JP2007535966A - 染色体異常を検出するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は染色体構造の変化を検出する方法に関する。本方法は核酸を結合する標識されたプローブを使用する。例えば、これらのプローブは、核酸、または核酸アナログおよび検出可能な標識からなる。

Description

本出願は、米国仮特許出願６０／５６７，４４０号および６０／５６７，５７０号に対して優先権を主張し、両出願は、共に２００４年５月４日に出願され、その全体を参照として本明細書中に援用する。

本発明は、１つの態様において、染色体構造の変化を検出する方法に関する。本方法は、核酸を結合するプローブを使用する。例えば、これらのプローブは、核酸または核酸アナログ及び検出標識からなり得る。

非放射性標識を使用する分子生物学の基本的プロセスを含むインサイチュハイブリダイゼーションによる核酸配列の検出は、数年の間利用されてきた（Ｓｐｅｅｌ，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１２：８９−１１３（１９９９））。プローブベースのアッセイは、核酸の検出、同定、定量または分析に有用である。核酸プローブは、細菌、真菌、ウイルス、または他の生物体由来の核酸の存在についてサンプルを分析するために使用されてきており、遺伝学ベースの疾患状態または目的の臨床条件を試験することにもまた有用である。

蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、１９７０年後半に最初に開発された（Ｒｕｄｋｉｎ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２６５：４７２−７３（１９７７））。この技術は、一般的に、サンプルの調製、プローブの標識、標的染色体およびプローブの変性、標的配列へのプローブのハイブリダイズ、ならびにシグナルの検出を必要とする。その発端以来、哺乳動物細胞において特異的なＤＮＡ配列の数、サイズまたは位置を検出するための重要なツールとなった。これらの細胞において、染色体は、対になって配列され、ここで、対になった各染色体は、姉妹染色体である。例えば、ヒト細胞は、２３対の染色体を有する。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、標的配列を蛍光的に染色し、その結果、これらの位置、サイズまたは数は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリーまたは他の適切な手段を使用して決定され得る。全ゲノムから数キロベースの範囲にわたるＤＮＡ配列は、現在のハイブリダイゼーション技術および商業的に利用可能な手段を使用して研究され得る。

ハイブリダイゼーションシグナルが中期伸展および間期核の両方で見られ得るように、ＦＩＳＨベースの染色は十分異なる。核酸の検出のためのプローブを使用する単色ＦＩＳＨおよび多色ＦＩＳＨは、出生前診断、白血病診断および腫瘍細胞遺伝学を含む分子細胞遺伝学として一般的に知られる、異なる臨床応用に応用される。一般的に、ＦＩＳＨ技術は、使用の容易さ、迅速な結果、蛍光標識に先行する放射標識と比較して減少されたバックグラウンド、および高い感度を含むいくつかの利点を有する。

ＦＩＳＨ技術は、臨床的設定においていくつかの応用を有する。これらの応用は、例えば、出生前診断、血液学的癌、および固形腫瘍における染色体異数性の検出；遺伝子異常性、例えば、遺伝子増幅、遺伝子欠失、または遺伝子融合の検出；染色体構造異常性、例えば、転座、重複、挿入、または逆位；近接遺伝子症候群、例えば、微小欠失症候群の検出；治療の遺伝的効果のモニタリング；体細胞内および染色体中のウイルス組み込み部位内のウイルス核酸の検出；遺伝子マッピング；ならびに細胞周期分析を含む（Ｌｕｋｅ ａｎｄ Ｓｈｅｐｅｌｓｋｙ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ ５：４９−５３（１９９８））。

癌の研究の応用に関しては、ＦＩＳＨ分析は、胸部、腎臓、肺、子宮、精巣、および卵巣を含む種々の組織中の癌に相関する、ヒト染色体中のいくつかの欠失する傾向のある領域の同定を導いた（Ｓｚｅｌｅｓ，Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇａｒｉｃａ，４９：６９−８０（２００２））。ＦＩＳＨ分析はまた、腫瘍抑制遺伝子およびＤＮＡ修復遺伝子を分析するために使用された。さらに、ＦＩＳＨはまた、リンパ腫のような転座に関連する癌を検出するために使用された。

当業者が染色体を分析するのに使用したＦＩＳＨ技術の種々のバリエーションが存在する（Ｌｕｋｅ ａｎｄ Ｓｈｅｐｅｌｓｋｙ，Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ ５：４９−５３（１９９８））。例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）において、全ゲノムは、染色され、異常なコピー数を有する領域を検出するために、正常な参照ゲノムと比較される。多色ＦＩＳＨ技術（ｍ−ＦＩＳＨまたは複合ＦＩＳＨ）において、各別々の正常染色体は、別々の色によって染色される（Ｅｉｌｓら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ８２：１６０−７１（１９９８））。異常な材料で使用された場合、プローブは、異常な染色体を染色し、それによって、由来する正常な染色体を推定する（Ｍａｃｖｉｌｌｅ Ｍら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８：２９９−３０５（１９９７））。ＡＢＬ遺伝子のような特定のＤＮＡ配列は、ほんの１５ｋｂのプローブを使用して確実に染色され得る（Ｔｋａｃｈｕｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：５５９−６２（１９９０））。テロメア複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＦＩＳＨ（ＴＭ−ＦＩＳＨ）において、１つのサンプルスライドガラスにおけるいくつかのサブテロメアプローブの同時ハイブリダイゼーションがある（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ，８１：４８３−９１（２００１））。これらのサブテロメアプローブは、染色体の末端から１００ｋｂと１Ｍｂとの間である。

スペクトル染色体分析（ＳＫＹ）は、電荷結合素子（ＣＣＤ）画像化およびフーリエ分光学を使用し、スキャンされた各ピクセルについて蛍光波長のスペクトルを評価し、同定されたスペクトルに依る特定の偽色を割り当てる（Ｓｃｈｒｏｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：４９４−４９７（１９９６））。小さなゲノム断片を含む染色体異常の場合、ＳＫＹ分析は、より小さなサブテロメアプローブを使用する補足的ＦＩＳＨ分析を必要とし得る（Ｆａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ，４：９−１４（２０００）；Ｈｉｌｇｅｎｆｅｌｄら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１１３：３０５−１７（２００１））。

離れたシグナルＦＩＳＨ（ｓｓＦＩＳＨ）は、２つのプローブを使用することによって染色体構造の変化を検出し、この各々のプローブは、異なる検出可能な標識によって標識される。検出可能な標識は、互いに識別し得るべきである。各プローブは、染色体の擬似分岐点の片側で、染色体に結合する。正常な染色体において、この２つのプローブは、これらの異なる標識の合わさったシグナルが、各標識単独とは異なるシグナルを形成するように、互いに十分近位である。従って、正常な染色体サンプルは、姉妹染色体上の２つのプローブの合わさったまたは融合したシグナルのみを含む。異常なサンプルにおいて、１つの姉妹染色体は、擬似分岐点において分岐しており、融合したシグナルは、正常な姉妹染色体上に残る。分岐した染色体において、１つのプローブが、異なる染色体に移動し、ここで、このプローブの特有のシグナルが、明らかになる。他の個々のプローブは、分裂した染色体上に残り、それは、もはや他のプローブに近位でないので、なおその特有のシグナルを放射する。要約すると、染色体構造の分岐のために、２つのプローブは、もはや並置されず、これらが一緒になって引き起こされる、融合したシグナルは、各プローブに対する個々のシグナルに離され得る。図１を参照。一般的には、ＷＯ９８／５１８１７を参照。

