BR112012003847B1 - método para selecionar um ou mais embriões humanos que provavelmente alcançarão o estágio de blastocisto - Google Patents

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Abstract

IMAGEAMENTO E AVALIAÇÃO DE EMBRIÕES, OÓCITOS E CÉLULAS TRONCO São fornecidos métodos, composições e kits para determinar o potencial de desenvolvimento de um ou mais embriões ou células pluripotentes e/ou a presença de anomalias cromossômicas em um ou mais embriões ou células pluripotentes. Estes métodos, composições e kits encontram uso na identificação de embriões e oócitos in vitro que são úteis em tratamento de infertilidade em seres humanos.

Description

REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisorio de Patente US 61/332.651, depositado em 7 de maio de 2010 e Pedido Provisorio de Patente US 61/236.085, depositado em 22 de agosto de 2009, ambos dos quais estao incorporados como referenda em suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] Esta invencao refere-se ao campo de testes biologicos e clmicos, e particularmente, imageamento e avaliacao de zigotos/embrioes, oocitos e celulas tronco tanto de humanos quanto de animais.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
[0003] A infertilidade e um problema comum de saude que afeta 10 a 15% de casais em idade fertil. Somente nos Estados Unidos no ano de 2006, aproximadamente 140.000 ciclos de fertilizagao in vitro (IVF) foram realizados (cdc.gov/art). Isto resultou na cultura de mais de um milhao de embrioes anualmente com potencial para implantagao e desenvolvimento a termo variavel e geralmente mal definido. A taxa de nascidos vivos, por ciclo, apos IVF foi apenas 29%, enquanto em media 30% dos nascidos vivos resultaram em multiplas gestagoes (cdc.gov/art). Multiplas gestagoes tem resultados adversos bem documentados para as maes e fetos como aborto espontaneo, nascimento pre-maturo e baixa taxa de natalidade. As causas potenciais de falha de IVF sao diversas; no entanto, desde a introdugao de IVF em 1978, um dos principais desafios tem sido identificar os embrioes que sao mais apropriados e os mais provaveis em resultar em gravidez a termo.
[0004] O entendimento na tecnica de desenvolvimento basico de embriao e limitado uma vez que estudos na biologia embrionaria humana permanecem como desafio e geralmente isentos de financiamento de pesquisa. Consequentemente, a maior parte do conhecimento atual do desenvolvimento embrionario deriva de estudos de organismos modelos. No entanto, enquanto os embrioes de diferentes especies passam por estagios semelhantes de desenvolvimento, o tempo varia por especie. Estas diferengas, e muitas outras podem tornar isto inadequado para diretamente extrapolar de uma especie para outra. (Taft, R.E. (2008) Theriogenology 69(1):10-16). As vias gerais de desenvolvimento humano, bem como os determinantes moleculares fundamentais subjacentes, sao unicas para o desenvolvimento embrionario humano. Por exemplo, em camundongos, a transcrigao embrionaria e ativada aproximadamente 12 horas apos a fertilizagao, concorrente com a primeira clivagem de divisao, enquanto em humanos a ativagao de gene embrionario (EGA) ocorre no dia 3, proximo ao estagio de 8 celulas (Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Braude, P., et al. (1988) Nature 332:459-461; Hamatani, T. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:10326-10331; Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14):1461-1470). Alem disso, os genes que sao modulados no desenvolvimento humano precoce sao unicos (Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14):1461- 1470).Alem disso, em outras especies como os camundongos, mais de 85% dos embrioes cultivados alcangam o estagio de blastocisto, um dos principais marcos no desenvolvimento de mamiferos, enquanto os embrioes cultivados tem uma media de formagao de blastocisto de aproximadamente 30 a 50%, com uma alta incidencia de mosaicismo e fenotipos anomalo, como impedimento de fragmentagao e desenvolvimento (Rienzi, L. et al. (2005) Reprod. Biomed. Online 10: 669-681; Alikani, M., et al. (2005) Mol. Hum. Reprod. 11:335-344; Keltz, M. D., et al. (2006) Fertil. Steril. 86:321-324; French, D. B., et al. (2009) Fertil. Steril.).Apesar destas diferengas, a maior parte dos estudos de desenvolvimento de embriao pre-implantagao se originam de organismos modelos e sao dificeis de se relacionarem ao desenvolvimento de embrioes humanos (Zernicka-Goetz, M. (2002) Development 129:815-829; Wang, Q., et al. (2004) Dev Cell. 6:133-144; Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691701; Zernicka-Goetz, M. (2006) Curr. Opin. Genet. Dev. 16:406-412; Mtango, N. R., et al. (2008) Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 268:223-290).
[0005] Tradicionalmente nas clmicas de IVF, a viabilidade de embrioes humanos tem sido avaliada por observagoes morfologicas simples como a presenga de blastomeros mononucleados de tamanho uniforme e o grau de fragmentagao celular (Rijinders PM, Jansen CAM. (1998) Hum Reprod 13:2869-73; Milki AA, et al. (2002) Fertil Steril 77:1191-5). Mais recentemente, metodos adicionais como cultura estendida de embrioes (para o estagio de blastocisto no dia 5) e analise de estado cromossomico atraves de diagnostico de pre-implantagao (PGD) tambem foram usados para avaliar a qualidade dos embrioes (Milki A, et al. (2000) Fertil Steril 73:126-9; Fragouli E, (2009) Fertil Steril Jun 21 [EPub ahead of print]; El-Toukhy T, et al. (2009) Hum Reprod 6:20; Vanneste E, et al. (2009) Nat Med 15:577-83). No entanto, os riscos potenciais destes metodos tambem existem pois eles prolongam o periodo de cultura e interrompem a integridade embrionaria (Manipalviratn S, et al. (2009) Fertil Steril 91:305-15; Mastenbroek S, et al. (2007) N Engl J Med. 357:9-17).
[0006] Recentemente foi demonstrado que o imageamento de lapso de tempo pode ser uma ferramenta util para observar o desenvolvimento embrionario precoce. Alguns metodos usaram imageamento de lapso de tempo para monitorar o desenvolvimento de embrioes humanos apos a injegao de esperma intracitoplasmico (ICSI) (Nagy et al. (1994) Human Reproduction. 9(9):1743-1748; Payne et al. (1997) Human Reproduction. 12:532- 541). A extrusao do corpo polar e a formagao pro-nuclear foram analisados e correlacionados com a boa morfologia no dia 3. No entanto, nenhum parametro estava correlacionado com a formagao de blastocisto em resultados de gravidezes. Outros metodos observaram no imcio da primeira clivagem como um indicador para prever a viabilidade de embrioes humanos (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction, 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652-2657). No entanto, estes metodos nao reconhecem a importancia da duragao da citocinese em intervalos de entre as divisoes precoces.
[0007] Outros metodos usaram o imageamento de lapso de tempo para medir o tempo e a extensao de divisoes celulares durante o desenvolvimento precoce de embrioes (WO/2007/144001). No entanto, estes metodos revelam somente um metodo basico e geral para imageamento de lapso de tempo de embrioes bovinos, que sao substancialmente diferentes de embrioes humanos em termos de potencial de desenvolvimento, comportamento morfologico, programas moleculares e epigeneticos, e tempo e parametros ao redor que cercam a transferencia. Por exemplo, os embrioes bovinos levam substancialmente mais tempo para implantar comparado aos embrioes humanos (30 dias e 9 dias, respectivamente). (Taft, (2008) Theriogenology 69(1):10-16. Alem disso, nenhum parametro especii’ico de imageamento ou intervalos de tempo sao revelados que podem prever a viabilidade de embrioes humanos.
[0008] Mais recentemente, o imageamento de lapso de tempo tem sido usado para observar o desenvolvimento de embrioes humanos durante as primeiras 24 horas apos a fertilizagao (Lemmen et al. (2008) Reproductive BioMedicine Online 17(3):385- 391). A sincronia dos nucleos apos a primeira divisao demonstrou estar correlacionada com os resultados das gravidezes. No entanto, este trabalho concluiu que a primeira clivagem precoce nao foi um parametro de previsao importante, o que contradiz os estudos anteriores (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652-2657).
[0009] Finalmente, nenhum estudo validou os parametros de imageamento atraves da correlagao com os programas moleculares ou composigao cromossomica dos embrioes. Os metodos de avaligao de embriao humano sao, portanto, deficientes em varios aspectos e podem ser melhorados pelos presentes metodos, o que envolve novas aplicagoes de microscopia de lapso de tempo, analise por imagem, e correlagao dos parametros de imageamento com os perfis moleculares e composigao cromossomica. A presente invengao direciona estas questoes.
SUMARIO DA INVENCAO
[0010] Metodos, composigoes e kits para determinar o potencial de desenvolvimento de um ou mais embrioes ou celulas pluripotentes em um ou mais embrioes ou celulas pluripotentes sao fornecidos. Estes metodos, composigoes e kits encontram uso na identificagao de embrioes e oocitos in vitro que tem um bom potencial de desenvolvimento, ou seja, a capacidade de se desenvolverem em um blastocisto, que sao, portanto, uteis em metodos de tratamento de infertilidade em seres humanos kits e semelhantes.
[0011] Em alguns aspectos da invengao, os metodos sao fornecidos para determinar o potencial de desenvolvimento de um embriao ou uma celula pluripotente. Em tais aspectos, um ou mais parametros celulares de um embriao ou celula pluripotente sao medidos para chegar a uma medigao de parametro de celula. O parametro de celula e entao empregado para fornecer uma determinagao do potencial do embriao ou celula pluripotente, cuja determinagao pode ser usada para guiar um curso clmico de agao. Em algumas modalidades, o parametro de celula e um evento morfologico que e mensuravel pela microscopia de lapso de tempo. Em algumas modalidades, por exemplo, quando um embriao e avaliado, os um ou mais parametros celulares sao: duragao de um evento da citocinese, por exemplo, citocinese 1; intervalo de tempo entre citocinese 1 e citocinese 2; e intervalo de tempo entre citocinese 2 e citocinese 3. Em certas modalidades, a duracao do ciclo celular e tambem utilizada como um parametro de celula. Em algumas modalidades, a medicao do parametro de celula e empregado comparando-o a uma medicao de parametro de celula comparavel de um embriao de referenda, e usando o resultado desta comparacao para fornecer uma determinacao do potencial de desenvolvimento potencial do embriao. Em algumas modalidades, o embriao e um embriao humano. Em algumas modalidades, o parametro de celula e um mvel de expressao de gene que e medido para chegar a uma medida de expressao de gene. Em algumas modalidades, a medida de expressao de gene e empregada pela comparacao deste a uma medida de expressao de gene de uma celula pluripotente ou embriao de referencia ou uma ou mais celulas destas, onde o resultado desta comparacao e empregado para fornecer uma determinacao de cada potencial de desenvolvimento da celula pluripotente ou embriao. Em algumas modalidades, o embriao e um embriao humano.
[0012] Em alguns aspectos da invencao, metodos sao fornecidos para classificar embrioes ou celulas pluripotentes para seus potenciais de desenvolvimento em relagao aos outros embrioes ou celulas pluripotentes no grupo. Em ditas modalidades, um ou mais parametros celulares dos embrioes ou celulas pluripotentes no grupo sao medidos para chegar a uma medicao de parametro de celula para cada um dos embrioes ou celulas pluripotentes. As medicoes de parametro de celula sao entao empregados para determinar o potencial de desenvolvimento de cada um dos embrioes ou celulas pluripotentes no grupo em relagao ao outro, cuja determinagao pode ser usada para guiar um curso clmico de agao. Em algumas modalidades, o parametro de celula e um evento morfologico que e mensuravel por microscopia de lapso de tempo. Em algumas modalidades, por exemplo, quando os embrioes sao classificados, o um ou mais parametros de celula sao a duragao de um evento da citocinese, por exemplo, citocinese 1; intervalo de tempo entre citocinese 1 e citocinese 2; e intervalo de tempo entre citocinese 2 e citocinese 3. Em certas modalidades, a duragao do ciclo celular 1 e tambem medida. Em algumas modalidades, o parametro de celula e o mvel de expressao de um ou mais genes. Em algumas modalidades, uma ou mais medigoes de parametro de celula sao empregados peal comparagao das medigoes de parametro de celula de cada um dos embrioes ou celulas pluripotentes no grupo a outro para determinar o potencial de desenvolvimento de embrioes ou celulas pluripotentes em relagao a outro. Em algumas modalidades, as uma ou mais medigoes de parametro de celula sao empregados por comparagao de cada medigao de parametro de celula a uma medigao de parametro de celula de um embriao ou celula pluripotente de referenda para determinar o potencial de desenvolvimento para cada embriao ou celula pluripotente, e comprar os potenciais de desenvolvimento para determinar o potencial de desenvolvimento dos embrioes ou celulas pluripotentes em relagao a outra.
[0013] Em alguns aspectos da invengao, os metodos sao fornecidos para fornecer embrioes com bom potencial de desenvolvimento para transferencia para uma mulher para reprodugao assistida (IVF). Em ditos aspectos, um ou mais embrioes sao cultivados sob condigoes suficientes para desenvolvimento de embriao. Um ou mais parametros de celula sao entao medidos em um ou mais embrioes para chegar a uma medigao de parametro de celula. A medigao do parametro de celula e entao empregada para fornecer uma determinagao do potencial de desenvolvimento de um ou mais embrioes. O um ou mais embrioes que demonstram bom potencial de desenvolvimento sao, entao, transferidos para uma mulher.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] A invengao e mais bem entendida a partir da seguinte descrigao detalhada quando lida em conjunto com os desenhos que acompanham. E enfatizado que, de acordo com a pratica comum, as varias caracteristicas dos desenhos nao estao escalonadas. Pelo contrario, as dimensoes das varias caracteristicas sao arbitrariamente expandidas ou reduzidas para clareza. Inclwdos nos desenhos estao as seguintes figuras.
[0015] A Figura 1 e um fluxograma que apresenta os processos usados para avaliar embrioes.
[0016] A Figura 2 e uma serie de fotografias que mostram a clivagem e divisao celular pelo periodo de 6 dias. As imagens sao marcadas do dia 1 ao dia 6. As barras em escala representam 50 gm.
[0017] A Figura 3 e um grafico de barra que mostra percentuais de desenvolvimento bem sucedido em blastocistos de embrioes de 1 celula (zigotos). Pelo curso de 4 experimentos separados, um total de 100 embrioes foram observados ate o Daia 5 a 6 atraves de microscopia de lapso de tempo. O percentual de celulas que alcanna cada estagio indicado (blastocisto, 8 celulas, 4 a 7 celulas, 2 a 3 celulas e 1 celula) e mostrado.
[0018] A Figura 4 e uma serie de tres diferentes embrioes sendo desenvolvidos para os tempos indicados (linhas superior, media e inferior).
[0019] A Figura 5 e um diagrama mostrando os lapsos de tempo entre os estagios usados para as avaliagoes atuais, incluindo a duragao da primeira citocinese, tempo entre a primeira e a segunda divisao (medido como o intervalo de tempo entre a resolugao da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2), e tempo entre a 2a e 3a mitose (medido como o intervalo de tempo entre o imcio da citocinese 2 e o imcio da citocinese 3).
[0020] A Figura 6 e um grafico de pontos em 3-D mostrando a medigao de tres eventos, incluindo a duragao da primeira citocinese, o intervalo de tempo entre a primeira e segunda divisoes celulares (medida como o intervalo de tempo entre a resolugao da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2), e o intervalo de tempo entre a segunda e terceira divisoes celulares (medido como o intervalo de tempo entre o imcio da citocinese 2 e o imcio da citocinese 3), para um grupo grande de embrioes. Os embrioes que alcangam o estagio de blastocisto (marcado com circulos) sao mostrados por se juntarem no grafico 3-D, enquanto os embrioes que prendem (marcados com X) antes de alcangar o blastocisto sao espalhados por todo o grafico.
[0021] A Figura 7 e um grafico que mostra uma curva caracteristica de operagao do receptor (ROC) para prever a formagao de blastocisto usando os 3 parametros morfologicos dinamicos.
[0022] A Figura 8 e um grafico radar de mveis de expressao de 52 genes de 6 embrioes presos de 1 a 2 celulas e 5 embrioes normais de 1 a 2 celulas. A diferenga nos mveis de expressao entre os embrioes normais e anormais foi estatisticamente significativa para aqueles genes destacados em amarelo e denotados com um asterisco, conforme determinado pelo teste de Mann-Whitney.
[0023] A Figura 9 e um grafico em barras que mostra os mveis de expressao de diferentes genes em embrioes de 2 celulas presos e embrioes normais de 2 celulas. Um numero selecionado de imagens de lapso de tempo para os embrioes de 2 celulas presos sao mostrados na parte superior.
[0024] A Figura 10 e um grafico em barras que mostra os mesmos genes apresentados na Fig. 9, em um embriao preso de 4 celulas e embrioes normais de 4 celulas. Um numero selecionado de imagens de lapso de tempo para os embrioes de 4 celulas presos sao mostrados na parte superior.
[0025] A Figura 11 e uma serie de graficos de barra que mostram padroes de expressao de gene (ESSP) contendo 4 padroes distintos. Sao indicadas as vezes de transferencia precoce antes da ativagao do gene embrionario (dia 2) e expressao tipica no dia 3.
[0026] A Figura 12 mostra expressao genica de genes de blastomeros simples em diferentes estagios. (A) Expressao genica de dois genes, CTNNB1 e CDX2 de blastomeros simples plotados em estagios de celulas diferentes e mostra as alteragoes nestes mveis de expressao genica em diferentes estagios, por exemplo, 2 celulas, 3 celulas, morula e blastocisto. (B) Assinaturas de expressao genica em barras que representam os genes expressos no programa maternal como comparado aos genes expressos do programa zigotico.
[0027] A Figura 13 e um desenho de um modelo para uso em analise de imagem de lapso de tempo e analise molecular correlacionado para avaliar a viabilidade de embriao.
[0028] A Figura 14 e uma serie de fotografias que mostram tres estagios de desenvolvimento durante a maturagao in vitro de oocito.
[0029] A Figura 15 e uma serie de fotografias que mostra o processo de desenvolvimento do embriao apos maturagao in vitro do oocito.
[0030] A Figura 16 e um fluxograma que mostra processos usados para avaliar oocitos.
[0031] A Figura 17 e um fluxograma que mostra processos usados para avaliar celulas tronco e celulas tronco pluripotentes.
[0032] A Figura 18 e uma serie de fotografias que mostra o processo de celulas tronco pluripotentes induzidas que se diferenciam em rosetas de neuronios.
[0033] A Figura 19 e uma tabela de categorias nas quais os genes avaliados para o nrvel de expressao podem ser categorizados, incluindo o numero de genes por categoria. A Figura 20 e uma tabela dos quatro Padroes Espedficos de Estagio Embrionario (ESSPs) que foram identificados durante a analise de expressao genica de 141 embrioes simples e blastomeros simples normalmente desenvolvidos, e a categorizagao dos genes em cada uma destas categorias.
[0034] A Figura 21 mostra a analise de imagem automatizada demonstrando a capacidade de parametros de imageamento para prever a formagao de blastocisto. (A) Mostra os resultados de algoritmo de rastreamento para um unico embriao. (B) Mostra um conjunto de 14 embrioes que foram analisados. (C) Mostra a comparagao de analise da imagem manual para analise automatizada para a duragao da citocinese. (D) Mostra a comparagao de analise de imagem manual para analise automatizada para o tempo entre primeira e segunda mitoses. (E) Mostra a comparagao de boa morfologia de blastocisto para morfologia ruim de blastocisto.
[0035] A Figura 22 e um desenho esquematico de um microscopio de campo escuro de acordo com a presente invengao; a insergao a esquerda mostra um campo escuro usinado a laser de ajuste de fragmento.
[0036] A Figura 23 e uma fotografia de um arranjo de tres microscopios conforme ilustrado na Fig. 22, montado em um suporte para a instalagao em uma incubadora e para conexoes a computador. A Fig. 23A mostra os microscopios, e Fig.23B mostra os microscopios dentro de uma incubadora.
[0037] A Figura 24 e uma tela de software de captura de imagem usada no presente trabalho, que mostra embrioes sendo refletidos de 3 canais.
[0038] A Figura 25 A a D e uma serie de quatro fotografias que mostra imagem selecionada de lapso de tempo do experimento 2, estagao 2. Figs. 25A e 25B sao imagens capturadas antes da troca de meio, e as Figs. 25C e 25D sao imagens capturadas apos a troca de meio.
[0039] A Figura 26 A a D e uma serie de quatro fotografias que mostra imagem selecionada de lapso de tempo do experimento 1, estagao 2. Figs. 26A e 26B sao imagens capturadas antes da troca de meio, e as Figs. 26C e 26D sao imagens capturadas apos a troca de meio.
[0040] As Figuras 27 A e B sao desenhos de uma placa de petri personalizada em micropogos. A Fig. 27A mostra um desenho da placa com dimensoes, e Fig. 27B mostra uma vista 3D dos micropogos.
[0041] As Figura 28 A e B sao graficos que mostra a atividade celular com e sem registro de imagem anterior. As Figs. 28A e 28B juntas mostram que o registro limpa o resultado e remove picos devido ao alteragao ou rotagao do embriao.
[0042] As Figura 29 A e B mostra graficos (esquerda) e fotografias de celulas (direita) mostrando a atividade celular de embrioes normais e anormais. Juntas, as Fig. 29A e Fig. 29B mostram que, no dia 3, os embrioes tem morfologia semelhante, mas seus plots de atividades celulares sao drasticamente diferentes e somente um deles se desenvolve em um blastocisto.
[0043] A Figura 30 e um grafico que mostra a diferenga nas intensidades de pixel entre pares sucessivos de imagens durante o desenvolvimento do embriao. Isto pode ser usado por si so para avaliar a viabilidade de embriao, ou como uma forma de melhorar outros algoritmos, como um filtro de particula, ao determinar quantas particulas (prever os modelos de embriao) devem ser usados.
[0044] A Figura 31 A-G e uma serie de sete fotografias que mostra os resultados de rastreamento 2D em varios estagios celulares. O progresso celular, conforme indicado pelos numeros no quadro associados com cada par de figuras: Quadro 15 (Fig. 31A), 45 (B), 48 (C), 189 (D), 190 (E), 196 (F) e 234 (G) . A linha inferior mostra as imagens simuladas sobrepostas. Os contornos sao membranas celulares visiveis, e as linhas brancas pontilhadas sao membranas oclwdas. Os quadros de imagens sao capturados a cada 5 minutos, e somente alguns sao apresentados.
[0045] As Figura 32 A e B sao uma serie de fotografias e desenhos que mostram dois casos bem sucedidos de rastreamento celular 3D. As ilustragoes sob cada foto de um embriao mostram a vista de cima para baixo do modelo 3D, exceto o quadro 314 e quadro 228, que mostram vistas laterais dos modelos no quadro 314 e quadro 228, respectivamente. Os quadros de imagens foram capturados a cada 5 minutos.
[0046] A Figura 33 e uma representagao diagramatica de filtro de particula para uma divisao de 1 celula a 2 celulas. Os pontos de dados sao os locais 3D dos centros celulares. Os pontos sao mostrados para modelos de 1 celula, modelos de 2 celulas, modelos de 3 celulas, e modelos de 4 celulas. A linha superior mostra as partfculas apos a previsao, e a linha inferior mostra as partfculas apos reamostragem.
[0047] As Figuras 34 A e B sao graficos que mostram uma comparagao de analise de imagem automatizada vs. manual de um conjunto de embrioes. A Fig. 34A mostra a comparagao para duragao da primeira citocinese, e a Fig. 34B mostra a comparagao para o tempo entre 1a e 2a mitose.
[0048] A Figura 35 e um fluxograma mostrando como a analise de imagem e usada para embrioes modelos e medir certos parametros morfologicos.
