CN102925553A - 一种子宫颈癌荧光原位杂交检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及hWAPL荧光探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒。利用本发明提供的hWAPL荧光探针结合杂交缓冲液、未标记的竞争性DNA及DAPI复染剂可以制备一种检测试剂盒，实现hWAPL基因检测，有助于子宫颈癌的早期筛查和治疗方案选择，从而降低死亡率，减少复发风险，达到优化诊疗效果的目的。

Description

一种子宫颈癌荧光原位杂交检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及hWAPL荧光探针的制备方法，还涉及利用这些探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒，本发明的hWAPL荧光探针及相应的试剂盒可用于子宫颈癌的早期筛查和治疗方案选择。 

背景技术

子宫颈癌(cervical carcinoma)是女性常见恶性肿瘤之一，是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。在全球范围内，每年约有20多万女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，排行榜首。我国每年新发病例有13.5万，死亡率占总癌症死亡率的第一位。近年来，全国宫颈癌病例呈现年轻化的趋势。女性患宫颈癌以36岁～50岁最为集中，占总患病人数的57％左右[李隆玉，李诚信.宫颈癌的预防及普查.中国实用妇科与产科杂志.2003，19(3)]。 

在活跃的化生过程中，加上一些外来致癌物质的刺激，可使活跃的未成熟细胞或增生的鳞状上皮细胞向不典型增生方向发展，此时的上皮细胞不同于正常细胞，但不足以诊断为癌，称为癌前期病变。虽然并非所有的不典型增生均会发展为子宫颈癌，但据统计，如不给予治疗，有10％～15％的轻、中度和75％的重度不典型增生将会转变为浸润癌。对于宫颈癌的转移，可向邻近组织和器官直接蔓延，也可通过淋巴管转移至宫颈旁、髂内、髂外、腹股沟淋巴结，晚期甚至可转移到锁骨上及全身其他淋巴结。临床追踪观察显示，从一般的宫颈癌前病变发展为宫颈癌大约需要10年时间，而当宫颈癌的症状出现三个月后的就诊者有2/3已为癌症晚期。目前治疗方案以手术和放射治疗为主，但中晚期患者治愈率很低。及时发现和治疗宫颈癌前病变，将有效终止其向宫颈癌的发展，大大提高宫颈癌的治愈率[曹泽毅，子宫颈癌治疗的变迁和思考.中华妇产科杂志.2004，39(3)：212-215] 

人半翼基因hWAPL(human wings apart-like，hwapl)是果蝇半翼基因(wings apart-like，wapl)的同源基因，与wapl具相似功能，编码蛋白具调节异染色质结构的功能，通过与黏连蛋白结合，调节姐妹染色单体的分离。近年来的研究发现，hWAPL是仅在宫颈癌组织中特异高表达的基因，具有癌基因的特性，与宫颈癌的发展有关。其相应的RNAi能明显抑制细胞hWAPL的表达并促进细胞凋亡，是宫颈癌基因治疗的一个潜在靶点。[Yonghong Xie，Guangtao Xu，Peng Shen，hWAPL is associated with cell growth，and the hWAPL expression may play a significant role in cervical carcinogenesis and tumor progression.Journal of Convergence  Information Technology(JCIT)Volume6，Number12，December 2011；R Gandhi，PJ Gillespie Human Wapl is a cohesin-binding protein that promotes sister-chromatid resolution in mitotic prophase.Current biology，2006.Ohbayashi，T Kiyono，Expression of a novel human gene，human wings apart-like(hWAPL)，is associated with cervical carcinogenesis and tumor progression.Cancer research，2004，] 