しかし、ｓｓＦＩＳＨの但し書きは、偽の負の読み取りが、現れる事実にある。特に、染色体転座は起こり得、プローブシグナルは、実際に、染色体の２つの異なる対の間で離され得るが、異常なサンプルは、まるで融合したシグナルのみが存在するかのように現れる。このことは、転座に関与する２つの染色体の対がサンプル中で互いに空間的に物理的に重なる場合起こり、分裂したプローブを近位に導き、偽の融合したシグナルを与える。

融合シグナルＦＩＳＨは、２つの標識の近接が新しい融合したシグナルを発生するように、２つの異なる識別可能な標識を有する２つのプローブが使用されるｓｓＦＩＳＨと類似する。２つの方法は、融合シグナルＦＩＳＨに対して、２つのプローブが、染色体再配列の結果として互いに近位になると疑われる位置で、２つの異なる染色体対と結合するということにおいて異なる。従って、正常なサンプルにおいて、個々のプローブ由来のシグナルのみが存在し、融合したシグナルは現れない。異常なサンプルにおいて、１つの染色体の断片は、別の染色体に付着し、関与する２つの対の各々における正常な染色体は、個々のプローブのシグナルの各々を放射する。異常な染色体において、プローブは今や転座により近位にあり、融合したシグナルが現れる。図２を参照。

融合シグナルＦＩＳＨ法は、偽の正の読み取りを与え得る。特に、正常な染色体サンプルは、２つのプローブがなお、異なる染色体対に別々に結合するけれども、正の融合したシグナルを誤って与え得る。この場合において、転座に関与する２つの染色体対は、サンプル中で互いに空間的に物理的に重なっており、近位に正常に分裂したプローブを導き、偽の融合したシグナルを与える。以下に議論されるように、本発明は、偽の正の読み取りおよび偽の負の読み取りの問題を克服した新規の方法を使用する。

標的核酸配列に対するインサイチュハイブリダイゼーションのプローブに基づいた方法はまた、非標的配列に結合する大きなプローブによる高いバックグラウンドの問題を備える。例えば、ヒトゲノムのかなりの成分は、非標的繰り返し配列を含む。高等生物のＤＮＡにおける熱変性および再アニーリング研究は、真核生物ＤＮＡの３つの集団に区別した；総ＤＮＡの２５％に相当する迅速再アニーリング成分、総ＤＮＡの３０％に相当する中間成分、および総ＤＮＡの４５％に相当する遅い成分（Ｂｒｉｔｔｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １６１：５２９−５４０（１９６８））。配列分析は、遅い成分が、単一コピー配列から構成され、この配列が、タンパク質をコードする遺伝子を含み、その一方で、迅速成分および中間成分が、繰り返し配列に相当することを示した。迅速成分は、小さく（数ヌクレオチド長）、高度に繰り返しのＤＮＡ配列を含み、これは、通常タンデムに見いだされ、一方で、中間成分は、散在した反復ＤＮＡを含む（Ｎｏｖｉｃｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４６（１）：３２−４１（１９９６）およびＢｒｏｓｉｕｓ Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７５３（１９９１））。中間成分の反復単位は、ゲノム中に散在され、ゲノム核酸に由来する大きなゲノム核酸プローブ（すなわち、＞１００ｂｐ）は、ハイブリダイゼーション分析に良好には適し得ないという大きな理由である。

散在した繰り返し配列は、ＳＩＮＥｓ（短い散在反復配列）またはＬＩＮＥｓ（長い散在反復配列）のいずれかとして分類される（Ｋｒｏｅｎｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ，５３：３９１−４００（１９８８））。霊長類において、これらのクラスの各々は、一本鎖ＤＮＡ配列ファミリーによって優位を占められ、この両方は、レトロスポノス（ｒｅｔｒｏｓｐｏｎｏｓ）として分類される（Ｒｏｇｅｒｓ Ｊ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔ Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，９３：１８７−２７９（１９８５））。主要なヒトＳＩＮＥｓは、Ａｌｕ反復ＤＮＡ配列ファミリーである。Ａｌｕ反復ＤＮＡ配列ファミリーメンバーは、頭対尾のダイマーとして整列された２つの類似する配列からなる約２８０〜３００ｂｐのコンセンサス配列によって特徴付けられる。約１００万コピーのＡｌｕ反復配列は、１つの半数体ヒトゲノムあたりで存在すると見積もられ、それによって、ゲノムの約１０％に相当する（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９６））。この見積もりは、ヒト第２１染色体および第２２染色体の最近の配列決定と一致する。これらの報告は、Ａｌｕ反復がＤＮＡのそれぞれ９．４８％および１６．８０％にわたることを示す（Ｈａｔｔｏｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，４０５：３１１−３１９（２０００）およびＤｕｎｈａｍ Ｉ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，４０２：４８９−４９５（１９９９））。

Ａｌｕ要素は、過去６５００万年にわたって、レトロポジションによってヒトゲノム中で増幅され、サブファミリーメンバーによって共有される診断的変異に基づいて豊富な重複サブファミリーに組織化された（例えば、Ｂａｔｚｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，４２：３−６（１９９６）を参照）。Ｂａｔｚｅｒらは、Ａｌｕ反復配列に対する共通命名法を記載し、最も年老いた（Ｊ）、中間（Ｓ）および若い（Ｙ）ファミリーブランチを提示した。Ｙファミリーブランチのみが、なお転写活性であるが、これは、規定されたａ５、ａ８およびｂ８サブファミリーメンバーの各々が、２０００未満の要素を生成するように、非常に小さい（Ｓｈｅｒｒｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４７：１９７７−１９８２（１９９７））。霊長類Ａｌｕ反復ファミリーブランチの要素が計算され、約１/５がＪファミリーに属し、４／５がＳファミリーに属する（Ｂｒｉｔｔｅｎ，Ｒ．Ｊ．，ＰＮＡＳ−ＵＳＡ，９１：６１４８−６１５０（１９９４））。Ｓファミリーは、総Ｓファミリーブランチの５０％超に相当するほど、Ｓｘサブファミリーによって優位を占められる。

ＳＩＮＥｓおよびＬＩＮＥｓに加えて、ヒトのゲノム核酸および他の生物体中に存在することが公知のいくつかの他の型の反復が存在する。染色体テロメアは、全ての染色体の末端にのみ、または主に全ての染色体の末端に存在するように見える反復配列である。これらは、生物体の生命の間に短くなると信じられており、生物体の老化に役割を果たし得る（Ｌａｎｄｓｏｒｐ，Ｐ．，ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ９７／１４０２６を参照）。同様に、染色体動原体は、染色体の中央（動原体）領域にのみ、または主に染色体の中央（動原体）領域に存在する別個の反復配列を含む。動原体反復配列の若干数は、生物体の全ての染色体において検出され得、その一方で、他の反復配列は、特定の染色体に特有であり、特定の染色体を同定するために使用され得る（Ｔａｎｅｊａら、Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ，３０：５７−６３（２００１））。

テロメアおよび動原体反復配列は、テロメアおよび動原体反復配列が染色体の特定の領域内に局在化される、ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥｓのような散在した反復配列とは異なる。比較して、本明細書中でランダムに分布した反復配列といわれるＳＩＮＥｓおよびＬＩＮＥｓは、全ゲノムにわたってランダムに分散される（Ｕｌｌｕ Ｅ．，ＴＩＢＳ：２１６−２１９（Ｊｕｎｅ，１９８２））。従って、本明細書中で使用される場合、用語「ランダムに分布した反復配列」は、生物体のゲノム核酸の全てにおいて、または本質的に全てにおいてランダムに生じる反復配列をいうことが意図される。これらとしては、Ａｌｕ−反復、Ｋｐｎ−反復、ジ−ヌクレオチド反復、トリ−ヌクレオチド反復、テトラ−ヌクレオチド反復、ペンタ−ヌクレオチド反復、ヘキサ−ヌクレオチド反復、ＭＩＲ反復およびＬＴＲ反復が挙げられるが、これらに限定されない。これらの全ては、より一般的には、ＳＩＮＥｓまたはＬＩＮＥｓと分類される。

