ES2858849T3 - Método de detección no invasivo para el cribado de blástulas de crecimiento saludable - Google Patents

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Abstract

Un método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado, caracterizado porque, el genoma de las células del trofectodermo del blastocisto que se va a detectar se somete a detección por metilación; el nivel promedio de metilación del ADN de los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se usa como estándar; y un blastocisto que se va a detectar está bien desarrollado cuando su nivel de metilación del ADN es cercano o igual al estándar, en el que los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se refieren a blastocistos de grados AA, AB, BA y BB.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de detección no invasivo para el cribado de blástulas de crecimiento saludable
Campo técnico
La invención se refiere al campo de la informática epigenética a un nivel de todo el genoma, específicamente, a un método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado.
Antecedentes de la técnica
La fertilización in vitro y el trasplante de embriones (IVF-ET), conocido como "bebé probeta", es una tecnología de reproducción asistida clínica especial. La IVF es el procedimiento de fertilización mediante la toma de óvulos y muestras de esperma, y luego finalizando manualmente la fertilización en un ambiente controlado in vitro. En este procedimiento, luego el embrión temprano se trasplanta al útero y se convierte en un feto. Los bebés que nacen usando tal fertilización in vitro también se denominan "bebés probeta". Los embriones fertilizados in vitro se deben cribar antes de la implantación. En la actualidad, existen dos métodos de cribado clínico:
(1) Sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner. Durante la IVF-ET, el cultivo y el trasplante de un blastocisto es una etapa importante. La calidad de los blastocistos es uno de los factores más importantes que influyen en el éxito de la IVF-Et . En la actualidad, el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se aplica clínicamente. Según el tamaño del blastocele y el estado de eclosión, el desarrollo del blastocisto se divide en 6 etapas. Estadio 1: existe una cavidad en el blastocisto en un estadio temprano, con una cavidad de blastocele menor que la mitad del volumen del embrión. Estadio 2: la cavidad del blastocele es igual o mayor que la mitad del volumen del embrión. Estadio 3: blastocisto completo, con la cavidad del blastocele llenando completamente el volumen del embrión. Estadio 4: blastocisto expandido, con la cavidad del blastocele llenando completamente el volumen del embrión, el volumen total del embrión aumenta de tamaño y la zona pelúcida se vuelve más delgada. Estadio 5: eclosión del blastocisto y parte del blastocisto se escapa de la zona pelúcida. Estadio 6: blastocisto eclosionado y todo el blastocisto se escapa de la zona pelúcida. Los blastocistos en la etapa 3 a 6 también requieren una clasificación de calidad de su masa celular interna iCm y células de trofectodermo (células TE). Grados ICM: grado A, muchas células y células están compactas; grado B, pocas células y las células están agrupadas débilmente; grado C, muy pocas células. Grados TE: grado A, muchas células forman epitelio con una estructura compacta; grado B, unas pocas células forman un epitelio suelto; grado C, el epitelio está formado por células escasas. Según el método de clasificación, el mejor blastocisto debe ser el blastocisto de grado 3AA en el quinto día, así como el blastocisto de grado 4AA en el sexto y séptimo día. Durante los tratamientos de tecnología de reproducción asistida (ART), los blastocistos de grado AA son ideales para el trasplante de embriones. Sin embargo, en la práctica clínica, solo el 33 % de las parejas pueden obtener embriones de grado AA para implantación, y el 52 % de los pacientes solo pueden obtener blastocistos de grado B* (incluidos AB, BA y BB). La tasa de natalidad de los blastocistos de grado AA es del 39 % y de los blastocistos de grado B* es de aproximadamente el 28 %. Sin embargo, la tasa de natalidad de los blastocistos de grado C* (incluidos BC y CB) es del 4 %, y en la que la tasa de natalidad de los blastocistos de grado CC es casi cero.
El sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner es una morfología de embriones tradicional que selecciona embriones con un alto nivel morfológico para el trasplante, se basa en técnicas microscópicas tradicionales y tiene una precisión baja. Los datos de los ensayos clínicos mostraron que, para la terapia de reproducción asistida que solo usada detección morfológica, la tasa de aborto de pacientes con aborto recurrente es del 33.5 % y la tasa de embarazo clínico es del 45.8 %. Dado que la tasa de éxito promedio de un "bebé probeta" es de aproximadamente 20 % a 30 %, se implantarán de 2 a 3 blastocistos en un útero al mismo tiempo para aumentar la tasa de éxito de la implantación. Como resultado, a menudo ocurre un embarazo multifetal. El embarazo multifetal es más riesgoso que el embarazo único, y este riesgo existe tanto para la madre como para los bebés. Por consiguiente, para la seguridad de la madre y los bebés, la reducción fetal debe realizarse en principio cuando el número de fetos supera los tres. Sin embargo, la reducción fetal puede provocar el aborto de todos los embriones con una probabilidad del 10 %.
Como resultado, se necesitan nuevos métodos para mejorar la tasa de éxito del 'bebé probeta' y para evitar los peligros y conflictos éticos provocados por la reducción fetal durante el embarazo causada por el embarazo multifetal resultante del trasplante de múltiples embriones que se llevan a cabo con el fin de aumentar la tasa de éxito del embarazo.
(2) Cribado/diagnóstico genético previo a la implantación (PGS/PGD, también llamado "la tercera generación de bebés probeta"). Al analizar blastómeros con tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Handyside en Inglaterra realizó con éxito el embarazo y el parto después de la selección embrionaria del género para portadores de enfermedades ligadas al sexo en 1990. Este fue el primer PGS en todo el mundo y marcó el comienzo de una nueva era de cribado prenatal. En la década de 1990, la tecnología de cribado previa a la implantación se había desarrollado rápidamente. En 1994, Monne usó la tecnología de hibridación in situ fluorescente (FISH) y tuvo éxito en el cribado de aneuploidías cromosómicas y la detección de género antes de la implantación. Desde entonces, se han desarrollado diversas tecnologías, tales como múltiples-PCR, fluorescencia-PCR y M-FISH. En 1998, FISH comenzó a aplicarse en el PGS de la translocación de equilibrio cromosómico. Al seleccionar gametos o embriones normales y equilibrados, el PGS puede disminuir notablemente las tasas de aborto espontáneo recurrente causado por la translocación cromosómica. Ese mismo año, se comenzó a aplicar una sonda de cinco colores disponible comercialmente para cribar aneuploidías en los ovocitos y embriones de mujeres mayores durante el PGS. Esta sonda de cinco colores se puede usar para cribar cinco cromosomas simultáneamente: cromosomas 13, 18, 21, X e Y. Desde el año de 1999, la tecnología de conversión nuclear en interfase, la hibridación genómica comparativa (CGH) y la amplificación del genoma completo (WGA) se aplican a PGS, lo que facilita aún más la investigación y aplicación de PGS. Desde 2010, la secuenciación de alto rendimiento ha comenzado a desarrollarse rápidamente. Se pueden secuenciar desde cientos de miles de ADN hasta millones de ADN a la vez, lo que hace posible el análisis detallado del genoma embrionario y lleva al PGS a una nueva dimensión. El entusiasmo por la investigación de la tecnología PGS nunca ha disminuido en el país y en el extranjero. En la actualidad, el PGS se aplica principalmente en el diagnóstico de las siguientes enfermedades genéticas: a. anomalía en el número de cromosomas; b. diagnóstico de género preimplantacional; c. enfermedad genética de tipo deleción genética; d. diagnóstico de trastornos embrionarios monogénicos.