DESCRICAO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0049] Antes de os presentes metodos e composigoes serem descritos, deve ser entendido que esta invengao nao e limitada ao metodo ou composigao particulares descritos, pois esses podem, claro, variar. Deve ser entendido tambem que a terminologia usada aqui e para fins de descrever modalidades particulares somente e nao tem a intengao de ser limitante, uma vez que o escopo da presente invengao sera limitado somente pelas reivindicagoes anexadas.
[0050] Quando uma faixa de valores e fornecida, deve ser entendido que cada valor inteiro do intervalo, ao decimo da unidade dos limites inferiores salvo se o contexto claramente indicar, entre os limites superior e inferior da faixa e tambem especificamente revelado. Cada faixa menor entre qualquer valor declarado ou valor intermediario em uma faixa estabelecida e qualquer outro valor declarado ou intermediario naquela faixa declarada e inclwdo dentro da invengao. Os limites superiores e inferiores destas faixas menores podem independentemente ser inclwdos ou exclwdos na faixa, e cada valor onde um deles, nenhum ou ambos os limites estao inclwdos nas faixas menores sao tambem inclwdos dentro da invengao, sujeito a qualquer limite especificamente exclwdo no valor declarado. Onde a faixa declarada inclui um ou ambos os limites, as faixas excluindo um ou ambos aqueles limites inclwdo estao tambem inclwdos na invengao.
[0051] Salvo se definido de outra forma, todos os termos tecnicos e cientfficos aqui usados tem o mesmo significado que comumente entendidos pelos especialistas na tecnica ao qual esta invengao pertence. Embora qualquer metodo e material semelhante ou equivalente aos descritos aqui possam ser usados na pratica ou testagem da presente invengao, alguns metodos e materiais potenciais e preferenciais sao agora descritos. Todas as publicagoes mencionadas estao incorporadas aqui como referenda para revelar e descrever os metodos e/ou materiais em relagao com os quais as publicagoes sao citadas. Deve ser entendido que a presente revelagao suplanta qualquer revelagao de uma publicagao incorporada a extensao em que ha uma contradigao.
[0052] Deve ser notado que conforme usado aqui e nas reivindicagoes anexadas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o/a” incluem os referentes plurais salvo se o contexto claramente definir o contrario. Assim, por exemplo, a referenda a “uma celula” inclui uma pluralidade de ditas celulas e a referenda a “o peptideo” inclui referenda a um ou mais peptideos e equivalentes dos mesmos, por exemplo, polipeptideos, conhecidos aos especialistas na tecnica e assim por diante.
[0053] As publicagoes discutidas aqui sao fornecidas unicamente para suas revelagoes antes da data de deposito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissao de que a presente invengao nao e intitulada para antecipar dita publicagao em virtude de invengao anterior. Ainda, as datas de publicagao podem ser diferentes das datas de publicagoes reais que podem precisar ser independentemente confirmadas.
DEFINICOES
[0054] Metodos, composigoes e kits para determinar o potencial de desenvolvimento de um ou mais embrioes ou celulas pluripotentes e/ou a presenga de anormalidades cromossomicas em um ou mais embrioes ou celulas pluripotentes sao fornecidos. Estes metodos, composigoes e kits encontram uso na identificagao de embrioes e oocitos in vitro que sao mais uteis no tratamento de infertilidade em humanos. Estes e outros objetos, vantagens, e caracteristicas da invengao ficarao aparentes aos especialistas na tecnica quando lerem os detalhes dos metodos e composigoes objeto conforme mais detalhadamente descrito abaixo.
[0055] Os termos “potencial de desenvolvimento” e “competencia de desenvolvimento” sao usados aqui para referir-se a capacidade ou habilidade de um embriao saudavel ou celula pluripotente de crescer ou se desenvolver.
[0056] O termo “embriao” e usado para referir-se a ambos o zigoto que e formado quando duas celulas gametas diploides, por exemplo, um oocito secundario nao fertilizado e uma celula de espermatozoide, se unem para formar uma celula totipotente diploide, por exemplo, um ovulo fecundado, e o embriao que resulta das divisoes celulares imediatamente subsequentes, ou seja, clivagem embrionaria, ate a morula, ou seja, estagio de 16 celulas e o estagio de blastocisto (como trofoectoderma diferenciado e massa celular interna).
[0057] O termo “celula pluripotente” e usado aqui para significar qualquer celula que tem a capacidade de se diferenciar em multiplos tipos de celulas em um organismo. Exemplos de celulas pluripotentes incluem celulas tronco, oocitos, e embrioes de 1 celula (ou seja, zigotos).
[0058] O termo “celula tronco” e usado aqui para referir-se a uma celula ou uma populagao de celulas que: (a) tem a capacidade de seu auto-renovar, e (b) tem o potencial de gerar diversos tipos celulares diferenciados. Frequentemente, uma celula tronco tem o potencial de originar multiplas linhagens de celulas. Conforme usado aqui, uma celula tronco pode ser uma celula tronco totipotente, por exemplo, um oocito fertilizado, que origina todos os tecidos embrionarios e extraembrionarios de um organismo; uma celula tronco pluripotente, por exemplo, uma celula tronco embrionaria (ES), celula germinativa embrionaria (EG), ou uma celula tronco pluripotente induzida (iPS), que gera todos os tecidos embrionarios de um organismo, ou seja, linhagens de endoderma, mesoderma, e ectoderma; uma celula tronco multipotente, por exemplo, uma celula tronco mesenquimal, que gera pelo menos dois dos tecidos embrionarios de um organismo, ou seja, pelo menos duas de linhagens de endoderma, mesoderma e ectoderma, ou este pode ser uma celula tronco especifica de tecido, que gera multiplos tipos de celulas diferenciadas de um tecido particular. Celulas tronco especifica de tecido incluem celulas embrionarias espedficas de tecido, que geram as celulas de um tecido particular, e celulas tronco somaticas, que residem em tecidos adultos e podem originar as celulas daquele tecido, por exemplo, celulas tronco neuronais, que geram todos as celulas do sistema nervoso central, celulas satelites, que geram musculo esqueletico, e celulas tronco hematopoieticas, que geram todas as celulas do sistema hematopoietico.
[0059] O termo “oocito” e usado aqui para referir-se a uma celula feminina nao fertilizada, ou agameta. Oocitos da aplicagao objeto podem ser oocitos primarios, em cujo caso podem estar posicionadas para passar ou estarem passando por meiose I, ou oocitos secundarios, em cujo caso estao posicionados para passar ou estarem passando por meiose II.
[0060] Por “meiose” entende-se os eventos de ciclo celular que resultam na produgao de gametas. No primeiro ciclo celular meiotico, ou meiose I, os cromossoma da celula sao duplicados e participados em duas celulas filhas. Estas celulas filhas entao se dividem em um segundo ciclo celular meiotico, ou meiose II, que nao e acompanhado de smtese de DNA, resultando em gametas com um numero haploide cromossomos.
[0061] Por estagio “vesfcula germinativa” entende-se o estagio de uma maturagao de oocito primario que se correlacioando com a profase I do ciclo celular de meiose I, ou antes da primeira divisao de material nuclear. Oocitos neste estagio sao tambem chamados de “oocitos de vesfcula germinativa”, para o nucleo caracteristicamente grande, chamado de vesfcula germinativa. Em um oocito humano normal cultivado in vitro, a vesfcula germinativa ocorre cerca de 6 a 24 horas apos o imcio da maturagao.
[0062] Pelo estagio de “metafase I” entende-se o estagio de uma maturagao de oocito primario que se correlacionado com a metafase I do ciclo celular de meiose I. Em comparagao aos oocitos de vesfcula germinativa, os oocitos de metafase I nao tem um nucleo grande claramente definido. Em um oocito humano normal cultivado in vitro, a metafase I ocorre cerca de 12 a 36 horas apos o imcio da maturagao.
[0063] Por estagio de “metafase II” entende-se o estagio de uma maturagao de oocito secundario que se correlaciona com a metafase II do ciclo celular de meiose II. A metafase II e distinguivel pela extrusao do primeiro corpo polar. Em um oocito humano normal cultivado in vitro, a metafase II ocorre cerca de 24 a 48 horas apos o imcio da maturagao.
[0064] Por um “ciclo celular mitotico”, entende-se os eventos em uma celula que resultam na duplicagao de cromossomos de uma celula e a divisao destes cromossomos e uma materia citoplasmatica em duas celulas filhas. O ciclo celular mitotico e dividido em duas fases: Interfase e mitose. Na interfase, a celula cresce e replica seu DNA. Na mitose, a celula inicia e completa a divisao celular, primeiro particionando seu material nuclear, e em seguida dividindo seu material citoplasmatica e seu material nuclear particionado (citocinese) em duas celulas separadas.
[0065] Por um “primeiro ciclo celular mitotico” ou “ciclo celular 1” entende-se o intervalo de tempo desde a fertilizagao ate a conclusao do evento de citocinese, ou seja, a divisao do oocito fertilizado em duas celulas filhas. Nos casos em que oocitos as fertilizados in vitro, o intervalo de tempo entre a injegao da gonatropina corionica humana (HCG) (geralmente administrada antes da recuperagao do oocito) ate a conclusao do primeiro evento de citocinese pode ser usado como um intervalo de tempo substituto.
[0066] Por um “segundo ciclo celular mitotico” ou “ciclo celular 2” entende-se o segundo evento de ciclo celular observado em um embriao, o intervalo de tempo entre a produgao das celulas filhas de um oocito fertilizado por mitose e a produgao de um primeiro conjunto de celulas netas de uma das celulas filhas (a “celula filha Hder”, ou celula filha A) por mitose. Na conclusao do ciclo celular 2, o embriao consiste de 3 celulas. Em outras palavras, o ciclo celular 2 pode ser visualmente identificado como o tempo entre o embriao contendo 2 celulas e o embriao contendo 3 celulas.
[0067] Por um “terceiro ciclo celular” ou “ciclo celular 3” entende-se o evento de terceiro ciclo celular observado em um embriao, tipicamente o intervalo de tempo da produgao de celulas filhas de um oocito fertilizado por mitose e a produgao de um segundo conjunto de celulas netas da segunda celula filha (a “celula filha atrasada” ou celula filha B) por mitose. Na conclusao do ciclo celular 3, o embriao consiste de 4 celulas. Em outras palavras, o ciclo celular 3 pode ser visualmente identificado como o tempo entre o embriao contendo 3 celulas e o embriao contendo 4 celulas.
[0068] Por “primeiro evento de clivagem”, entende-se a primeira divisao, ou seja, a divisao do oocito em duas celulas filhas, ou seja, ciclo celular 1. Na conclusao do primeiro evento de clivagem, o embriao consiste de 2 celulas.
[0069] Por “segundo evento de clivagem”, entende-se o segundo conjunto de divisoes, ou seja, a divisao da celula filha Hder em duas celulas netas e a divisao da celula filha atrasada em duas celulas netas. Em outras palavras, o segundo evento de clivagem consiste de ambos o ciclo celular 2 e o ciclo celular 3. Na conclusao da segunda clivagem, o embriao consiste de 4 celulas.
[0070] Por “terceiro evento de clivagem”, entende-se o terceiro conjunto de divisoes, ou seja, as divisoes das celulas netas. Na conclusao do terceiro evento de clivagem, o embriao tipicamente consiste de 8 celulas.
[0071] Por “citocinese” ou “divisao celular” entende-se que a fase de mitose na qual uma celula passa por divisao celular. Em outras palavras, e o estagio de mitose na qual um material nuclear particionado de celula e seu material citoplasmatico sao divididos para produzir duas celulas filhas. O periodo da citocinese e identificavel como o periodo, ou janela, de tempo entre quando uma constrigao da membrana celular (um “sulco de clivagem”) e primeiro observado e a resolugao de que daquele evento de constrigao, ou seja, a geragao de duas celulas filhas. O imcio do sulco de clivagem pode ser visualmente identificado como o ponto no qual a curvatura da membrana celular muda de convexa (arredondada por fora) para concava (curvada para dentro com um dente ou entalhada). Isto e ilustrado na Fig.4 painel superior por setas brancas apontando para 2 sulcos de clivagem. O imcio do alongamento da celula pode ainda ser usado para marcar o imcio da citocinese, no qual o periodo da citocinese e definido como o periodo de tempo dentre o imcio do alongamento da celula e a resolugao da divisao celular.
[0072] Por “primeira citocinese” ou “citocinese 1” entende-se que o primeiro evento de divisao celular apos a fertilizagao, ou seja, a divisao de um oocito fertilizado para produzir duas celulas filhas. A primeira citocinese geralmente ocorre cerca de um dia apos a fertilizagao.
[0073] Por “segunda citocinese” ou “citocinese 2”, entende-se o segundo evento de divisao celular observado em um embriao, ou seja, a divisao de uma celula filha do oocito fertilizado (a “celula filha rider”, ou filha A) em um primeiro conjunto de duas netas.
[0074] Por “terceira citocinese” ou “citocinese 3”, entende-se o terceiro evento de divisao celular observado em um embriao, ou seja, a divisao de outras celulas filhas do oocito fertilizado (a “celula filha atrasada”, ou filha B) em um segundo conjunto de duas netas.
[0075] O termo “marcador fiduciario” ou “marcador fiducial,” e um objeto no campo de visao de um sistema de imageamento que aparece na imagem produzida, para uso como um ponto de referenda ou uma medigao. Isto pode ser alguma coisa colocada no objeto em imageamento, ou uma marca ou conjunto de marcas no reticulo de um instrumento optico.
[0076] O termo “micropogo” refere-se a um recipiente que e dimensionado em uma escala celular, preferencialmente para fornecer acomodagao a uma celula eucariotica simples.
Celulas pluripotentes e embrioes de interesse
[0077] Nos metodos da invengao, um ou mais embrioes ou celulas pluripotentes sao avaliados para seu potencial de desenvolvimento medindo-se um ou mais parametros de celula dos embrioes ou celulas pluripotentes e aplicando estas medigoes para determinar o potencial de desenvolvimento dos embrioes ou celulas pluripotentes. As informagoes assim derivadas podem ser usadas para guiar decisoes clmicas, por exemplo, se transferir ou nao embriao fertilizado in vitro, se transplantar ou nao celula ou celulas cultivadas.
[0078] Exemplos de embrioes que podem ser avaliados pelos metodos da invengao incluem embrioes de 1 celula (tambem chamados de zigotos), embrioes de 2 celulas, embrioes de 3 celulas, embrioes de 4 celulas, embrioes de 5 celulas, embrioes de 6 celulas, embrioes de 8 celulas, etc. tipicamente ate e incluindo 1embrioes de 6 celulas, qualquer um dos quais pode ser derivado por qualquer metodo conveniente, por exemplo, de um oocito que amadureceu in vivo ou de um oocito que amadureceu in vitro.
[0079] Exemplos de celulas pluripotentes que podem ser avaliadas pelos metodos da invengao incluem celulas tronco totipotentes, por exemplo, oocitos, como oocitos primarios e oocitos secundarios; celulas tronco pluripotentes, por exemplo, celulas ES, celulas EG, celulas iPS, e semelhantes; celulas multipotentes, por exemplo, celulas tronco mesenquimal; e celulas tronco espedficas de tecido. Elas podem estar a partir de qualquer estagio de vida, por exemplo, embrionaria, neonatal, juvenil ou adulto, e de qualquer sexo, ou seja, XX ou XY.
[0080] Embrioes e celulas pluripotentes podem ser derivados de qualquer organismo, por exemplo, qualquer especie de mamifero, por exemplo, humano, primata, equino, bovino, porcino, canino, felino, etc. Preferencialmente, sao derivados de um humano. Podem ser anteriormente congelados, por exemplo, embrioes criopreservados em um estagio de 1 celula e em seguida descongelados, ou oocitos e celulas tronco congelados e descongelados. Alternativamente, podem ser recem-preparados, por exemplo, embrioes que sao recem-preparados de oocitos por tecnicas de fertilizagao in vitro; oocitos que sao recem colhidos e/ou recentemente amadurecidos atraves de tecnicas de amadurecimento in vitro ou outras que sao derivados de celulas tronco pluripotentes diferenciadas em celulas germinativas in vitro e amadurecidas em oocitos; as celulas tronco recem preparadas a partir de dissociagao e cultura de tecidos por metodos conhecidos na tecnica; e semelhantes. Podem ser cultivados sob qualquer condigao conveniente conhecida na tecnica para promover sobrevivencia, crescimento, e/ou desenvolvimento da amostra a ser avaliada, por exemplo, para embrioes, sob condigoes como aquelas usadas na tecnica de fertilizagao in vitro; vide, por exemplo, Patente US 6.610.543, Patente US 6.130.086, Patente US 5.837.543, as revelagoes das quais estao aqui incorporadas como referencia; para oocitos, sob condigoes como aquelas usadas na tecnica para promover a maturagao de oocito; vide, por exemplo, Patente US 5.882.928 e Patente US 6.281.03, as revelagoes das quais estao aqui incorporadas como referencia; para celulas tronco sob condigoes como aquelas usadas na tecnica para promover proliferagao; vide, por exemplo, Patente US 6.777.233, Patente US 7037892, Patente US 7.029.913, Patente US 5.843.780, e Patente US 6.200.806, Pedido US 2009/0047263; Pedido US 2009/0068742, as revelagoes das quais estao incorporadas aqui como referencia. Geralmente, os embrioes/celulas pluripotentes sao cultivados em um meio comercialmente dispomvel como KnockOut DMEM, DMEM-F12, ou Meio de Dulbecco Modificado Iscoves que foi complementado com soro ou substituto de soro, aminoacidos, e fatores de crescimento ajustados para as necessitas de embrioes /celulas pluripotentes particulares sendo avaliadas.
Analise de Imageamento de Lapso de Tempo
[0081] Em algumas modalidades, os embrioes/celulas pluripotentes sao avaliados pela medigao de parametros celulares por imageamento de lapso de tempo. Os embrioes/celulas pluripotentes podem ser cultivados em placas de cultura padroes. Alternativamente, os embrioes/celulas pluripotentes podem ser cultivados em placas de cultura de costume, por exemplo, placas de cultura de costume com micropogos de qualidade optica conforme descrito aqui. Em ditas placas de cultura de costume, cada micropogo mantem um unico embriao /celula pluripotente, e a superficie de fundo de cada micropogo tem um acabamento de qualidade otica de modo que o grupo completo de embrioes dentro de uma unica placa possa ser refletido simultaneamente por uma unica microscopia de miniatura com resolugao suficiente para acompanhar os processos de mitose. O grupo complete de micropogos compartilha a mesma queda de meio na placa de cultura, e pode tambem incluir uma parede externa posicionada ao redor de micropogos para estabilizar a queda de meio, bem como marcadores fiduciais colocados proximos aos micropogos. A hidrofobicidade da superficie pode ser ajustada com cauterizagao plasmatica ou outro tratamento para prevenir bolhas de se formarem nos micropogos quando preenchidos com meio. Independente se a placa de cultura padrao ou uma placa de cultura comum e utilizada, durante a cultura, um ou mais embrioes em desenvolvimento podem ser cultivados no mesmo meio de cultura, por exemplo, entre 1 e 30 embrioes podem ser cultivados por placa.
[0082] As imagens sao obtidas sobre o tempo, e sao entao analisadas para chegar em medidas de um ou mais parametros de celula. O imageamento de lapso de tempo pode ser realizado com qualquer microscopio controlado por computador que seja equipado para armazenamento e analise de imagem digital, por exemplo, microscopios invertidos equipados com estagios aquecidos e camaras de incubagao, ou arranjos de microscopios miniatura construidos customizados que se ajustam dentro uma incubadora convencional. O arranjo de microscopios em miniatura permite a cultura simultanea de multiplas placas de amostras na mesma incubadora, e e escalonavel para acomodar multiplos canais sem limitagoes sobre o intervalo de tempo minimo entre a captura de imagens sucessivas. O uso de multiplos microscopios elimina a necessidade de movimentar a amostra, o que melhora a precisao do sistema e a confianga geral no sistema. Os microscopios individuais na incubadora podem ser parcial ou completamente isolados, fornecendo cada placa de cultura com seu proprio ambiente controlado. Isto permite que as placas sejam transformadas para e a partir das estagoes de imageamento sem perturbar o ambiente das outras amostras.
[0083] O sistema de imageamento para imageamento de lapso de tempo pode empregar a iluminagao em campo claro, iluminagao em campo escuro, contraste de fase, contraste de modulagao de Hoffman, contraste de interferencia diferencial, ou fluorescencia. Em algumas modalidades, a iluminagao de campo escuro pode ser usada para fornecer contraste de imagem aumentada para subsequente extragao de caracteristica e analise da imagem. Alem disso, fontes de luz vermelha ou infravermelha proxima podem ser usadas pra reduzir a fototoxicidade e melhorar a proporgao de contraste entre as membranas celulares e as partes internas das celulas.
[0084] As imagens que sao adquiridas podem ser estabelecidas em uma base contmua, ou como um video ao vivo, ou em uma base intermitente, como em fotografia de lapso de tempo, onde um sujeito e repetidamente imageado em uma imagem estatica. Preferencialmente, o intervalo de tempo entre imagens deve estar entre 1 a 30 minutos para capturar eventos morfologicos significativos conforme descrito abaixo. Em uma modalidade alternativa, o intervalo de tempo entre imagens poderia ser variado dependendo da quantidade de atividade celular. Por exemplo, durante periodos ativos as imagens poderiam ser tomadas com uma frequencia de alguns segundos ou a cada minuto, enquanto que durante os periodos inativos poderiam ser tomadas a cada 10 ou 15 minutos ou mais. A analise de imagem em tempo real nas imagens capturadas poderia ser usadas para detectar quando e como variam os intervalos de tempo. Em nossos metodos, a quantidade total de luz recebida pelas amostras e estimulada como sendo equivalente a aproximadamente 24 minutos de exposigao a luz de mvel baixo por 5 dias de imageamento. A intensidade da luz para sistemas imageamento de lapso de tempo e significativamente menor que a intensidade da luz tipicamente usada em um microscopio de reproducao assistida devido a baixa potencia dos LEDs (exemplo, usando um LED de 1W comparado com um bulbo de halogenio tipico de 100W) e alta sensibilidade do sensor da camera. Assim, a quantidade total de energia luminosa recebida por um embriao usando o sistema de imageamento de lapso de tempo e comparavel ou menor do que a quantidade de energia recebida durante a manipulagao de rotina uma clinica IVF. Alem disso, o tempo de exposicao pode ser significativamente encurtado para reduzir a quantidade total de exposigao de luz ao embriao/celula pluripotente. Para imageamento de 2 dias, com imagens capturadas a cada 5 minutos em 0,5 segundo de exposigao a luz por imagem, a quantidade total de exposigao a luz de mvel baixo e inferior a 5 minutos.
[0085] Apos a obtengao de imagens, as imagens sao exrimdas e analisadas por diferentes parametros celulares, por exemplo, tamanho da celula, espessura da zona pelucida, grau de fragmentagao, simetria das celulas filhas resultantes de uma divisao celular, os intervalos de tempo entre as primeiras mitoses, e duragao da citocinese.