非放射性標識を使用するインサイチュハイブリダイゼーションによる核酸配列の検出は、ほぼ２０年間応用されている。しかし、上記されるように、ＳＩＮＥｓおよびＬＩＮＥｓのようなランダムに分布した反復配列は、プローブが、必然的にランダムに分布した反復配列を含むので、大きなクローンに由来する特定の核酸プローブの生成に対して特に問題になる。この問題は、核酸プローブが、その中に含まれるランダムに分布した反復配列を有するので生じ、それによって、プローブのランダムに分布した反復配列と全ての染色体内に見出される天然のゲノム核酸との間のハイブリダイゼーションを促進する。検出可能なプローブが、標的およびゲノム核酸中にランダムに見い出される反復配列に特異的にハイブリダイズするので、高い度合いのバックグラウンドシグナルが生じる。

従って、１つの態様において、本発明は、非特異的バックグラウンドシグナルノイズを最小化する。

（本発明の要旨）
１つの態様において、本明細書中で分離融合（Ｓｐｌｉｔ−Ｆｕｓｉｏｎ）ＦＩＳＨ（ＳＦ−ＦＩＳＨ）といわれる、少なくとも３つの異なる識別できる標識を有する少なくとも３つの異なるプローブが使用される。１つの態様において、プローブの２つは、核酸の調製物において標的領域に結合する。核酸の調製物としては、染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣ、プラスミド、およびコスミドの調製が挙げられるがこれらに限定されない。別の態様において、標的領域は、２つのプローブが第１の融合したシグナルを生成するために十分近位であるように、染色体中の擬似分岐点のいずれかの側上であり得る。第３のプローブは、サンプル中の異なる標的領域に結合し、それ自身の独立したシグナルを示す。例えば、これは、他の２つのプローブによって結合される染色体を除く、サンプル中の１つの染色体、染色体の特定のグループ、または他の全ての染色体への結合を含み得る。核酸構造の変化が生じる場合、第１の融合したシグナルは、第１の２つのプローブの近接がなくなったことにより、そのそれぞれの個々のシグナルに分離する。さらに、新規の融合したシグナルが、第３のプローブの２つの他のプローブの１つへの新規の近接により現れる。核酸構造の変化は、第１の融合したシグナルが失われたり、新規の離れたシグナルが現れたり、そして新規の第２の融合したシグナルが現れたりする場合に、明確に同定される。図３を参照。別の態様において、ＳＦ−ＦＩＳＨ法において使用される少なくとも３つのプローブの少なくとも１つは、相補的な反復非標的配列に前もって吸着され、ＳＦ−ＦＩＳＨ法における使用の前にサンプル中の反復非標的配列に結合し得る標識されたプローブを除去する。

別の態様において、相補的な反復非標的配列は、固体表面に結合される。例えば、ビーズが使用され得る。図４を参照。

本発明のさらなる目的と利点は、後に続く、または本発明の実施によって習得され得る発明の詳細な説明に一部示される。本発明の目的と利点は、添付の特許請求の範囲に特に示される要素および組み合わせによって実現および達成される。

前述の一般的な記載および以下の発明の詳細な説明の両方は、例示的および説明的であるのみで、特許請求の範囲とは違い、本発明を限定しないことが理解されるべきである。本明細書の一部として組み込まれ、そして構成する添付の図面は、本明細書と一緒に本発明の態様を示し、本発明の原理を説明するために役に立つ。

（発明の詳細な説明）
１つの態様において、本発明は、染色体構造の変化を検出する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、句、染色体構造の変化は、正常な染色体コントロールと比較した場合、試験サンプル中の染色体の変化をいう。本明細書中で使用される場合、正倍数性は、正常な数の構造的に正常な染色体を有する状態である。例えば、ヒト女性由来の正倍数性体細胞は、総計４６染色体または２３染色体対に対して、４４の常染色体および２つのＸ染色体を含む。正倍数性の雄牛は、５８の常染色体、１つのＸ染色体および１つのＹ染色体を有する。

染色体変化の非網羅的な例としては、異数性、遺伝子増幅、遺伝子欠失を含む欠失、遺伝子融合、転座、重複、挿入、または逆位が挙げられる。本明細書中で使用される場合、異数性は、正常な倍数体状態または正常な二倍体数の染色体より少ないかまたはより多い染色体を有する状態からの任意の逸脱をいう。異数性は、最も頻繁に観察される型の細胞遺伝学的異常である。一般的に、異数性は、染色体数の大きな変化が致死の性質であるために、大きな逸脱がほとんど検出されないので、正倍数性からの小さな逸脱として認識される。本明細書中で使用される場合、増幅は、特定のＤＮＡフラグメントのコピー数の増加をいう。このようなＤＮＡフラグメントは、例えば、遺伝子または全染色体を含む。本明細書中で使用される場合、欠失は、核酸配列が染色体から除去される遺伝的事象をいう。本明細書中で使用される場合、遺伝子融合は、２つの遺伝子のＤＮＡの偶然の結合をいう。遺伝子融合は、転座または逆位によっても起こり得る。遺伝子融合は、別の遺伝子のシス調節要素（例えば、エンハンサーまたはプロモーター）の並置によって、ハイブリッドタンパク質または１つの遺伝子の転写の誤調節を生じ得る。本明細書中で使用される場合、転座は、１つの染色体の核酸配列の一部がその染色体から除去され、異なる染色体に結合する遺伝的事象である。本明細書中で使用される場合、重複は、染色体または染色体断片中のヌクレオチド配列の反復をいう。例えば、重複は、重複した配列に対して、一列に並置しているヌクレオチド配列の反復を生じる。本明細書中で使用される場合、挿入は、核酸配列が、染色体中の２つの点の間に導入される遺伝的事象をいう。本明細書中で使用される場合、逆位は、染色体中の核酸配列の方向が逆を向く遺伝的事象である。本明細書中で使用される場合、染色体分岐点は、染色体が２つの断片に分離する染色体中の位置をいう。

１つの態様において、本発明は、染色体上で標的核酸配列に特異的に結合する少なくとも３つのプローブを使用する。本明細書中で使用される場合、プローブは、目的の構造または標的に結合する「核酸」プローブまたは「核酸アナログ」プローブをいう。本明細書中で使用される場合、「核酸」は、核酸塩基配列を含むオリゴマー、ポリマー、またはポリマー断片をいい、天然に存在するヌクレオチドまたは非修飾のヌクレオチドのみから形成された骨格を有する。本明細書中で使用される場合、「核酸アナログ」は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドからなるオリゴマー、ポリマー、またはポリマー断片あるいはヌクレオチドの修飾から直接誘導されたサブユニットを意味する。天然に存在する核酸塩基の非限定的な例としては：アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルが挙げられる。修飾されたヌクレオチドの非限定的な例としては：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２―チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）ならびにＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が挙げられる。他の適切な核酸塩基の非限定的な例としては、Ｂｕｃｈａｒｄｔらの図２（Ａ）および２（Ｂ）（米国特許６，３５７，１６３）に示される核酸塩基が挙げられる。