En la actualidad, aproximadamente el 12 % de las mujeres en edad fértil en los Estados Unidos necesitan la ayuda de la tecnología de reproducción asistida (ART) para dar a luz. En la población con embarazo natural, muchas mujeres embarazadas sufrieron abortos provocados por un desarrollo embrionario anormal. Asimismo, después de la cirugía de ART, una proporción significativa de embriones se aborta debido a un desarrollo anormal. La inestabilidad genética es una razón importante para el aborto, tal como diversas mutaciones genéticas, anomalías en el número y la estructura de los cromosomas. Para excluir embriones humanos tempranos con defectos genéticos, el diagnóstico genético preimplantacional (PGD) se ha usado ampliamente en la clínica mediante la eliminación de algunas células del trofodermo de un embrión mediante micromanipulación y el posterior análisis genético de estas células. En la actualidad, la tecnología PGD se usa ampliamente en aplicaciones clínicas y se la conoce como "la tercera generación de bebés probeta", lo que reduce en gran medida la tasa de abortos en pacientes con aborto recurrente que reciben terapia de reproducción asistida y mejora la tasa de embarazo clínico.
El cribado del gen de preimplantación de PGS solo criba los trastornos genéticos en los que cambia el número de cromosomas o la secuencia de ADN. Si bien la infertilidad o el aborto no se deben principalmente al cambio de la secuencia del ADN, la mayoría de los abortos espontáneos ocurren sin razones conocidas.
La información epigenética juega un papel crítico durante el desarrollo animal. Todas las células de un organismo comparten el mismo conjunto de genoma de ADN. Sin embargo, bajo la regulación del epigenoma, las células se diferencian en diferentes tipos y luego forman diferentes órganos. En otras palabras, las células en diferentes estadios de desarrollo durante el desarrollo temprano del embrión deben seguir un patrón epigenómico específico para asegurar la totipotencia de los embriones y dirigir la correcta diferenciación de las células. La desmetilación del ADN de todo el genoma se produce durante el desarrollo embrionario temprano en los mamíferos. La prevención manual de la reprogramación de la metilación del ADN mediante la deficiencia genética de las metiltransferasas de ADN (DNMT) o la secuencia genética de Tet3 da como resultado un desarrollo embrionario anormal.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado en base a un examen epigenético previo a la implantación (PEGE). El método usa en primer lugar la información epigenética para identificar el estado de un embrión. Algunas células TE se separan de un blastocisto cultivado in vitro. Estas células no son invasivas para todo el blastocisto, pero pueden representar el estado de metilación y la ploidía de cada cromosoma en todo el embrión.
Después de que el embrión se convierte en mórula, la mórula continúa con la división celular. Al mismo tiempo, el líquido secretado de la cavidad uterina penetra en la célula a través de la zona pelúcida y forma blastocele. Rodeado del blastocele hay una capa de células escamosas. En esta capa, las células tienen un tamaño más pequeño y se convertirán en una parte de la placenta, llamada células trofectodermo (TE). Las células más grandes acumuladas en un extremo del embrión se denominan masa celular interna (ICM). Las células en ICM son células madre embrionarias indiferenciadas con totipotencia y se convertirán en diversos tejidos del feto. Dado que las células TE se convertirán en caul y placenta, algunas de las células TE se toman para su detección durante la genética, por lo que tal diagnóstico no influye en la formación de una placenta normal y el desarrollo fetal.
La presente invención construye una biblioteca de metilación de genoma completo de células traza con el método de "un tubo" y luego realiza la secuenciación por metilación de genoma completo de una muestra. El nivel promedio de metilación del ADN de los embriones de grado AA se considera un estándar, que es el estándar cuantitativo para la detección no invasiva de embriones antes de la implantación. Cuanto más se acerque el estado de metilación del embrión analizado al valor del estándar, mejor será el estado de desarrollo, mayor será el potencial de convertirse en un feto normal y mayor será la idoneidad para el trasplante. Además, se puede determinar si la ploidía cromosómica del genoma del embrión es anormal analizando los datos de metilación. Los embriones con cromosomas anormales serán rechazados para ART. Por consiguiente, los médicos pueden seleccionar embriones con ploidía cromosómica normal y un mejor perfil epigenético para el trasplante de embriones mediante el método de la presente invención.
El estudio de la presente invención encuentra que el nivel de metilación del genoma completo de los embriones identificados como embriones de grado AA que tienen una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner exhiben una alta consistencia (Figura 1); parte de los embriones identificados como embriones B* que tienen una morfología general muestran un nivel de metilación de genoma completo similar al de los embriones de grado AA, y parte de los embriones B* tienen un nivel de metilación del ADN dramáticamente diferente al de los embriones de grado AA (Figura 2); y la mayoría de los embriones C* con mala morfología muestran un nivel de metilación del genoma completo significativamente diferente al de los embriones de grado AA (Figura 1). En resumen, cuanto peor es el grado de los embriones en la clasificación morfológica, mayor es la proporción de embriones que muestran un nivel de metilación del ADN diferente en comparación con los embriones de grado AA.
Mientras tanto, en la presente invención, también se encuentra que el patrón de metilación del ADN de todos los embriones de grado Aa es bastante similar (Figuras 3 y 4), lo que significa que diferentes embriones muestran el mismo estado de metilación alto o bajo en el mismo regiones genómicas. Por el contrario, los embriones de baja calidad muestran un estado de metilación bastante diferente (Figuras 3 y 4).
Se demuestra en la presente invención que la inestabilidad de la informática epigenética a nivel de genoma completo se produce con frecuencia durante el desarrollo embrionario temprano del ser humano, lo que podría ser un factor importante que conduce a una disminución de la tasa de natalidad en humanos. El perfil de metilación del ADN genómico es fundamental para el desarrollo embrionario. Las regiones reguladoras de algunos genes críticos están metiladas incorrectamente en embriones con perfil de metilación anormal (Figuras 5 y 6). Un blastocisto con un nivel de metilación del ADN que cumpla o se acerque al estándar es un candidato ideal para el trasplante de embriones. Los embriones con un nivel de metilación del ADN más cercano al de los embriones de grado AA se pueden seleccionar para trasplante mediante detección PEGE. Los materiales epigenéticos de los embriones se pueden analizar directamente para determinar si los embriones están desarrollados de forma anormal, seleccionando así los embriones que son más apropiados para el trasplante. La detección puede mejorar potencialmente la precisión de la tecnología de reproducción asistida, mejorar la tasa de éxito del embarazo del "bebé probeta", reducir la tasa de abortos espontáneos, mejorar la calidad del embarazo y aumentar la tasa de natalidad del "bebé probeta" (Figura 7).
