治療有効量のCAR-T細胞またはCAR-NK細胞の投与と同時である、項27～31のいずれか一項記載の方法。
項34. 該ブリオスタチン剤の投与が、該治療有効量のCAR-T細胞またはCAR-NK細胞の投与の後である、項27～31のいずれか一項記載の方法。
項35. 工程(b)が、該対象に、該細胞表面抗原に特異的に結合する治療有効量の抗体剤、ADC、二特異性抗体剤を投与することを含む、項26記載の方法。
項36. 該抗体剤が、ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を含む、項35記載の方法。
項37. 該抗体剤が、IgG1アイソタイプまたはIgG4アイソタイプの全長抗体を含む抗体である、項35記載の方法。
項38. 該剤が、細胞傷害剤を含むADCである、項35記載の方法。
項39. 該細胞傷害剤が、サイトトキシンまたは放射性剤である、項38記載の方法。
項40. 該細胞傷害剤が、ADCの抗体と、リンカーを介して複合体化されている、項39記載の方法。
項41. 該リンカーが、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーから選択される、項40記載の方法。
項42. 該細胞傷害剤が、カリチアマイシン、アウリスタチン、マイタンシノイド、タキソール誘導体、およびデュオカルマイシンから選択される、項38～41のいずれか一項記載の方法。
項43. 該ADCが、イノツズマブオゾガマイシンおよびゲムツズマブオゾガマイシンから選択される、項35記載の方法。
項44. 該剤が二特異性抗体剤である、項35記載の方法。
項45. 該二特異性抗体が、抗CD20/抗CD22二特異性抗体融合タンパク質または抗CD19/抗CD22二特異性抗体融合タンパク質である、項44記載の方法。
項46. 該剤が、経口、眼内、経耳、皮下、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および吸入から選択されるルートにより投与される、項35～45のいずれか一項記載の方法。
項47. 該がんが、白血病またはB細胞性リンパ腫である、項18～46のいずれか一項記載の方法。
項48. 該B細胞性リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、項47記載の方法。
項49. 該がんが、バーキットリンパ腫およびB細胞性慢性リンパ性白血病から選択される、項47記載の方法。
項50. 該がんが、黒色腫、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、食道がん、または腎臓がんである、項18～49のいずれか一項記載の方法。
項51. 該対象が哺乳動物である、項18～50のいずれか一項記載の方法。
項52. 該対象が、細胞表面抗原標的指向療法に対し再発性または難治性である、項51記載の方法。
項53. 該細胞表面抗原が、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD34、CD38、CD40、CD52、CD80、CD86、CD137、CDK4、CDK6、OX40、およびCD340から選択される、項52記載の方法。
項54. 該対象から得られた試料の標的がん細胞における細胞表面抗原のレベルまたは発現または提示を決定することをさらに含む、項18～53のいずれか一項記載の方法。
項55. 少なくとも1つの追加の抗がん療法を該患者に施す工程をさらに含み、
該追加の抗がん療法は、放射線療法、化学療法、免疫療法、チェックポイント阻害剤、手術、および脈管を標的とする療法から選択される、項18～54のいずれか一項記載の方法。
項56. 該がんの状態をアッセイするために、該対象の試料中の1つまたは複数のバイオマーカーを評価する工程
をさらに含む、項18～55のいずれか一項記載の方法。

Claims (21)

  1. 対象において標的細胞を調節する方法であって、
    以下：
    （a）前記標的細胞における抗原の発現、（b）前記標的細胞における抗原の移行、（c）前記標的細胞における抗原の細胞表面提示、および（d）前記標的細胞における抗原の細胞表面残留
    のうちの1つまたは複数を選択的に強化して、標的細胞の免疫原性を調節するために、標的細胞を有効量のブリオスタチン剤と接触させる工程
    を含む、方法。
  2. 前記抗原が、
    タンパク質抗原、ペプチド抗原、ネオ抗原、および標的細胞のmRNA処理から誘導される抗原
    から選択される、請求項1記載の方法。
  3. 前記標的細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）改変T細胞またはキメラ抗原受容体-ナチュラルキラー細胞（CAR-NK細胞）であり、
    前記標的細胞をブリオスタチン剤と接触させる前記工程が、前記CARの発現または細胞表面提示および残留を強化する、請求項1または2記載の方法。
  4. 前記接触させる工程がエクスビボで実施され、前記標的細胞が前記対象から取り出される（自己細胞である）、請求項3記載の方法。
  5. 前記接触させる工程がエクスビボで実施され、前記標的細胞がドナーから取り出される（アロジェニック細胞である）、請求項3記載の方法。
  6. 前記標的細胞が、がん細胞、がん幹細胞、およびがん前駆細胞から選択される、請求項1記載の方法。
  7. 前記接触させる工程がインビボで実施され、がんを有する対象に前記ブリオスタチン剤を投与することを含む、請求項6記載の方法。
  8. 前記対象の免疫系による排除に対し前記標的細胞を増感させる、請求項6または7記載の方法。
  9. 前記調節された標的細胞の増殖を阻害すること、または前記調節された標的細胞を排除することのうちの1つまたは複数ができる有効量の治療剤を前記対象に投与する工程
    をさらに含む、請求項7記載の方法。
  10. 前記標的細胞がHIV感染細胞である、請求項1記載の方法。
  11. 前記接触させる工程がインビボで実施され、かつHIVと診断された、またはHIVを有すると思われる対象に前記ブリオスタチン剤を投与することを含み、
    前記接触させる工程が、治療効果を有することができる、請求項1記載の方法。
  12. 対象のがんを治療する方法であって、
    (a）対象の標的細胞の細胞表面抗原またはネオ抗原の提示および残留を強化するために、有効量のブリオスタチン剤を前記対象に投与する工程、および
    (b）前記細胞表面抗原に特異的に結合して前記対象のがんを治療する治療有効量の治療剤を前記対象に投与する工程
    を含む、方法。
  13. 前記対象が、標的指向抗がん療法に対し再発性または難治性である、請求項12記載の方法。
  14. 工程(a)の前は、前記標的がん細胞が、前記標的細胞表面に治療無効レベルの細胞表面抗原を提示している、請求項12記載の方法。
  15. 前記ブリオスタチン剤が、
    (a)細胞表面抗原の発現、(b)発現した細胞表面抗原の前記標的細胞表面への移行、および(c)細胞表面抗原の前記標的細胞表面での残留
    のうちの1つまたは複数を強化する、請求項12記載の方法。
  16. 前記治療剤が、キメラ抗原受容体発現T細胞（CAR T細胞）、CAR-ナチュラルキラー細胞（CAR-NK細胞）、抗体剤、抗体薬物複合体（ADC）、および二特異性抗体剤から選択される、請求項12～15のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記がんが、白血病またはB細胞性リンパ腫である、請求項12～16のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記がんが、黒色腫、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、食道がん、または腎臓がんである、請求項12～16のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記対象から得られた試料の標的がん細胞における細胞表面抗原のレベルまたは発現または提示を決定する工程をさらに含む、請求項12～18のいずれか一項記載の方法。
  20. 少なくとも1つの追加の抗がん療法を前記患者に施す工程をさらに含み、
    前記追加の抗がん療法が、放射線療法、化学療法、免疫療法、チェックポイント阻害剤、手術、および脈管を標的とする療法から選択される、請求項12～19のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記がんの状態をアッセイするために、前記対象の試料中の1つまたは複数のバイオマーカーを評価する工程
    をさらに含む、請求項12～20のいずれか一項記載の方法。
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