用語「核酸アナログ」はまた、核酸に結合し得る合成分子をいう。例えば、核酸アナログプローブは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸(ＬＮＡ）、または核酸の任意の誘導体型からなり得る。本明細書中で使用される場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、少なくとも１つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含む任意のオリゴマーまたはポリマーを意味し、全てが本明細書中に参照として援用される米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、同第６，２０１，１０３号、同第６，２２８，９８２号および同第６，３５７，１６３号に言及されるかまたはペプチド核酸として特許請求される、任意のオリゴマーまたはポリマー断片を含むが、これらに限定されない。用語ＰＮＡはまた、以下の刊行物に記載される核酸模倣物の１つ以上のサブユニットを含む任意のオリゴマーまたはポリマー断片に適用される：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １：５ ５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．，３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）；およびＷＯ９６／０４０００に開示されるｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭｓ） ｏｆ Ｓｈａｈら。本明細書中で使用される場合、用語「ロックト核酸」または「ＬＮＡ」は、少なくとも１つ以上のＬＮＡサブユニットを含むオリゴマーまたはポリマーを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「ＬＮＡサブユニット」は、リボースの２’−酸素を４’ −炭素で結合するメチレン橋を含むリボヌクレオチドを意味する。一般的には、Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１６２８−４４（２００３）を参照。

プローブは、１つ以上の核酸断片または合成分子断片を含み得、ここで、各断片は検出可能な標識で別々に標識される。プローブはまた、核酸断片と合成分子断片との混合物を含み得、ここで、各断片は検出可能な標識で別々に標識される。

本明細書中で使用される場合、標的配列は検出または同定されるように探される核酸配列である。核酸配列は、目的の核酸分子（例えば、染色体）の部分配列であり得る。本明細書中で使用される場合、非標的配列は標的配列でない核酸配列である。

プローブは特定の条件下で標的配列に結合する。用語「結合する」は、「ハイブリダイズする」と同意語である。２つの分子がハイブリダイズする場合、これらは、１つ以上の型の化学結合または相補的塩基対形成によって２つの分子の組み合わせを形成する。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外の結合によって連結され得る。従って、オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結された構成塩基を有する。適切なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９９５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２節、４節および６節に例示されるような最小の実験を用いて当業者によって選択され得る。さらにストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，７章、９章および１１章に記載される。本明細書中に使用される場合、用語相補的は、互いにハイブリダイズし得る核酸塩基をいう。例えば、アデニンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。

本明細書中に使用される場合、句、特定の条件下で結合するは、ハイブリダイゼーションおよび互いに実質的に同一または相同なヌクレオチド配列が互いに結合したまま残る洗浄のための条件を記載することが意図される。少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、および例えば少なくとも約８５〜９０％同一である配列が互いに結合したまま残る条件であり得る。

１つの態様において、プローブは検出可能な標識を含む。本明細書中に使用される場合、検出可能な標識はオリゴマーまたはポリマーに結合し、それによってオリゴマーまたはポリマーを道具または方法によって検出可能にし得る部分をいう。１つの態様において、検出可能な標識はプローブに直接結合され得る。別の態様において、検出可能な標識はプローブに間接的に結合され得る。例えば、検出可能な標識はリンカーを使用することによってプローブに結合され得る。検出可能な標識は、例えば蛍光色素、発色団、スピンラベル、放射性同位元素、酵素、ハプテン、量子点、ビーズ、アミノヘキシル、ピレン、およびアクリジニオン（ａｃｒｉｄｉｎｉｏｎｅ）のような化学ルミネセンス化合物であり得る。本発明の方法で使用され得る蛍光色素としては、ＩＲ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリスリン、カスケード青、Ｏｒｅｇｏｎ緑４８８、パシフィック青、ローダミン緑、５（６）−カルボキシフルオレセイン、シアニン色素（すなわち、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン（すなわち、ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン、リスサミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、テキサス赤、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、およびＡｌｅｘａ色素が挙げられるがこれらに限定されない。本発明で使用され得るハプテンとしては、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ローダミン、臭化デオキシウリジン、アセチルアミノフルレン（ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｆｌｕｒｅｎｅ）、トリニトロフェノール水銀、エストラジオールおよびビオチンが挙げられるがこれらに限定されない。本発明で使用され得る酵素としては、ダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の１つの態様において、使用される標識は、検出可能で、互いに識別可能である。識別可能なプローブは、互いに分離して検出される場合、異なるシグナルを与えるプローブである。本明細書中で使用される場合、融合したシグナルは、２つ以上の個々のシグナルが共局在化し、新規または異なるシグナルを生成する場合生じる。例えば、２つの標識されたプローブが、これらのシグナルが重なり合うほど十分近位にある場合、融合したシグナルは生じる。融合したシグナルは、結合された標的配列に結合するための標識されたプローブを必要としない。標識されたプローブが共局在化シグナルを生じるほど十分近い場合、融合したシグナルは生じる。例えば、プローブ間の差異がプローブシグナルの直径の２倍未満である場合、融合したシグナルは生じる。融合したシグナルはまた、３つの標識されたプローブが互いに近位にある場合に生じ、このことは、染色体挿入によって生じ得る。これらの挿入は、試験されたヒト患者の約２０％で生じる。それによって、融合したシグナルを作り上げる個々のシグナルが、別々に同定され得るように互いから離されている場合、離れたシグナルは生じる。標識は、蛍光顕微鏡、明視野顕微鏡、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、およびデジタル画像化顕微鏡、レーザースキャニング、フローサイトメトリーを含む種々の手段によって検出され得る。プローブおよび標識されたプローブは、当該分野で公知の任意の方法によって準備され得る。

１つの態様において、プローブは染色体調製物と接触される。別の態様において、プローブは染色体調製物と連続して接触される。別の態様において、プローブは染色体調製物と同時に接触される。本明細書中で使用される場合、染色体調製物は、目的の細胞型由来の染色体からなる組成物をいう。目的の細胞型は、哺乳動物細胞、細菌細胞、または酵母細胞であり得る。さらなる態様において、染色体調製物は、種々の体細胞分裂の段階の哺乳動物細胞から生成し得る。例えば、染色体調製物は、間期、前期、後期、終期、または中期における細胞から生成し得る。ＳＦ−ＦＩＳＨ分析における使用のための染色体調製物の生成方法は、当業者に周知である。

１つの態様において、本発明は、非特異的バックグラウンドシグナルノイズを最小化する。１つの例において、図４に示されるように反復配列はプローブから激減され得る。別の例において、プローブは、まず、抗原で標識された反復核酸配列のプールにハイブリダイズされ得る。次いで、反復配列は、該抗原を認識する表面結合抗体とサンプルを接触させることによって除去され、そのために、反復配列に結合し得る捕捉プローブに対する抗体を使用する。次いで、このプローブサンプルは、ＳＦ−ＦＩＳＨのようなＦＩＳＨ技術における使用の前に、固定された抗体から除去され得る。

別の態様において、本発明は、標識されたプローブが部分的にまたは完全に染色体分岐点領域に伸びる標的領域あるいはハイブリダイゼーションが所望されない任意の他の領域への標識されたプローブのハイブリダイゼーションを最小化する。標識されたプローブのハイブリダイゼーションが望まれない染色体上の領域にハイブリダイズする配列を含む、過剰の標識されないＤＮＡを加えることによってブロッキングは、達成され得る。図５を参照。ブロッキングＤＮＡは、プラスミド、コスミド、ＰＡＣ、ＢＡＣ、またはＹＡＣを含むがこれらに限定されない種々のベクターから調製され得る。