El nivel de metilación del ADN de algunas de las células TE sometidas a biopsia de un blastocisto de una manera no invasiva puede representar el nivel de metilación del ADN de todo el embrión (Figura 8). Por lo tanto, en la presente invención, en primer lugar se toman algunos TE de una manera no invasiva, y luego se mide el perfil de metilación de estas células. El nivel promedio de metilación del ADN (0.3±0.02) de los embriones de grado AA en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner se usa como estándar para el cribado de un blastocisto bien desarrollado. Para múltiples embriones de los mismos padres, el blastocisto con un nivel de metilación del ADN cercano a 0.3 es más apropiado para ART.
Previamente, un indicador importante para detectar si un embrión se puede trasplantar es si los cromosomas del embrión son anormales. El perfil de metilación medido se puede usar para juzgar si la ploidía de cada cromosoma de un embrión es normal. Por ejemplo, se encontró que muchos embriones tenían errores en los cromosomas al usar los datos del perfil de metilación (Tabla 2). Por ejemplo, se encontró una copia adicional de un fragmento grande del cromosoma 5 y la falta de una copia de un fragmento grande del cromosoma 9 al analizar los cromosomas de la muestra s-25-4CC (Figura 9), lo que indica que este embrión no era apropiado para trasplante de embriones.
En resumen, el nivel de metilación del ADN, el patrón de metilación del ADN y el estado de los cromosomas se pueden obtener midiendo el perfil de metilación de algunas de las células TE que se someten a una biopsia no invasiva y, por lo tanto, los médicos pueden seleccionar embriones con ploidía cromosómica normal y mejor perfil epigenético para el trasplante de embriones.
Específicamente, la presente invención proporciona un método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado, en el que el genoma de las células del trofectodermo de un blastocisto que se va a detectar se somete a detección por metilación, el nivel promedio de metilación del ADN de los embriones identificados como que tiene una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner como estándar, el blastocisto que se va a detectar está bien desarrollado cuando su nivel de metilación del ADN es cercano o igual al estándar, y en el que los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se refiere a los blastocistos de los grados AA, AB, BA y BB.
El método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado según la presente invención incluye además el uso de un patrón de metilación del ADN de embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner como estándar.
Adicionalmente, el método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado proporcionado por la presente invención incluye además determinar si el número de copias de ploidía de cada cromosoma del blastocisto es normal según los resultados de secuenciación por metilación y los cromosomas del blastocisto que se va a analizar es normal cuando los cromosomas son cromosomas diploides estándar.
La presente invención proporciona el uso del método de detección no invasivo anterior para aumentar la tasa de embarazo.
La presente invención proporciona un método de aumento de la tasa de natalidad de un bebé probeta, en el que un blastocisto que tiene un nivel de metilación del ADN de las células del trofectodermo cercano o igual al nivel de metilación del ADN de los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se selecciona para el trasplante de embriones, y los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner se refieren a blastocistos de los grados AA, AB, BA y BB.
Un método de aumento de la tasa de natalidad de bebés probeta incluye además seleccionar un blastocisto que se va a detectar, cuyos resultados de secuenciación por metilación del ADN muestran que todos los cromosomas son cromosomas diploides estándar según los resultados de secuenciación por metilación del ADN de las células del trofectodermo.
Se describe un kit para el cribado de un blastocisto bien desarrollado, que es un kit para la secuenciación por metilación del ADN de un blastocito, en el que se usa el nivel promedio de metilación del ADN de los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner como estándar, y el blastocisto que se va a detectar está bien desarrollado cuando su nivel de metilación del ADN es cercano o igual al estándar, y los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se refieren a blastocistos de grados AA, AB, BA y BB.
Adicionalmente, el kit para el cribado de un blastocisto bien desarrollado descrito es un kit para la secuenciación por metilación de un blastocisto, y el blastocisto que se va a detectar está bien desarrollado cuando los resultados de la secuenciación por metilación del ADN del blastocisto muestran que todos los cromosomas son cromosomas diploides estándar.
Preferiblemente, los objetos de detección del kit descrito son células TE de un blastocisto.
La presente invención proporciona el uso de un valor del nivel de metilación del ADN de embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner en la preparación de un kit para el cribado de un blastocisto bien desarrollado, y los embriones identificados por tener una buena morfología. en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se refieren a blastocistos de los grados AA, AB, BA y BB.
Específicamente, cuando el genoma de las células de trofectodermo de un blastocisto que se va a analizar se somete a secuenciación por metilación del ADN usando el método de secuenciación por metilación como se describe en los ejemplos de la presente invención, y el nivel de metilación del ADN de las células de trofectodermo del blastocisto que se va a analizar está en el rango de 0.3±0.2, el blastocisto está bien desarrollado.
Preferiblemente, el blastocisto que se va a analizar está bien desarrollado cuando el nivel de metilación del ADN de sus células de trofectodermo está en el intervalo de 0.3±0.02.
Más preferiblemente, el blastocisto que se va a analizar está bien desarrollado cuando el patrón de metilación del ADN de las células del trofectodermo del blastocisto que se va a analizar se acerca al patrón de los blastocistos de grado AA.
Más preferiblemente, el método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado incluye además determinar si la ploidía de cada cromosoma es normal según los resultados de la secuenciación por metilación del ADN, y los cromosomas del blastocisto que se van a analizar son normales si los cromosomas son cromosomas diploides estándar.
Además, la presente invención proporciona un método de aumento de la tasa de natalidad de un bebé probeta, en el que el blastocisto con un nivel de metilación del ADN de las células del trofectodermo de 0.3±0.2 se selecciona para trasplante usando el método de secuenciación por metilación de la presente invención.
Preferiblemente, el blastocisto con un nivel de metilación del ADN de las células del trofectodermo de 0.3±0.02 se selecciona para trasplante.
Más preferiblemente, el método de la presente invención incluye además seleccionar un blastocisto con cromosomas diploides estándar para el trasplante según los resultados de secuenciación por metilación de las células del trofectodermo.
Se describe un kit para el cribado de un blastocisto bien desarrollado, en el que se usa el método de secuenciación por metilación del ADN como se describe en los ejemplos de la presente invención, y el blastocisto que se va a analizar está bien desarrollado cuando el nivel promedio de metilación del ADN del blastocisto que se va a analizar es 0.3±0.2 y su patrón de metilación del ADN es similar al de los blastocistos de grado AA y/o todos los cromosomas son cromosomas diploides estándar.