目前试验室检测方法常见的有免疫组化、Northern印迹技术和荧光定量PCR方法(FQ-PCR)。2004年，Oikawa等利用Northern印迹技术对宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌等及其相应正常组织中的hWAPL基因mRNA表达水平进行检测，发现宫颈癌中该基因的mRNA表达升高十分明显。2007年，鲁笑钦等人研究了hWAPL基因在正常宫颈组织、宫颈癌以及胃、肝、膀胱、食道、子宫内膜、肾、直肠、肺等8种癌组织中的表达情况，免疫组化PV-9000方法结果显示，.正常宫颈和宫颈癌组织中hWAPL基因阳性表达率分别为3.70％、97.87％。hWAPL基因在胃癌、肝癌、子宫内膜癌、肾癌、直肠癌、肺癌中呈阴性表达，在膀胱癌和食管癌中仅有部分样本呈弱阳性表达，认为hWAPL基因是一种宫颈癌特异性高表达基因。2011年，Guangtao Xu等人利用IHC方法，以CIN I-III和宫颈鳞癌为样本研究了hWAPL在宫颈疾病诊断中的临床应用价值，认为hWAPL有望成为诊断低阶CIN的标志物。2012年，张文虹等人利用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)检测慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)和宫颈癌共100例患者hWAPL基因mRNA，结果宫颈癌组hWAPL基因mRNA表达显著高于慢性宫颈炎组和CIN I～III组(P＜0.05)，慢性宫颈炎组与CIN I～III组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。认为hWAPL mRNA表达与宫颈癌变直接相关，特异性高，有助于宫颈癌早期诊断。[K Oikawa，T Ohbayashi，T Kiyono，Expression of a novel human gene，human wings apart-like(hWAPL)，is associated with cervical carcinogenesis and tumor progression.Cancer research，2004；鲁笑钦，崔金全，胡滨.hWAPL基因在宫颈癌组织中的特异性表达及意义.医药论坛杂志.2007，28(10)；Guangtao Xu；Peng Shen；Xiaoyan Pan Human Health and Biomedical Engineering(HHBE)，2011International Conference on Jilin19-22Aug.2011：936-940；张文虹，郑卫东.FQ-PCR检测宫颈癌hWAPL基因mRNA及其诊断价值分析.国际检验医学杂志.2012，33(10)] 

综上，hWAPL因其在宫颈癌中的特异表达特征，及其表达抑制所导致的宫颈癌癌细胞的死亡，有望作为肿瘤早期筛查和靶向治疗的新靶标。但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段，市场无灵敏度高、特异性好的检测试剂。 

荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和分 子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等检测。 

本发明利用荧光原位杂交技术，以hWAPL基因区段为靶标，设计并制备荧光探针。利用探针实现对hWAPL基因状态的检测，有助于子宫颈癌的早期筛查和治疗方案制定，通过早防早治，达到子宫颈癌可预防可治愈的目的。 

本发明提供了一种子宫颈癌分子标志物hWAPL探针的制备方法，并在此基础上利用探针自主研制了hWAPL基因检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。 

发明内容

本发明的一个目的是提供hWAPL基因探针(GSP hWAPL)和作为内控的用于10号染色体鉴别的10号染色体着丝粒探针(CSP10)的制备方法。 

根据本发明一个优选的实施方案，GSP hWAPL的制备步骤包括： 

(1)克隆筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有hWAPL(10q23)基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。 

(2)克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆(Invitrogen RPCI11.C)，取100μl克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；针对hWAPL基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。 

(3)基因探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5℃储存。 

(4)基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。 

根据本发明一个优选的实施方案，CSP10的制备步骤包括： 

(1)片段分析：通过NCBI Mapview数据库检索重复区域序列，进行重复性分析。 

(2)引物设计：针对重复片段，利用Primer Premier5.0设计引物对。 

(3)克隆、培养和鉴定：以人基因组DNA为模板，利用上述引物对进行PCR反应。通过电泳进行鉴定；将目的产物进行克隆、培养，同样使用上述引物对进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。 

(4)探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5℃储存。 

(5)探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。 

根据本发明一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有hWAPL基因最优选的克隆，编号为RP11-383M14(chr10：88159615..88339509)。 

