CN102994631B - 一种脂肪肉瘤鉴别诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用DDIT3荧光探针制备的荧光原位杂交检测的试剂盒，还涉及其DDIT3荧光探针的制备方法，本发明的DDIT3荧光探针及相应的试剂盒可用于脂肪肉瘤的鉴别诊断。

Description

一种脂肪肉瘤鉴别诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种利用DDIT3荧光探针制备的荧光原位杂交检测的试剂盒，还涉及其DDIT3荧光探针的制备方法，本发明的DDIT3荧光探针及相应的试剂盒可用于脂肪肉瘤的鉴别诊断。

背景技术

脂肪肉瘤(liposarcomas)是一种常见的恶性软组织肿瘤，起源于脂肪母细胞向脂肪细胞分化的间叶细胞，故表现为不同分化程度的异型脂肪母细胞，均含有脂质。根据细胞成分的不同，脂肪肉瘤又可分为：①高分化脂肪肉瘤，也称脂肪瘤样脂肪肉瘤；②粘液型脂肪肉瘤；③圆细胞型脂肪肉瘤；④多形型脂肪肉瘤；⑤未分化型脂肪肉瘤，但肿瘤中通常是多型细胞混合存在。本病多见于30～70岁患者，以50岁左右发病最多。男性多于女性。四肢特别是大腿、臀部好发，上肢、腹膜后、头、颈块，直径3～10cm多见，后腹膜巨大者直径可达20cm以上，肿瘤常为结节状，或分叶状，质软或稍硬。本病进展相对缓慢，很少发生转移，手术切除可延长病人生命。分化型及粘液型脂肪肉瘤预后较好，5年生存率可达80％左右，多形型、圆细胞型、去分化型脂肪肉瘤预后差，5年生存率20％～50％。转移以血行转移为主，多转移到肺。

肉瘤分类与临床预后和治疗反应相关，对于患者的治疗非常重要。尤因肉瘤(Ewingsarcoma)和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)对长春新碱/放线菌素D/环磷酰胺加异环磷酰胺/依托泊苷反应效果好。滑膜肉瘤对阿霉素和异环磷酰胺反应效果好，而黏液样脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)优先与trabectedine(ET-743，Yondelis，PharmaMar与Johnson&Johnson药厂研发)反应。临床需要将脂肪肉瘤与恶性纤维组织细胞瘤中的普通型和粘液型以及横纹肌肉瘤中的多形型进行鉴别。一般认为恶性纤维组织细胞瘤，来源于未分化的间充质细胞，并分化为纤维细胞和组织细胞，是最常见的软组织恶性肿瘤之一。横纹肌肉瘤是软组织肉瘤中恶性程度较高的，按多形性、胚胎性和腺泡性的顺序恶性程度依次增高。横纹肌肉瘤是小儿软组织肉瘤中最多见的一种，占小儿恶性实体瘤的10％。横纹肌肉瘤是20岁以下病人软组织中最常见的肉瘤。目前进行脂肪肉瘤鉴别诊断主要依靠病理学诊断。但因大约10％的肉瘤处于低分化，依靠传统的组织和免疫学方法无法分类，结果使患者很难得到最佳的治疗。如，恶性纤维组织细胞瘤与多形性脂肪肉瘤的鉴别诊断，后者无分层改变，但有成脂细胞和脂细胞的分化。在恶性纤维组织细胞瘤中也可能存在胞浆内空泡，但在成脂细胞中，空泡能向细胞核和周围转移，并使核变平，另外，在恶性纤维组织细胞瘤细胞形成的空泡中含有粘多糖物质。由于两种肿瘤(前者和多形性脂肪肉瘤)的脂质染色均为阳性，故对鉴别诊断无任何意义。手术中横纹肌肉瘤的形态无明显特征，很像高度软组织肉瘤。随着分子技术的发展，在软组织肿瘤中已经鉴别出许多遗传改变，这成为了肿瘤辅助诊断和分类的新的生物标志物，对于靶向治疗也产生积极意义。[AD Singhi，EA Montgomery.Liposarcomas.Surgical Pathology Clinics，Volume 4，Issue 3，Pages 963-994；Aatur D.Singhi，Elizabeth A.MontgomeryKrikelis D，Judson I.Role of chemotherapy in the management of soft tissue sarcoma.Expert Rev Anticancer Ther.2010；10：249-60.PMID：20132000.doi：10.1586/era.09.176；Grier HE，Krailo MD，Tarbell NJ et al.Addition of ifosfamide and etoposide to standard chemotherapy forEwing′s sarcoma and primitive neuroectodermal tumor of bone.N Engl J Med.2003；348：694-701；Ruymann FB，Grovas AC.Progress in the diagnosis and treatment of rhabdomyosarcoma andrelated soft tissue sarcomas.Cancer Invest.2000；18：223-41；Sleijfer S，Ouali M，van Glabbeke M etal.Prognostic and predictive factors for outcome to first-line ifosfamide-containing chemotherapyfor adult patients with advanced soft tissue sarcomas：An exploratory，retrospective analysis onlarge series from the European Organization for Research and Treatment of Cancer-Soft Tissue andBone Sarcoma Group(EORTC-STBSG).Eur J Cancer.2010；46：72-83；Alfredo L.Valente，JamieTull，Shengle Zhang.Utility of fluorescence in situ hybridization in sub-classifying unclassifiedhigh-grade sarcomas：A study of 40 cases using break-apart probes of EWSR1，FOXO1A，SS18 andDDIT3 genes.Journal of Solid Tumors，April 2012，Vol.2，No.2：4-9]