Preferiblemente, con respecto al kit descrito, el blastocisto que se va a analizar está bien desarrollado cuando el nivel promedio de metilación del ADN del blastocisto que se va a analizar es 0.3±0.02, su patrón de metilación del ADN es similar al de los blastocistos de grado AA y/o todos los cromosomas son cromosomas diploides estándar.
Preferiblemente, los objetos de detección del kit son células de trofectodermo de un blastocisto.
La presente invención también proporciona el uso de un valor del nivel de mutilación del ADN de los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner en la preparación de un kit para el cribado de un blastocisto bien desarrollado. Aplicando el método de secuenciación por metilación como se describe en los ejemplos de la presente invención, se detecta que el nivel de metilación del ADN de los blastocistos de grado AA es 0.30±0.02. Cuanto más se aproxime el nivel de metilación del ADN de un blastocisto que se va a detectar a 0.3, mayor será la idoneidad para el trasplante de embriones.
Mientras tanto, el método de la presente invención puede detectar el estado de cada cromosoma en un embrión. Solo los embriones sin números de copias anormales en los cromosomas se pueden usar para el trasplante de embriones. En otras palabras, solo los embriones en los que todos los cromosomas son cromosomas diploides estándar se pueden usar para el trasplante de embriones.
Aplicando el método de secuenciación por metilación de la presente invención, se pueden obtener al mismo tiempo dos indicadores, es decir, el perfil de metilación del ADN (incluido el nivel de metilación del ADN) y el estado de cada cromosoma en el embrión. Los embriones se seleccionan para ART combinando estos dos indicadores. El método de la presente invención tiene grandes ventajas sobre los métodos anteriores.
El método de la presente invención selecciona cuantitativamente un embrión de preimplantación en base al estado de desarrollo y el potencial de desarrollo del embrión. El método de la presente invención tiene el mismo intervalo de aplicación que el método de cribado morfológico tradicional y es apropiado para todos los embriones tipificados morfológicamente, incluidos los de grado AA, grado B* o grado C*, pero el método de la presente invención es más objetivo y preciso. Al mismo tiempo, la tecnología se puede usar para el cribado de todos los embriones y se espera que aumente en gran medida la precisión de la ART, reduzca el riesgo de cirugía, alivie los dolores de los pacientes y mejore aún más la tasa de nacidos vivos de bebés probeta. Los efectos beneficiosos aportados por la presente invención se muestran a continuación:
1. El método de la presente invención realiza un cribado cuantitativo adicional de un embrión bien desarrollado en base a la morfología tradicional y PGS. Este método aumentará la tasa de éxito del "bebé probeta" y reducirá la tasa de abortos.
En comparación con la morfología embrionaria tradicional que se basa en técnicas de microscopía para seleccionar embriones con un alto grado morfológico para trasplante, el método de la presente invención es más objetivo y evita la incertidumbre artificial en la tipificación morfológica, ya que muchas pruebas morfológicas se basan más en la experiencia personal de personal médico. Además, la calidad de la morfología no puede representar el estado genómico y epigenómico de un blastocisto y no puede predecir con precisión el estado de desarrollo y el potencial de un blastocisto. Sin embargo, el método de la presente invención puede medir y analizar directamente la información epigenética de los embriones, determinar con precisión si un embrión tiene un patrón de metilación del ADN estándar y tiene el potencial de convertirse en un feto sano, y al mismo tiempo determinar si los cromosomas son normales y, por lo que, puede cribar un embrión que esté bien desarrollado y tenga cromosomas normales. El presente método PEGE propone en primer lugar el concepto de usar información epigenética para cribar embriones y realizar pruebas previas al trasplante.
2. El método PEGE de la presente invención es superior al método PGS actualmente en uso.
PGD/PGS es un método de uso común en todo el mundo que puede determinar si un embrión tiene anomalías cromosómicas mediante el análisis de la secuencia de ADN y la estructura cromosómica. Sin embargo, el método PGS/PGD no tiene ningún efecto en la mayoría de las personas sin anomalías cromosómicas ni trastornos genéticos, y no puede mejorar la tasa de embarazo y la tasa de natalidad después de la ART en la mayoría de las personas. Por el contrario, el método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado de la presente invención es aplicable a todas las poblaciones y también es capaz de detectar anomalías cromosómicas. Por lo tanto, el presente método PEGE no solo puede determinar la presencia de aneuploidía cromosómica que puede detectarse mediante el método PGS actual, sino que también puede cribar embriones con mejor estado epigenético al mismo tiempo. Por lo tanto, el presente método PEGE tiene ventajas notables sobre el método PGS actual. Por lo tanto, el presente método PEGE tiene el potencial de convertirse en el método de cribado clínico previo al trasplante más común, básico y preciso para embriones.
3. Prevención del embarazo con múltiples fetos y reducción de la cirugía de reducción fetal.
Dado que la tasa de éxito promedio de un "bebé probeta" es de aproximadamente un 20 % a un 30 %, se implantarán 2 o 3 blastocistos en el útero al mismo tiempo para aumentar la tasa de éxito de una implantación. Como resultado, a menudo ocurre un embarazo con múltiples fetos. El embarazo con múltiples fetos es más riesgoso que el embarazo único, y este riesgo existe tanto para la madre como para los bebés. La investigación autorizada muestra que los gemelos tienen una tasa de partos por cesárea del 78.45 %, una tasa de nacimientos prematuros del 47.07 % y una tasa de complicaciones del 39.7 %. Las madres de mellizos o partos múltiples tienen un mayor riesgo de desarrollar síndromes gestacionales tales como diabetes e hipertensión durante el embarazo, y una mayor probabilidad de hemorragia posparto y también es más probable que ocurra un parto prematuro. La mayoría de los bebés prematuros nacen con enfermedades pulmonares congénitas que los acompañarán durante toda su vida. Por consiguiente, para la seguridad de la madre y los bebés, la reducción fetal se debe realizar en principio cuando el número de fetos supera los tres. Sin embargo, la reducción fetal también puede provocar el aborto de todos los embriones con una posibilidad del 10 %. El método de la presente invención puede evitar el embarazo de múltiples fetos que resulta en la implantación de varios embriones en una cirugía de implantación, aliviar el dolor de las madres y mejorar la tasa de supervivencia de los embriones y la tasa de embarazo exitoso.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que muestra el nivel de metilación del ADN de los embriones de grado AA (el grado más alto) y los embriones de grado CC o CB (grado bajo). Los embriones AA-1 y CB-1 se derivaron de los mismos padres, y los embriones AA-3 y CC-6 se derivaron de los mismos padres. Los resultados mostraron que el nivel de metilación del ADN de los embriones de grado AA fue de 0.30 ± 0.02, mientras que el nivel de metilación del ADN de los embriones de grado CC o CB, en su conjunto, fue muy diferente al de los embriones de grado AA.