[0086] Os parametros celulares que podem ser medidos por imageamento de lapso de tempo sao geralmente eventos morfologicos. Por exemplo, ao avaliar os embrioes, o imageamento de lapso de tempo pode ser usado para medir a duragao de um evento de citocinese, por exemplo, citocinese 1, citocinese 2, citocinese 3, ou citocinese 4, onde a duragao do evento de citocinese e definido como o intervalo de tempo entre a primeira observagao de um sulco de clivagem (o imcio da citocinese) e a resolugao do sulco de clivagem em duas celulas filhas (ou seja, a produgao de duas celulas filhas). Outro parametro de interesse e a duragao de um evento do ciclo celular, por exemplo, ciclo celular 1, ciclo celular 2, ciclo celular 3 ou ciclo celular 4, onde a duragao de um evento do ciclo celular e definida como o intervalo de tempo entre a produgao de uma celula (para o ciclo celular 1, a fertilizagao de um ovulo; para posteriores ciclos celulares, em uma resolugao de citocinese) e a produgao de duas celulas filhas daquela celula. Outros parametros de celula de interesse que podem ser medidos por imageamento de lapso de tempo incluem os intervalos de tempo que sao definidos por estes eventos celulares, por exemplo, (a) o intervalo de tempo entre citocinese 1 e citocinese 2, definivei como qualquer um do intervalo entre o imcio da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2, o intervalo entre a resolugao da citocinese 1 e a resolugao da citocinese 2, o intervalo entre o imcio da citocinese 1 e a resolugao da citocinese 2; ou o intervalo entre a resolugao da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2; ou (b) o intervalo de tempo entre citocinese 2 e citocinese 3, defimvel como qualquer um de o intervalo entre o imcio da citocinese 2 e o imcio da citocinese 3, ou o intervalo entre a resolugao da citocinese 2 e a resolugao da citocinese 3, ou o intervalo entre o imcio da citocinese 2 e a resolugao da citocinese 3, ou o intervalo entre resolugao de citocinese 2 e o imcio da citocinese 3.
[0087] Para efeitos da fertilizagao in vitro, considera-se vantajoso que o embriao seja transferido para o utero no imcio de desenvolvimento, por exemplo, pelo dia 2 ou 3, ou seja, ate no estagio de 8 celulas, para reduzir a perda de embriao devido as desvantagens das condigoes de cultura em relagao ao ambiente in vitro, e para reduzir os resultados adversos potenciais associados com erros epigeneticos que podem ocorrer durante a cultura (Katari et al. (2009) Hum Mol Genet. 18(20):3769-78; Sepulveda et al. (2009) Fertil Steril. 91(5):1765-70). Assim, e preferencial que a medigao dos parametros de celula ocorram dentro de 2 dias da fertilizagao, embora periodos maiores de analise, por exemplo, cerca de 36 horas, cerca de 54 horas, cerca de 60 horas, cerca de 72 horas, cerca de 84 horas, cerca de 96 horas, ou mais, tambem sao contemplados pelos metodos presentes.
[0088] Exemplos de parametros de celula em um oocito em amadurecimento que podem ser avaliados por imageamento de lapso de tempo incluem, entre outros, alteragoes na morfologia da membrana da oocito, por exemplo, a taxa e extensao da separagao da zona pelucida; alteragoes na morfologia do nucleo do oocito, por exemplo, imcio, conclusao e taxa de quebra de vesfcula germinativa (GVBD); a taxa e a diregao do movimento de granulos no citoplasma e nucleo; a citocinese do oocito e primeiro corpo polar e o movimento e/ou duragao da extrusao do primeiro corpo polar. Outros parametros incluem a duragao da citocinese do oocito secundario maduro e o segundo corpo polar.
[0089] Exemplos de parametros de celula em uma celula tronco ou populagao de celulas tronco que podem ser avaliados por imageamento de lapso de tempo incluem, entre outros, duragao de eventos de citocinese, tempo entre eventos de citocinese, tamanho e forma das celulas tronco antes e durante os eventos de citocinese, numero de celulas filhas produzidas por um evento de citocinese, orientagao espacial do sulco de clivagem, a taxa e/ou numero de divisoes assimetricas observadas (ou seja, onde uma celula filha mantem uma celula tronco, enquanto a outra se diferencia), a taxa e/ou numero de divisoes simetricas observadas (ou seja, onde ambas celulas filhas se mantem como celulas tronco ou ambas se diferenciam) e o intervalo de tempo entre a resolugao de um evento de citocinese e quando uma celula tronco comega a se diferenciar.
[0090] Parametros podem ser medidos manualmente, ou podem ser medidos automaticamente, por exemplo, pelo software de analise de imagem. Quando o software de analise de imagem e empregado, algoritmos de analise de imagem podem ser usados que empregam uma tecnica de estimativa do modelo probabiHstico baseada no metodo de Monte Carlo sequencial, por exemplo, gerando distribuigoes de hipoteses de modelos de embriao/celula, simulando imagens com base em um modelo optico simples e comparando estas simulagoes para os dados da imagem observada. Quando sao empregados tais estimativas do modelo probabiHstico, as celulas podem ser modeladas como qualquer forma apropriada, por exemplo, como colegoes de elipses no espago 2D, colegoes de elipsoides no espago 3D, e semelhantes. Para lidar com oclusoes e ambiguidades de profundidade, o metodo pode aplicar restrigoes geometricas que correspondem ao comportamento fisico esperado. Para melhorar a robustez, as imagens podem ser capturadas em um ou mais planos focais.
Analise de Expressao Genica
[0091] Em algumas modalidades, os embrioes ou celulas pluripotentes sao avaliados atraves da medigao da expressao genica. Em tais modalidades, o parametro de celula e um nivel de expressao de gene ou perfil de expressao genica. Determinar a expressao de um ou mais genes, ou seja, obter um perfil de expressao ou a avaliagao da expressao, pode ser feito medindo-se os transcritos de acido nucleico, por exemplo, de mRNAs, de um ou mais genes de interesse, por exemplo, um perfil de expressao de acido nucleico; ou medindo-se os mveis de um ou mais proteinas/polipeptideos diferentes que sao produtos de expressao de um ou mais genes de interesse, por exemplo, um perfil de expressao proteomico. Em outras palavras, os termos “perfil de expressao” e “avaliagao da expressao” sao usados amplamente para incluir um perfil de expressao genica em mvel de RNA ou nivel de proteina.
[0092] Em algumas modalidades, a expressao de genes pode ser avaliada pela obtengao de um perfil de expressao de acido nucleico, onde a quantidade ou o nivel de um ou mais acidos nucleicos na amostra e determinada, por exemplo, o transcrito de acido nucleico de um ou mais genes de interesse. Nestas modalidades, a amostra que e avaliada para gerar o perfil de expressao e uma amostra de acido nucleico. A amostra de acido nucleico inclui uma pluralidade ou populagao de acidos nucleicos distintos que incluem informagoes de expressao dos genes de interesse do embriao ou da celula a ser avaliada. O acido nucleico pode incluir acidos nucleicos de RNA ou DNA, por exemplo, mRNA, cRNA, cDNA etc., desde que a amostra mantenha as informagoes de expressao da celula hospedeira ou tecido do qual e obtida. A amostra pode ser preparada em um numero de maneiras diferentes, como e conhecido na tecnica, por exemplo, pelo isolamento do mRNA em uma celula, onde o mRNA isolado e usado como tal, amplificado, empregado para preparar cDNA, cRNA, etc., como e conhecido na tecnica de expressao diferencial. A amostra pode ser preparada a partir de uma unica celula, por exemplo, uma celula pluripotente de uma cultura de celulas pluripotentes de interesse, ou uma celula unica (blastomere) de um embriao de interesse; ou de varias celulas, por exemplo, uma fragao de uma cultura de celulas pluripotentes, ou 2, 3 ou 4, ou mais blastomeres de um embriao de interesse, usando protocolos padroes.
[0093] O perfil de expressao pode ser gerado a partir da amostra inicial de acido nucleico usando qualquer protocolo conveniente. Enquanto uma variedade de maneiras diferentes de gerar perfis de expressao sao conhecidas, como aquelas empregadas no campo da analise de expressao genica diferencial, um tipo representativo e conveniente de protocolo para a geragao de perfis de expressao e o protocolo de geragao de perfil de expressao genico baseado em arranjos. Ditas aplicagoes sao ensaios de hibridizagao em que um acido nucleico que exibe acidos nucleicos “sondas” para cada um dos genes a ser avaliado/perfilados no perfil a ser gerado e empregado. Nestes ensaios, uma amostra de acidos nucleicos alvos e preparada pela primeira vez a partir da amostra inicial de acidos nucleicos sendo avaliada, onde a preparagao pode incluir a marcagao dos acidos nucleicos alvos com um rotulo, por exemplo, um membro do sistema de produgao de sinal. Apos a preparagao da amostra de acido nucleico alvo, a amostra e contatada com o arranjo sob condigoes de hibridagao, atraves do qual sao formados complexos entre acidos nucleicos alvos que sao complementares as sequencias das sondas ligadas a superficie do arranjo. A presenga de complexos hibridizados e entao detectada, qualitativa ou quantitativamente.
[0094] A tecnologia de hibridagao especffica que pode ser praticada para gerar os perfis de expressao utilizados nos metodos do assunto inclui a tecnologia descrita nas Patentes US5.143.854; 5.288.644; 5.324.633; 5.432.049; 5.470.710; 5.492.806;5.503.980; 5.510.270; 5.525.464; 5.547.839; 5.580.732; 5.661.028; 5.800.992; as revelagoes das quais estao aqui incorporadas como referencia; bem como WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; e EP 785 280. Nestes metodos, um arranjo de “sondas” de acidos nucleicos que inclui uma sonda para cada um dos genes determinantes do fenotipo cuja expressao esta sendo avaliada e contatado com acidos nucleicos alvos conforme descrito acima. O contato e realizado sob condigoes de hibridagao, por exemplo, condigoes rigorosas de hibridizagao, e os acidos nucleicos nao ligados sao removidos. O termo “condigoes rigorosas do ensaio”, conforme usado aqui, refere-se as condigoes que sao compativeis para produzir pares de ligagao de acidos nucleicos, por exemplo, superficie ligados e acidos nucleicos na fase de solugao, de complementaridade suficiente para fornecer o nivel desejado de especificidade no ensaio enquanto sendo menos compativel para a formagao de pares de ligagao entre os de complementaridade insuficiente para fornecer a especificidade desejada. As condigoes rigorosas de ensaio sao a soma ou combinagao (totalidade) das condigoes de hibridagao e lavagem.
[0095] O padrao resultante da hibridizagao de acidos nucleicos fornece informagoes sobre expressao para cada um dos genes que foram sondados, onde as informagoes de expressao sao em termos de se ou nao o gene e expresso e, normalmente, a que nivel, onde os dados da expressao, ou seja, do perfil de expressao (por exemplo, sob a forma de um transcriptosomo), podem ser tanto qualitativos como quantitativos.
[0096] Alternativamente, metodos baseados em nao arranjos para quantificar o nivel de um ou mais acidos nucleicos em uma amostra podem ser empregados, incluindo aqueles baseados em protocolos de amplificagao, por exemplo, ensaios baseados em Reagao de Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo PCR quantitativo, PCR de transcrigao reversa (RT-PCR), PCR em tempo real, e semelhantes.
[0097] Em algumas modalidades, a expressao de genes pode ser avaliada pela obtengao de um perfil de expressao proteomico, onde a quantidade ou o nivel de um ou mais proteinas/polipeptideos na amostra e determinado, por exemplo, a proteina/polipeptideo codificado pelo gene de interesse. Nestas modalidades, a amostra que e avaliada para gerar o perfil de expressao empregada nos metodos e uma amostra de proteina. Onde o perfil de expressao e o perfil de expressao proteomico, ou seja, um perfil de um ou mais niveis de proteina em uma amostra, qualquer protocolo conveniente para avaliar os niveis da proteina podem ser empregados em que o nivel de uma ou mais proteinas na amostra ensaiada e determinado.
[0098] Enquanto uma variedade de maneiras diferentes de avaliagao de niveis de proteina e conhecida na tecnica, um tipo representativo e conveniente de protocolo para avaliagao de niveis da proteina e ELISA. Em ELISA e ensaios baseados em ELISA, um ou mais anticorpos especificos para as proteinas de interesse podem ser imobilizados em uma superficie solida selecionada, preferencialmente uma superficie que apresenta afinidade a proteina como pogos de uma placa de microtitulagao de poliestireno. Apos a lavagem para remover material incomplete adsorvido, os pogos da placa de ensaio sao cobertos com uma protema de “bloqueio” nao especifica que e conhecida por ser antigenicamente neutra com relacao a amostra de teste como albumina de soro bovino (BSA), casema ou solugoes de leite em po. Isso permite o bloqueio de sriios de adsorgao nao espedficos na superficie imobilizante, reduzindo assim o background causado pela ligagao nao espedfica do anfigeno na superficie. Apos a lavagem para remover a protema bloqueadora nao ligada, a superficie imobiliza e contatada com a amostra a ser testada sob condigoes que sao condutoras a formagao de complexos imunes (anfigeno/anticorpo). Ditas condigoes incluem diluir a amostra com diluentes como BSA ou gama globulina bovina (BGG) em salina tamponada com fosfato (PBS)/Tween ou PBS/Triton-X 100, que tambem tende a auxiliar na redugao de background nao especifico, e permitir que a amostra seja incubada por cerca de 2-4 horas em temperaturas na ordem de cerca de 25° a 27°C (embora outras temperaturas possam ser usadas). Apos a incubagao, a superficie de contato com antissoro e lavada, para remover o material nao-imunocomplexado. Um procedimento de lavagem exemplar inclui lavagem com uma solugao como PBS/Tween, PBS/Triton-X 100 ou tampao de borato. A ocorrencia e a quantidade de formagao de imunocomplexo, em seguida, podem ser determinadas, submetendo os imunocomplexos ligados a um segundo anticorpo contendo especificidade para o alvo que difere do primeiro anticorpo e detectar a ligagao do segundo anticorpo. Em certas modalidades, o segundo anticorpo tera uma enzima associada, por exemplo, urease, peroxidase ou fosfatase alcalina, que ira gerar um precipitado colorido apos a incubagao com um substrato cromogenico apropriado. Por exemplo, uma urease ou IgG anti-humano conjugado com peroxidase pode ser empregada, por um periodo de tempo e sob condigoes que favorecem o desenvolvimento da formagao de imunocomplexo (por exemplo, a incubagao por 2 horas em temperatura ambiente em uma solugao contendo PBS como PBS/Tween). Apos dita incubagao com o segundo anticorpo e lavagem para remover material nao ligado, a quantidade de maracagao e quantificada, por exemplo, pela incubagao com um substrato cromogenico como ureia e purpura de bromocresol no caso de um marcador de urease ou acido 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolina)-6-sulf6nico (ABTS) e H2O2, no caso de um marcador de peroxidase. A quantificagao e, assim, conseguida medindo o grau de geragao de cor, por exemplo, usando um espectrofotometro de espectro visivel.
[0100] O formato anterior pode ser alterado por primeiro ligar a amostra a placa de ensaio. Em seguida, o anticorpo primario e incubado com a placa de ensaio, seguido pela detecgao do anticorpo primario ligado usando um segundo anticorpo marcado com especificidade para o anticorpo primario.
[0101] O substrato solido sobre o qual o anticorpo ou anticorpos sao imobilizados pode ser preparado por uma grande variedade de materiais e em uma ampla variedade de formas, por exemplo, placa de microtitulagao, microperolas, haste, partfculas de resina, etc. O substrato pode ser escolhido para maximizar o sinal para proporgoes de rrndo, para minimizar a ligagao de background, bem como para facilitar a separagao e o custo. As lavagens podem ser efetuadas de forma mais apropriado para o substrato a ser utilizado, por exemplo, removendo uma perola ou haste de um reservatorio, esvaziando ou diluindo um reservatorio como uma placa de pogos de microtitulagao ou rinsando uma perola, partfcula, coluna cromatografica ou filtro com uma solugao de lavagem ou solvente.
[0102] Alternativamente, metodos nao baseados em ELISA para medir os mveis de uma ou mais protemas em uma amostra podem ser empregados. Exemplos representativos incluem, entre outros, espectrometria de massa, arranjos proteomicos , tecnologia de microesfera xMAPTM, citometria de fluxo, western blotting e imunohistoqmmica.
[0103] Os dados resultantes fornecem informagoes sobre expressao para cada um dos genes que foram sondados, em que as informagoes de expressao sao em termos de se ou nao o gene e expresso e, normalmente, em que mvel, e em que os dados de expressao podem ser tanto qualitativos como quantitativos.
[0104] Ao gerar o perfil de expressao, em algumas modalidades, uma amostra e avaliada para gerar um perfil de expressao que inclui dados de expressao para pelo menos um gene/protema, as vezes, uma pluralidade de genes/protemas, onde por pluralidade se entende pelo menos dois diferentes genes/protemas e muitas vezes pelo menos cerca de 3, normalmente pelo menos cerca de 10 e mais usualmente pelo menos cerca de 15 diferentes genes/protemas ou mais, como 50 ou mais, ou 100 ou mais, etc.
[0105] No seu sentido mais amplo, a avaliagao da expressao pode ser qualitativa ou quantitativa. Como tal, onde a detecgao e qualitativa, os metodos fornecem uma leitura ou avaliagao, por exemplo, avaliagao, de se ou nao o analito alvo, por exemplo, acido nucleico ou produto de expressao, esta presente na amostra a ser avaliada. Ainda em outras modalidades, os metodos fornecem uma detecgao quantitativa do se analito alvo substancia esta presente na amostra a ser avaliada, ou seja, uma avaliagao ou analise da quantidade real ou abundancia relativa do analito alvo, por exemplo, acido nucleico ou protema na amostra a ser avaliada. Em ditas modalidades, a detecgao quantitativa pode ser absoluta ou, se o metodo e um metodo de detecgao de dois ou mais diferentes analitos, por exemplo, acidos nucleicos ou protemas alvos, em uma amostra, e relativo. Com tal, o termo “quantificar” quando usado no contexto de quantificagao de um analito alvo, por exemplo, os acidos nucleicos ou protemas, em uma amostra, podem referir-se a quantificagao absoluta ou relativa. A quantificagao absoluta pode ser conseguida mediante a inclusao de concentragoes conhecidas de um ou mais analitos de controle e de referenda, ou seja, normalizando, o mvel detectado do analito alvo com analitos conhecidos de controle (por exemplo, atraves da geragao de uma curva padrao). Alternativamente, a quantificagao relativa pode ser conseguida pela comparagao dos mveis detectados ou quantidades entre dois ou mais diferentes analitos alvos para fornecer uma quantificagao relativa de cada um dos dois ou mais diferentes analitos, por exemplo, um em relagao ao outro.
[0106] Exemplos de genes cujos mveis de expressao sao preditivos de potencial de zigoto de desenvolvimento incluem Cofilina (NM_005507), DIAPH1 (NM_001079812, NM_005219), ECT2 (NM_018098), MYLC2/MYL5 (NM_002477), DGCR8 (NM_022720), Dicer/DICER1 (NM_030621, NM_177438), TARBP2 (NM_004178, NM_134323, NM_134324), CPEB1 (NM_001079533, NM_001079534, NM_001079535, NM_030594), Symplekin/SYMPK (NM_004819), YBX2 (NM _015982), ZAR1 (NM_175619), CTNNB1 (NM_001098209, NM_001098210,NM_001098210, NM_001904), DNMT3B (NM_006892, NM_175848, NM_175849, NM_175850), TERT (NM_198253, NM_198255), YY1 (NM_003403), IFGR2/IFNGR2 (NM_005534), BTF3 (NM _001037637, NM_001207), e NELF (NM_001130969, NM_001130970, NM_001130971, NM_015537). Outros genes cujos mveis de expressao podem servir como preditores de parametros de celulas de potencial embrionario sao fornecidos na Fig. 8. Para chegar em uma medida do mvel de expressao genica, o mvel de expressao e geralmente avaliado e em seguida normalizado para um padrao de controle, por exemplo, o mvel de expressao na amostra de um gene que e conhecido como constante atraves do desenvolvimento, por exemplo, GAPDH ou RPLPO, ou de um gene cuja expressao na naquele ponto de tempo e conhecida.
[0107] Os mveis de expressao genica podem ser determinados a partir de uma celula unica, por exemplo, um blastomero de um embriao de interesse, ou um oocito isolado, ou uma celula isolada de uma cultura de celulas tronco, etc., ou podem ser determinados a partir de um embriao, por exempl9o, 2, 3, ou 4, ou mais blastomeros de um embriao de interesse, ate e incluindo o embriao completo de interesse, ou multiplas celulas de uma cultura de celulas tronco, ate e incluindo a cultura completa de celulas tronco, etc.
[0108] Em outros aspectos, a presente invencao compreende um protocolo para a realizagao de genotipagem simultanea e analise de expressao genica em uma unica celula. Para embrioes, isso pode ser usado para melhorar o diagnostico genetico pre-implantagao (PGD), um procedimento onde uma unica celula e removida de um embriao e seu DNA e testado para defeitos cariofipicos ou a presenga de genes de doenga espedfica. Nosso metodo permite analise simultanea genetica e de expressao genica. O metodo envolve as seguintes etapas: (1) coletar uma unica celula em um volume pequeno de meio ou tampao, (2) realizar a transcrigao reversa em uma etapa e amplificagao em reagao em cadeia da polimerase (PCR) usando uma mistura de iniciadores de analise genotipagem e expressao genica, (3) coletar uma afiquota do cDNA amplificado depois de menos de 18 ciclos de PCR para preservar a linearidade da amplificagao, (4) usar a afiquota de cDNA para realizar a analise de a expressao genica com tecnicas padrao como PCR em tempo real quantitativo, (5) usar a amostra restante para realizar uma segunda rodada de PCR para amplificar ainda mais a informagao genetica para fins de genotipagem, e (6) genotipagem usando tecnicas padroes como eleftroforese em gel.
Determinar Potencial de Desenvolvimento de Imagem e /ou Analise de Expressao genica
[0109] Uma vez que medicoes de parametros de celulas foram obtidos, as medigoes sao empregadaos para determinar o potencial de desenvolvimento do embriao/ celula pluripotente. Como discutido acima, os termos "potencial de desenvolvimento" e "competencia para o desenvolvimento" referem-se a possibilidade ou capacidade de uma celula pluripotente ou tecido em crescer ou se desenvolver. Por exemplo, no caso de um oocito ou embriao, o potencial de desenvolvimento pode ser a capacidade ou habilidade de que o oocito ou embriao para crescer ou se desenvolver em um blastocisto saudavel. Como outro exemplo, no caso de uma celula tronco, o potencial de desenvolvimento e a habilidade ou a capacidade para crescer ou desenvolver em uma ou mais celulas de interesse, por exemplo, um neuronio, um musculo, uma celula B ou T, e semelhantes. Em algumas modalidades, o potencial de desenvolvimento de um oocito ou embriao e a habilidade ou capacidade daquele oocito ou embriao de se desenvolver em um blastocisto saudavel; para ser implantado com sucesso em um utero; para passar por gestagao; e/ou ser um nascido vivo. Em algumas modalidades, o potencial de desenvolvimento de uma celula pluripotente e a habilidade ou capacidade daquela celula pluripotente de se desenvolver em uma ou mais celulas de interesse, por exemplo, um neuronio, um musculo, uma celula B ou T, e semelhantes; e/ou para contribuir para um tecido de interesse in vivo.
[0110] Por “bom potencial de desenvolvimento”, entende-se que o embriao/celula pluripotente e estatisticamente possivel de se desenvolver conforme desejado, ou seja, tem 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de chance, por exemplo, 100% de chance, de se desenvolver conforme desejado. Em outras palavras, 55 de 100, 60 de 100, 70 de 100, 80 de 100, 90 de 100, 95 de 100, ou 100 de 100 embrioes ou celulas pluripotentes que demonstram a medigao do parametro de celulas usado para chegar na determinagao de bom potencial de desenvolvimento do, de fato, se desenvolve conforme desejado. De forma redproca, por “fraco potencial de desenvolvimento” entende-se que o embriao/celula pluripotente nao e estatisticamente possivel de desenvolver conforme desejado, ou seja, tem 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou menos de chance, por exemplo, 0% de chance, de se desenvolver conforme desejado. Em outras palavras, somente 50 de100, 40 de 100, 30 de 100, 20 de 100, 10 de 100, ou 5 de 100 ou menos de embrioes ou celulas pluripotentes que demonstram a medigao do parametro de celulas usado para chegar na determinagao de fraco potencial de desenvolvimento do, de fato, se desenvolvem conforme desejado. Conforme usado aqui, embrioes e celulas pluripotentes “normal” ou “saudavel” demonstram bom potencial de desenvolvimento, enquanto que embrioes e celulas pluripotentes “anormal” apresentam potencial de desenvolvimento.