DNA损伤诱导转录因子(DNA damage inducible transcript 3，DDIT3，也叫CHOP)位于12号染色体长臂1区3带，与其相关的染色体重排在黏液样脂肪肉瘤(MLS)、圆细胞脂肪肉瘤(round cell liposarcomas，RCLS)和混合型脂肪肉瘤(mixed liposarcomas)中常见。而其中的一种易位t(12；16)(q13；p11)被认为是上述类型脂肪肉瘤的核型标志，出现在超过95％的病例中。这个易位形成FUS/DDIT3融合蛋白；在少数病例中也发现t(12；22)(q13；q12)染色体易位，形成EWS/DDIT3融合蛋白。FUS/DDIT3融合基因的出现对于MLS是敏感和特异的指标。在其他形态学上相似的肿瘤中不出现，如腹膜后粘液变为主的高分化脂肪肉瘤和粘液纤维肉瘤。[Downs-Kelly，Erinn DO，Goldblum，John R.et，al.The Utility of Fluorescence In SituHybridization(FISH)in the Diagnosis of Myxoid Soft Tissue Neoplasms.American Journal ofSurgical Pathology.2008.32(1)：8-13；]

综上，DDIT3重排作为MLS、RCLS及混合型脂肪肉瘤的特异标志，有望成为肿瘤鉴别诊断的生物标志物。但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段，国内市场无灵敏度高、特异性好的检测试剂。

荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和分子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等检测。

本发明利用荧光原位杂交技术，以DDIT3基因断裂区两端为靶标，分别设计并制备跨断裂点荧光探针。利用探针实现对DDIT3基因重排的检测，有助于脂肪肉瘤的鉴别诊断，通过准确诊断，达到及时准确治疗的目的。

本发明提供了一种脂肪肉瘤分子标志物DDIT3探针的制备方法，并在此基础上利用探针自主研制了DDIT3基因断裂检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供DDIT3基因探针(GSP DDIT3)的制备方法。

根据本发明一个优选的实施方案，GSP DDIT3的制备步骤包括：

(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有DDIT3(12q13)基因断裂区两侧的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。

(2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆(Invitrogen RPCI11.C)，取100μl克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对DDIT3基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。