根据本发明一个优选的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列为：上游引物5’-ATGAATAGGCAGGCTGAGGATTT-3’(SEQ ID NO：1)和下游引物5’-TGACTCAGCCAAACCTTCTTAGG-3’(SEQ ID NO：2)；PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。 

根据本发明一个优选的实施方案，用于制备CSP10探针的引物对序列为：上游引物5’-TGGATAATTGGCCCTCTTTGA-3’(SEQ ID NO：3)和下游引物5’-TTTCCATGTCTAAGATTGGCGT-3’(SEQ ID NO：4)；PCR扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。 

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA提取可使用市售的质粒提取试剂盒，优选Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit。 

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中克隆质粒DNA的定量是将质粒DNA稀释后分别测定260nm和280nm下的吸光度，计算产物浓度。 

根据本发明一个优选的实施方案，探针制备步骤中质粒DNA进行荧光标记可以使用切口平移方法标记，利用DNaseI和DNA聚合酶I实现基因探针的荧光标记。 

根据本发明一个优选的实施方案，50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间，标记条件为16℃2小时。 

根据本发明一个优选的实施方案，探针标记的荧光素为荧光素标记的dUTP，并优选Spectrum dUTP。 

根据本发明一个优选的实施方案，探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用1～2μl灭菌纯化水或Human Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。 

本发明的另一个目的是利用hWAPL基因探针和CSP10探针(内控)制备一种用于辅助子宫颈癌早期诊断及治疗选择的hWAPL基因荧光原位杂交检测试剂盒。 

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案： 

(1)样本处理和制片：按照原位杂交方法对各类型样本进行处理。 

(2)杂交：配制杂交液，主要包括标记探针和杂交缓冲液。合适温度下进行8～16小时的杂交，然后以合适的洗液洗去未结合上的和非特异结合的探针；DAPI复染剂复染。 

(3)通过荧光显微镜相应滤块观察荧光信号，对不同信号进行观察计数。 

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA，DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。 

根据本发明的一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。 

根据本发明的一个优选实施方案，荧光标记探针混合物包括GSP hWAPL和CSP10探针，每人份荧光标记探针混合物中两种基因探针的使用量均为0.5μl。 

根据本发明的一个优选实施方案，由杂交缓冲液、荧光标记探针混合物和未标记的竞争性DNA配制杂交液，其中未标记的竞争性DNA选择Human COT-1DNA。每人份杂交液中加入7μl杂交缓冲液，1μl荧光标记探针混合物，Human COT-1DNA使用量为1μg，并用H2O补至10μl。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。 

利用本发明的试剂盒，依照常规的荧光原位杂交方法对人的中期和间期细胞进行信号计数。 

本发明与现有技术相比，具有下列优点： 

(1)实现了对子宫颈癌样本中新分子标志物hWAPL基因状态的检测； 

(2)进行准确、快速的信号计数、且结果重复性好； 

(3)无需进行细胞培养和制备高质量的中期染色体片，可用于中期或间期细胞信号计数，操作相对简单； 

(4)通过制备成试剂盒，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应用，有助综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系。 

附图说明

图1显示GSPhWAPL克隆鉴定的电泳结果。目的产物343bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表300bp。 

图2显示CSP10克隆鉴定的电泳结果。目的产物888bps。其中1道为marker，2道为样本；箭头标示代表900bp。 

图3显示人类外周血淋巴细胞中GSPhWAPL(红色)和CSP10(绿色)检测结果。 

图4显示宫颈癌组织样本中GSP hWAPL(红色)和CSP10(绿色)的检测结果。其中箭头分别指示出两色探针的荧光信号。 

图5显示宫颈脱落细胞中，细胞核内双色探针的荧光结果。信号类型为2红2绿，信号正常。 

图6显示活检组织样本经福尔马林固定石蜡包埋后，细胞核内双色探针的荧光结果。信号类型为(4～5)红2绿，hWAPL有扩增。 

图7显示hWAPL基因所在10q23区段。 

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 

实施例1：GSP hWAPL探针的制备 

(1)引物设计克隆筛选：hWAPL基因位于人染色体10q23区段，NCBI Mapview数据库检索所有含有hWAPL基因的克隆，筛选出包含有该基因的克隆，编号为RP11-383M14。(参见附图7) 