別の態様において、使用される３つのプローブの１つ以上は、相補的な反復核酸配列に前もって吸着される。反復核酸配列として、Ａｌｕ−リピート、Ｋｐｎ−リピート、ジ−ヌクレオチドリピート、トリ−ヌクレオチドリピート、テトラ−ヌクレオチドリピート、ペンタ−ヌクレオチドリピート、ヘキサ−ヌクレオチドリピート、ＭＬＲおよびＬＴＲが挙げられるがこれらに限定されず、これらの全ては、ＳＩＮＥｓまたはＬＩＮＥｓとして分類される。反復配列は、通常、非標的配列である。本明細書中に使用される場合、前もって吸着されるは、標識されたプローブを相補的な反復核酸配列に曝し、結合した標識されたプローブを形成することをいう。相補的な反復核酸配列によって結合された、結合した標識されたプローブは、ＳＦ−ＦＩＳＨ法において残りの標識されたプローブを使用する前に除去される。さらに別の態様において、相補的な反復核酸配列は固体表面に結合される。固体表面は、ビーズおよびスライドガラスを含むがこれらに限定されない。１つの態様において、反復配列は固体表面に共有結合され得る。別の態様において、反復配列は固体表面に水素結合され得る。

本発明は、標識されたプローブから所望されない配列を除去する工程を包含する、染色体の構造の変化を検出するための方法を包含する。所望されない配列は、反復ヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない。

本発明は、標的領域の変化を検出する方法を包含し、この方法は：
（ａ）核酸の調製物を得る工程；
（ｂ）核酸の調製物を、第１の標識を含む第１のプローブと接触させる工程；
（ｃ）核酸の調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ標的領域内に結合し、第１のプローブと第２のプローブとの結合が融合したシグナルを生じる、工程：
（ｄ）核酸の調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで第３のプローブは、核酸の調製物中の異なる標的領域に結合する、工程：ならびに
（ｅ）核酸構造の変化を検出する工程、
を包含し、ここで、この第１のプローブおよび第２のプローブは、離れたシグナルを生じる同じ標的領域には存在せず；
（ｉ）第１のプローブおよび第３のプローブ；または
（ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
が新規の融合したシグナルを生じる同じ標的領域に存在する。

本発明は、染色体構造の変化を検出するための方法を包含し、この方法は：
（ａ）染色体調製物を得る工程；
（ｂ）染色体調製物を、第１の標識を含む第１のプローブと接触させる工程；
（ｃ）染色体調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ染色体に結合し、第１のプローブと第２のプローブとの結合が融合したシグナルを生じる、工程：
（ｄ）染色体調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで、第３のプローブは染色体調製物中の他の染色体または同じ染色体の別の領域に結合する、工程：ならびに
（ｅ）染色体構造の変化を検出する工程、
を包含し、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは離れたシグナルを生じる同じ染色体には存在せず；
（ｉ）第１のプローブおよび第３のプローブ；または
（ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
が新規の融合したシグナルを生じる同じ染色体に存在する。

本発明はまた、染色体構造の変化を検出するための方法を包含し、この方法は：
（ａ）染色体調製物を得る工程；
（ｂ）染色体サンプル中に存在し結合した標識されたプローブを形成し得る非標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する相補的なプローブと、第１の標識を含む第１のプローブを接触させる工程；
（ｃ）結合した標識されたプローブを除去し、第１の選択されたプローブを残す工程；
（ｄ）染色体調製物を第１の選択されたプローブと接触させる工程；
（ｅ）染色体調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１の選択されたプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ染色体に結合し、第１の選択されたプローブと第２のプローブとの結合が融合したシグナルを生じる、工程：
（ｆ）染色体調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで、第３のプローブは第１の選択されたプローブおよび第２のプローブによって結合される染色体以外の、染色体調製物中の他の染色体に結合する、工程：ならびに
（ｇ）染色体構造の変化を検出する工程、
を包含し、ここで、第１の選択されたプローブおよび第２のプローブは、離れたシグナルを生じる同じ染色体には存在せず；
（ｉ）第１の選択されたプローブおよび第３のプローブ；または
（ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
は、新規の融合したシグナルを生じる同じ染色体に存在する。

本明細書中で使用される場合、Ａ，Ｂ、およびＣのような項目のリストが続く句「その１つ以上から選択された」、「その少なくとも１つから選択された」、「１つ以上から選択された」、および「少なくとも１つから選択された」は、Ａ，Ｂ、およびＣの１つ以上（例えば、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢのみ、ＢおよびＣのみ、ＡおよびＣのみ、またはＡ、ＢおよびＣ）が選択され得ることを示し、また、各Ａ、ＢまたはＣの範疇内の１つ以上の型（例えば、Ａ１およびＡ２のみ、Ａ１およびＡ２およびＢ１のみ、Ｂ１およびＢ２およびＣ１のみなど）が選択され得ることを示す。

以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定または制限することは意図されない。

（実施例）
（実施例１）
中期伸展および間期核を含むスライドガラスを、Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ １，第２版、Ｄ．Ｅ．ＲｏｏｎｅｙおよびＢ．Ｈ．Ｃｚｅｐｕｌｋｏｗｓｋｉ ｅｄｉｔｏｒｓ（１９９２）に記載されるように３．７％ホルムアルデヒドを含むＴＢＳ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）中、室温で２分間前処理した。次いで、このスライドガラスをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で、１回洗浄あたり５分間室温で、２回リンスした。リンスの後、このスライドガラスを７０％エタノール中４℃で２分間インキュベートし、８５％エタノール中４℃で２分間インキュベートし、次いで、９６％エタノール中４℃で２分間インキュベートし、その後空気乾燥することによって、このスライドガラスを一連の冷エタノール（４℃）中で脱水した。

各々の標的領域上に、１０μＬのＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｎｇフルオレセイン標識プローブ、１００ｎｇ Ｔｅｘａｓ赤標識プローブ、５μＭ ＰＮＡオリゴミックス、４５％ホルムアミド、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０％硫酸デキストラン）を加え、１８×１８ｍｍのカバーガラスをかけ、ハイブリダイゼーション領域を覆った。８２℃５分間の変性の前に、カバーガラスの縁を、ゴムセメントで密封した。スライドガラスを４５℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、カバーガラスを除去し、スライドガラスを６５℃のストリンジェント洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で１０分間洗浄した。

次いで、スライドガラスを上記のように、７０％、８５％および９６％の一連の冷エタノール（４℃）中で脱水する前に、ＴＢＳで１分間リンスした。各スライドガラスに、０．１μｇ／ｍＬ ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ， Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充された１０μＬのアンチフェード溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈ−１０００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）をマウントし、カバーガラスで密封した。スライドガラスを、ＣＣＤデジタルカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用して分析した。

図６〜１０は、それぞれ、ＢＣＲ、ＥＴＶ６、ＭＬＬ、ＴＣＦ３およびＴＬＸ３遺伝子に結合するプローブを用いた結果を提供する。この技術において例えば、ＢＣＲ、ＥＴＶ６、ＭＬＬ、ＴＣＦ３およびＴＬＸ３遺伝子をアッセイするために使用され得る特定のプローブ配列は、仮出願６０／５６７，５７０に提供され、本願はこの出願に対して優先権を主張しており、その全体は本明細書中に参照として援用される。さらなるプローブ配列は、同時に出願された対応する国際出願に提供され、「核酸プローブおよび核酸アナログプローブ」と題される。この出願もまた、本明細書中に参照として援用される。

（実施例２）
正常細胞および試験サンプル細胞由来の中期伸展および間期核を含むスライドガラスを、上記されるようにＴＢＳ中で前処理する。次いで、このスライドガラスをＰＢＳで、１回洗浄あたり５分間室温で、２回リンスする。リンスの後、このスライドガラスを、上記されるように７０％、８５％、および９６％の一連の冷エタノール（４℃）中で脱水し、空気乾燥する。