(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5℃储存。

(4)基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有DDIT3基因断裂点两端最优选的克隆，编号为RP11-1077C21(chr12：57658810..57865820)和CTD-2554O15(chr12：57939268..58154978)。

根据本发明一个优选的实施方案，RP11-1077C21克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列为：上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO：2)；PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。CTD-2554O15克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列为：上游引物5’-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物5’-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’(SEQ ID NO：4)；PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中质粒DNA进行荧光标记可以使用切口平移方法标记，利用DNaseI和DNA聚合酶I实现基因探针的荧光标记。

根据本发明一个优选的实施方案，50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间，标记条件为16℃2小时。

根据本发明一个优选的实施方案，探针标记的荧光素为荧光素标记的dUTP，并优选Spectrum dUTP。

根据本发明一个优选的实施方案，探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用1～2μl灭菌纯化水或Human Cot-1 DNA(1μg/μl)溶解沉淀。

本发明的另一个目的是利用DDIT3基因探针制备一种用于辅助脂肪肉瘤鉴别及治疗选择的DDIT3基因重排荧光原位杂交检测试剂盒。

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

(1)样本处理和制片：按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。

(2)杂交：配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8～16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。

(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对不同信号进行观察计数。

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA，DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

根据本发明的一个优选实施方案，荧光标记探针混合物包括GSP DDIT3跨断裂点探针，每人份荧光标记探针混合物中探针的使用量为1.0μl。

根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记探针混合物和未标记的竞争性DNA配制杂交液，其中未标记的竞争性DNA选择Human COT-1DNA。每人份杂交液中加入7μl杂交缓冲液，1μl荧光标记探针混合物，Human COT-1DNA使用量为1μg，并用H₂O补至10μl。

根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于lml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行信号计数。

本发明与现有技术相比，具有下列优点：

(1)实现了对子肉瘤样本中分子标志物DDIT3基因状态的检测；

(2)进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好；

(3)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞信号计数，操作相对简单；

(4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。

附图说明

图1显示GSP DDIT3近着丝粒端克隆鉴定的电泳结果。目的产物138bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表100bp。

图2显示GSP DDIT3近端粒端克隆鉴定的电泳结果。目的产物312bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表300bp。

图3显示人类外周血淋巴细胞中期染色体上GSP DDIT3(红色/绿色)检测结果。

图4显示人类外周血淋巴细胞间期细胞核上GSP DDIT3(红色/绿色)检测结果。

图5显示脂肪肉瘤组织样本中GSP DDIT3(红色/绿色)的检测结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。

图6显示DDIT3基因所在12q13区域。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：GSP DDIT3探针的制备

(1)引物设计克隆筛选：DDIT3基因位于人染色体12q13区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有DDIT3基因的克隆，筛选出基因断裂端两边的克隆，编号为RP11-1077C21和CTD-2554O15。(参见附图6)

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆，分别取100μl克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；RP11-1077C21菌液使用上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，55℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果在138bps具有明亮的条带(参见附图1)。CTD-2554O15菌液使用上游引物5’-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’和下游引物5’-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，分别选择orange-dUTP和green-dUTP标记DDIT3基因两端探针。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制：

混匀后置于-80℃冰箱中2小时，4℃12000rpm离心20分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃12000转/分钟离心10分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用1μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得DDIT3基因探针，避光、-20℃储存。

(4)DDIT3基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体上均可见荧光信号。

实施例2：DDIT3基因重排荧光原位杂交检测试剂盒制备

以10人份/盒为例。

(1)杂交液配制

将标记好的探针依次放好，按下表方案配制荧光标记探针混合物：

按下表方案配制杂交液：

(2)DAPI复染剂配制

抗褪色液：全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，调节pH为9.0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20℃储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现黄色或者橙色则需废弃并重新配制。