La figura 2 es un gráfico que muestra los niveles de metilación del ADN de 6 embriones (BB/BA). Dos líneas punteadas indican la SD del nivel de metilación del ADN para cinco embriones de grado AA. Los resultados muestran que los niveles de metilación del ADN de tres embriones (BB-3, BB-4 y BB-5) son similares con los embriones de grado AA, mientras que los niveles de metilación del ADN de los tres embriones restantes (BA-1, BB-2, y BB-6) son muy diferentes a los de los embriones de grado AA.
La figura 3 es un gráfico que muestra el análisis de componentes principales (análisis de PCA) según el patrón de metilación de CpG de cada embrión. Los patrones de metilación del ADN de los embriones de grado AA son bastante similares, pero los embriones de grado CC o CB muestran un patrón de metilación del ADN significativamente diferente del patrón de los embriones de grado AA, y el estado de cada embrión de grado CC o CB es significativamente diferente.
La figura 4 muestra los niveles promedio de metilación del ADN de diferentes elementos funcionales genómicos en 5 embriones de grado AA y 7 embriones de grado CB o CC. Los niveles de metilación del ADN de cada elemento funcional de 5 embriones AA son similares, mientras que 7 embriones de grado CC o CB muestran niveles de metilación del ADN bastante divergentes y la mayoría de los embriones muestran un nivel de metilación del ADN muy diferente al de los embriones de grado AA.
La figura 5 es un diagrama de análisis funcional de la reprogramación de metilación de diferentes embriones tipificados morfológicamente. Se realizó un análisis de enriquecimiento funcional de regiones metiladas diferencialmente entre embriones de alto grado y de bajo grado. Los genes con promotores ubicados en DMR se analizaron mediante análisis de enriquecimiento con DAVID GO. Los elementos cisreguladores de la región DMR intergénica se analizaron con herramientas GREAT. El análisis de GO con P <0.05 tuvo una significación estadística. Los resultados indican que las regiones que tienen metilación errónea a menudo se producen en genes metabólicos basales que son importantes para la supervivencia celular, o en genes implicados en el desarrollo, especialmente el neurodesarrollo, lo que indica que un perfil de metilación normal es fundamental para el desarrollo embrionario.
La figura 6 es un gráfico que muestra que el potenciador cerca del gen IDH2 está metilado diferencialmente en diferentes embriones. La figura muestra que en embriones de grado alto y bajo grado, un nivel de metilación del ADN suavizado se extiende dentro de los ±5 kb de la región del gen. El estado de metilación alrededor del potenciador en AA1, AA2 y AA3 es similar, pero el estado de metilación del potenciador en CC5 y CC6 es anormal. Las barras negras cortas indican sitios CpG.
La figura 7 muestra la proporción de embriones con un nivel de metilación del ADN dentro de 0.30 ± 0.02 en embriones con diferentes grados y la tasa de natalidad de embriones con diferentes grados. La tasa de natalidad de los embriones C* se usa para reemplazar la tasa de natalidad de los embriones CC y C*, por lo que la tasa de natalidad de los embriones C* es mayor que la tasa de natalidad total de los embriones CC y C*. Esta figura demuestra que los embriones con mejor estado de metilación son propensos a tener una mayor tasa de natalidad.
La figura 8 es un gráfico que muestra que los niveles de metilación del ADN de las células TE sometidas a biopsia no invasiva son similares a los del embrión completo. BB-7-TE y CC-8-TE son algunas de las células de trofectodermo (TE) sometidas a biopsia de embriones BB-7 y CC-8, respectivamente.
La figura 9 es un gráfico que muestra el análisis del número de copias cromosómicas en base al resultado del perfil de metilación del ADN. Una copia adicional de un fragmento del cromosoma 5 y la falta de una copia de un fragmento del cromosoma 9 se encuentran en la muestra s-25, lo que indica que el cromosoma del embrión es anormal y este embrión no es apropiado para el trasplante de embriones.
Modos específicos para llevar a cabo las realizaciones
Los siguientes ejemplos describen adicionalmente la presente invención, pero no pretenden limitar el alcance de la invención. Se pretende que las modificaciones y sustituciones de los métodos, procedimientos o condiciones de la presente invención realizadas sin apartarse de la presente invención estén incluidas dentro del alcance de la invención.
A menos que se indique particularmente, los reactivos químicos usados en los ejemplo son reactivos habituales disponibles comercialmente. Los medios técnicos usados en los ejemplo son los bien conocidos para un experto en la técnica.
Ejemplo 1: El descubrimiento de la inestabilidad de la metilación del ADN a nivel del genoma completo en blastocisto humano
En la presente invención, se recogieron blastocistos con diferentes grados morfológicos de Gardner, incluidos blastocistos de grado AA (grado más alto) y blastocistos de grado CC, BC y CB (grado bajo). Estos blastocistos eran de Peking University Third Hospital and the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University. Cuando una paciente aceptó la ART, se cultivaron in vitro varios blastocistos y luego se trasplantó al útero el blastocisto con la mejor morfología. Luego, el paciente donó blastocistos excedentes para la investigación científica sobre el tema de la presente invención después de que el paciente firmara el formulario de consentimiento informado. Para cada blastocisto, se realizó la secuenciación por metilación del ADN a una resolución de base única. Los experimentos de "un tubo" de la presente invención se llevaron a cabo de la siguiente manera:
1. Preparación de la muestra
Se sometieron a biopsia células TE de embriones, se mantuvieron en tubos de 200 pl con menos de 5 pl de medio de cultivo de embriones o solución reguladora PBS y luego se congelaron inmediatamente a -80 °C.
2. Lisis celular
Tabla 1 Solución reguladora de lisis celular
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La muestra congelada se descongeló rápidamente y se centrifugó a 4 °C (3000 g, 5 min). La proteopepsis se realizó a 56 °C, durante 1.5 h. Luego, las proteasas se inactivaron a 75 °C, durante 30 min.
3. Cizallamiento de ADN
Se agregó ADN Lambda sin metilar a la muestra en una proporción de 5 pg de ADN Lambda por 1000 pg de muestra de ADN. El volumen final de la muestra se ajustó a 50 pl con agua ultrapura. Condiciones de cizallamiento: S2, 50 pl, 400 pb. El volumen de la muestra se redujo a 30 pl por concentración.
4. Reparación de extremos
Se preparó una solución reguladora de reparación de extremos de la siguiente manera:
Figure imgf000008_0002
La reacción se realizó durante 30 min a 20 °C, seguida de inactivación de la enzima a 75 °C, durante 20 min. Luego, la muestra se sometió a una etapa posterior o se congeló a una temperatura de -20 °C o menos.