(2)克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-383M14，取100μl克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37℃摇床中摇菌培养8～12小时；菌液使用上游引物5’-ATGAATAGGCAGGCTGAGGATTT-3’和下游引物5’-TGACTCAGCCAAACCTTCTTAGG-3’进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果在343bps具有明亮的条带(参见附图1)。 

(3)基因探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。 

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择orange-dUTP标记hWAPL基因。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。 

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。 

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制： 

混匀后置于-80℃冰箱中2小时，4℃12000rpm离心20分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃12000转/分钟离心10分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用1μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得hWAPL基因探针，避光、-20℃储存。 

(4)hWAPL基因探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(10号染色体)上均可见荧光信号。 

实施例2：CSP10着丝粒探针的制备 

(1)引物设计：通过NCBI Mapview数据库检索重复区域序列，进行重复性分析，利用Primer Premier5.0设计引物对。 

(2)克隆、培养和鉴定：以人基因组DNA为模板，利用上游引物5’-TGGATAATTGGCCCTCTTTGA-3’和下游引物5’-TTTCCATGTCTAAGATTGGCGT-3’进行PCR反应。扩增条件为：94℃5分钟；(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环；72℃7分钟。对扩增产物进行电泳验证，结果在888bps具有明亮的条带(参见附图2)。 

(3)探针制备：鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的Plasmid Maxi Kit，按照说明书要求的操作方法进行质粒DNA提取，通过测定260nm和280nm处的吸光度对质粒DNA定量；按照公式：双链DNA浓度(ng/μl)＝OD260×50(ng/μl)计算质粒DNA浓度。 

通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记，探针标记的荧光素为Spectrum dUTP，选择green-dUTP标记CSP10探针。按如下方案，严格避光条件下在冰上配制PCR反应体系。 

配完后震荡混匀，16℃标记2小时，再80℃孵育10分钟灭活酶。 

对标记产物进行乙醇沉淀和浓缩，按如下方案在1.5ml离心管中依次加入醋酸钠和无水乙醇，避光、冰上配制： 

混匀后置于-80℃冰箱中2小时，4℃12000rpm离心20分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，加入1ml的70％乙醇，4℃12000转/分钟离心10分钟，小心去上清，勿搅动沉淀，避光干燥。使用1μl灭菌纯化水溶解沉淀，获得hWAPL基因探针，避光、-20℃储存。 

(4)CSP10探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。包含中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后，间期细胞或中期染色体(19号染色体)上均可见荧光信号。 

实施例3：hWAPL基因荧光原位杂交检测试剂盒制备 

以10人份/盒为例。 

(1)杂交液配制 

将标记好的探针依次放好，按下表方案配制荧光标记探针混合物： 

按下表方案配制杂交液： 

(2)DAPI复染剂配制 

抗褪色液：全程操作必须避光，10mg的对苯二胺溶于1ml的PBS中，调节pH为9.0，加入9ml甘油，反复震荡混匀，-20℃储存。终溶液应该为无色或者略带淡黄色，假如呈现黄色或者橙色则需废弃并重新配制。 

用去离子水配制1mg/ml DAPI储存液。 

取2.5μl的DAPI溶液(0.1mg/ml)溶于1ml抗褪色液中，避光条件下反复震荡混匀，-20℃避光密闭保存。 

(3)成品组装 

组分名称	规格	数量
			杂交液	100μl/管	1管

[0090] 