用去离子水配制1mg/ml DAPI储存液。

取2.5μl的DAPI溶液(0.1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20℃避光密闭保存。

(3)成品组装

组分名称	规格	数量
			杂交液	100μl/管	1管
DAPI复染剂	100μl/管	1管
			说明书		1份

实施例3：DDIT3基因重排荧光原位杂交检测试剂盒在福尔马林固定石蜡包埋的肉瘤组织样本中的使用方法

(1)玻片预处理

玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；取出玻片，放入室温二甲苯中30分钟，再将其放入室温1∶1(V∶V)的二甲苯：无水乙醇中10分钟，放入室温无水乙醇中10分钟，再依次放入室温100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分钟；室温去离子水中静置3分钟，吸取多余水分；100±5℃的去离子水中煮片25分钟(切片水平放置于容器中，样本面朝上)。在样本区域滴加200ul的胃蛋白酶反应液，消化20分钟。甩去多余液体，放入2×SSC中室温洗涤5分钟；取出，再放入另一缸室温2×SSC中5分钟；取出，再放入70％、90％、100％梯度乙醇脱水各2分钟；取出玻片，室温晾干玻片；继续杂交过程。

(2)样品和探针同时变性

从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加10μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性85℃2分钟，杂交37℃10～18小时。继续杂交后洗涤步骤。

(3)杂交后洗涤及复染

取出，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃2×SSC中10分钟；再将其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗涤2分钟；室温70％乙醇3分钟；暗处晾干。

复染：滴加10μlDAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

(4)结果分析

在Olympus BX53荧光显微镜下，用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的各探针的数目。

(5)结果判定

按处理方法要求进行操作，记录GSP DDIT3信号类型。荧光原位杂交结果显示：在人外周血淋巴细胞中，中期染色体上的对应靶点可见融合信号(或距离小于一个信号直径的红/绿信号)(参见附图3)，其它染色体区域未见荧光信号；间期细胞核中见融合信号(或距离小于一个信号直径的红/绿信号)(参见附图4)，未见其它荧光信号。在组织样本中，核内可见双色探针荧光信号(参见附图5)。

实施例4：DDIT3基因重排检测试剂盒的临床使用评价

收集11例临床样本，包括粘液脂肪肉瘤和其它肉瘤类型样本为研究对象，利用本发明实施例3中所述的DDIT3基因检测试剂盒进行检测。检测结果如表1示。

表1检测结果

从结果可知，1例粘液性脂肪肉瘤检测结果为FISH阳性，1例临床病理判断疑似粘液脂肪肉瘤的样本检测结果为FISH阴性，其它9例样本均为阴性。提示在临床检测中应用DDIT3检测可辅助临床诊断。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种辅助脂肪肉瘤鉴别诊断及治疗选择的DDIT3基因重排荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含DDIT3跨断裂点探针，每人份荧光标记探针混合物中DDIT3探针的使用量为1.0μl。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征还在于未标记的竞争性DNA为Human COT-1DNA。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g／ml。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征还在于DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于由10mg／1ml对苯二胺／PBS和甘油混合组成的1ml抗褪色液。

5.一种制备权利要求1试剂盒所述DDIT3基因重排检测基因探针的方法：

(1)片段筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有DDIT3基因断裂点两端的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择含有DDIT3基因断裂点两端区域的最优克隆，编号为RP11-1077C21和CTD-2554O15；

(2)培养鉴定：按照DDIT3筛选确定的克隆编号购买克隆，常规培养，使用针对DDIT3基因断裂点两端区域的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选DDIT3克隆的鉴定；

(3)探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；

(4)探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征还在于含DDIT3基因3基因断裂点两端的克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为：上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’和下游引物5’-CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’，及上游引物5'-GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’和下游引物5'-ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’。

7.根据权利要求5所述制备方法，其特征还在于探针制备过程中50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间。

8.根据权利要求5所述制备方法，其特征还在于探针标记的荧光素为荧光素标记的Spectrum dUTP。

9.根据权利要求5所述制备方法，其特征还在于探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用1～2μl灭菌纯化水或1μg/μl的Human Cot-1DNA溶解沉淀。

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