[0111] Em algumas modalidades, a medigao do parametro de celula e usado diretamente para determinar o potencial de desenvolvimento do embriao/celula pluripotente. Em outras palavras, o valor absoluto da medigao por si so e suficiente para determinar o potencial de desenvolvimento. Exemplos destas modalidades usando imageamento de lapso de tempo para medir parametros de celulas incluem, entre outros, os seguintes, qualquer um dos quais sozinhos ou em combinagao sao indicativos de bom potencial de desenvolvimento em um embriao humano: (a) uma citocinese 1 que dura cerca de 0 a 30 minutos, por exemplo, cerca de 6 a 20 minutos, em media cerca de 12 a 14 minutos; (b) um ciclo celular 1 que dura cerca de 20 a 27 horas, por exemplo, cerca de 25 a 27 horas; (c) um intervalo de tempo entre a resolugao da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2 que e cerca de 8 a 15 horas, por exemplo, cerca de 9 a 13 horas, com um valor medio de cerca de 11 +/- 2,1 horas; (d) um intervalo de tempo, ou seja, sincronicidade, entre o imcio da citocinese 2 e o imcio da citocinese 3 que e cerca de 0 a 5 horas, por exemplo, cerca de 0 a 3 horas, com um tempo medio de cerca de 1 +/- 1,6 horas. Exemplos de medigoes diretas, qualquer um dos quais sozinhos ou em combinagao sao indicativos de fraco potencial de desenvolvimento em um embriao humano, inclui, entre outros: (a) uma citocinese 1 que dura mais do que cerca de 30 minutos, por exemplo, cerca de 32, 35, 40, 45, 50, 55, ou 60 minutos ou mais; (b) um ciclo celular 1 que dura mais do que cerca de 27 horas, por exemplo, 28, 29, ou 30 ou mais horas; (c) um intervalo de tempo entre a resolugao da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2 que dura mais do que 15 horas, por exemplo, cerca de 16, 17, 18, 19, ou 20 ou mais horas, ou menos do que 8 horas, por exemplo, cerca de 7, 5, 4, ou 3 ou menos horas; (d) um intervalo de tempo entre o imcio da citocinese 2 e o imcio da citocinese 3 que e 6, 7, 8, 9, ou 10 ou mais horas.
[0112] Em algumas modalidades, a medigao do parametro de celula e empregada pela comparagao deste a uma medigao de parametro de celula de uma referenda, ou controle, embriao/celula pluripotente, e usando o resultado desta comparagao para fornecer uma determinagao do potencial de desenvolvimento do embriao/celula pluripotente. Os termos “referenda” e “controle” conforme usados aqui significam um embriao padronizado ou celula a ser usada para interpretar a medigao do parametro de celulas de certo embriao/celula pluripotente e designa uma determinagao de potencial de desenvolvimento deste. A referencia ou controle pode ser um embriao/celula pluripotente que e conhecida por ter um fenotipo desejado, por exemplo, bom potencial de desenvolvimento, e, portanto, pode ser uma referencia positiva ou controle embriao/celula pluripotente. Alternativamente, o embriao/celula pluripotente referencia/controle pode ser um embriao/celula pluripotente conhecido por ter um fenotipo desejado, e, portanto, ser um embriao/celula pluripotente referencia/controle negativo.
[0113] Em certas modalidades, a medigao de parametro de celula obtido e comparada a uma medigao de parametro de celula comparavel a partir de um unico embriao/celula pluripotente referencia/controle para obter informagoes em relagao ao fenotipo do embriao/celula sendo avaliado. Ainda em outras modalidades, as medigoes de parametro de celula obtidas sao comparadas as medigoes de parametro de celula comparaveis de dois ou mais diferentes embrioes ou celulas pluripotentes de referencia/controle para obter informagoes mais profundas em relagao ao fenotipo do embriao/celula avaliado. Por exemplo, as medigoes de parametro de celula obtidas dos embrioes ou celulas pluripotentes sendo avaliados podem ser comparadas a ambos embrioes ou celulas pluripotentes positivos e negativos para obter informagoes em relagao se o embriao/celula tem o fenotipo de interesse.
[0114] Como um exemplo, citocinese 1 em um embriao humano normal, ou seja, com bom potencial de desenvolvimento, e cerca de 0 a 30 minutos, mais geralmente cerca de 6 a 20 minutos, em media cerca de 12 a 14 minutos, ou seja, cerca de 1, 2, 3, 4, ou 5 minutos, mais geralmente cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 minutos, em alguns casos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou ate cerca de 30 minutos. Um periodo mais longo para completar a citocinese 1 no embriao sendo avaliado conforme comparado aquele observado para um embriao de referencia e indicativo de fraco potencial de desenvolvimento. Como um segundo exemplo, ciclo celular 1 em um embriao normal, ou seja, do tempo de fertilizagao ate a conclusao de citocinese 1, e normalmente completado em cerca de 20 a 27 horas, mais geralmente em cerca de 25 a 27 horas, ou seja, cerca de 15, 16, 17, 18, ou 19 horas, mais geralmente cerca de 20, 21, 22, 23, ou 24 horas, e mais geralmente cerca de 25, 26 ou 27 horas. Um ciclo celular 1 que e mais longo no embriao sendo avaliado conforme comparado aquele observado para um embriao de referenda e indicativo de fraco potencial de desenvolvimento. Como um terceiro exemplo, a resolugao da citocinese 1 e o imcio da citocinese 2 em embrioes humanos normais e cerca de 8 a 15 horas, mais frequente cerca de 9 a 13 horas, com um valor medio de cerca de 11 +/- 2,1 horas; ou seja, 6, 7, ou 8 horas, mais geralmente cerca de 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou ate cerca de 15 horas. Um ciclo celular 2 mais curto ou mais longo no embriao sendo avaliado conforme comparado aquele observado para um embriao de referencia e indicativo de fraco potencial de desenvolvimento. Como um quarto exemplo, o intervalo de tempo entre o imcio da citocinese 2 e o imcio da citocinese 3, ou seja, a sincronicidade da segunda e terceira mitoses, em embrioes humanos normais e geralmente cerca de 0 a 5 horas, mais geralmente cerca de 0, 1, 2 ou 3 horas, com um tempo medio de cerca de 1 +/- 1,6 horas; um intervalo de tempo maior entre a conclusao de citocinese 2 e citocinese 3 no embriao sendo avaliado como comparado aquele observado em um embriao normal de referencia e indicativo de fraco potencial de desenvolvimento. Finalmente, como um exemplo de como esta modalidade pode ser aplicada quando usando mveis de expressao genica como parametros para avaliagao de potencial de desenvolvimento, mveis mais baixos de expressao de Cofilina, DIAPH1 , ECT2, MYLC2, DGCR8, Dicer, TARBP2, CPEB1, Symplekin, YBX2, ZAR1, CTNNB1 , DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2, BTF3 e/ou NELF, ou seja, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, ou 100 vezes menos expressao, em embrioes de 2 celulas sendo avaliados como comparados aqueles observados para um embriao normal de referencia de 2 celulas e indicativo de fraco potencial de desenvolvimento, enquanto que a expressao que e igual ou maior do que a observada para um embriao normal de referencia de 2 celulas e indicativo de bom potencial de desenvolvimento. Outros exemplos podem ser derivados de dados empmcos, por exemplo, observado um ou mais embrioes de referencia ou celulas pluripotentes ao lado de embriao/celula pluripotente a ser avaliado. Qualquer embriao/celula pluripotente de referenda pode ser empregado, por exemplo, uma amostra normal de referenda com bom potencial de desenvolvimento, ou uma amostra anormal de referenda com fraco potencial de desenvolvimento. Em alguns casos, mais do que uma amostra de referencia pode ser empregada, por exemplo, ambas a amostra de norma de referencia e uma amostra anormal de referencia podem ser usadas.
[0115] Em algumas modalidades, pode ser desejavel usar medicoes de parametro de celula que sao conseguidas por microscopia de lapso de tempo ou pelo perfil de expressao, mas nao por ambos microscopia de lapso de tempo e perfil de expressao. Em outras modalidades, pode ser desejavel usar as medicoes de parametro de celula que sao conseguidas por microscopia de lapso de tempo bem como medicoes de parametro de celula que as conseguidas por perfil de expressao.
[0116] Conforme discutido acima, um ou mais parametros podem ser medidos e empregados para determinar o potencial de desenvolvimento de um embriao ou celula pluripotente. Em algumas modalidades, uma medigao de um unico parametro pode ser suficiente para chegar em uma determinagao de potencial de desenvolvimento. Em algumas modalidades, pode ser desejavel empregar medidas de mais do que um parametro, por exemplo, parametros de 2 celulas, parametros de 3 celulas, ou parametros de 4 celulas ou mais.
[0117] Em certas modalidades, avaliar multiplos parametros pode ser desejavel como avaliagao para multiplos parametros pode fornecer maior sensibilidade e especificidade. Por sensibilidade entende-se a proporgao de positivos reais que sao corretamente identificados como tal. Isto pode ser descrito matematicamente como:
Figure img0001
[0118] Assim, em um metodo no qual “positivos” sao os embrioes que tem bom potencial de desenvolvimento, ou seja, que irao se desenvolver em blastocistos, e “negativos” sao os embrioes que tem fraco potencial de desenvolvimento, ou seja, que nao irao se desenvolver em blastocistos, uma sensibilidade de 100% significa que o teste reconhece todos os embrioes que irao se desenvolver em blastocistos como tal. Em algumas modalidades, a sensibilidade do ensaio pode ser cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mais, por exemplo, 100%. Por especificidade entende-se a proporgao de negativos que sao corretamente identificados como tal. Isto pode ser descrito matematicamente como:
Figure img0002
[0119] Assim, em um metodo no qual positivos sao os embrioes que tem bom potencial de desenvolvimento, ou seja, que irao se desenvolver em blastocistos, e negativos sao os embrioes que tem fraco potencial de desenvolvimento, ou seja, que nao irao se desenvolver em blastocistos, uma especificidade de 100% significa que o teste reconhece todos os embrioes que nao irao se desenvolver em blastocistos, ou seja, serao interrompidos antes do estagio de blastocisto, como tal. Em algumas modalidades, a especificidade do ensaio pode ser cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mais, por exemplo, 100%.
[0120] Conforme demonstrado na segao de exemplos abaixo e na figura 7, o uso de tres parametros fornece sensibilidade de 94% e especificidade de 93% com um ponto de cutoff de 3 vezes os desvios padroes da distribuigao de blastocisto. Em outras palavras, os metodos da invengao sao capazes de corretamente identificar o numero de embrioes que irao se desenvolver em blastocistos 94% do tempo (sensibilidade), e o numero de embrioes que serao interrompidos antes do estagio de blastocisto 93% do tempo (especificidade). Alem disso, os valores medios especificados e/ou pontos de cut-off podem ser modificados dependendo do conjunto de dados para calcular estes valores bem como a aplicagao espedfica.
[0121] Em algumas modalidades, a avaliagao de um embriao ou celula pluripotente inclui gerar um laudo escrito que inclui a avaliagao do tecnico do sujeito embriao/celula pluripotente, por exemplo, uma “avaliagao de potencial de desenvolvimento”, uma “avaliagao de anormalidades cromossomicas”, etc. Assim, um metodo sujeito pode ainda incluir uma etapa de gerar ou extrair um laudo fornecendo os resultados de tal avaliagao, cujo laudo pode ser fornecido na forma de um meio eletronico (por exemplo, um display eletronico em um monitor de computador), ou na forma de um meio tangkel (por exemplo, um laudo impresso em papel ou outro meio tangwel).
[0122] Um “laudo,” conforme descrito aqui, e um documento eletronico ou tangivel que inclui elementos de laudo que fornecem informagoes relacionadas a uma avaliagao conseguida pelos metodos da invengao. Um laudo de sujeito pode ser completamente ou parcialmente eletronicamente gerado. Um laudo sujeito inclui pelo menos uma avaliagao do potencial de desenvolvimento do sujeito embriao ou celula pluripotente, uma avaliagao da probabilidade da existencia de anormalidades cromossomicas, etc. Um laudo de sujeito pode ainda incluir um ou mais de: 1) informagoes em relagao a facilidade do teste; 2) informagoes de prestadores de servigo; 3) dados do sujeito; 4) dados da amostra; 5) uma sessao do laudo de avaliagao detalhada, fornecendo informagoes em relagao a como a avaliagao foi conseguida em, por exemplo, a) medigoes tomadas de parametro de celula , b) valores de referenda empregados, se algum; e 6) outras caracteristicas.
[0123] O laudo pode incluir informagoes sobre a facilidade de teste, cuja informagao e relevante para o hospital, clinica, ou laboratorio em cuja coleta de amostra e/ou geragao de dados foi conduzida. A coleta de amostra pode incluir como a amostra foi gerada, por exemplo, como foi colhida de um sujeito, e/ou como foi cultivada etc. A geragao de dados pode incluir como as imagens foram obtidas ou os perfis de expressao genica foram analisados. Esta informagao pode incluir um ou mais detalhes em relagao a, por exemplo, o nome e localizagao da instalagao do teste, a identidade do tecnico do laboratorio que realizou o ensaio e/ou quem inseriu os dados, a data e hora que o ensaio foi conduzido e/ou analisado, o local onde a amostra e/ou dados resultantes sao armazenados, o numero de lote dos reagentes (por exemplo, kit, etc.) usados no ensaio, e semelhantes. Os campos do laudo com estas informagoes podem geralmente ser preenchidos usando as informagoes fornecidas pelo usuario.
[0124] O laudo pode incluir informagoes sobre o prestador de servigo, que pode estar localizado fora da unidade de saude na qual o usuario esta localizado, ou dentro da unidade de saude. Exemplos de tais informagoes podem incluir o nome e a localizagao do prestador de servigos, o nome do revisor, e, quando necessario ou desejado, o nome da pessoa que conduziu a preparagao de amostras e/ou geragao de dados. Os campos do laudo com essas informacoes podem geralmente ser preenchidos com dados digitados pelo usuario, que pode ser selecionado entre selegoes pre-manuscritas (por exemplo, usando um menu de rolagem). Outras informacoes de prestador de servico no laudo podem incluir informagoes de contato para informagoes tecnicas sobre o resultado e/ou sobre o laudo interpretativo.
[0125] O relatorio pode incluir uma segao de dados do suj eito, incluindo a historia medica dos sujeitos dos quais os oocitos ou celulas pluripotentes foram colhidas, idade do paciente, caracteristicas do ciclo de fertilizagao in vitro (por exemplo, taxa de fertilizagao, dia 3 de mvel de hormonio foHculo estimulante (FSH)), e , quando oocitos sao colhidos, parametros de coorte de zigoto/embriao (por exemplo, numero total de embrioes). Estes dados de sujeitos podem ser integrados para melhorar a avaliagao do embriao e/ou auxiliar a determinagao do numero otimo de embrioes para transferir. O laudo pode ainda incluir dados administrativos do sujeito (ou seja, dados que nao sao essenciais para a avaliagao do potencial de desenvolvimento), como informagoes para identificar o sujeito (por exemplo, nome, data de nascimento do sujeito (DOB), genero, enderego de email e/ou residencial, numero do registro medico (MRN), sala e/ou numero do leito em uma unidade de saude), informagoes de seguro, e semelhantes, o nome do medico do sujeito ou outro profissional de saude que solicitou a avaliagao de potencial de desenvolvimento e, se diferente do medico solicitante, o nome de um medico da equipe que e responsavel pelos cuidados do sujeito (por exemplo, medico de assistencia primaria).
[0126] O laudo pode incluir uma segao de dados da amostra, que pode fornecer informagoes sobre a amostra biologico analisada na avaliagao, como o tipo de amostra (embriao ou celula pluripotente, e tipo de celula pluripotente), como a amostra foi manipulada (por exemplo, temperatura de armazenamento, protocolos de preparagao) e as datas e hora de coleta. Os campos do laudo com essas informagoes podem geralmente ser preenchidos com dados digitados pelo usuario, alguns dos quais podem ser fornecidos como selegoes pre-manuscritas (por exemplo, usando um menu drop-down).
[0127] O laudo pode incluir uma segao de avaliagao do laudo, que pode incluir informagoes referentes a como as avaliagoes/determinagoes foram conseguidas conforme descrito aqui. O laudo interpretativo pode incluir, por exemplo, imagens de lapso de tempo do embriao ou celula pluripotente sendo avaliadas, e/ou resultados de expressao genica. A parte da avaliagao do laudo pode opcionalmente ainda incluir uma segao de recomendagao. Por exemplo, onde os resultados indicam bom potencial de desenvolvimento de um embriao, as recomendagoes podem incluir uma recomendagao que um numero limitado de embrioes a ser transplantado no utero durante o tratamento de fertilidade conforme recomendado na tecnica.
[0128] Sera prontamente apreciado que os laudos podem incluir elementos adicionais ou elementos modificados. Por exemplo, onde eletronico, o laudo pode conter hyperlinks que indicam bases de dados internas ou externas que fornecem mais informagoes mais detalhadas sobre os elementos selecionados do laudo. Por exemplo, os elementos de dados do paciente do laudo podem incluir um hyperlink a um registro eletronico do paciente, ou um site para acessar tal registro do paciente, cujo registro do paciente e mantido em uma base de dados confidencial. Esta ultima modalidade pode ser de interesse em um sistema hospitalar ou ambiente clinico. Quando em um formato eletronico, o laudo e registrado em um meio fisico apropriado, como um meio lido em computador, por exemplo, em uma memoria de computador, drive zip, CD, DVD, etc.
[0129] Sera prontamente apreciado que o laudo pode incluir todos ou alguns dos elementos acima, com a provisao de que o laudo geralmente inclui pelo menos os elementos suficientes para fornecer a analise solicitada pelo usuario (por exemplo, uma avaliagao de potencial de desenvolvimento).
Utilidade
[0130] Conforme discutido acima, os metodos da invengao podem ser usados para avaliar os embrioes ou celulas pluripotentes para determinar seus potenciais de desenvolvimento. Esta determinagao de potencial de desenvolvimento pode ser usada para direcionar as decisoes clmicas e/ou agoes. Por exemplo, para aumentar as taxas de gravidez, os medicos geralmente transferem multiplos embrioes nos pacientes, potencialmente resultando em gravidezes multiplas que possuem alto risco tanto para as maes quanto para os fetos. Usando os resultados obtidos dos metodos da invengao, o potencial de desenvolvimento de embrioes sendo transferidos para se desenvolver em fetos e determinado antes do transplante, permitindo que o medico decida quantos embrioes transferir de modo a maximizar a chance de sucesso de uma gravidez completa enquanto minimiza o risco.
[0131] As avaliacoes feitas pelos seguintes metodos da invengao podem ainda encontrar uso embrioes ou celulas pluripotentes classificados em um grupo de embrioes ou celulas pluripotentes para seus potenciais de desenvolvimento. Por exemplo, em alguns casos, multiplos embrioes podem ser capazes de se desenvolver em blastocistos, ou seja, terao bom potencial de desenvolvimento. No entanto, alguns embrioes serao mais provaveis de atingir o estagio de blastocistos ou um blastocisto de qualidade maior do que outro, ou seja, terao melhor potencial de desenvolvimento do que outros embrioes. Em ditos casos, os metodos da invengao podem ser usados para classificar os embrioes no grupo. Em ditos metodos, um ou mais parametros de celula para cada embriao/celula pluripotente e medido para chegar a uma medigao de parametro de celula para cada embriao/celula pluripotente. A uma ou mais medigoes de parametro de celula de cada um dos embrioes ou celulas pluripotentes sao entao empregados para determinar o potencial de desenvolvimento dos embrioes ou celulas pluripotentes em relagao ao outro. Em algumas modalidades, a medigao do parametro de celulas de cada um dos embrioes ou celulas pluripotentes e empregada por comparagao dos mesmos diretamente um ou outro para determinar o potencial de desenvolvimento de embrioes ou celulas pluripotentes. Em algumas modalidades, a medigao do parametro de celulas de cada um dos embrioes ou celulas pluripotentes e empregada pela comparagao da medigao do parametro de celulas para uma medigao de parametro de celula de um embriao/celula pluripotente de referenda para determinar os potenciais de desenvolvimento para cada embriao/celula pluripotente, e em seguida comparar os determinados potenciais de desenvolvimento para cada embriao/celula pluripotente para determinar o potencial de desenvolvimento dos embrioes ou celulas pluripotentes em relagao a um outro. Desta forma, um medico que avalia, por exemplo, multiplos zigotos/embrioes, pode escolher somente os embrioes de melhor qualidade, ou seja, aqueles com o melhor potencial de desenvolvimento, para transferir de modo a maximizar as chance de successo de uma gravidez completa enquanto minimiza o risco.
[0132] As avaliagoes feitas seguindo os metodos da invengao podem ainda encontrar uso na determinagao do potencial de desenvolvimento de oocitos que sao maturados in vitro e celulas tronco que sao cultivadas in vitro. As informagoes sobre o potencial de desenvolvimento de oocitos obtidos pelos metodos da invengao podem direcionar a selegao do medico de oocitos para fertilizar, resultando em maior probabilidade de sucesso em derivar blastocistos destes oocitos. Da mesma forma, as informagoes sobre o potencial de desenvolvimento de celulas tronco podem informar a selegao do medico de celulas tronco para usar nos procedimentos para, por exemplo, reconstituir ou substituir um tecido in vivo em um sujeito em necessidade do mesmo.
Reagentes, Dispositivos e Kits
[0133] Tambem sao fornecidos reagentes, dispositivos e kits dos mesmos para praticar um ou mais dos metodos descritos acima. Os reagentes, dispositivos e kits objetos dos mesmos podem variar enormemente. Os reagentes e dispositivos de interesse incluem aqueles mencionados acima com relagao aos metodos de medigao de qualquer um dos parametros de celula acima mencionados, onde ditos reagentes podem incluir placas de cultura, meio de cultura, microscopios, software de imageamento, software de analise de imageamento, iniciadores de acido nucleico, arranjos de sondas de acido nucleico, anticorpos, reagentes de sistema produtores de sinal, etc., dependendo do protocolo particular de medigao a ser realizado. Por exemplo, os reagentes podem incluir iniciadores de PCR que sao espedficos para um ou mais dos genes Cofilina, DIAPH1 , ECT2, MYLC2/MYL5, DGCR8, Dicer/DICER1 , TARBP2, CPEB1, Symplekin/SYMPK, YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2/IFNGR2, BTF3, e NELF, conforme descrito acima. Outros exemplos de reagentes incluem arranjos que compreendem sondas que sao especificas para um ou mais dos genes de interesse, ou anticorpos para as protemas codificadas por estes genes de interesse.
[0134] Alem dos componentes acima, os kits objetos irao ainda incluir instrugoes para a pratica dos metodos sujeitos. Estas instrugoes podem estar presentes nos kits objetos em uma variedade de formas, uma ou mais das quais podem estar presentes no kit. Uma forma da qual estas instrugoes podem estar presentes e uma informagao impressa em um meio ou substrato apropriado, por exemplo, um pedago ou pedagos de papel no qual a informagao e impressa, na embalagem do kit, em uma bula, etc. Ja outros meios poderiam ser um meio lido em computador, por exemplo, disquete, CD, etc., no qual as informagoes foram registradas. Ja outros meios que podem estar presentes sao um enderego de website que pode ser usado atraves da internet para acessar as informagoes em um site removido. Qualquer meio conveniente pode estar presente nos kits.