DAPI复染剂	100μl/管	1管
			说明书		1份

实施例4：hWAPL基因荧光原位杂交检测试剂盒在脱落细胞样本中的使用方法 

(1)玻片预处理 

LCT处理后，直接沉降滴制片。将玻片正面朝上平置，在样本区域滴加200ul的胃蛋白酶反应液消化10分钟；甩去多余液体，放入2×SSC中室温洗涤5分钟；取出，再放入另一缸室温2×SSC中5分钟；取出，再放入70％、90％、100％梯度乙醇脱水各2分钟；取出玻片，室温晾干玻片；继续杂交过程。 

(2)样品和探针同时变性 

从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加10μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性78℃2分钟，杂交37℃10～18小时。 

(3)杂交后洗涤及复染 

取出，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃2×SSC中10分钟；再将其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗涤2分钟；室温70％乙醇3分钟；暗处晾干。 

复染：滴加10μl DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。 

(4)结果分析 

在Olympus BX53荧光显微镜下，用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的各探针的数目。 

(5)结果判定 

按处理方法要求进行操作，记录GSP hWAPL和CSP10信号数目。荧光原位杂交结果显示：在人外周血淋巴细胞中，中期染色体上的对应靶点可分别见两个信号点(参见附图3)，其它染色体区域未见荧光信号；间期细胞核中分别见两色信号点(参见附图4)，未见其它荧光信号。在脱落细胞样本中，核内可见双色探针荧光信号(参见附图5)。 

实施例5：hWAPL基因荧光原位杂交检测试剂盒在福尔马林固定石蜡包埋的宫颈组织样本中 的使用方法 

(1)玻片预处理 

玻片放入65±5℃恒温箱中烤片过夜；取出玻片，放入室温二甲苯中30分钟，再将其放入室温1∶1(V∶V)的二甲苯：无水乙醇中10分钟，放入室温无水乙醇中10分钟，再依次放入室温100％乙醇、90％乙醇、70％乙醇各3分钟；室温去离子水中静置3分钟，吸取多余水分；100±5℃的去离子水中煮片25分钟(切片水平放置于容器中，样本面朝上)。在样本区域滴加200ul的胃蛋白酶反应液，消化20分钟。甩去多余液体，放入2×SSC中室温洗涤5分钟；取出，再放入另一缸室温2×SSC中5分钟；取出，再放入70％、90％、100％梯度乙醇脱水各2分钟；取出玻片，室温晾干玻片；继续杂交过程。 

(2)样品和探针同时变性 

从试剂盒中取出杂交液，震荡混匀，瞬时离心；加10μl的杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，避免产生气泡；橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；将玻片放入杂交仪中，湿润原位杂交仪湿度条，插入湿条，盖上杂交仪上盖，设置“Denat&Hyb”程序，变性85℃2分钟，杂交37℃10～18小时。继续杂交后洗涤步骤。 

(3)杂交后洗涤及复染 

取出，小心去除橡皮胶水和盖玻片；将玻片放入37±1℃2×SSC中10分钟；再将其放入37±1℃0.1％NP-40/2×SSC洗涤2分钟；室温70％乙醇3分钟；暗处晾干。 

复染：滴加10μl DAPI到载玻片目标区域，盖上盖玻片，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。 

(4)结果分析 

在Olympus BX53荧光显微镜下，用滤镜组分别观察DAPI复染的杂交荧光信号，用CCD照相记录。在40×物镜下寻找，在100×物镜下计数；调整合适的焦距，对信号和背景有明确的概念；信号点因位于细胞内；当细胞外存在荧光信号点时，要注意与细胞内信号点区分，最好能避开该区域进行计数；调整焦距，在核的不同层次找到信号点；记录观察每个细胞中的各探针的数目。 

(5)结果判定 

按处理方法要求进行操作，记录GSP hWAPL和CSP10信号数目。荧光原位杂交结果显示：在人外周血淋巴细胞中，中期染色体上的对应靶点可分别见两个信号点(参见附图3)，其它染色体区域未见荧光信号；间期细胞核中分别见两色信号点(参见附图4)，未见其它荧光信号。在组织样本中，核内可见双色探针荧光信号(参见附图6)。 