5. Terminación de dA
Se agregaron los siguientes reactivos al producto de la etapa 4:
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La incubación se realizó durante 30 min a 37 °C, seguida de la inactivación de la enzima a 75 °C, durante 20 min. La muestra se sometió a una etapa posterior o se congeló a una temperatura de -20 °C o menos.
6. Ligadura del adaptador
Se agregaron los siguientes reactivos al producto de la etapa 5:
Figure imgf000009_0002
La mezcla se mezcló bien y se incubó a 16 °C, durante la noche (al menos 8 h). Luego, la muestra se sometió a una etapa posterior o se congeló a una temperatura de -20 °C o menos.
7. Kit de preparación de la biblioteca de metilación
Se formuló el reactivo de conversión de CT para una muestra de 50 pl según las instrucciones del kit. Se preparó una mezcla de conversión de bisulfato de la siguiente manera:
La mezcla se mezcló bien, la muestra se dividió igualmente en 2 tubos (75 pl de muestra por tubo) y se llevó a cabo el siguiente programa: 98 °C, durante 10 min; 64 °C, durante 2 h; 4 °C por hasta 2 h. Se colocó una columna de giro en un tubo de recogida y se agregaron a la columna 600 pl de solución reguladora de unión y 0.5 pl de ARN portador. Se agregaron 150 pl de muestra a la solución reguladora de unión. La mezcla se mezcló bien mediante pipeteo suave y repetido, y luego se cerró la tapa y se colocó durante 5 min. Luego, el tubo se centrifugó a 10,000 rpm o más durante 1 min. Los reactivos del tubo de recogida se agregaron a la columna de centrifugación y la centrifugación se volvió a realizar una centrifugación de 1 min. Los reactivos después de la centrifugación se descartaron. Se agregaron 100 pl de solución reguladora de lavado a la columna y se centrifugó a 10,000 rpm o más durante 1 min. Se agregaron 200 pl de solución reguladora de desulfonación a la columna y la columna se colocó a temperatura ambiente durante 15 a 20 min, luego se centrifugó a 10,000 rpm o más durante 1 min. Los reactivos después de la centrifugación se descartaron. Se agregaron de nuevo 100 pl de solución reguladora de lavado a la columna y se centrifugó a 10.000 rpm o más durante 1 min. Se repitió la etapa de lavado y se descartaron los reactivos del tubo de recogida, luego se transfirió la columna de centrifugación a un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 ml. Se agregaron 11 pl de agua ultrapura, se colocaron durante 10 min a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 10,000 rpm o más durante 1 min, y se repitió esta etapa nuevamente. La muestra obtenida después de la centrifugación fue el ADN tratado con bisulfito. La muestra se sometió a una etapa posterior o se congeló a una temperatura de -20 °C o menos.
8. Primera ronda de amplificación por PCR
Se usó el kit de amplificación por PCR y la solución reguladora de amplificación se preparó de la siguiente manera:
Figure imgf000010_0001
La amplificación se realizó según el siguiente programa: 98 °C, durante 45 s, 98 °C, durante 15 s, 65 °C, durante 30 s, 72 °C, durante 30 s (6 ciclos en total); 72 °C, durante 1 min; y mantener a 4 °C.
La muestra obtenida se sometió a una etapa posterior o se congeló a una temperatura de -20 °C o inferior.
9. Se agregó un volumen igual (50 pl) de Cuentas AMPure XP a la muestra de ADN obtenida en la etapa anterior, se mezcló bien y se centrifugó. Luego, la muestra se colocó a 37 °C, durante 10 min. El tubo se colocó en una rejilla magnética durante 5 min. Las cuentas magnéticas se lavaron con 200 pl de etanol al 75 % y se descartó el sobrenadante. Las cuentas magnéticas se secaron al aire durante 2 min para evaporar el etanol. Las cuentas magnéticas se volvieron a suspender con 25 pl de Tris-HCl 10 mM (pH 8.5), se centrifugaron a baja velocidad, se dejaron reposar durante 5 min, y luego se colocaron en una rejilla magnética durante 5 min. El sobrenadante se recogió en un nuevo tubo de centrífuga de 200 pl y luego se sometió a una etapa posterior, o se congeló a una temperatura de -20 °C o menos.
10. Segunda ronda de amplificación por PCR
Se usó un kit de amplificación por PCR y se preparó una solución reguladora de amplificación de la siguiente manera:
Figure imgf000010_0002
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La amplificación se realizó según el siguiente programa: 98 °C, durante 45 s, 98 °C, durante 15 s, 65 °C, durante 30 s, 72 °C, durante 30 s (13 a 16 ciclos en total); 72 °C, durante 1 min; y mantener a 4 °C. La muestra obtenida se sometió a una etapa posterior o se congeló a una temperatura de -20 °C o menos.
11. Extracción de gel
La muestra de ADN se sometió a electroforesis en gel de agarosa con una concentración de agarosa del 2 % y un voltaje de 90V. Se cortaron fragmentos de ADN con un tamaño apropiado para la extracción en gel según el requisito de secuenciación. Para la última etapa de extracción en gel, el ADN se eluyó tres veces con un volumen total de 50 |il de agua ultrapura estéril.
12. Eliminación del adaptador
Se agregaron Cuentas 0.8x AMPure XP (40 |il) a la muestra de ADN obtenida en la etapa anterior, se mezcló bien y se centrifugó. La mezcla se dejó reposar a 37 °C, durante 10 min. El tubo se colocó en la rejilla magnética durante 5 minutos para la absorción de cuentas. El sobrenadante se desechó cuidadosamente sin tocar las cuentas. Las cuentas se lavaron con 200 |il de etanol al 75 % y luego se descartó el sobrenadante. Las cuentas se secaron al aire durante 2 min para evaporar el etanol. Las cuentas se volvieron a suspender con 15 |il de Tris-HCl 10 mM (pH 8.5), se centrifugaron a baja velocidad, se dejaron reposar durante 5 min y luego se colocaron en una rejilla magnética durante 5 min. El sobrenadante se recogió en un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 mL y se almacenó a -20 °C. La muestra obtenida fue la muestra de ADN que se va a secuenciar.
Se obtuvo una biblioteca de metilación del ADN mediante los procedimientos anteriores, y la biblioteca se puede secuenciar después de pasar la inspección de calidad de la biblioteca. Los datos de secuenciación por metilación de genoma completo de blastocisto obtenidos se mapearon primero en una secuencia de referencia humana (hg19) mediante el software de alineación Bismark. Según la información de mapeo, la lectura única mapeada a la secuencia de referencia humana se dividió en fragmentos de cadena de Watson and Crick después de que se eliminaron el fragmento de repetición de PCR y la región de superposición de fragmentos de doble extremo. El estado de metilación de la citosina en el fragmento de cadena de Waston y la adenina en el fragmento de cadena de Crick se obtuvieron con el software Samtools, respectivamente. Luego, la información sobre las dos cadenas se combinó para obtener el nivel de metilación del ADN en cada sitio CpG. El nivel de metilación del genoma completo fue el valor medio de los niveles de metilación del ADN en todos los sitios CpG.