Imageamento de celula automatizado com um arranjo de microscopio
[0135] Alguns dos metodos descritos acima requerem a capacidade de observar desenvolvimento de embriao e celula tronco atraves de imageamento de lapso de tempo. Isto pode ser conseguido usando um sistema contendo uma montagem de microscopio em mininatura de multi canal que pode ser ajustado dentro de uma incubadora padrao. Isto permite que mutliplas amostras a serem imageadas rapidamente e simultaneamente sem ter que fisicamente movimentar as placas. Um prototipo ilustrativo, mostrado na Fig. 22, consiste de um arranjo microscopico de 3 canais com iluminagao de campo escuro, embora outros tipos de iluminagao podem ser usadas. Por “tres canais,” entende- se que ha tres microscopios independentes de imageamento de tres distintas placas de cultura simultaneamente. Um motor passo-a-passo e usado para ajustar a posigao focal para focar ou obter empilhamento de imagens 3D. LEDs de luz branca sao usados para iluminagao, embora tenhamos observado que para embrioes humanos, usando LEDs de luz vermelha ou infravermelha proxima (IR) podem melhorar a proporgao de contraste entre as membranas de celulas e as partes internas das celulas. Esta proporgao de contraste aumentada pode auxiliar ambas as analises de imagem manual e automatizada. Alem disso, movimentar para a regiao de infravermelho pode reduzir a fototoxicidade para as amostras. As imagens sao capturas por webcams de baixo custo e alta resolugao, mas outros tipos de cameras podem ser usadas.
[0136] Conforme mostrado na Fig. 22, cada microscopio do sistema de prototipo acima descrito e usado para imagear uma placa de cultura que pode conter em qualquer parte de 1-30 embrioes. O microscopio coleta luz de um LED vermelho fraco conectado a um dissipador para auxiliar qualquer calor gerado pelo LED, que e muito pequeno para breves exposigoes de tempos. A luz passa atraves de um patch de campo escuro convencional para interromper a luz direta atraves de lentes condensadoras e sobre um especime rotulado “placa de petri,” que e uma placa de cultura contendo os embrioes sendo cultivados e estudados. A placa de cultura pode ter pogos que auxiliam manter a ordem dos embrioes e impedir o movimento dos mesmos enquanto a placa e conduzida de e para a incubadora. Os pogos podem ser espagados juntos suficientes de modo que os embrioes possam compartilhar a mesma parcela de meio. A luz espalhada e entao passada por uma objetiva de microscopio, entao atraves de um dubleto acromatico, e sobre um sensor CMOS. O sensor CMOS atua como uma camera digital e e conectado a um computador para analise de imagem e rastreamento conforme descrito acima.
[0137] Este projeto e facilmente escalavel para fornecer significativamente mais canais e diferentes tecnicas de iluminagao, e podem ser modificados para acomodar dispositivos fluidos para alimentar as amostras. Alem disso, o projeto pode ser integrado com um sistema de controle de retroalimentagao, onde as condigoes de cultura como temperatura, CO2 (para controlar o pH) e meio sao otimizadas com base em retroalimentagao em tempo real e nos dados de imageamento. Este sistema foi usado para obter v^deos de lapso de tempo de desenvolvimento do embriao humano, que tem utilidade na determinagao de viabilidade de embriao para os procedimentos de fertilizagao in vitro (IVF). Outras aplicagoes incluem terapia de celula tronco, triagem de droga, e engenharia de tecido.
[0138] Em uma modalidade do dispositivo, a iluminagao e fornecida por um diodo emissor de luz branca Luxeon (LED) montado em um dissipador de alummio e alimentado por condutor regulado por corrente BuckPuck. A luz do LED e passada por lentes de colimagao. A luz colimada passa entao por um patch stop de laser usinado customizado, conforme mostrado na Fig. 22, e focado em um cone oco de luz usando uma lente condensadora esferica. A luz que e diretamente transmitida atraves da amostra e rejeitada pela objetiva, enquanto a luz que e espalhada pela amostra e coletada. Em uma modalidade, objetivas Olympus com ampliagao de 20X sao usadas, embora ampliagoes menores possam ser usaas para aumentar o campo de visao, ou ampliagoes maiores podem ser usadas para aumentar a resolugao. A luz coletada e entao passada por uma lente de dubleto acromatica (ou seja, tentes tubo) para reduzir os efeitos de aberragao cromatica e esferica. Alternativamente, a luz coletada da objetiva de imageamento pode ser passada por outra objetiva, apontada na diregao oposta, que atua como uma substituigao da lente tubo. Em uma configuragao, a objetiva de imageamento pode ser uma objetiva de 10X, enquanto a lente tubo pode ser uma objetiva de 4X. A imagem resultante e capturada por um sensor CMOS com 2 megapixel de resolugao (1600 x 1200 pixels). Diferentes tipos de sensores e resolugoes podem tambem ser usados.
[0139] A Fig. 23A mostra uma fotografia de arranjo de microscopio de mutlicanal, contendo 3 microscopios identicos. Todos os componentes opticos sao montados em tubos de lentes. Na operagao do sistema de arranjo, as placas de petri sao carregadas em palataformas acrilicas que sao montadas em estagios de 2 eixos de inclinagao manual, o que permite ajuste do plano da imagem em relagao ao eixo optico. Estes estagios sao fixos a base do microscopio e nao se movimentam apos o imcio do alinhamento. Os modulos de iluminagao, que consistem de LEDs, lentes colimadoras, patch stops, e lentes condensadoras, sao montados em estagios xyz manual para posicionamento e foco da luz de iluminagao. Os modulos de imageamento, que consistem das objetivas, lentes acromaticas, e sensores CMOS, sao tambem montados em estagios xyz manual para posicionamento do campo de visao e foco das objetivas. Todos os 3 modulos de imageamento sao ligados a laminas lineares e suportadas por um unico brago de alavanca, que e atuado usando um motor de passo. Isto permite o foco controlado por computador e captura automatica de pilhas de imagens. Outros metodos de foco automatico bem como atuagao podem ser usados.
[0140] O arranjo de microscopio foi colocado dentro de uma incubadora padrao, conforme mostrado na Fig.. 23B. Os sensores de imagem CMOS sao conectados via conexao USB a um unico hub localizado dentro da incubadora, que e roteada para um PC externo junto com outras linhas de comunicagao e energia. Todos os cabos eletricos saem da incubadora atraves do centro de uma rolha de borracha vedada com cola de silicone.
[0141] O arranjo de microscopio descrito acima foi usado para registrar as imagens de lapso de tempo de desenvolvimento do embriao humano precoce e crescimento documentado dos estagios de zigoto a blastocisto. Quatro diferentes experimentos monitoraram um total de 242 embrioes. Deste grupo, 100 foram imageados ate o dia 5 ou 6; os outros foram removidos das estagoes de imageamento em varios pontos de tempo analise de expressao genica. Uma captura da tela do software de captura de imagem e embrioes imageados e mostrada na Fig. 24. As imagens foram capturadas a cada 5 minutos com grosseiramente 1 segundo de exposigao de luz baixa por imagem. A quantidade total de luz recebida pelas amostras foi equivalente a 24 minutos de exposigao continua, semelhante ao nivel total experimentado em uma clinics de IVF durante a manipulagao. A duragao de 1 segundo de exposigao de luz pode ser reduzida. Antes do trabalho com os embrioes humanos, realizamos experimentos extensivos de controle com embrioes de camundongos pre-implantagao para garantir que ambas as taxas de formagao de blastocisto e padroes de expressao genica nao foram afetados pelo processo de imageamento.
[0142] As Figs. 25 e 26 mostram imagens selecionadas a partir das sequencias de lapso de tempo. As imagens sao mostradas para o dia 1, dia 2,5, dia 4, e dia 5,5. Para a sequencia mostrada na Fig. 25, 3 de 9 embrioes se desenvolveram em blastocistos, e para a sequencia mostrada na Fig. 26, 5 de 12 embrioes se desenvolveram em blastocistos. Os embrioes individuais foram acompanhados ao longo do tempo, mesmo embora suas posigoes no campo fotografico alteragao conforme os embrioes foram submetidos por uma troca de meio no dia 3. O uso de meio sequencial e necessario para atingir os requisitos espedficos do estagio dos embrioes em desenvolvimento. Durante a troca de meio, os embrioes foram removidos da estagao de imageamento por alguns minutos e transferidos para novas placas de petri. Para manter a rastreabilidade da identidade de cada embriao durante a troca de meio, a transferencia de amostras de uma placa para outra foi filmada para verificar que os embrioes nao eram misturados. Este processo foi tambem usado durante a coleta de amostras para analise de expressao genica. A questao de rastreamento da identidade do embriao pode ser mitigada usando pogos para auxiliar o arranjo dos embrioes em uma ordem particular.
Placa Petri com micropogos
[0143] Quando transferindo as placas petri entre estagoes diferentes, os embrioes podem, as vezes, se movimentar ao redor, assim, tornando dificil manter a rastreabilidade da identidade do embriao. Isto representa um desafio quando o imageamento de lapso de tempo e realizado em uma estagao e os embrioes sao subsequentemente movimentados para uma segunda estagao para a selegao do embriao e transferencia. Um metodo e cultivar embrioes em placas petri individuais. No entanto, isto requer que cada embriao tenha su propria gota de meio. Em um procedimento de IVF tipico, e geralmente desejado cultivar todos os embrioes do paciente na mesma placa petri e na mesma gota de meio drop. Para direcionar este problema, desenhamos uma placa petri customizada com micropogos. Isto impede que os embrioes se movimentem e mantenham seus arranjos na placa petri quando transferidos para e da incubadora ou estagoes de imageamento. Alem disso, os pogos sao pequenos suficientes e espagados juntos de modo que possam compartilhar a mesma gota de meio e todos sejam visualizados simultaneamente pelo mesmo microscopio. A superficie inferior de cada micropogo tem um acabamento de qualidade optica. A Fig. 27A mostra um desenho com dimensoes para uma modalidade. Nesta versao, ha 25 micropogos espagados estreitamente dentro de um campo de visao de 1,7 x 1,7 mm. A Fig. 27B mostra uma visao 3D dos micropogos, que sao recuados aproximadamente 100 microns na superficie da placa. Os marcadores fidiciarios, incluindo letras, numeros, e outros marcadores, estao incluidos na placa para auxiliar a identificagao.
[0144] Todas as referencias citadas aqui estao incorporadas como referenda em suas totalidades.
EXEMPLOS
[0145] Os seguintes exemplos sao apresentados para fornecer, aos especialistas na tecnica, uma revelagao e descrigao de como preparar e usar a presente invengao, e nao sao intencionados para limitar o escopo do que os inventores consideram como suas invengoes nem sao intencionados para representar que os experimentos abaixo sao todos ou os unicos experimentos realizados. Foram feitos esforgos para garantir a precisao com relagao aos numeros usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios podem ser contabilizados. Salvo se indicado de outra forma, partes sao partes em peso, peso molecular e peso molecular medio ponderado, temperatura e em graus Centigrados, e pressao e a pressao atmosferica ou proxima a esta.
[0146] Fonte de Amostra
[0147] Todos os embrioes usados neste estudo foram coletados sobre um periodo de varios anos e fertilizados e crioperservados por multiplos embriologistas. O numero medio de embrioes por paciente em nosso estudo foi 3, e todos os grupos deidade encontrados em um centro de rotina de IVF foram incluidos. Notoriamente, todos os embrioes usados para estes experimentos foram gerados por IVF (conforme oposto ao ICSI), de modo que os embrioes foram derivados de espermatozoide que tinha fungao relativamente normal (pelo menos em termos de suas capacidades para penetrar o cumulus, zona, e oolemma e formam um pro-nucleo). Os protocolos de estimulagao foram protocolos de lupron de longa duragao padrao (cdc.gov/art). A criopreservagao de embrioes humanos supernumerarios foi conseguida colocando-os em meio de congelamento (1,2-propanediol 1,5 M + sacarose 0,2 M) por 25 minutos em temperatura ambiente (22 + 2oC). Os embrioes foram entao congelados usando um protocolo de congelamento lento (-1oC/min a -6,5oC; manter por 5 min; semear; manter por 5 min; - 0,5oC/min a -80oC; mergulho em nitrogenio tiquido). Comite. Nenhuma informagao de saude protegida poderia ser associada com os embrioes.
[0148] Um grande conjunto de embrioes criopreservados foi validado e as seguintes observagoes foram feitas: 1) Os embrioes demonstraram tempo indicativo de desenvolvimento normal do embriao em termos de marcos incluindo: Clivagem para 2 celulas (ocorreu precoce dia 2), imcio de degradagao de RNA (ocorreu nos dias 1 a 3), clivagem para 4 e 8 celulas (ocorreram tardia no dia 2 e dia 3, respectivamente), ativagao do genoma embrionario (no dia 3 do estagio de 8 celulas), e formagao de morula e blastocisto (ocorreu nos Dias Dias 4 e 5, respectivamente). 2) Os embrioes demonstraram eficiencia no alcance do estagio de blastocisto que e tipico dos embrioes obtidos em um ambiente ctinico. Isto e possivelmente devido ao fato de que os embrioes foram criopreservados no estagio 2PN e representaram o arranjo de embrioes encontrados em uma clmica de IVF uma vez que nenhuma “triagem” daqueles que poderia e nao poderia se desenvolver antes da criopreservagao no estagio de 1 (como e tipico de embrioes criopreservados tardiamente no desenvolvimento dos estagios do dia 3 ou blastocisto). Assim, nossos dados confirmam que estes embrioes apresentaram taxas de formagao de blastocisto semelhantes comparadas aquelas observadas em clmicas tipicas de IVF. 3) Estudos anteriores demonstraram que os embrioes que sao congelados no estagio de 2PN apresentam um potencial semelhante para desenvolvimento, implantagao, gravidez clmica e nascimento quando comparado a embrioes frescos. Outros estudos tambem apresentaram resultados semelhantes para oocitos congelados sugerindo que os eventos mais precoces de desenvolvimento do embriao humano mantem uma linha de tempo apropriada pos-criopreservagao. 4) Focamos nos parametros que nao eram dependentes de tempo de fertilizagao ou tempo de descongelamento. O primeiro parametro que medimos (duragao da primeira citocinese) e de curta duragao (cerca de 10 a 15 min) e nao e dependente do tempo de fertilizagao neste estudo (este e capaz de ser medido independentemente em todos os embrioes sem contar com o resultado final). Alem disso, todos os parametros subsequentes sao medidos em relagao a este ponto de medigao inicial e comprados entre os embrioes que se sucedem no desenvolvimento ao blastocisto e aqueles que nao conseguem. 5) Finalmente, observamos que os embrioes frescos (nao congelados) que estao 3PN sao conhecidos por se desenvolverem no mesmo prazo que embrioes normais frescos; comparamos os parametros em embrioes 3PN frescos que foram obtidos da clinics Stanford IVF, e observou-se que nao foram diferentes daqueles nossos embrioes criopreservados ou relatos publicados.
[0149] Plano experimental
[0150] Em quatro conjuntos experimentais, rastreamos o desenvolvimento de 242 embrioes em estagio pro-nuclear (61, 80, 64 e 37, respectivamente). Em cada conjunto de experimentos, zigotos humanos foram descongelados no dia 1 e cultivados em pequenos grupos em placas multiplas. Cada placa foi observada independentemente com microscopia de lapso de tempo sob iluminagao de campo escuro em estagoes separadas de imageamento. Em aproximadamente intervalos de 24 horas, uma placa de embrioes foi removida do sistema de imageamento e coletado em embrioes unicos e celulas unicas (blastomeros) para analise de expressao genica por PCR quantitativo em tempo real de alto rendimento. Cada placa tipicamente continha uma mistura de embrioes que alcangaram o estagio de desenvolvimento no momento da colheita (chamados “normais”) e aqueles que foram interrompidos ou atrasados em estagios mais cedo, ou fragmentados extensivamente (chamados “anormais”). Os embrioes foram analisados como embrioes unicos intactos ou foram desassociados em blastomeros simples seguido por amplificagao de RNA especifico por gene. Um subconjunto de embrioes (100 de 242) foi imageado ate o dia 5 ou 6 para monitorar a formagao de blastocisto.
[0151] Cultura de embriao humano e microscopia
[0152] Os embrioes humanos foram descongelados pela remogao de criofrascos do tanque de armazenamento de nitrogenio liquido e colocados em temperatura ambiente. Uma vez que o frasco tenha sido descongelado, foram abertos e os embrioes foram visualizados sob um microscopio dissecante. Os conteudos do fracos foram entao vertidos no fundo de uma placa de cultura 3003. Os embrioes foram localizados no drop e a sobrevivencia de cada embriao foi avaliada e registrada. Em temperatura ambiente, os embrioes foram transferidos para uma placa de cultura 3037 contendo 1,2 propanodiol 1,0 M + sacarose 0,2M por 5 minutos, em seguida 1,2 propanodiol 0,5 M + sacarose 0,2M por 5 minutos, e 1,2 propanodiol 0,0 M + sacarose 0,2M por 5 minutos. Subsequentemente, os embrioes foram cultivados em Meio de Clivagem de Quinn’s Advantage (CooperSurgical) complementado com Substituto de Proteins Serica 10% Quinn’s Advantage (SPS; CooperSurgical) entre o dia 1 a 3, e Meio Quinn’s Advantage Blastocisto (CooperSurgical) com 10% SPS apos o dia 3 usando microgotas sob oleo. Todos os experimentos usaram o mesmo tipo de meio de clivagem-estagio, exceto para duas estagoes durante o primeiro experimento, que usou um meio Global (LifeGlobal,Guilford, CT). Neste pequeno subconjunto (12 embrioes), os embrioes apresentaram uma taxa de formagao de blastocisto ligeiramente menor (3 de 12, ou 25%) mas a sensibilidade e especificidade de nossos parametros preditivos foram ambos 100% para este grupo.
[0153] O imageamento de lapso de tempo foi realizado em sistemas multiplos para acomodar a analise concorrente de mutliplas amostras bem como para validar a consistencia dos dados entre as diferentes plataformas. Os sistemas consistiram de 7 microscopios individuais: (1) dois microscopios Olympus IX-70/71 modificados equipados com estagios de aquecimento Tokai Hit, LEDs Luxeon de luz branca, e uma abertura de iluminagao de campo escuro; (2) dois microscopios Olympus CKX-40/41 modificados equipados com estagios de aquecimento, LEDs Luxeon de luz branca, e Iluminagao de Contraste de Modulagao Hoffman (nota: estes sistemas foram usados somente durante os primeiros 4 experimentos apos o que foi decidido que a iluminagao de campo escuro foi preferencial para medigao dos parametros); e (3) um arranjo customizado de microscopio em miniatura constrwdo de 3 canais que se ajusta dentro de uma incubadora padrao, equipado com LEDs Luxeon de luz branca e aberturas para iluminagao em campo escuro. Nao observamos nenhuma diferenga significativa no comportamento de desenvolvimento, taxa de formagao de blastocisto, ou perfil de expressao genica entre os embrioes cultivados nestes diferentes sistemas; de fato, nossos parametros para a previsao de blastocisto foram consistentes entre os mutliplos sistemas e experimentos.
[0154] A intensidade de luz para todos os sistemas foi significativamente menor do que a luz tipicamente usada em um microscopio de reprodugao assistida devido a baixa energia de LEDs (em relagao a uma lampada tipica de Halogenio de 100W) e alta sensibilidade dos sensores da camera. Usando um medidor de forga, determinados que a energia de um microscopio tipico de reprodugao assistida (Olympus IX-71 Hoffman Modulation Contrast) em um comprimento de onda de 473 nm varia grosseiramente de 7 a 10 mW dependendo da ampliagao, enquanto a energia de nossos sistemas de imageamento foram medidos para estar entre 0,2 e 0,3 mW no mesmo comprimento de onda. As imagens foram capturadas em um tempo de exposigao de 1 segundo a cada 5 minutos por ate 5 ou 6 dias, resultando em aproximadamente 24 minutos de exposigao a luz continua. Em uma energia de 0,3 mW, isto e equivalente a grosseiramente 1 minuto de exposigao sob um microscopio tipico de reprodugao assistida.
[0155] Para rastrear a identidade de cada embriao durante o imageamento correlacionado e experimento de expressao genica, instalamos uma camera de v^deo no estereomicroscopio e registramos o processo de transferencia de amostra durante a troca de meio e coleta de amostra. Realizamos experimentos de controle com embrioes de camundongos pre-implantagao (n = 56) e um pequeno subconjunto de embrioes humanos (n = 22), e nao observamos nenhuma diferenga significativa (p = 0,96) na taxa de formagao de blastocisto entre os embrioes imageados e os controles.
[0156] Analise de qRT-PCR de alto rendimento
[0157] Para analise de qRT-PCR de embrioes unicos ou blastomeros unicos, os embrioes foram primeiro tratados com solugao de Acido de Tyrode para remover a zona pelucida. Para coletar blastomeros simples, os embrioes foram incubados em meio Quinn’s Advantage livre de Ca2+Mg2+com HEPES (CooperSurgical) por 5 a 20 minutos a 37°C com pipetagao rigorosa. As amostras foram coletadas diretamente em 10 pl de tampao de reagao; em seguida reagao de uma etapa de transcrigao reversa /pre- amplificagao foi realizada conforme anteriormente predescrito. Grupos de iniciadores e misturas de sondas de 20X ABI ensaio-on-demand qRT-PCR (Applied Biosystems) foram usados como iniciadores espedficos para os genes durante as reacoes de transcrigao reversa e pre-amplificagao. Reagoes de alto rendimento de qRT-PCR foram realizadas com Fluidigm Biomark 96.96 Dynamic Arrays conforme anteriormente descrito usando o ensaio sob demanda ABI de sondas qRT-PCR. Todas as amostras foram carregadas em 3 ou 4 replicatas tecnicas. A analise dos dados de qRT-PCR foi realizada com qBasePlus (Biogazelle), Microsoft Excel, e um software customizado. Certos genes foram omitidos da analise dos dados devido a sua qualidade fraca de dados (por exemplo, curvas fracas de amplificagao de PCR) ou baixa consistencia devido a falta de expressao nos embrioes avaliados. Para a analise de idade de blastomero, o grupo de transcrito maternal usado incluiu DAZL, GDF3, IFITM1, STELLAR, SYCP3, VASA, GDF9, PDCD5, ZAR1 e ZP1, enquanto que o grupo de genes embrionarios inclui ATF7IP, CCNA1, EIF1AX, EIF4A3, H2AFZ, HSP70.1, JARID1B, LSM3, PABPC1, e SERTAD1. O valor de expressao de cada gene em relagao aos genes de referencia GAPDH e RPLP0, bem como em relagao ao medio, foi calculado usando os metodos geNorm e AACt. GAPDH e RPLP0 foram selecionados como genes de referencia para este estudo empiricamente baseado no valor de estabilidade de gene e coeficiente de variagao: 1,18 e 46% para GAPDH e 1,18 e 34% para RPLP0. Estes foram os mais estaveis entre os 10 genes housekeeping que testamos e bem dentro da faixa de um conjunto de amostra tipica heterogenea. Segundo, observamos que em blastomeros simples, conforme esperado, a quantidade de transcritos de RPLP0 e GAPDH diminuiu em aproximadamente 1 Ct valor por divisao entre estagio de 1 celula e 8 celulas, congruente com as expectativas de que cada celula herda aproximadamente metade do grupo de mRNA com cada divisao de clivagem, na ausencia de novos transcritos antes da EGA durante os primeiros 3 duas de desenvolvimento humano . Terceiro, observamos que o mvel de expressao destes genes de referencia nos blastomeros simples permaneceu entre os estagios de 8 celulas a morula, apos EGA ter comegado. No mvel de embriao intacto, os valores Ct de ambos RPLP0 e GAPDH permaneceram amplamente constantes ao longo do desenvolvimento ate o estagio de morula com um leve aumento no estagio de blastocisto talvez devido aos mveis aumentados de transcrito nos numeros maiores de blastomeros presentes. A maior parte da analise de expressao genica realizada neste estudo focou nos estagios de desenvolvimento antes do estagio da morula, no entanto, quando o mvel de expressao de genes de referencia foi extremamente estavel.