实施例6：hWAPL基因检测试剂盒的临床使用评价 

以临床检测为慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)和宫颈癌的患者为研究对象，收集入选的30例患者的脱落细胞样本或活检组织样本，利用本发明实施例3中所述的hWAPL基因检测试剂盒进行hWAPL基因状态检测。据样本类型，按照实施例4或5进行操作和结果判断。检测结果如表1示。 

表1hWAPL基因检测结果 

从结果可知，在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变(CIN)和宫颈癌样本中，hWAPL基因阳性率分别为：0％、11.1％和81.8％。结果提示hWAPL在宫颈癌中多出现基因扩增情况，但特别注意的是筛查CIN样本时，检测出一例FISH阳性，但是否提示癌变可能性需进一步临床验证。考虑到本次研究中纳入样本数量较少，若需进一步验证临床使用性能，需增大样本量进行测试。 

因此，在CIN患者中推广hWAPL基因检测筛查，有助于早期诊断；在子宫颈癌患者中进行hWAPL基因检测，有助于其后治疗方案选择。总之，通过综合评价各分子标志物，了解其与肿瘤发生等的联系，对于明确基因分类，指导临床用药、治疗和判断预后效果都极其有益。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。 

Claims (11)

1.一种辅助子宫颈癌早期诊断及治疗选择的hWAPL基因荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含hWAPL基因探针和10号染色体着丝粒探针，每人份荧光标记探针混合物中GSP hWAPL和CSP10因探针的使用量均为0.5μl。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于未标记的竞争性DNA为Human COT-1DNA。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于杂交缓冲液的组分包括去离子甲酰胺，SSC，硫酸葡聚糖，其中去离子甲酰胺浓度为50％～70％，硫酸葡聚糖浓度为0.1g/ml。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于DAPI复染剂配制方法为50～250ng DAPI溶于1ml抗褪色液(10mg/ml对苯二胺/PBS，甘油混合液)。

5.一种制备权利要求1试剂盒所述hWAPL基因探针和10号染色体着丝粒探针的方法，如下：

(1)片段筛选：通过NCBI Mapview数据库检索所有含有hWAPL基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆；通过NCBI Mapview数据库检索10号染色体重复区域序列，并进行重复性分析，选择引物设计区域

(2)培养鉴定：按照hWAPL筛选确定的克隆编号购买克隆Invitrogen RPCI11.C，常规培养，使用针对hWAPL基因区域的STS引物进行PCR扩增，并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选hWAPL克隆的鉴定；CSP10以人基因组DNA为模板，利用设计的引物对进行PCR反应，通过电泳进行鉴定；将目的产物进行克隆、培养，从而完成待选CSP10片段鉴定

(3)探针制备：对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，通过切口平移方法对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化

(4)探针验证：使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于克隆筛选步骤中筛选含有hWAPL基因最优的克隆，编号为RP11-383M14(chr10：88159615..88339509)。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于包含hWAPL基因片段的克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列分别为：上游引物5’-ATGAATAGGCAGGCTGAGGATTT-3’和下游引物5’-TGACTCAGCCAAACCTTCTTAGG-3’；PCR扩增条件为：94℃5分钟，(94℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)×35循环，72℃7分钟。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于制备CSP10探针的引物对序列为：

上游引物5’-TGGATAATTGGCCCTCTTTGA-3’和下游引物5’-TTTCCATGTCTAAGATTGGCGT-3’；PCR扩增条件为：94℃5分钟，(94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒)×35循环，72℃7分钟。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针制备过程中50μl切口平移体系中DNA聚合酶I使用量在10U～20U间，DNase I使用量在0.001U～0.01U间。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针标记的荧光素为荧光素标记的dUTP，并优选Spectrum dUTP。

11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征还在于探针浓缩方法为乙醇沉淀浓缩，最后使用1～2μl灭菌纯化水或Human Cot-1DNA(1μg/μl)溶解沉淀。

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