各々の標的領域上に、１０μＬのＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｎｇフルオレセイン標識プローブ、１００ｎｇ Ｔｅｘａｓ赤標識プローブ、１００ｎｇ ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ａｃｉｔｉｃ ａｃｉｄ））標識プローブ、５μＭ ＰＮＡオリゴミックス、４５％ホルムアミド、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＮａＰＯ_４、１０％硫酸デキストラン）を加え、１８×１８ｍｍのカバーガラスをかけ、スライドガラス上のハイブリダイゼーション領域を覆う。８２℃５分間の変性の前に、カバーガラスの縁を、ゴムセメントで密封した。スライドガラスを４５℃で一晩ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの後、カバーガラスを除去し、スライドガラスを６５℃のストリンジェント洗浄緩衝液（０．２×ＳＳＣ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で１０分間洗浄する。ブロッキングＤＮＡはまた、所望されない結合を避けるために図５に示されるように加え得る。

次いで、スライドガラスを上記のように、７０％、８５％および９６％の一連の冷エタノール（４℃）中で脱水する前に、ＴＢＳで１分間リンスする。各スライドガラスに、０．１μｇ／ｍＬ ４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を補充された１０μＬのアンチフェード溶液（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ Ｈ−１０００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）をマウントし、カバーガラスで密封する。

スライドガラスを、ＣＣＤデジタルカメラを備える蛍光顕微鏡を使用して分析する。正常細胞染色体調製物を含むスライドガラスにおいて、Ｔｅｘａｓ赤標識プローブおよびＦＩＴＣ標識プローブは、両方の姉妹染色分体上に共局在化し、２つの同一の融合したシグナルを生成する。図３を参照。ＡＭＣＡ標識プローブは、Ｔｅｘａｓ赤標識プローブともＦＩＴＣ標識プローブとも共局在化しない。異常細胞染色体調製物において、元のＴｅｘａｓ赤／ＦＩＴＣシグナルは、１つの染色分体上に残る。しかし、別の染色分体において、１つのみの標識（すなわち、ＦＩＴＣ）が残り、その一方で、他の標識は別の染色体上でＡＭＣＡ標識と共局在化し、新規の融合したＴｅｘａｓ赤／ＡＭＣＡシグナルを形成する。図３を参照。試験サンプル調製物における元の融合したシグナルの消失および新規の融合したシグナルの出現は、染色体構造の変化を示す。

（実施例３）
ＰＤＧＦＲＡプローブを、正常組織および細胞株ＥＬＯ−１由来の中期伸展からの中期染色体にハイブリダイズした。第４染色体上の正常なＰＤＧＦＲＡ座を、正常細胞において、黄色の点または染色体構造の予想される疾患に関連する変化から上流および下流の領域にハイブリダイズする赤プローブおよび緑プローブの並置に起因する共局在化した緑／赤シグナルのいずれかによって検出した。

（実施例４）
ＰＤＧＲＦＢプローブをＮＡＬＭ−６細胞株由来の中期染色体にハイブリダイズした。第５染色体上の正常なＰＤＧＦＲＢ座を、正常細胞において、黄色の点または染色体構造の予想される疾患に関連する変化から上流および下流の領域にハイブリダイズする赤プローブおよび緑プローブの並置に起因する共局在化した緑／赤シグナルのいずれかによって検出した。一方の緑シグナルの欠損は誘導体第５染色体の欠失を示し、その一方で、赤シグナルは別の染色体への転座を示した。

（実施例５）
他のプローブが、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ＭＹＣ、ＰＡＸ５、ＣＣＮＤ１、ＴＬＸ１、ＴＣＲＡＤ、ＴＣＲＢおよびＴＣＲＧ遺伝子に結合するように設計された。これらのプローブは、染色体構造または種々の疾患、例えばＴ−細胞前リンパ球性白血病、Ｔ−細胞巨大顆粒リンパ性白血病（Ｔ−ＬＧＬ）、好酸球増多症候群（ＨＥＳ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、リンパ形質細胞性（Ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍｏｃｙｔｉｃ）リンパ腫（ＬＰＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、脾性辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、辺縁帯（ＭＡＬＴ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｔ−細胞白血病／リンパ腫（ＴＬＬ）、Ｔ−細胞白血病／リンパ腫（ＴＬＬ）、およびリンパ腫に関与する標的領域の変化を検出するために使用され得る。

この技術において使用され得る特定のプローブ配列は「核酸プローブおよび核酸アナログプローブ」と題された添付の国際出願および２００４年５月４日に出願された米国仮出願６０／５６７，５７０に提供され、本願は、これらに対して優先権を主張する。これらの出願の両方は、本明細書中に参照として援用される。

本発明の他の態様は、本明細書の考察および本明細書中に開示される本発明の実施から当業者には明らかである。本明細書および実施例は、例示としてのみ見なされることが意図される。本明細書中で議論されるかまたは参照される全ての参照は、参照として援用される。