[0158] Rastreamento de celulas automatizado
[0159] Nosso algoritmo de rastreamento de celula usa uma estrutura probabiHstica baseada em metodos sequenciais de Monte Carlo, que no campo de visao do computador e geralmente referenciado como o filtro de particula. O filtro de particular rastreia a propagagao de tres principais variaveis ao longo do tempo: o estado, o controle e a medigao. A variavel de estado e um modelo de hum embriao e e representado como uma colegao de elipses. A variavel de controle e uma entrada que transforma a variavel de estado e consiste em nosso modelo de propagagao celular e divisao. A variavel de medigao e uma observagao do estado e consiste de nossas imagens adquiridas pelo lapso de ritmo microscopio. Nossa estimativa do estado atual de cada etapa de tempo e representada com uma distribuigao de probabilidade posterior, que e aproximada por um conjunto de amostras pesadas chamadas partfculas. Usamos os termos partfculas e modelos de embrioes de forma intercambiavel, onde uma particula e uma hipotese de um modelo de embriao em dado momento. Apos a inicializagao, o filtro de partfculas repetidamente aplica tres etapas: previsao, medigao, e atualizagao.
[0160] Previsao: As celulas sao representados como elipses no espago 2D, e cada celula tem uma orientagao e mdice de sobreposigao. O mdice de sobreposigao especifica a altura relativa das celulas. Em geral, existem dois tipos de comportamento que queremos prever: movimento celular e divisao celular. Para o movimento da celula, a nossa entrada de controle leva uma partfcula e, aleatoriamente, perturba cada parametro para cada celula, incluindo posigao, orientagao e comprimento dos eixos maior e menor. A perturbagao e aleatoriamente amostrada a partir de uma variancia normal de distribuigao com relativamente pequena (5% dos valores iniciadas). Para divisao celular, usamos a seguinte abordagem. Em certo ponto no tempo, para cada partfcula, designamos uma probabilidade de 50% que uma das celulas vai se dividir. Este valor foi escolhido de forma empmca, e abrange uma ampla faixa de possiveis divisoes celulares, mantendo uma boa cobertura da configuragao atual. Se uma divisao e prevista, entao, a celula em divisao e escolhida aleatoriamente. Quando uma celula e escolhida para se dividir, aplicamos a divisao simetrica ao longo do eixo maior da elipse, produzindo duas celulas filhas de igual tamanho e forma. Em seguida, aleatoriamente perturbarmos cada valor para as celulas filhas. Finalmente, selecionamos aleatoriamente os mdices de sobreposigao das duas celulas filhas, mantendo a sua sobreposigao coletiva em relagao ao resto das celulas.
[0161] Apos a aplicagao da entrada de controle, convertemos cada partfcula em uma imagem simulada. Isto e conseguido pela projegao da forma etfptica de cada celula para a imagem simulada utilizando o mdice de sobreposigao. Os valores de pixel correspondentes sao definidos para um valor binario de 1 e dilatados para criar uma espessura da membrana comparavel aos dados de imagem observados. Uma vez que os embrioes sao parcialmente transparentes e fora de foco de luz sao coletados, as membranas celulares, na parte inferior do embriao sao apenas algumas vezes visiveis. Por conseguinte, as membranas celulares oclwdos sao adicionadas com probabilidade de 10%. Na pratica, verificou-se que estes pontos de membrana oclwdos sao cruciais para a modelagem da forma exata, mas e importante para torna-los esparso suficiente de modo que eles nao se paregam uma borda visivel.
[0162] Medicao: Uma vez que geramos uma distribuigao de modelos hipoteticos, as imagens correspondentes simuladas sao comparados com a imagem real do microscopio. A imagem do microscopio e pre-processada para criar uma imagem binaria de membranas celulares usando um prindpio do metodo baseado na curvatura seguido por limiarizagao. A precisao da comparagao e avaliada utilizando uma distancia de chanfro simetrica truncada, que e entao usada para atribuir um peso, ou a probabilidade, para cada partfcula.
[0163] Atuali-acao: Depois de pesos serem atribwdos, as partfculas sao selecionadas em proporgao com estes pesos para criar um novo conjunto de partfculas para a iteragao seguinte. Esta concentra a distribuigao de particulas na regiao de maior probabilidade. Partfculas com probabilidade baixa sao descartadas, enquanto as partfculas com alta probabilidade sao multiplicados. A nova amostragem de partfculas e realizada utilizando o metodo de variancia baixa.
[0164] Uma vez que os embrioes foram modelados, podemos extrair a dinamica de parametros de imageamento como a duragao da citocinese e tempo entre mitose, como discutido no texto principal. O nosso software de rastreamento de celulas foi anteriormente implementado em Matlab, e tempos de computagao variaram de alguns segundos para meio minuto para cada imagem, dependendo do numero de partfculas. A nossa versao atual do software e implementada em C, e tempos de computagao variam de 1 a 5 segundos, dependendo do numero de partfculas.
EXEMPLO 1
[0165] Analise de imageamento para determinar o potencial de desenvolvimento de embrioes.
METODOS
[0166] As celulas de embrioes humanos 1 congeladas, tambem referidas como zigotos, foram descongeladas e colocados em cultura e sob condigoes de cultura como aqueles utilizados em procedimentos de IVF. Como descrito em mais detalhe acima, estes embrioes parecem ser representativos da populagao de fertilizagao in vitro tipica (IVF) como foram congelados no estagio 2PN e, assim, indiscriminadamente criopreservadas. Isto esta em contraste com embrioes tipicamente criopreservados em estagios posteriores de desenvolvimento apos a transferencia daqueles percebidos como sendo da mais alta qualidade durante ciclos frescos. Para alguns experimentos, os embrioes foram colocados em uma placa de cultura padrao. Para outros experimentos, os embrioes foram cultivados em placa de cultura customizada com micropogos de qualidade optica.
[0167] Os embrioes de crescimento, tipicamente entre 1 a 30 por placa, foram acompanhados individualmente por imageamento de lapso de tempo com um microscopio controlado por computador equipado para armazenamento de imagem digital e analise. Em alguns casos, o imageamento de lapso de ritmo foi realizado com microscopios invertidos equipados com estagios aquecidos e camaras de incubagao. Em outros casos, o imageamento de lapso de tempo foi realizado com arranjos de microscopicos em miniaturas customizados que se ajustam dentro de uma incubadora convencional, o que permitiu a cultura concorrente de multiplas placas de amostras na mesma incubadora e foi escalavel para acomodar com multiplos canais sem limitagoes no intervalo de tempo mmimo entre a captura de imagem sucessiva. O uso de multiplos microscopios tambem elimina a necessidade de movimentar a amostra, o que melhora a precisao do sistema e a confianga geral no sistema. Os sistemas de imageamento usam iluminagao de campo escuro, que forneceu contraste de imagem melhorada para posterior extragao de caractensticas e analise de imagem, embora notou-se que outras iluminagoes teriam sido suficientes. Os microscopios individuais na incubadora foram isolados um do outro, fornecendo cada placa de cultura com o seu proprio ambiente controlado. Isto permite que as placas sejam transformadas para e a partir das estagoes de imageamento sem perturbar o ambiente das outras amostras.
[0168] As imagens lapso de tempo foram coletadas para analise subsequente da morfologia celular, incluindo medigao da pelo menos um dos seguintes parametros celulares: a duragao do primeiro citocinese, o intervalo o ritmo de entre primeira e segunda divisao celular, e o intervalo de tempo entre a segunda e a terceira divisao celular. As imagens apresentadas nas figuras foram tomadas em tempo de exposigao de 1 segundo a cada 5 minutos por ate 5 ou 6 dias. Como descrito em maior detalhe abaixo, a primeira citocinese ocorre geralmente um dia apos a fertilizagao e dura entre cerca de 14 minutos. As primeira e segunda divisoes celulares sao geralmente separadas por uma media de cerca de 11 horas. As segunda e terceira divisoes celulares sao geralmente separadas por uma media de cerca de 1 hora. Assim, o imageamento foi durante um periodo de tempo de duragao de aproximadamente 36 horas (mais ou menos varias horas) apos a fertilizagao.
RESULTADOS
[0169] O cronograma de desenvolvimento de um embriao humano saudavel pre- implantagao na cultura foi documentado por um periodo de seis dias por dia de lapso de tempo imageamento (Fig. 2). Foi observado que um zigoto normal humano passa por uma primeira divisao de clivagem cedo no dia 2. Subsequentemente, o embriao cliva para um embriao tardio de 4 celulas e 8 celulas no dia 2 e dia 3 respectivamente, antes de se compactar em uma morula no dia 4. A primeira diferenciagao celular morfologicamente evidente e observada no dia 5 e 6 durante a formagao de blastocisto, quando os blastomeros totipotentes se diferenciam em celulas trofoectodermicas, o que gera as estruturas extra embrionarias como a placenta, ou massa celular interna, que se desenvolve no feto in vivo e celulas tronco embrionarias pluripotentes in vitro.
[0170] A seguir, rastreamos o desenvolvimento de 242 embrioes fertilizados normalmente em quatro conjuntos de experimentos independentes e documentamos a distribuigao de embrioes normais e interrompidos entre as amostras que foram cultivadas para dia 5 ou 6. Dos 242 embrioes, 100 foram cultivadas para dia 5 ou 6 e a taxa de formagao de blastocisto observou-se estar entre 33% a 53%, semelhante a taxa de formagao de blastocisto em crinica ripica de IFV (Fig. 3). Os embrioes interrompidos restantes nos diferentes estagios de desenvolvimento, mais comumente estagios entre 2 celulas e 8 celulas, e foram definidos como anormal (Fig. 3). A fim de identificar parametros quantitativos de imageamento que predizem o sucesso em desenvolvimento do embriao para o estagio de blastocisto, extraimos e analisamos varios parametros a partir de v^deos de lapso de tempo, incluindo tamanho de blastomero, a espessura da zona pelucida, grau de fragmentagao, o comprimento dois primeiros ciclos celulares, intervalos de tempo entre as primeiras mitoses e duragao da primeira citocinese. Durante a analise de imagens de v^deo de ambos os embrioes em desenvolvimento normais e anormais, observamos que muitos embrioes interrompidos passaram por citocinese anormal durante a primeira divisao celular. Embrioes normais completaram a citocinese em uma janela de tempo estreita de 14,3 +/-6,0 min a partir de aparecimento dos sulcos de clivagem para completar a separagao das celulas filhas, de modo plano e controlado. Isto e mostrado na Fig. 4 superior. Em contraste, embrioes anormais comumente mostraram um de dois fenotipos anormais de citocinese. No fenotipo mais brando, a morfologia e mecanismo da citocinese pareceram normais, mas o tempo necessario para completar o processo foi mais longo, variando desde alguns poucos minutos adicionais para um horas (Fig. 4). Ocasionalmente, um embriao que passou por uma citocinese ligeiramente prolongada ainda se desenvolveu em um blastocisto. No fenotipo mais grave, a morfologia e mecanismo da citocinese foram perturbados. Por exemplo, como mostrado no exemplo no painel inferior da Fig. 4, os embrioes formaram um sulco de clivagem unilateral e foram submetidos a uma serie incomum de eventos de enrugamento da membrana por varias horas antes de finalmente se fragmentarem em componentes menores. Outras variagoes desse tipo de comportamento tambem foram observadas. Alem disso, embrioes anormais demonstrando esses fenotipos mais graves frequentemente se tornaram fragmentados, fornecendo evidencias diretas de que a fragmentagao do embriao e provavelmente um subproduto da citocinese anormal subsequentemente resulta em desenvolvimento anormal do embriao.
[0171] A analise detalhada dos nossos resultados de imageamento indicou que embrioes normais seguiram tempo rigoroso na citocinese e mitose durante as divisoes iniciais, antes de a ativagao do gene embrionario (EGA) comegar, sugerindo que o potencial de desenvolvimento de um embriao e predeterminado pelo programas maternos herdados. Em particular, observamos tres intervalos temporais, ou parametros, nos ciclos celulares do embriao em estagio inicial que eram estritamente regulados: (1) duragao da primeira citocinese, (2) intervalo de tempo entre a mitose primeira e segunda, e (3) sincronicidade da segunda e terceira mitoses. A relacao entre estes tres intervalos de tempo e as modificagoes morfologicas e mostrada na Fig. 5. Para embrioes normais, medimos estes parametros como sendo, aproximadamente, 14,3 +/- 6,0 minutos, 11,1 +/2,1 horas, e 1,0 +/- 1,6 horas, respectivamente (mostrados aqui como desvio padrao medio mais/menos).
[0172] Tambem foram realizados imageamento em um pequeno conjunto (n=10) de embrioes frescos (nao-criopreservados) que eram 3PN (triploide) desde o estagio de uma unica celula. Embrioes 3PN tem demonstrado seguir o mesmo cronograma de eventos de referencia que os embrioes normais frescos atraves de pelo menos os tres primeiros ciclos celulares. Estes embrioes foram imageados antes de nossos principais experimentos para validar os sistemas de imageamento (mas por razoes tecnicas nao foram acompanhados fora de blastocisto). Fora deste conjunto de embrioes frescos, 3 dos embrioes seguiram um cronograma de eventos semelhantes que nossos embrioes criopreservados 2PN e com duracao da citocinese variando de 15 a 30 min, tempo entre a primeira e segunda mitoses variando de 9,6 a 13,8 horas, e tempo entre segunda e terceira mitose variando de 0,3 a 1,0 hora. No entanto, em 7 dos embrioes observamos um fenotipo unico de citocinese que foi caracterizado pelo aparecimento simultaneo de 3 sulcos de clivagem, uma citocinese ligeiramente prolongada, e, finalmente, a separacao em tres celulas filhas (Fig. 4). Estes embrioes tiveram uma duracao da citocinese variando de 15 a 70 min (caracterizadas como o tempo entre o imcio do sulco de clivagem ate a separacao completa em 3 celulas filhas), tempo entre a primeira e segunda mitoses (3 celula para 4 celulas) variando de 8,7 a 12,7 horas, e tempo entre segunda e terceira mitose (4 celulas a 5 celulas) que variam de 0,3 a 2,6 horas. Esta observacao, juntamente com a variada gama de fenotipos de citocinese apresentada por embrioes anormais, sugere que nossos embrioes criopreservados nao sao atrasados no desenvolvimento pelo processo de criopreservacao e se comportam de forma semelhante aos zigotos frescos que se clivam em 2 blastomeros.
[0173] Embrioes que atingiram o estagio de blastocisto poderiam ser previstos, com sensibilidade e especificidade de 94% e 93% respectivamente, tendo uma primeira citocinese de entre 0 a 33 min, um tempo entre primeira e segunda mitose de entre 7,8 a 14,3 horas, e um tempo entre segunda e terceira mitose de entre 0 a 5,8 horas (Fig. 6). Por outro lado, previu-se que os embrioes que apresentaram valores fora de um mais destas janelas foram interrompidos. Todos os embrioes normais se desenvolveram com sucesso em um blastocisto apresentaram valores semelhantes em todos os tres parametros. Em contraste, os embrioes anormais apresentaram uma quantidade muito alta de variabilidade nos periodos de tempo que levaram para completar os intervalos (Fig. 6). Observamos que (1) um periodo mais longo de tempo para completar a primeira citocinese do que o normal indica fraco potencial de desenvolvimento; (2) um intervalo maior ou menor entre primeira e segunda divisoes celulares do que a normal indica fraco potencial de desenvolvimento; e (3) um intervalo de tempo maior entre a segunda e terceira divisoes celulares do que o normal indica fraco potencial de desenvolvimento. Assim, estes parametros foram preditivos da capacidade de o embriao em proceder a formagao de blastocisto e qualidade de blastocisto.
[0174] Finalmente, observamos que enquanto cada parametro foi autonomamente preditivo do potencial de desenvolvimento do embriao, o uso de todos os tres parametros forneceu sensibilidade e especificidade que ambos excederam 90%, com um ponto de cutoff de 3 vezes os desvios padroes. A curva de caracteristica de operagao de receptor (ROC) para estes parametros e mostrada na Fig. 7. A curva nesta Figura mostra a taxa de verdadeiros positivos (sensibilidade) versus a taxa de falsos positivos (1 - especificidade) para varios desvios padrao de cutoff. Para chegar neste ROC, os seguintes numeros foram utilizados: Numero de positivos verdadeiros = 34 (corretamente previsto para alcangar blastocisto), numero de verdadeiros negativos = 54 (corretamente previsto para interromper), numero de falsos positivos = 4 (incorretamente previsto para chegar a blastocisto), numero de falsos negativos = 2 (incorretamente previsto para interromper).
DISCUSSAO
[0175] Nossa analise indica que embrioes que seguem calendario rigoroso na mitose e citocinese durante as primeiras tres divisoes de clivagem sao muito mais propensos a se desenvolver para a fase de blastocisto e formar um blastocisto de alta qualidade com uma massa celular interna expandida (ICM). Os parametros dinamicos morfologicas podem ser usados para selecionar os embrioes otimos para transferencia ou criopreservagao durante um procedimento de IFV. Estes parametros tambem podem ser usados para distinguir entre diferentes qualidades de blastocisto, permitindo uma classificagao de potenciais relativos de desenvolvimento de embrioes dentro de um grupo. A pratica padrao em cHnicas de IVF e transferir na no estagio de 8 celulas (dia-3). Algumas cHnicas escolhem cultivar embrioes para o estagio de blastocisto (dia 5), uma vez que a transferencia de blastocisto tem ate duas vezes as taxas de implantagao comparadas com a transferencia no dia 3. No entanto, muitas cHnicas evitam a cultura prolongada devido ao risco aumentado de transtornos epigeneticos. Os parametros preditivos de imageamento podem ser usados para prever a viabilidade do embriao por um estagio de 4 celulas (no dia 2) e antes da ativagao do gene embrionario. Isto pode permitir a transferencia ou a crio-preservagao de embrioes um dia inteiro antes do que e tipicamente praticado e antes de os embrioes sofrerem alteragoes significativas nos seus programas moleculares. Isso tambem pode permitir que os embrioes mais ideais sejam selecionados para PGD ou outros tipos de analise.
EXEMPLO 2
[0176] A validagao de parametros de imageamento atraves de analise de expressao genica, e uso de analise de expressao genica para determinar potencial de desenvolvimento.
METODOS
[0177] As celulas de embrioes humanos 1 congeladas, tambem referidas como zigotos, foram descongeladas e colocados em cultura e sob condigoes de cultura como aquelas utilizados em procedimentos de IVF. Para alguns experimentos, os embrioes foram colocados em uma placa de cultura padrao. Para outros experimentos, os embrioes foram cultivados em placa de cultura customizada com micropogos de qualidade optica.
[0178] Os embrioes foram removidos a partir da cultura e do sistema de imageamento e coletados como embrioes individuais ou celulas individuais (blastomeros) para analise de expressao genica. Cada placa normalmente continha uma mistura de embrioes, com alguns atingindo o estagio de desenvolvimento esperado no momento da colheita, e outros interrompidos em estagios precoces do desenvolvimento ou extensivamente fragmentados. Aqueles que atingiram o estagio de desenvolvimento esperado no momento da colheita foram classificados como "normais", enquanto aqueles que foram interrompidos foram considerados "anormais. Por Exemplo, quando uma placa de embrioes foi removida a partir da estagao imageamento no dia 2 tardio para a coleta de amostra, qualquer embriao que tinha atingido o estagio de 4 celulas e alem poderia ser identificado como normal, enquanto aqueles que nao conseguiram atingir o estagio de 4 celulas seria rotulados como interrompidos. Estes embrioes interrompidos foram classificados pelo estagio de desenvolvimento no qual se tornaram interrompidos, de modo que um embriao com apenas 2 blastomeros no dia 2 tardia poderia ser analisado como um embriao interrompido em 2 celulas. Cuidados foram tomados para excluir os embrioes que morfologicamente pareceram estar mortos e porosos no momento da coleta da amostra (por exemplo, blastomeros degenerados). Apenas embrioes que pareciam vivos (tanto para normais quanto interrompidos) foram utilizadas para analise de expressao genica. No entanto, e possivel que embrioes que pareciam normais durante o momento da coleta pudessem por fim estar interrompidos se foram deixadas crescer em um estagio tardio. Analise representativa de expressao genica de embrioes de cada uma destas classes foi realizada por RT-PCR quantitativo (qRT-PCR). Em intervalos de aproximadamente 24 horas, os embrioes foram coletados a partir dos sistemas individuais de imageamento para analise de expressao genica em qRT-PCR de alto rendimento com reagoes multiplex de ate 96 genes avaliados contra 96 amostras. A analise de expressao genica foi realizada com o Sistema Fluidigm Biomark, que pode realizar ate 9216 reagoes simultaneas de qRT-PCR baseadas em TaqMan em quantidades de nanolitros.
RESULTADOS
[0179] A fim de elucidar os mecanismos moleculares que podem estar subjacentes aos eventos morfologicos, foi realizada correlagao de perfis de expressao genica. Os mveis de expressao de 96 genes diferentes que pertencem a diferentes categorias foram ensaiadas por amostra, incluindo os genes housekeeping, marcadores de celulas germinativas, fatores maternos, marcadores EGA, marcadores trofoblasticos, marcadores de massa celular interna, marcadores pluripotencia, reguladores epigeneticos, fatores de transcrigao, receptores de hormonios e outros (Tabela 1, na Figura 19). Dois conjuntos ligeiramente diferentes, mas que se sobrepoem, de genes foram avaliados em dois conjuntos diferentes experimentais, proporcionando um conjunto unico de genes de diagnostico embriao humano de destino. Os conjuntos de genes unicos foram compilados a partir de dados sobre expressao genica em embrioes de organismos modelos ou em celulas tronco embrionarias humanas, bem como de nossos proprios dados de microarranjos ineditos. O estado de expressao destes conjuntos de genes em embrioes humanos preimplantagao e revelado pela primeira vez no presente estudo.
[0180] O valor de expressao de cada gene em relagao a genes de referencia GAPDH e RPLPO, bem como em relagao ao gene medio, foi calculado usando a geNorm (El Toukhy T, et al. (2009) Hum Reprod) e AACt (Vanneste E, et al. (2009) Nat Med 15:577- 83) metodos. O valor da estabilidade genetica e coeficiente de variagao foram 1,18 e 46% para GAPDH e 1,18 e 34% para RPLPO, o mais estavel entre os 10 genes housekeeping que testamos e bem dentro da faixa de um conjunto de amostra heterogenea. Em blastomeros simples, como esperado, a quantidade de transcritos de RPLPO e GAPDH diminuiu aproximadamente 1 valor Ct por divisao entre uma os estagios de 1 celula e 8 celulas, devido ao efeito de redugao pela metade da divisao de clivagem, bem como a falta de EGA durante os primeiros 3 dias do desenvolvimento humano. O mvel de expressao destes genes de referencia nos blastomeros simples permaneceu estavel entre os estagios de 8 celulas a morula. Em mvel do embriao total, os valores de Ct de ambos RPLPO e GAPDH mantiveram-se em grande parte constante ao longo do desenvolvimento ate a fase de morula. O mvel de expressao de RPLPO e GAPDH e aumentou significativamente nos blastocistos, provavelmente devido ao numero aumentado de blastomeros presentes. Estas variagoes nao afetaram a validade de RPLPO e GAPDH como genes de referencia. A maior parte da analise de expressao genica realizada neste estudo focou nos estagios de desenvolvimento antes do estagio da morula, quando o mvel de expressao de genes de referencia foi extremamente estavel.