El análisis mostró que los niveles de metilación del ADN de los blastocistos de grado 5 AA eran similares. Sin embargo, los niveles de metilación del ADN de 6 de los 7 embriones de bajo grado se desviaron significativamente del nivel promedio de metilación del ADN de los embriones de grado AA, y la diferencia entre los embriones de bajo grado también fue obvia. En comparación con los embriones de alto grado, esos embriones de bajo grado estaban demasiado desmetilados o no lo suficientemente desmetilados (Figura 1). Para los embriones de grado BA o BB, 3 de los 6 embriones eran buenos candidatos para el trasplante de embriones porque sus niveles de metilación del ADN eran similares a los de los embriones de grado AA, mientras que el resto no era apropiado para el trasplante de embriones (Figura 2).
Además, el análisis de componentes principales (PCA) para el patrón de metilación del ADN bioinformático mostró que el patrón de metilación del ADN de los 5 embriones AA eran muy similares y pueden agruparse (indicado por el círculo en la figura 3). En contraste, 7 embriones de bajo grado distribuidos fuera del círculo, y el patrón de metilación del ADN de estos embriones era bastante diferente al de los embriones de grado AA.
Un análisis que compara el estado de metilación del ADN de las mismas regiones de elementos funcionales de diferentes embriones mostró que los patrones de metilación del ADN de embriones de grado 5 AA eran similares para la misma región de elementos funcionales. Sin embargo, en los embriones de bajo grado, el estado de metilación de la misma región de elementos funcionales difiere entre sí (Figura 4). Se puede ver que la inestabilidad epigenética a nivel de todo el genoma ocurre con frecuencia durante el desarrollo embrionario temprano del ser humano, y los niveles de metilación del ADN de los embriones AA son bastante similares (es decir, diferentes embriones muestran el mismo estado metilado alto o bajo en las mismas regiones genómicas). Los embriones de bajo grado en la clasificación morfológica (incluidos B* y C*) muestran diferentes niveles de divergencia en el estado de metilación del ADN. Cuanto menor es el grado morfológico, mayor es la desviación del nivel de metilación del ADN de los embriones AA. Dado que la tasa de natalidad de los embriones de grado AA es la más alta y los niveles de metilación del ADN de los embriones AA son bastante similares, se considera que el patrón de metilación del ADN de los embriones de grado AA es el más correcto y se puede usar para guiar la embriogénesis temprana normal.
Ejemplo 2. La reprogramación de mutilación anormal afectó las vías de señalización que regulan el desarrollo embrionario temprano
Se realizó un análisis de la función génica de regiones que muestran diferentes estados de metilación en embriones de alto grado y embriones de bajo grado (ontología genética).
El análisis encontró que los genes con promotores ubicados en regiones metiladas diferencialmente (DMR) estaban enriquecidos en muchas vías relacionadas con el desarrollo embrionario, incluido el ciclo celular, el metabolismo del ADN, la modificación del ADN, la ubicación de cromosomas, el procesamiento del ARN, la reparación del ADN y similares. (Figura 5). Los genes con DMR intergénicas participaron principalmente en el desarrollo de tejidos específicos, tales como el desarrollo de neuronas, la diferenciación neuronal y la determinación del destino celular, la estructura de la médula espinal y el estado de equilibrio del ARNm (Figura 5).
Los resultados también mostraron que las metilaciones en potenciadores a menudo se reprogramaron falsamente en embriones de grado CC (grado más bajo). Los genes con DMR ubicados dentro de los potenciadores se enriquecieron en vías de desarrollo y relacionadas con el metabolismo. La figura 6 muestra el estado de metilación del potenciador del gen IDH2 y las regiones flanqueadas en diferentes embriones. Los embriones de grado AA mostraron un estado de hipometilación en esta región, mientras que los embriones de grado CC mostraron un estado de hipermetilación en esta región. La hipermetilación de la región potenciadora provocó una disminución significativa en la expresión del gen IDH2.
Ejemplo 3. Relación entre el nivel de metilación del ADN de los blastocistos antes de la implantación y la tasa de natalidad después de la ART
En este ejemplo, el nivel promedio de metilación del ADN de los blastocistos de grado AA fue de 0.3 ± 0.02 se usó como estándar, es decir, un estándar cuantitativo para la detección no invasiva de blastocistos antes de la implantación clínica. Este estándar, que se basa en un examen morfológico, es un nuevo indicador clínico para el cribado preciso de blastocistos bien desarrollados. Para validar aún más la precisión de este indicador, se recolectaron seis blastocistos de grado B* para su análisis (Figura 2). Los resultados muestran que tres de ellos tenían un nivel de metilación del ADN que era significativamente diferente del estándar, que era el nivel promedio de metilación del ADN de los blastocistos de grado AA de 0.3. La figura 1 muestra que el nivel de metilación del ADN de uno de cada cinco embriones de grado AA fue divergente del estándar, mientras que seis de los siete embriones C* divergieron del estándar. La tasa de blastocistos que cumplen con el estándar en embriones de grado AA, B* y C* fue del 80 %, 50 % y 14 %, respectivamente (Figura 7). Los resultados de la figura 7 muestran que la proporción de blastocistos con un nivel de metilación del ADN que cumple con el estándar en embriones en diferentes grados se correlacionó positivamente con la tasa de natalidad clínica de embriones en el grado correspondiente.
Los resultados del presente ejemplo demuestran que el perfil de metilación del ADN genómico es crítico durante el desarrollo embrionario, y los blastocistos con un nivel de metilación del ADN cercano o igual al estándar son candidatos ideales para el trasplante de embriones.
Ejemplo 4. Examen epigenético previo a la implantación logrado por algunas de las células TE sometidas a biopsia de blastocisto mediante técnicas de micromanipulación
Clínicamente, la tecnología de diagnóstico genético de preimplantación (PGD) se ha usado durante más de 20 años, que usa biopsia para eliminar algunas células de blastocistos para el diagnóstico de enfermedades tales como mutaciones genéticas y anomalías cromosómicas. En el presente ejemplo, se sometieron a biopsia algunas células de las células del trofectodermo de cada blastocisto que se va a analizar, y se construyó la biblioteca de metilación de células TE de diferentes blastocistos usando el método de biblioteca de metilación de genoma completo de células traza "un tubo" como se describe en el ejemplo 1 respectivamente, mientras que las células restantes de los diferentes blastocistos se usaron para construir bibliotecas de metilación paralelas. Luego, se realizó la secuenciación por metilación del genoma completo usando la plataforma de secuenciación Hiseq. La figura 8 muestra que el nivel de metilación del ADN de algunas de las células TE sometidas a biopsia no invasiva era similar al nivel de metilación del ADN del embrión completo, por lo que el perfil de metilación de las células TE puede representar el perfil de metilación de un embrión completo. Por lo tanto, este método de detección no invasivo mediante biopsia se puede usar para el cribado de blastocistos con mejor perfil de metilación del ADN antes del trasplante de embriones.