図１は、ｓｓＦＩＳＨ法における期待されるシグナルを要約する。白色の棒および丸は融合したシグナルを示し、その一方で、２つの異なる影付きの棒および丸は２つの異なる色付きプローブの個々のシグナルを示す。 図２は、融合したシグナルのＦＩＳＨ法において期待されるシグナルを要約する。白色の棒および丸は融合したシグナルを示し、その一方で、２つの異なる影付き棒および丸は２つの異なる色付きプローブの個々のシグナルを示す。 図３は、ＳＦ−ＦＩＳＨ法から得られる期待されるシグナルの組み合わせを要約する。一緒に示される白および淡い影付きの丸は３つのプローブの２つの近位から生じる第１の融合したシグナルを示し、これらは、赤および緑のような異なる色を有する。暗い影付きの丸は第３のプローブを示す。暗い影付きおよび淡い影付きの丸は、一緒に新規の融合したシグナルを示し、その一方で、白丸単独は染色体構造の変化から生じる新規の離れたシグナルを示す。１つの態様において、ここで暗い影付き丸によって示されるＩＧＨＣ、ＩＧＫＣおよびＩＧＬＣプローブは、第３、第４および第５の標識で印を付けられ、各々の標識は、異なる色の淡い影付きの標識を用いて特有の融合したシグナルを発生し、それによって、融合パートナーを同定する。 図４は、標識されたプローブが、本発明の使用の前に、どのように反復配列に前もって吸着され得るかを要約する。 図５は、標識されないブロッキングＤＮＡが、どのように望まれないシグナルを避けて使用され得るかを要約する。この図において、２つの「赤いプローブ」が細い線を用いて左上に描かれ、４つの「緑のプローブ」が太い線を用いて右上に描かれる。「ブロッキングプローブ」は、中間の太さの線を用いて描かれる。「赤いプローブ」は以下の棒および丸において明るく影付けされており、その一方で、「緑のプローブ」は暗く影付けされている。融合したシグナルは白である。 図６は、ＢＣＲプローブの中期染色体へのハイブリダイゼーションを示す。（Ａ）プローブによって覆われた領域の図、異なる色のプローブは短い点線および長い点線によって示される。；（Ｂ）正常な末梢血由来の中期伸展へのＢＣＲプローブのハイブリダイゼーション。第２２染色体上の正常な２つのＢＣＲ座は、２つの異なる色のプローブ由来の２つの点または共局在化したシグナル（例えば、黄色、または並置された緑および赤のシグナル）によって表される。；（Ｃ）正常な末梢血由来の核へのＢＣＲプローブのハイブリダイゼーション。２つの正常なＢＣＲ座は、２つの異なる色のプローブ由来の２つの淡い色の点または共局在化したシグナルによって表される；（Ｄ）細胞株ＢＶ１７３由来の中期伸展へのＢＣＲプローブのハイブリダイゼーション。第２２染色体上の１つの正常なＢＣＲ座は、２つの異なる色のプローブ由来の淡い色の点または共局在化したシグナルによって示される（図の左上の明るい点を参照のこと）。第９染色体と第２２染色体（細胞株ＢＶ１７３中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。さらなる第９染色体は、誘導体第９染色体の増幅の結果として検出され得る。；（Ｅ）細胞株ＢＶ１７３由来の核へのＢＣＲプローブのハイブリダイゼーション。１つの正常なＢＣＲ座は、２つの異なる色のプローブ由来の淡い色の点または共局在化したシグナルによって示される。（ここで示される核の右上側の明るい色の点を参照のこと。）第９染色体と第２２染色体（細胞株ＢＶ１７３において）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が、検出され得る。さらなる第９染色体は、誘導体第９染色体の増幅の結果として検出され得る。 図７は、中期染色体へのＥＴＶ６プローブのハイブリダイゼーションを示す。（Ａ）プローブによって覆われる領域の図面、異なる色のプローブは、短い点線および長い点線によって示される。；（Ｂ）正常な末梢血由来の中期伸展へのＥＴＶ６プローブのハイブリダイゼーション。第１２染色体上の２つの正常なＥＴＶ６座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって表される。；（Ｃ）正常な末梢血由来の核へのＥＴＶ６プローブのハイブリダイゼーション。２つの正常なＥＴＶ６座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって表される。；（Ｄ）細胞株ＲＥＨ由来の中期伸展へのＥＴＶ６プローブのハイブリダイゼーション。第１２染色体上の正常なＥＴＶ６座は欠失され、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルの欠損によって示される。代わりに、この伸展上で示される各々のシグナルは１つの混ざっていない色（緑または赤）である。第１２染色体と第２１染色体（細胞株ＲＥＨ中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。小さな緑のシグナルは、欠失されたＥＴＶ６座の残りの部分として検出され得る。；（Ｅ）細胞株ＲＥＨ由来の核へのＥＴＶ６プローブのハイブリダイゼーション。第１２染色体上の正常なＥＴＶ６座は欠失され、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルの欠損によって示される。第１２染色体と第２１染色体（細胞株ＲＥＨ中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が、検出され得る。小さな緑のシグナルは、欠失されたＥＴＶ６座の残りの部分として検出され得る（この伸展上の右上および左下の点）。 図８は、中期染色体へのＭＬＬプローブのハイブリダイゼーションを示す。（Ａ）プローブによって覆われる領域の図面、異なる色のプローブは、短い点線および長い点線によって示される。；（Ｂ）正常な末梢血由来の中期伸展へのＭＬＬプローブのハイブリダイゼーション。第１１染色体上の２つの正常なＭＬＬ座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナル（４つ全ての点が示される）によって表される。；（Ｃ）正常な末梢血由来の核へのＭＬＬプローブのハイブリダイゼーション。２つの正常なＭＬＬ座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナル（全ての点が示される）によって表される。；（Ｄ）細胞株ＲＳ−４;１１由来の中期伸展へのＭＬＬプローブのハイブリダイゼーション。第１１染色体上の１つの正常なＭＬＬ座は、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって示される（右上）。第４染色体と第１１染色体（細胞株ＲＳ−４;１１中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。；（Ｅ）細胞株ＲＳ−４;１１由来の核へのＭＬＬプローブのハイブリダイゼーション。第１１染色体上の１つの正常なＭＬＬ座は、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって示される（右上および下の伸展上のより大きな点）。第４染色体と第１１染色体（細胞株ＲＳ−４;１１中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。 図９は、中期染色体へのＴＣＦ３プローブのハイブリダイゼーションを示す。（Ａ）プローブによって覆われる領域の図面、異なる色のプローブは、短い点線および長い点線によって示される。；（Ｂ）正常な末梢血由来の中期伸展へのＴＣＦ３プローブのハイブリダイゼーション。第１９染色体上の２つの正常なＴＣＦ３座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって表される。；（Ｃ）正常な末梢血由来の核へのＴＣＦ３プローブのハイブリダイゼーション。２つの正常なＴＣＦ３座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって表される。；（Ｄ）細胞株６９７由来の中期伸展へのＴＣＦ３プローブのハイブリダイゼーション。第１９染色体上の１つの正常なＴＣＦ３座は、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって示される（右の２つの明るい点）。第１染色体と第１９染色体（細胞株６９７中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。；（Ｅ）細胞株６９７由来の核へのＴＣＦ３プローブのハイブリダイゼーション。第１９染色体上の１つの正常なＴＣＦ３座は、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって示される（伸展上の中央の並置された点）。第１染色体と第１９染色体（細胞株６９７中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。 図１０は、中期染色体へのＴＬＸ３プローブのハイブリダイゼーションを示す。（Ａ）プローブによって覆われる領域の図面、異なる色のプローブは、短い点線および長い点線によって示される。；（Ｂ）正常な末梢血由来の中期伸展へのＴＬＸ３プローブのハイブリダイゼーション。第５染色体上の２つの正常なＴＬＸ３座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって表される（ここに示される全ての点）。；（Ｃ）正常な末梢血由来の核へのＴＬＸ３プローブのハイブリダイゼーション。２つの正常なＴＬＸ３座は、２つの淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって表される；（Ｄ）細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ由来の中期伸展へのＴＬＸ３プローブのハイブリダイゼーション。第５染色体上の１つの正常なＴＬＸ３座は、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって示される（右上）。第５染色体と第１４染色体（細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。；（Ｅ）細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ由来の核へのＴＬＸ３プローブのハイブリダイゼーション。第５染色体上の１つの正常なＴＬＸ３座は、淡い色の点または共局在化した異なる色のシグナルによって示される（中央の点）。第５染色体と第１４染色体（細胞株ＨＰＢ−ＡＬＬ中の）との間の転座由来の２つの誘導体染色体が検出され得る。 図１〜１０（ｅ）の色付バージョンは仮出願６０５６７，４４０に提供され、それに対して本出願は優先権を主張し、それは本明細書中に参照として援用される。

Claims (41)