[0181] Expressao genica diferencial entre embrioes normais e anormais. A Fig. 8 mostra o mvel de expressao medio de 52 genes de 6 anormais 1- para embrioes de 2 celulas e 5 normais 1- a embrioes de 2 celulas plotados em um grafico radar em uma escala logaritmica. Os embrioes interrompidos em geral mostraram uma quantidade reduzida de mRNA em comparagao com embrioes normais que facilitaram a citocinese, o processamento de RNA e biogenese miRNA mais gravemente afetados. Os genes destacados com um asterisco indicam uma diferenga estatisticamente significativa (p <0,05) entre embrioes normais e anormais, conforme determinado pelo teste de Mann- Whitney. Estes 18 genes sao Cofilina, DIAPH1, ECT2, MYLC2, DGCR8, Dicer, TARBP2, CPEB1, Symplekin, YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2, BTF3 e NELF. Cada gene pertence a um grupo, conforme indicado na Figura, a saber Citocinese: Cofilina, DIAPH1, ECT2 e MYCL2; biogenese miRNA: DGCR8, Dicer e TARBP2; processamento de RNA: YBX2; fatores maternos: ZAR1; housekeeping: CTNNB1; pluripotencia: DNMT3B, TERT e YY1; receptor: IGFR2, e fator de transcricao: BTF3 e NELF. Na maioria dos casos, a expressao destes genes foi maior normal 1 - e embrioes de 2 celulas do que em interrompido 1 - e embrioes de 2 celulas.
[0182] Curiosamente, certas categorias de genes determinadas foram mais afetadas em embrioes anormais do que outros. Por exemplo, em embrioes anormais, a maioria dos genes housekeeping, receptores de hormonas e fatores maternos nao foram significativamente alterados na expressao genica, enquanto que muitos genes envolvidos na citocinese e biogenese de miRNA apresentaram expressao significativamente reduzida. Alem disso, entre os genes que foram afetados, alguns genes mostraram uma diferenca muito maior entre embrioes normais e anormais do que outros. Por exemplo, genes envolvidos na via de biogenese de miRNA, como DGCR8, Dicer e TARBP2, apresentaram mveis de expressao muito reduzidas em embrioes anormais. Notavelmente, CPEB1 e Symplekin, dois dos genes mais gravemente afetados, pertencentes ao mesmo mecanismo molecular que regula a armazenagem de mRNA materno e reativacao atraves da manipulacao do comprimento de poli(A) cauda de transcrito (Bettegowda, A. et al. (2007) Front. Biosci. 12:3713-3726). Estes dados sugerem que a anormalidade do embriao se correlaciona com defetios no programa de regulacao de mRNA do embriao.
[0183] Correlacionando citocinese com perfis de expressao genica. Analise de expressao genica foi realizada com genes que codificavam para os componentes chaves de citocinese. A identidade de cada embriao foi rastreada atraves da instalacao de uma camera na stereomicroscopio e gravagao de v^deo do processo de transferencia de amostra durante a troca de meio e coleta de amostras. Ao avaliar os perfis de expressao genica de embrioes anormais, observamos uma forte correlacao entre citocinese anormal e menor mvel de expressao genica em componentes chaves de citocinese. Curiosamente, os perfis de expressao genica de embrioes anormais foram tao diversos e variaveis como os seus fenotipos morfologicos anormais.
[0184] Foi descoberto que a expressao genica de citocinese variou entre embrioes normais de 2 celulas e embrioes anormais de 2 celulas (Fig. 9) e como entre embrioes normais e anormais de 4 celulas (Fig. 10). As Figs. 9 e 10 mostram as expressoes relativas dos genes que sao mais altamente expressos em embrioes humanos normais de 2 celulas (Fig. 9) e embrioes normais de 4 celulas (Fig. 10), correlacionados com os diferentes fenotipos de citocinese. Como representado na Fig. 9, um embriao interrompido de 2 celulas que mostrou enrugamento anormal de membrana durante a primeira citocinese tinha mvel de expressao significativamente reduzido de todos os genes reguladores de citocinese testados. Os genes que mostram diferengas na Fig. 9 sao anilina, cofilina, DIAPH1, DIAPH2, DNM2, ECT2, MKLP2, MYCL2 e RhoA. Os mveis de expressao normais sao mostrados nas barras a direita e podem ser observados como maiores em cada gene. Nas fotografias acima dos graficos da Figura 9, mostrando embrioes anormais de duas celulas, a barra de escala representa 50 |im. Fig. 10 mostra resultados de um embriao interrompido de 4 celulas que passou por uma citocinese anormal com um sulco unilateral de citocinese e citocinese extremamente prolongadao durante a primeira divisao mostraram expressao diminmda nos reguladores de citocinese Anilina e ECT2. A Barra de escala na Fig. 10 representa tambem 50 |im.
[0185] Padroes de expressao genica espedficos de estagio embrionario. Fig. 11 mostra quatro Padroes Especii’icos do Estagio Embrionario (ESSPs) que foram identificados durante a analise de expressao genica de 141 embrioes simples normalmente desenvolvidos e blastomeros simples. Os genes que se enquadram em cada um dos quatro ESSPs estao listados na Tabela 2 (Fig. 20). Os graficos da Fig. 11 foram criados atraves do agrupamento de genes com base em padroes de expressao semelhantes e uma media de seus valores de expressao (em relagao aos genes de referenda). O mvel de expressao relativa de um ESSP foi calculado ponderando os mveis medios de expressao de genes com padroes de expressao semelhantes. Mveis de expressao genica sao plotados contra estagios diferentes de celulas, ou seja, 1c = uma celula; M = morula, B = blastocisto. Na fig. 11, a expressao relativa de genes em cada um dos quatro ESSPs e mostrada como uma fungao de desenvolvimento, de 1 celula (1c) para morula e blastocisto. ESSP1 mostra heranga materina, ESSP2 mostra a ativagao da transcrigao do gene, ESSP3 mostra ativagao do estagio tardio, e ESSP4 mostra transcrigoes persistentes. Conforme indicado na ESSP2, o ponto de transferencia tipico em uma clmica de IVF ocorre no dia 3, quando os embrioes sao submetidos a mudangas significativas de desenvolvimento, devido a ativagao do gene embrionario. Os dados de imagem de lapso de tempo indicam que o potencial de desenvolvimento de um embriao pode ser identificado pelo estagio de 4 celulas, assim, permitindo a transferencia precoce de embrioes no dia 2 e antes desta ativagao do gene. Esta transferencia precoce e util para melhorar a taxa de sucesso de procedimentos de IVF.
[0186] Tabela 2 (Fig. 20) lista os genes que pertencem a cada um dos quatro ESSPs identificados. O mvel de expressao genica relativo de cada gene foi calculado contra genes de referencia (GAPDH e RPLPO) e em relagao a media do gene. O padrao de expressao de cada gene contra cronograma de desenvolvimento do embriao seguido um dos quatro ESSPs seguintes: Padrao ESSP (1) em estagio precoce: genes que iniciam alta, lentamente se degradam, e se desligam antes de blastocisto, padrao ESSP (2) Estagio intermediario: genes que se transformam em estagio de 4 celulas, padrao ESSP (3) fase tardia: genes que se transformam em morula ou blastocisto, e padrao ESSP (4) Constante: genes que tem valores de expressao relativamente constante.
[0187] ESSP1 descreveu o padrao de genes maternalmente herdados. Essas transcrigoes comegaram com um mvel alto de expressao na fase de zigoto e subsequentemente declinou conforme os embrioes se desenvolveram em blastocistos. A meia-vida destes transcritos foi aproximadamente 21 horas. Fatores maternos classicos de outros organismos modelos, como GDF9 e ZAR1, bem como genes espedficos de celulas germinativas (oocito) VASA e DAZL ficaram nesta categoria. ESSP2 incluiu os genes embrionarios ativados, que foram primeiro transcritos nos embrioes apos o estagio de 4 celulas. Alguns genes nesta categoria pareceram apresentar duas ondas de ativagao, a primeira e menor no estagio de 5 a 6 celulas, e a segunda e maior na fase de 8 celulas. Genes EGA conhecidos de outros modelos de organismos, Como EIF1AX31 e JARID1 B32, ficaram nesta categoria. ESSP3 foi composta de genes ativados tardiamente que nao foram expressos ate o estagio de blastocisto, incluindo o marcador de trofoblasto GCM1. ESSP4 continha transcrigoes persistentes que mantiveram a expressao estavel em relacao a um gene de referencia ao longo do desenvolvimento. A meia-vida de tais genes foi de 193 horas, aproximadamente 9 vezes mais longa do que ESSP1. Esta categoria incluiu uma mistura de genes housekeeping, fatores de transcrigao, reguladores epigeneticos, receptores de hormonios e outros. Estes 4 padroes de expressao genica foram confirmados em outro conjunto de experimentos utilizando 61 amostras de embrioes simples normais e blastomeros.
[0188] Embrioes anormais apresentam comportamento citocinetio anormal e mitotico anormal durante as primeiras divisoes, correlacionados com perfis de expressao genica altamente irregulares, especialmente nos genes envolvidos na gestao de RNA embrionario. Assim, pode-se combinar estas metodologias para fornecer metodos que podem ser utilizados para prever viabilidade de pre-implantacao do embriao. Os resultados sugerem que embrioes anormais comeca a vida com programas defeituosos no processamento do RNA e biogenese de miRNA, causando a degradacao excessiva do mRNA materno. A natureza estocastica de tal degradagao de RNA nao regulado leva a destruicao aleatoria de transcricoes, causando a grande variedade de fenotipos anormais observada em embrioes anormais. O mvel diminmdo de miRNAs gera defeitos na degradacao regular de RNA materno, levando a interrupcao de desenvolvimento in diferentes estagios.
[0189] Analise de blastomero individual. A fim de avaliar quando a diferenciagao molecular comegou em embrioes humanos pre-implantagao, o mvel de expressao de CDX2 em simples blastomeros colhidos a partir de 17 embrioes em diferentes estagios de desenvolvimento foi analisada. Fig. 12A mostra o mvel de expressao relativa de dois genes, CTBBN1 (barras escuras) e CDX2 (barras claras) como uma fungao do estagio de desenvolvimento, a partir de 2 celulas para blastocisto. Como pode ser observado, CDX2 foi expresso esporadicamente em mveis baixos, em alguns blastomeros simples de embrioes antes do estagio de 4 celulas (Fig. 12A). No entanto, a partir do estagio de 6 celulas, cada embriao continha pelo menos 1 blastomero que expressou CDX2 a um mvel significativo. O mvel de expressao do gene housekeeping CTNNB1 tambem mostrado na fig. 12A se manteve constante entre blastomeros a partir do mesmo embriao, indicando que o padrao de expressao heterogeneo de CDX2 nao era um artefato qPCR. Os dados de uma experiencia independente demonstram observances semelhantes. Estes resultados indicam que a diferenciagao molecular em embrioes humanos preimplantagao pode ocorrer tao cedo como imediatamente apos o estagio de 4 celulas.
[0190] Curiosamente, a inspegao de perfis de expressao genica em blastomeros simples revelou embrioes que continham blastomeros com assinaturas de expressao genica correspondentes a diferentes idades de desenvolvimento. O perfil de expressao genica de qualquer embriao em qualquer dado momento e igual a soma de degradagao do mRNA materno e EGA. Um blastomero mais jovem em idade de desenvolvimento precoce geralmente contem uma elevada quantidade de transcrigoes maternas e uma baixa quantidade de genes zigoticos, e o oposto e verdadeiro para um blastomero mais velho em uma idade mais avangada de desenvolvimento. Nesta experiencia, o programa material foi definido como os valores medios de expressao de 10 marcadores ESSP1 (transcrigoes maternas), e o programa embrionario pelos valores de expressao medios de 10 marcadores ESSP2 (transcrigoes embrionarias). O grupo de transcrigao maternal usado inclui DAZL, GDF3, IFITM1, STELLAR, SYCP3, VASA, GDF9, PDCD5, ZAR1 e ZP1, enquanto que o grupo de genes embrionarios inclui ATF7IP, CCNA1, EIF1 AX, EIF4A3, H2AFZ, HSP70,1, JARID1 B, LSM3, PABPC1, e SERTAD1 . Entre os 6 blastomeros com coletados com sucesso a partir deste embriao particular de 8 celulas, 3 blastomeros apresentaram uma expressao de assinatura genetica semelhante aos blastomeros de uma amostra de embriao normal de 3 celulas, enquanto os outros 3 blastomeros foram semelhantes aos blastomeros de uma amostra normal de embriao de 8 celulas (Fig. . 12B). A explicagao mais provavel desta observagao e a interrupgao de uma sub-populagao de celulas dentro do embriao. Este fenotipo de interrupgao parcial foi tambem observado em outro embriao de 9 celulas e 2 morulas entre as amostras testadas. O fato de que o mvel de transcrigao materna manteve-se elevado nos blastomeros interrompidos, que gastaram a mesma quantidade de tempo na cultura como as suas celulas irmas normais, indica que a degradagao do RNA materno nao e um processo espontaneo que simplesmente ocorre ao longo do tempo, mas muito provavelmente requer o funcionamento do mecanismo especifico de degradagao de RNA como microRNAs (miRNAs). Estes dados tambem fornecem evidencia adicional de que a degradagao do mRNA materno e um evento de desenvolvimento conservado durante a embriogenese de mamiferos e e necessario para o desenvolvimento normal do embriao (Bettegowda, A., et al. (2008) Reprod. Fertil. Dev. 20:45-53). Alem disso, estes dados sugerem que os blastomeros individuais em um embriao sao autonomos e podem se desenvolver independentemente de cada outro. Alem disso, estes resultados indicam que podem ser usados os testes de mvel de expressao genica descritos aqui para testar para um mvel de um mRNA (que e indicativo de mvel de expressao genica) em uma celula a ser testada, onde o RNA e de um gene conhecido como parte do programa materno, e a persistencia de dito mvel de expressao em um estagio tardio de desenvolvimento embrionario esta correlacionado com uma probabilidade de resultado anormal, ou parte do programa embrionario, em que a ausencia sobre o tempo e indicativo de uma probabilidade de um resultado anormal. Os genes do programa materno avaliados aqui sao ZAR1, PDCD5, NLRP5, H5F1, GDF9 e BNC2. Outros genes de efeito materno sao conhecidos e podem ser utilizados.
[0191] Ativagao do gene embrionario. Os presentes metodos estao pelo menos em parte baseados nos achados de que embrioes de desenvolvimento interrompidos anormais geralmente apresentam citocinese anormal e tempo mitotico durante as primeiras tres divisoes perante EGA (ativagao do gene embrionario) ocorre. Isto sugere que o destino do desenvolvimento do embriao e amplamente determinado pela heranga materna, um achado em termos notavel com um modelo matematico de desenvolvimento pre-implantagao humana realizada por Hardy et al. em 200134. Alem disso, as anomalias da citocinese e mitose fortemente se correlacionam com diminuigao dos mveis de transcrigoes maternas em genes que regulam a biogenese de miRNA e mascaramento de mRNA materno, armazenamento e reativagao. miRNAs regulam a tradugao atraves da promogao da degradagao do mRNA em diversos processos biologicos, incluindo organismo em desenvolvimento e diferenciagao (Blakaj, A. & Lin, H. (2008) J. Biol. Chem. 283:9505-9508; Stefani, G. & Slack, F. J. (2008) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9:219230). A evidencia crescente de organismos modelos mostram que miRNAs podem ser os principais reguladores de degradagao transcrigao materna nos embrioes precoces (Bettegowda, A., et al. (2008) Reprod. Fertil. Dev. 20:45-53). Assim, defeitos de biogenese de miRNA provavelmente levarao a um desenvolvimento anormal do embriao. Por outro lado, a incapacidade de controlar adequadamente mRNAs maternos pode tambem a embriogenese fraca. Oocitos de mamiferos sintetizam um grande conjunto de transcrigoes maternas de RNA necessarias para apoiar o crescimento de embriao inicial antes do nascimento da mae. Estas transcrigoes sao reprimidas e armazenadas durante um periodo prolongado de tempo, ate que sejam reativadas apos a fertilizagao. Defeitos neste programa de gestao de RNA materno provavelmente afetarao a quantidade e a qualidade das transcrigoes maternas e, assim, comprometer a chance de desenvolvimento bem- sucedido.
[0192] Modelo para avaliar a viabilidade do embriao. Fig. 13 mostra um modelo para desenvolvimento humano do embriao em imageamento correlacionado e analise molecular. E mostrado o cronograma de desenvolvimento do zigoto a blastocisto incluindo tempos curtos criticos para a previsao de desenvolvimento bem sucedido de blastocisto e um diagrama de desenvolvimento do embriao. Os principais dados moleculares, como diagramados, indicam que embrioes humanos comegam a vida com um conjunto distinto de RNAs de oocitos que sao herdados da mae. Este conjunto de RNAs e mantido e empacotado adequadamente por programas especificos de gestao de RNA no ovo. Apos a fertilizagao, a degradagao de um subconjunto de RNAs maternos especificos para o ovo (ESSP1; Padrao Especifico de Estagio Embrionariol) deve ser degradado conforme a transigao de oocito para embriao comega. Em paralelo, outros RNAs sao idealmente divididos igualmente para cada blastomero conforme o desenvolvimento continua (ESSP4). A degradagao bem sucedida e o particionamento de RNAs culminam com ativagao do genoma embrionario (EGA) e transcrigao dos genes de ESSP2 de uma maneira celula autonoma. Notavelmente, durante as divisoes de clivagem, blastomeros embrionarios podem ser interrompidos ou progredirem de forma independente. O resultado de desenvolvimento da celula autonoma nao embriao e que blastomeros individuais podem interromper ou progredir e conforme o embriao de 8 celulas progride para o estagio de morula e alem, a qualidade do blastocisto sera afetada pelo numero de celulas que sao interrompidas ou progridem alem de 8 celulas. Imageamento de dados demonstra que existem periodos criticos de desenvolvimento que preveem sucesso ou fracasso: primeira citocinese, a segunda divisao de clivagem e sincronicidade das segunda e terceira divisoes de clivagem. Estes parametros podem ser medidos automaticamente usando o algoritmo de rastreamento de celulas e software previamente descrito. Os sistemas e metodos descritos podem ser utilizados para diagnosticar embrioes resultados com preditores chave de imageamento e podem permitir a transferencia de embrioes menores precocemente no desenvolvimento (antes da EGA).
EXEMPLO 3
[0193] Imageamento oocito em amadurecimento e subsequente desenvolvimento do embriao.
RESULTADOS
[0194] Uma das principais limitagoes de procedimentos atuais de e a qualidade e disponibilidade de oocito Por exemplo, os protocolos atuais de IVF recrutam oocitos do pequeno dclico, fornecendo um pequeno numero de oocitos (por exemplo, 1-20) para fertilizagao. Alem disso, aproximadamente 20% de oocitos recuperados apos a estimulagao hormonal durante os procedimentos de IVF sao classificados como imaturos, e sao tipicamente descartados devido ao potencial reduzido para desenvolvimento de embriao em condigoes correntes de cultura.
[0195] Um metodo de aumentar o pool de oocito e atraves de maturagao in vitro. Fig. 14 mostra tres estagios de desenvolvimento durante a maturagao in vitro, incluindo vesfcula germinativa, metafase I, e metafase II. A vesfcula germinativa e os estagios de metafase I sao classificados em oocitos imaturos, enquanto a metafase II e classificada como matura devido a presenga do primeiro corpo polar, que ocorre em 24-48 horas apos o imcio da maturagao in vitro. Fig. 15 mostra o desenvolvimento do embriao de um oocito que foi amadurecido in vitro.
[0196] Outro metodo para aumentar o pool de oocito e recrutar oocitos a partir do pool primario e secundario, fornecendo ate varias centenas de oocitos. Neste procedimento, os fobculos dormentes sao recrutados a partir do ovario e programados in vitro para produzir oocitos com composigao normal de cromossomo, estado epigenetico, expressao de RNA, e morfologia. Em outros aspectos, os oocitos podem ser derivados de celulas tronco pluripotentes diferenciadas in vitro em celulas germinativas e amadurecidas em oocitos humanos.
[0197] Conforme ilustrado na Fig. 14, o processo de amadurecimento de um oocito in vitro e marcado por varias alteragoes celulares que podem ser usadas para definir parametros celulares para a medigao e analise nos do objeto da invengao. Estes incluem, por exemplo, alteragoes na morfologia da membrana do oocito, por exemplo, a taxa e extensao da separagao da zona pelucida; alteragoes na morfologia do nucleo do oocito, por exemplo, o imcio, conclusao e taxa de quebra de vesfcula germinativa (GVBD); a taxa e diregao do movimento dos granulos no citoplasma e nucleo; e o movimento de e extrusao do primeiro corpo polar.
EXEMPLO 4
[0198] Imageamento de diferenciagao de celula tronco.
RESULTADOS
[0199] A analise de imagem por lapso de tempo pode ser ainda usada para avaliar a viabilidade, potencial de desenvolvimento, e resultado de outros tipos de celulas, como celulas tronco, celulas tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), e celulas tronco humanas embrionarias (hESCs). O potencial de desenvolvimento de celulas tronco pode ser avaliado usando analise de imagem por lapso de tempo para medir as alteragoes na morfologia durante o desenvolvimento e diferenciagao celular (Fig. 17). As celulas diferenciadas pode entao ser analisadas e selecionadas para transplante in vivo ou outro uso. Varios parametros de celulas tronco podem ser extrados e analisados a partir de dados de imagens por lapso de tempo, como a duragao da citocinese, tempo entre eventos de mitose, tamanho e formato da celula, numero de celulas, movimento de celulas, padroes de divisao, diferenciagao, divisao assimetrica (em que uma celula filha mantem uma celula tronco enquanto a outra se diferencia), divisao simetrica (onde ambas celulas filhas permanece celulas tronco ou ambas se diferencia), e especificagao de destino (determinar precisamente quando uma celula tronco se diferencia).
[0200] A formula basica da terapia de celula tronca e que celulas tronco indiferenciadas podem ser cultivadas in vitro, diferenciadas para tipicos espedficos de celula, e subsequentemente transplantadas para recipientes para regeneragao de tecido e/ou orgaos lesionados. Analise de imagem por lapso de tempo pode ser usado como um dispositivo nao invasivo de alto rendimento para identificar celulas tronco que formam progenia diferenciada nao tumorigenica capaz de integragao em tecidos maduros. As aplicagoes potenciais incluem o tratamento neurologico de disturbios como Alzheimer e Parkinson, disturbios de sistema vascular e doengas cttrditictis, disturbios musculares e disturbios esqueleticos como artrite, doengas autoimune e canceres, bem como descoberta de droga pela avaliagao de alvos e novos terapeuticos.
[0201] Em humanos, os tecidos lesionados sao geralmente substitwdos por recrutamento continuo e diferenciagao de celulas tronco no organismo. No entanto, a capacidade do corpo para regeneragao e reduzida com a idade. Um exemplo disto e a incontinencia urinaria que resulta de deficiencia no esfincter. Acredita-se que o envelhecimento surja uma das principais causas de deficiencia do esfincter devido ao numero de fibras musculares e densidade de nervos diminufiem com a idade. Para tratar pacientes com incontinencia, iPSCs podem ser derivadas de fibroblastos cultivados de tecidos de parede vaginal para produzir celulas de musculo diferenciado. Estas celulas diferenciadas podem ser entao implantadas in vivo. Antes da implantacao, a analise de imagem por lapso de tempo pode ser usada para caracterizar os iPSCs com relagao a pluripotencia, diferenciagao, metilagao e tumorigenicidade. Outras aplicagoes incluem imageamento de lapso de tempo de iPSCs que sao derivados de celulas de pele de pacientes com Parkinson e diferenciados em neuronios para transplante (Fig. 18).