Ejemplo 5: detección de aneuploidía cromosómica de embriones
En la actualidad, PGD/PGS es un método comúnmente usado en todo el mundo que puede determinar si los embriones tienen anomalías cromosómicas analizando la secuencia de ADN y la estructura cromosómica de los embriones. Los resultados de la secuenciación por metilación del ADN del genoma completo de la presente invención también se pueden usar para evaluar la ploidía cromosómica y el algoritmo de anomalía cromosómica realiza un examen en base a la profundidad de secuenciación de los fragmentos cromosómicos. Para los datos de secuenciación por metilación del genoma completo de blastocisto después de la alineación, la profundidad de secuenciación se calculó en unidades de 1 Mb, después de eliminar factores tales como el contenido de GC y la preferencia de alineación. A continuación, los cromosomas se segmentaron según la similitud entre la profundidad de secuenciación mediante el modelo de cadena de Markov oculta (HMM). La profundidad de secuenciación extremadamente alta o baja de una región indica la duplicación o deleción de cromosomas en este segmento. Los resultados de la tabla 2 demuestran que 17 de los 36 embriones tenían anomalías cromosómicas y que esos embriones no eran apropiados para la implantación. Tomando la muestra s-25, por ejemplo, se encontró una copia extra de un fragmento del cromosoma 5 y la falta de una copia de un fragmento del cromosoma 9 (Figura 9).
Por lo tanto, el método PEGE de la presente invención no solo puede determinar la presencia de aneuploidía cromosómica que también se puede hacer mediante PGS, sino también cribar embriones con mejor estado epigenético al mismo tiempo, y de este modo el método es obviamente mejor que el método PGS existente. Por lo tanto, se puede esperar que el método PEGE sea un método de cribado previo a la implantación más convencional, básico y preciso para embriones. El método PEGE de la presente invención puede detectar anomalías cromosómicas al mismo tiempo, y se encuentra que los cromosomas de 17 embriones tienen anomalías cromosómicas y estos embriones no se pueden usar para el trasplante de embriones en absoluto.
Tabla 2 Detección de ploidía cromosómica de 17 embriones mediante el método de la presente invención
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Aunque la invención se describe en detalle en la descripción general y las realizaciones específicas anteriores, es obvio para un experto en la técnica que se pueden realizar algunas modificaciones o mejoras en base a la presente invención. Por lo tanto, todas estas modificaciones o mejoras realizadas sobre la base de la presente invención sin apartarse del espíritu de la presente invención caen dentro del alcance de protección reivindicado en la presente invención.
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporciona un método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado. Se detecta un perfil de metilación del ADN de algunas células de trofectodermo en blastocisto, el nivel promedio de metilación del ADN y el patrón de metilación del ADN de embriones con una buena morfología en el procedimiento de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner se usan como estándar para el cribado de un blastocisto bien desarrollado y cuanto más se acerque el nivel de metilación del ADN de las células del trofectodermo del blastocisto que se va a analizar al nivel de metilación del ADN o al estado de los embriones buenos, mejor será el desarrollo del embrión y mayor será la idoneidad para implantarse en un sujeto materno. Adicionalmente, los resultados de la secuenciación por metilación se pueden analizar para determinar si un cromosoma es anormal, a fin de eliminar directamente los embriones cromosómicos anormales. El método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado proporcionado por la presente invención puede ayudar a los médicos a seleccionar blastocistos con ploidía cromosómica normal y un mejor estado epigenético para el trasplante de embriones, y puede mejorar en gran medida la precisión de la ART, reducir la tasa de abortos espontáneos, mejorar la calidad del embarazo y aumentar la tasa de natalidad del "bebé probeta". El método tiene un alto valor económico y una buena perspectiva de aplicación.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método de detección no invasivo para el cribado de un blastocisto bien desarrollado, caracterizado porque, el genoma de las células del trofectodermo del blastocisto que se va a detectar se somete a detección por metilación; el nivel promedio de metilación del ADN de los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se usa como estándar; y un blastocisto que se va a detectar está bien desarrollado cuando su nivel de metilación del ADN es cercano o igual al estándar, en el que los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner se refieren a blastocistos de grados AA, AB, BA y BB.
2. El método de detección no invasivo según la reivindicación 1, caracterizado porque, incluye además el uso del patrón de metilación del ADN de embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocitos de Gardner como estándar.
3. El método de detección no invasivo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque, además incluye determinar si el número de copias de cada cromosoma del blastocisto es normal según los resultados de la secuenciación por metilación, y los cromosomas del blastocisto que van a ser analizados son normales cuando los cromosomas son cromosomas diploides estándar.
4. Uso del método de detección no invasivo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para aumentar la tasa de embarazo.
5. Un método de aumento de la tasa de natalidad de bebés probeta, caracterizado porque, un blastocisto que tiene un nivel de metilación del ADN de las células del trofectodermo cercano o igual al nivel de metilación del ADN y/o al patrón de metilación del ADN de los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner se selecciona para el trasplante, y en el que los embriones identificados por tener una buena morfología en el sistema de clasificación morfológica de blastocistos de Gardner se refieren a blastocistos de los grados AA, AB, BA y BB.
6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque, incluye además el cribado de blastocistos siendo todos los cromosomas, cromosomas diploides estándar según los resultados de secuenciación por metilación de las células del trofectodermo.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107419029A (zh) * 2017-09-18 2017-12-01 北京积水潭医院 一种筛选优质囊胚的试剂盒
CN109943628A (zh) * 2018-12-11 2019-06-28 北京中科遗传与生殖医学研究院有限责任公司 利用DedscRRBS分析法对活检细胞进行PGS及甲基化分析的方法
CN112582022B (zh) * 2020-07-21 2021-11-23 序康医疗科技（苏州）有限公司 用于无创胚胎移植优先级评级的系统和方法
CN112574944A (zh) * 2020-12-14 2021-03-30 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院） 基于体外诱导eps发育形成类囊胚结构的方法
CN114480629B (zh) * 2022-04-15 2023-02-07 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种同时实现囊胚非整倍体检测和高着床潜能筛选的方法
CN115612723B (zh) * 2022-09-26 2023-07-14 广州女娲生命科技有限公司 植入前胚胎的筛选方法
CN115910211B (zh) * 2022-12-15 2024-03-22 广州女娲生命科技有限公司 胚胎植入前dna分析检测方法及装置

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX342210B (es) * 2010-07-13 2016-09-20 Univfy Inc * Metodo para evaluar el riesgo de nacimientos multiples en tratamientos de infertilidad.

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