1. 標的領域の変化を検出する方法であって：
   （ａ）核酸の調製物を得る工程；
   （ｂ）核酸の調製物を、第１の標識を含む第１のプローブと接触させる工程；
   （ｃ）核酸の調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ標的領域内に結合し、第１のプローブと第２のプローブとの結合がこの正常なコントロールサンプル内で融合したシグナルを生じる、工程：
   （ｄ）核酸の調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで第３のプローブは核酸の調製物中の異なる標的領域に結合する、工程：ならびに
   （ｅ）核酸構造の変化を検出する工程、
   を包含し、ここで第１のプローブおよび第２のプローブは離れたシグナルを生じる同じ標的領域には存在せず；
   （ｉ）第１のプローブおよび第３のプローブ；または
   （ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
   が新規の融合したシグナルを生じる同じ標的領域に存在する、方法。
2. 染色体構造の変化を検出するための方法であって：
   （ａ）染色体調製物を得る工程；
   （ｂ）染色体調製物を、第１の標識を含む第１のプローブと接触させる工程；
   （ｃ）染色体調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ染色体に結合し、第１のプローブと第２のプローブとの結合が正常なコントロールサンプルにおいて融合したシグナルを生じる、工程：
   （ｄ）染色体調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで、第３のプローブは染色体調製物中の他の染色体または同じ染色体の別の領域に結合する、工程：ならびに
   （ｅ）染色体構造の変化を検出する工程、
   を包含し、ここで第１のプローブおよび第２のプローブは離れたシグナルを生じる同じ染色体には存在せず；
   （ｉ）第１のプローブおよび第３のプローブ；または
   （ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
   が新規の融合したシグナルを生じる同じ染色体に存在する、方法。
3. 前記染色体構造の変化が異数性、増幅、欠失、融合、転座、重複、挿入、および逆位の少なくとも１つから選択される、請求項２記載の方法。
4. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記第３のプローブあるいはこれらのプローブの１つより多くのプローブが核酸プローブである、請求項２記載の方法。
5. 前記核酸プローブがＤＮＡまたはＲＮＡからなる、請求項４記載の方法。
6. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記第３のプローブあるいはこれらのプローブの１つより多くのプローブが非核酸プローブである、請求項２記載の方法。
7. 前記非核酸プローブがＰＮＡまたはＬＮＡからなる、請求項８記載の方法。
8. 前記標識が発色団、蛍光色素、スピンラベル、放射性同位元素、酵素、ハプテン、量子点、ビーズ、アミノヘキシル、ピレンおよび化学ルミネセンス化合物の少なくとも１つから選択される、請求項２記載の方法。
9. 前記蛍光色素が５（６）−カルボキシフルオレセイン、シアニン色素、（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、リスサミン、テキサス赤、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、ＩＲ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリスリン、カスケード青、Ｏｒｅｇｏｎ緑４８８、パシフィック青、ローダミン緑、およびＡｌｅｘａ色素の少なくとも１つから選択される、請求項８記載の方法。
10. 前記ハプテンが５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ローダミン、臭化デオキシウリジン、アセチルアミノフルレン、トリニトロフェノール水銀、エストラジオールおよびビオチンの少なくとも１つから選択される、請求項８記載の方法。
11. 前記酵素がダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくとも１つから選択される、請求項８記載の方法。
12. 化学ルミネセンス化合物がアクリジニオンである、請求項８記載の方法。
13. 前記融合したシグナルが色変化によって検出される、請求項２記載の方法。
14. 前記離れたシグナルが色変化によって検出される、請求項２記載の方法。
15. 前記第１のプローブおよび第２のプローブが前記染色体中の擬似分岐点の両側に結合する、請求項２記載の方法。
16. 少なくとも２つのプローブが染色体調製物に同時に接触する、請求項２記載の方法。
17. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、および前記第３のプローブが染色体調製物に同時に接触する、請求項２記載の方法。
18. 標的領域の変化を検出するための方法であって：
    （ａ）核酸の調製物を得る工程；
    （ｂ）核酸の調製物中に存在し結合した標識されたプローブを形成し得る非標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有する相補的なプローブと、第１の標識を含む第１のプローブを接触させる工程；
    （ｃ）結合した標識されたプローブを除去し、第１の選択されたプローブを残す工程；
    （ｄ）核酸の調製物を第１の選択されたプローブと接触させる工程；
    （ｅ）核酸の調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１の選択されたプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ標的領域に結合し、第１の選択されたプローブと第２のプローブとの結合が正常なコントロールサンプルにおいて融合したシグナルを生じる、工程：
    （ｆ）核酸の調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで、第３のプローブは核酸の調製物中の他の核酸または同じ核酸の別の領域に結合する、工程：ならびに
    （ｇ）核酸構造の変化を検出する工程、
    を包含し、ここで、第１の選択されたプローブおよび第２のプローブは離れたシグナルを生じる同じ標的領域には存在せず；
    （ｉ）第１の選択されたプローブおよび第３のプローブ；または
    （ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
    が新規の融合したシグナルを生じる同じ標的領域に存在する、方法。
19. 染色体構造の変化を検出するための方法であって：
    （ａ）染色体調製物を得る工程；
    （ｂ）染色体調製物を、第１の標識を含む第１のプローブと接触させる工程；
    （ｃ）染色体調製物を、第２の標識を含む第２のプローブと接触させる工程であって、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは正常なコントロールサンプルにおいて同じ染色体に結合し、第１のプローブと第２のプローブとの結合がこの正常なコントロールサンプル内で融合したシグナルを生じる、工程：
    （ｄ）染色体調製物を、第３の標識を含む第３のプローブと接触させる工程であって、ここで、第３のプローブは染色体調製物中の他の染色体または同じ染色体の別の領域に結合する、工程：ならびに
    （ｅ）染色体構造の変化を検出する工程、
    を包含し、ここで、第１のプローブおよび第２のプローブは離れたシグナルを生じる同じ染色体には存在せず；
    （ｉ）第１のプローブおよび第３のプローブ；または
    （ｉｉ）第２のプローブおよび第３のプローブ
    が新規の融合したシグナルを生じる同じ染色体に存在し；ここで、
    （ｆ）核酸調製物をプローブと接触させる前に、
    （ｉ）第１の標識を含む第１のプローブ、第２の標識を含む第２のプローブおよび第３の標識を含む第３のプローブの１つ以上を相補的なプローブに結合させ、相補的なプローブが染色体サンプル中に存在し得る非標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、結合した標識されたプローブを生成する、工程；および
    （ｉｉ）結合した標識されたプローブを除去する工程、
    を包含する、方法。
20. １つのプローブが工程（ｆ）に従って処理される、請求項１９記載の方法。
21. プローブの２つが工程（ｆ）に従って処理される、請求項１９記載の方法。
22. ３つ全てのプローブが工程（ｆ）に従って処理される、請求項１９記載の方法。
23. 前記相補的プローブが固体表面に付着される、請求項１９記載の方法。
24. 前記固体表面がビーズまたはスライドガラスである、請求項２３記載の方法。
25. 前記染色体構造の変化が異数性、増幅、欠失、融合、転座、重複、挿入、および逆位の少なくとも１つから選択される、請求項１９記載の方法。
26. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記第３のプローブあるいは該プローブの１つより多くのプローブが核酸プローブである、請求項１９記載の方法。
27. 前記核酸プローブがＤＮＡまたはＲＮＡからなる、請求項２６記載の方法。
28. 前記相補的なプローブが非核酸プローブである、請求項１９記載の方法。
29. 前記非核酸プローブがＰＮＡまたはＬＮＡからなる、請求項２８記載の方法。
30. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブまたは前記第３のプローブあるいは該プローブの１つより多くのプローブが非核酸プローブである、請求項１９記載の方法。
31. 前記非核酸プローブがＰＮＡまたはＬＮＡからなる、請求項３０記載の方法。
32. 前記標識が発色団、蛍光色素、スピンラベル、放射性同位元素、酵素、ハプテン、量子点、ビーズ、アミノヘキシル、ピレンおよび化学ルミネセンス化合物の少なくとも１つから選択される、請求項１９記載の方法。
33. 前記蛍光色素が５（６）−カルボキシフルオレセイン、シアニン色素、（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、リスサミン、テキサス赤、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、ＩＲ色素、Ｄｙｏｍｉｃｓ色素、フィコエリスリン、カスケード青、Ｏｒｅｇｏｎ緑４８８、パシフィック青、ローダミン緑、およびＡｌｅｘａ色素の少なくとも１つから選択される、請求項３２記載の方法。
34. 前記ハプテンが５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ローダミン、臭化デオキシウリジン、スルホン酸塩、アセチルアミノフルレン、トリニトロフェノール水銀、エストラジオールおよびビオチンの少なくとも１つから選択される、請求項３２記載の方法。
35. 前記酵素がダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼの少なくとも１つから選択される、請求項３２記載の方法。
36. 化学ルミネセンス化合物がアクリジニオンである、請求項３２記載の方法。
37. 前記融合したシグナルが色変化によって検出される、請求項１９記載の方法。
38. 前記離れたシグナルが色変化によって検出される、請求項１９記載の方法。
39. 前記第１のプローブおよび第２のプローブが前記染色体中の擬似分岐点の両側に結合する、請求項１９記載の方法。
40. 少なくとも２つのプローブが染色体調製物に同時に接触する、請求項１９記載の方法。
41. 前記第１のプローブ、前記第２のプローブ、および前記第３のプローブが染色体調製物に同時に接触する、請求項１９記載の方法。
    
    

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