EXEMPLO 5
[0202] Validagao dos parametros de imageamento atraves de analise automatizada
[0203] Conforme evidenciado por nossos dados de imagem de lapso de tempo, o desenvolvimento humano do embriao e um processo altamente variavel entre embrioes dentro de uma coorte e embrioes podem apresentar uma ampla variedade de comportamentos durante a divisao celular. Assim, a caracterizagao manual de certos eventos de desenvolvimento como a duragao de citocinese altamente anormal (Fig. 4) pode ser submetida a interpretagao. Para validar nossos parametros de imageamento e a capacidade de sistematicamente prever a formagao de blastocisto, desenvolvemos um algoritmo para rastreamento automatico de divisoes celulares ate o estagio de 4 celulas. Nosso algoritmo de rastreamento emprega uma tecnica de estimagao de modelo probabifistico baseado nos metodos sequenciais de Monte Carlo. Esta tecnica trabalha pela geragao de distribuigoes de hipoteses de modelos de embriao, simulando as imagens baseadas em um modelo optico simples, e comparando estas simulagoes aos dados de imagem observados (Fig. 21a).
[0204] Embrioes foram modelados como uma colegao de elipses com posigao, orientagao e index sobreposto (para representar as alturas relativas das celulas). com estes modelos, a duragao da citocinese e tempo entre mitose podem ser extrados. Citocinese e tipicamente definido pelo primeiro aparecimento do sulco de citocinese (em que as endentagoes polares se formam junto ao eixo de clivagem) para a separagao completa das celulas filhas. Simplificamos o problema ao aproximar a citocinese conforme a duragao do alongamento antes da divisao celular de 1 celula para 2 . Uma celula e considerada alongada nos eixos que excedem 15% (escolhidos empiricamente). O tempo entre mitose e simples para extrair pela contagem do numero de celulas em cada modelo.
[0205] Testamos nosso algoritmo em um conjunto de 14 embrioes humanos (Fig. 21b) e comparados as medigoes automatizadas para analise manual de imagem (Fig. 21c, Fig. 21d). Neste conjunto de dados, 8 dos 14 embrioes alcangaram o estagio de blastocisto com boa morfologia (Fig. 21e superior). As medigoes automatizadas foram intimamente relacionadas as medigoes manuais, e todos os 8 embrioes foram corretamente previstos para atingir blastocisto. 2 dos 14 embrioes alcangaram blastocisto com fraca morfologia (fraca qualidade de massa celular interna; Fig. 21e inferior). Para estes embrioes, a avaliagao manual indicou que 1 poderia alcangar blastocisto e 1 poderia ser interrompido, enquanto a avaliagao automatizada previu que ambos seriam interrompidos. Finalmente, 4 dos 14 embrioes foram interrompidos para estagio de blastocisto, e foram todos corretamente previstos para interromper por ambos metodos.
[0206] Estrutura de Filtro de Partfculas
[0207] O filtro de partfcula e uma tecnica de estimativa de modelo baseado na simulagao de Monte Carlo. E usado para estimar modelos desconhecidos ou “escondidos” pela geragao de distribuigoes por modelos hipoteticos e comparando estes modelos aos dados observados. Sua capacidade de acomodar a dinamica de movimento arbitrario e incertezas de medigoes o tornam candidato ideal para rastreamento de divisoes celulares.
[0208] O filtro de partfcula rastreia a propagagao de tres principais variaveis ao longo do tempo: o estado x, o controle u, e a medigao z. O estado variavel x e um modelo do embriao desejamos estimar e e representado como uma colegao de elipses (para 2D) ou elipsoides (para 3D). A variavel de controle u e uma entrada que transforma a variavel de estado e consiste de nosso modelo de propagagao e divisao. A variavel de medigao z e uma observagao do estado e consiste de nossas imagens adquiridas pelo lapso de ritmo microscopio. Estes parametros sao descritos em maiores detalhes nas seguintes segoes.
[0209] Uma estimativa do estado corrente x em cada etapa de tempo e representado com uma distribuigao de probabilidade posterior. Este posterior e geralmente referenciado como a crenga e e definido como a probabilidade conditional do estagio corrente xt dado todas as medidas de imagens passada zi:t e controle passados ui:t
Figure img0003
[0210] O filtro de partfcula se aproxima ao posterior com um conjunto de amostras pesadas, ou partfculas, denotadas como:
Figure img0004
onde M e o numero de partfculas. Os termos partfculas e modelos de embrioes sao usados de modo intercambiavel aqui. Assim, uma partfcula simples xt[m](em que 1 <= m <= M) e uma hipotese do modelo de embriao no tempo t.
[0211] Apos a inicializagao, o filtro de partfculas repetidamente aplica tres etapas: A primeira etapa e previsao, em que cada partfcula e propagada usando a entrada de controle:
Figure img0005
[0212] O conjunto resultante de partfculas e uma aproximagao da probabilidade anterior. A segunda etapa e a medigao de atualizagao, onde cada partfcula e designada com um peso de importancia correspondente a probabilidade da medigao corrente:
Figure img0006
[0213] O conjunto de partfculas pesadas e uma aproximagao do posterior bel(xt).
[0214] Um componente chave do filtro de partfcula vem na terceira etapa, em que o conjunto de partfculas e re-amostrada de acordo com seus pesos. Esta etapa de reamostragem foca a distribuigao de partfculas na regiao de maior probabilidade.
[0215] Representagao Celular
[0216] As celulas sao representadas como elipses em espago de 2D. Cada celula tem um eixo principal, eixo menor, e posigao bidimensional em coordenadas Cartesianas, dada a equagao:
Figure img0007
[0217] Cada elipse tambem tem uma diregao principal 9 (yaw), que permite que esta gire no plano x-y. Uma vez que as elipses quase sempre se sobrepoem uma com a outra, tambem denotamos um mdice de sobreposigao h, que especifica a ordem de sobreposigao (ou a altura relativa das celulas). Os parametros para cada modelo de embriao no tempo t sao, portanto, apresentados como:
Figure img0008
onde N e o numero de celulas em certo modelo.
[0218] Perturbagao e Divisao de Celula
[0219] A primeira etapa do filtro de partfcula e previsao, em que cada partfcula e propagada usando a entrada de controle: Para nossa aplicagao, ha dois tipos de comportamento que desejamos modelar. Este primeiro tipo de comportamento inclui movimento de celula, que inclui tradugao, rotagao de cerca de angulo de guinada, e alteragoes no comprimento do principal e menores eixos. O segundo tipo de comportamento e a divisao celular, em que a celula se divide em duas novas celulas.
[0220] Para modelar o movimento celular, nossa entrada de controle toma uma partfcula e aleatoriamente perturba cada valor para cada celula: xoi, yoi, ai, bi, 9i. A perturbagao e aleatoriamente amostrada a partir de uma distribuigao normal com variancia relativamente pequena (tipicamente ajustado para 5% dos valores inicializadas).
[0221] Para modelo de divisao celular, usamos a seguinte abordagem. Em certo ponto no tempo, para cada partfcula, designamos uma probabilidade de 50% que uma das celulas vai se dividir. Este valor foi escolhido de forma empirica, e abrange uma ampla faixa de possiveis divisoes celulares, mantendo uma boa cobertura da configuragao atual. Se uma divisao e prevista, entao, a celula em divisao e escolhida aleatoriamente. Um modelo mais sofisticado poderia levar em consideragao fatores adicionais como o numero de celulas em uma partfcula e a historia de seus padroes de divisao, e poderia potencialmente criar modelos a base de comportamento observado dos dados reais.
[0222] Quando uma celula e escolhida para se dividir, uma divisao simetrica ao longo do eixo principal da elipse, produzindo duas celulas filhas de igual tamanho e forma e aplicado. Cada valor para as celulas filhas e entao aleatoriamente perturbado. A perturbagao e novamente amostrada de uma distribuigao normal mas com uma variancia maior (10% dos valores inicializados) para acomodar grande variabilidade nos novos formatos de celulas. Finalmente, os mdices de sobreposigao das duas celulas filhas sao aleatoriamente selecionados, mantendo a sua sobreposigao coletiva em relagao ao resto das celulas.
[0223] Simulagao de imagem
[0224] Apos aplicar a entrada de controle para cada partfcula, a representagao de partfcula deve ser convertida em uma imagem simulada que pode ser comparada as imagens reais. A simulagao da imagem precisao pode ser uma tarefa dificil, e geralmente requer o uso de tecnicas de rastreabilidade de ray e modelos opticos. Alem da tentativa de simular as imagens reatfsticas, o metodo da presente invengao foca nas caracteristicas de simulagao que sao facilmente identificaveis nas imagens. Especificamente, as imagens das membranas celulas sao estimuladas.
[0225] Ha duas observagoes fisicas que devem ser tomados em consideragao. Primeiro, embora o microscopio esteja focado em um unico plano atraves do embriao, a profundidade do campo e bastante ampla e a luz fora de foco e coletada de quase o embriao todo. E segundo, os embrioes sao parcialmente transparentes, o que significa que as membranas das celulas na parte inferior do embriao podem as vezes (mas nem sempre) ser observadas atraves das celulas da parte superior do embriao.
[0226] Com estas observagoes fisicas em mente, ha agora descrito o modelo de simulagao de imagem. Para cada celula Os valores de pixel correspondentes sao definidos para um valor binario de 1 e dilatados para criar uma espessura da membrana comparavel aos dados de imagem observados. O mdice de sobreposigao h especifica a ordem nas quais as celulas ficam sobre a outra. Pelo fato de que as membranas celulas oclrndas sao somente visiveis de vez em quando, se os pontos oclrndos sao detectados, eles sao colocados na imagem simulada com baixa probabilidade (tipicamente cerca de 10%). Na pratica, enquanto estes pontos de membrana oclrndas sao necessarios para a modelagem de formato precisa e importante para torna-los esparso suficiente de modo que eles nao se paregam uma borda visivel.
[0227] Imagem Pre-Processameto
[0228] A variavel de medida z sera agora descrita. Uma meta do metodo da presente invengao e extrair imagens binarias de membranas celulas das imagens do microscopio para comparagao das imagens simuladas. Estas membranas apresenta alta curvatura e alto contraste, mas nao sao facilmente extraicds usando tecnicas de intensidade ou de limite baseado em cor. Assim, um detector baseado em curvatura de prindpio e empregado. Este metodo usado o operador Hessian:
Figure img0009
em que Ixx, Ixy, e Iyy, sao derivadas parciais de segunda ordem avaliados em localizagao de pixel e escala de Gaussian o. Os valores proprios da matriz de 2x2 Hessian fornece informagoes sobre as curvaturas prindpios, enquanto o sinal de valores proprios distingue “vales” de “cristas’’43. Para detectar os picos de claridade ou cristas, a curvatura prindpio em cada pixel e calculado como
Figure img0010
em que 12 e o mmimo valor proprio. Para detectar membranas de espessuras variaveis, o operador Hessian sobre uma faixa de escalas (ou seja, omin <= o <= omax ) e aplicada, e a curvatura maxima sobre esta faixa e extraicd. Finalmente, a imagem de Hessian e limitante para criar uma imagem binaria das membranas de celula extfmdas. O mvel de limite e tipicamente ajustado para duas vezes o desvio padrao dos valores de pixel em Hessian.
[0229] Pesos das Partfculas
[0230] Conforme descrito na segao intitulado “Estrutura de Filtro de Partfcula,” a segunda etapa principal do filtro de partfcula e uma atualizagao de medigao, em que as partfculas sao designadas com peso correspondents a probabilidade da medigao corrente dado um modelo particular. Em nosso caso, o peso de importancia e determinado pela comparagao de imagem de microscopio pre-processada discutida acima, para a imagem estimulada tambem discutida acima.
[0231] Este problema foi investigado anteriormente, em que os pesos do filtro de partfcula foram calculados pela comparagao das imagens simuladas para imagens reais usando informagoes mutuas normalizadas. Esta abordagem e semelhante a ideia de combinagao de rede de ocupagao, que busca localizagoes de pixel que sao ambos ocupados (valor 1) ou ambos vazios (valor 0). Estes metodos podem ter problema quando as imagens simuladas e reais sao semelhantes no formato mas levemente desalinhadas. Por outro lado, o metodo sendo descrito usa uma fungao de probabilidade baseada na distancia em chanfro, que mede o valor medio das distancias mais proximas de um ponto para outro. Dois conjuntos de pontos A (no conjunto de numeros reais de tamanho m), e B (no conjunto de numeros de tamanho n), correspondente aos pixels nao zero na imagem simulada e imagem real, respectivamente, sao definidos. A distancia em chanfro direta a partir do conjunto de pontos A para B e dado como:
Figure img0011
[0232] A distancia em chanfro reverso e definida da mesma forma. O metodo presente emprega a distancia em chanfro simetrica, que fornece uma medida de quao bem a imagem simulada combina com a imagem real, bem como quao bem a imagem real combina com a imagem simulada:
Figure img0012
[0233] Na pratica, as medigoes de distancia individual estao truncadas para reduzir a influencia de rmdo. Para reduzir o tempo de computagao, as distancias sao determinadas olhando os locais de pixel na distancia transforma das imagens.
[0234] A distancia em chanfro e usada como uma medida de probabilidade de nossa medigao de dados dado o modelo estimado. Ou sej a, no tempo t, par cerca medigao de imagem zt e um modelo de partfcula xt[m], o peso de importancia da partfcula e dado como:
Figure img0013
[0235] A constante 1 e tipicamente ajustada para 1 e pode ser variado para controlar o “achatamento” da distribuigao de probabilidade.
[0236] Reamostragem de partfcula e Alocagao Dinamica
[0237] A terceira principal etapa do filtro de partfcula e reamostrar, onde as partfculas sao selecionadas na proporgao para seus pesos para criar um novo conjunto de partfculas. Partfculas com probabilidade baixa sao descartadas, enquanto as partfculas com alta probabilidade sao multiplicados. Houve muitos trabalhos anteriores no desenvolvimento de algoritmos eficientes para reamostragem. O metodo presente usa a abordagem de baixa variancia.
[0238] Uma importante questao em filtros de partfcula e a escolha do numero de partfculas. A escolha mais simples e usar um valor fixado, diz M=1000. Entao, para cada etapa de tempo, o conjunto de partfculas M e transformada em outro conjunto do mesmo tamanho. No contexto da aplicagao, pode haver periodos relativamente mais longos de tempo durante o quais as celulas sao inativas ou apenas ligeiramente mudando de tamanho e posigao. A vantagem desta observagao e tomar para reduzir a carga de processamento por alocagao dinamica do numero de partfculas de acordo com a quantidade de atividade celular. Ou seja, quando as celulas sao ativas e se dividem, aumentamos o numero de partfculas, e quando as celulas sao inativas, reduzimos o numero de partfculas.
[0239] Para medir o grau de atividade de celula, as diferengas de soma de quadrados (SSD) em intensidades de pixel entre a nova imagem (obtida pelo microscopio) e a imagem anterior e calculada. Para reduzir o rddo, as imagens sao primeiro suavizadas com um filtro de Gaussian, e o valor SSD e suavizado ao longo do tempo com uma media de movimento causal. O numero de partfculas e entao dinamicamente ajustado em proporgao a este valor e truncado para estar dentro dos limites 100<M<1000. Fig. 30 e um grafico que mostra como o numero de partfculas pode ser alocado para um embriao que se divide do estagio de 1 celula 4 celulas. Deve ser notado que este metodo meramente fornece ume medida da quantidade de “atividade” na imagem, mas nao se distingue entre a divisao celular e o movimento do embriao (translagao e/ou rotagao) porque uma registro de imagem anterior nao foi realizado. Nesta situagao (determinagao de numero de partfculas) isto e aceitavel uma vez que o numero de partfculas deveria aumentar em qualquer evento. Na pratica, tambem ajustamos o numero de partfculas baseado no numero de celulas no modelo de embriao mais provavel. Ou seja, mais partfculas sao geradas quando acredita-se que mais celulas estejam presentes nas imagens.
[0240] Limitagoes de Rastreamento Bi-dimensional
[0241] O algoritmo de rastreamento de celula 2D descrito acima e util para a determinagao do numero de celulas no embriao bem como suas formas 2D. No entanto, este e limitado pelo fato de que nao ha representagao fisica subjacente. Isto pode ser ou nao pode importante para automaticamente rastrear as divisoes celulares para avaliar a viabilidade de embriao. Por exemplo, certos parametros como a duragao da citocinese, e o tempo entre divisoes celulares, podem ser medidos usando o algoritmo de rastreamento de celula 2D. Na segao seguinte, estendemos nosso modelo 2D para 3D. Para lidar com oclusoes e ambiguidades de profundidade que surgem de estimativas de formatos 3D de imagens 2D, as restrigoes geometricas e restrigoes na conservagao do volume de celula sao aplicadas.
[0242] Representagao Celular e rastreamento em tres dimensoes
[0243] Esta segao descreve um algoritmo para rastreamento de 3D da divisao celular. Muitas das etapas de algoritmo 2D transitam neste algoritmo, com umas poucas excegoes chaves. Ha uma nova representagao celular para uso 3D. As celulas sao agora representadas como elipsoides em espago 3D, dado pela equagao:
Figure img0014
[0244] Cada elipsoide tambem tem uma diregao tfder 9, passo y, e lista a. Assim, a representagao de cada modelo embriao no tempo t e dado como:
Figure img0015
[0245] Um efeito importante deste modelo revisado e que pode haver ambiguidades associadas com formas de 3D interferentes das imagens de 2D. Por exemplo, uma celula que e esferica em formato poderia ter uma aparencia semelhante a uma celula com um eixo principal maior e um eixo de passo maior. Isto nao e uma preocupagao principal, pois como sera mostrado depois, a distribuigao de partfculas mantera estas multiplas hipoteses ate que informagoes suficientes estejam dispomveis para criar uma distingao (por exemplo, de um evento como divisao celular).
[0246] As elipsoides sao consideradas rigidas; ou seja, a deformagao nao e explicitamente modelada. No entanto, permitimos que uma quantidade pequena de sobreposigao entre as elipsoides vizinhas, e nestas regioes de sobreposigao assumimos que as celulas sao achatadas umas contra as outras. Isto e uma importante consideragao uma vez que e comumente observado nos embrioes, e contamos com isto nas seguintes segoes.
[0247] Perturbagao e Divisao de Celula
[0248] Nosso modelo 3D de divisao celular e perturbagao e semelhante ao modelo na Segao 4, “Perturbagao de Celula e Divisao,” com algumas poucas excegoes. A estimativa de formato 3D pode ser usada para aplicar a conservagao de volume. Isto impede as celulas de crescerem de forma arbitrariamente grande, particularmente, na diregao z. A conservagao de volume e aplicada em duas situagoes. Primeiro, para perturbagao celular, os eixos a e b sao variados, e c calculado de modo que o volume seja conservado para aquela celula individual. Segundo, para a divisao celular, a seguinte restrigao e aplicada:
Figure img0016
onde o transcrito p denota uma celula parente e os subscritos dl e d2 denotam as duas celulas filhas. Na pratica, permitimos uma leve violagao destas restrigoes deixando o volume total do embriao flutuante entre mais/menos 5% do volume original. Isto e usado para compensar as imprecisoes potenciais na estimativa de volume inicial.
[0249] Quando uma celula e escolhida para dividir em 3D, sua divisao e modelada da seguinte maneira. Primeiro, para a celula unica escolhida, uma divisao junto ao eixo longo da elipse, que poderia ser a, b, ou c dependendo da configuragao, e aplicada. As celulas filhas sao inicializadas para serem igual em tamanho e espagadas ainda mais, levando em consideragao a rotagao da celula parente. Seus parametros sao entao perturbados para cobrir uma ampla faixa de possiveis configuragoes, novamente usando uma distribuigao normal com conjunto de variancia para 10% dos valores inicializados.
[0250] Restrigoes Geometricas
[0251] As questoes de oclusao e ambiguidade de profundidade sao parcialmente mitigadas atraves da conservagao do volume. No entanto, as restrigoes referentes as relagoes espaciais de elipsoides vizinhos sao tambem necessarios. A primeira restrigao e que as celulas sao proibidas de se sobreporem em mais do que 20% em raio. Para as celulas que se sobrepoem por uma quantidade aceitavel, a suposigao de que achataram novamente umas sobre as outras e feita. O modelo de partfcula sendo descrito representa este fenomeno ignorando os pontos dentro das elipsoides de intersegao durante a simulagao de imagem. Isto foi empiricamente motivado e se correlaciona bem com comportamento fisicamente observado.
[0252] Uma segunda restrigao que mantem as celulas em proximidade mtima e imposta. Esta restrigao e diretamente relacionada ao comportamento fisico dos embrioes humanos, onde as celulas sao restringidas por uma membrana chamada de zona pelucida. A zona e modelada como uma concha esferica e usa isto para impor condigoes de limites. O raio da zona e ajustado para 30% maior do que o raio do embriao de 1 celula.
[0253] Estas restrigoes sao aplicadas como a seguir. Para cada partfcula em certo tempo, uma entrada controle aleatoria e aplicada para gerar uma nova particula, conforme discutido acima. Se as restrigoes fisicas foram violadas, a nova partfcula e descartada e um novo controle aleatorio e aplicado. Se uma nova partfcula nao e gerada apos certo numero de tentativas, entao aquela partfcula e descartada.
[0254] Simulagao de imagem
[0255] A vantagem da iluminagao em campo escuro, usado nos exemplos, e que as membranas celulares dispersam a luz mais do que o interior das celulas. Este efeito e mais pronunciado em locais onde as membranas celulares sao paralelas ao eixo optico (eixo z). Assim, para estimular as imagens, estes locais sao procurados em nossos modelos 3D, que nao sao necessariamente localizados nos equadores dos elipsoides devido as suas rotagoes. As mesmas regras em relagao aos ovos visiveis e oclwdos, conforme discutidos acima, sao entao acompanhados.
[0256] Exemplo em 2D de rastreamento de celula
[0257] Este exemplo pertence a microscopia de celula automatizada e usa o algoritmo descrito acima para rastreamento 2D das divisoes celulares. Este modelo e desenhado para rastrear o numero de celulas nas imagens bem como os contornos 2D das membranas celulares. A primeira etapa e aquisigao da imagem, que motiva as segoes subsequentes simulagao de imagem e pre-processamento da imagem. As sequencias de imagem por lapso de tempo para este exemplo foram obtidas com um microscopio Olympus IX-50 invertido customizado com uma objetiva de 10X. O microscopio e modificado para iluminagao em campo escuro, onde um cone oco de luz e focado na amostra colocando uma abertura circular entre a fonte de luz e lente condensadora. A lente objetiva coleta luz que e dispersa pela amostra e rejeita diretamente a luz transmitida, produzindo uma imagem clara em um fundo escuro. Uma vantagem da iluminagao em campo escuro e que as membranas de celulas tendem a dispersar a luz mais do que o interior da celula, assim, melhorando seus contrastes. O microscopio e equipado com um estagio aquecido e camara de incubagao customizada para permitir a cultura dos embrioes por um periodo de ate 5 ou 6 dias. As imagens foram capturadas em intervalos de 5 minutos por uma camera Olympus SLR digital montada na porta lateral de IX-50.
[0258] O imageamento de embrioes comegou quando eles eram zigotos, ou ovos fertilizados com formato grosseiramente esferico. Para inicializar o conjunto de partfculas, o Hessian limiarizado e computado conforme descrito na Segao 6, “Pre- processamento da imagem,” e ajusta um drculo a este usando mmimos quadrados. Todas as partfculas sao entao inicializadas com orientagoes aleatorias amostradas de uma distribuigao uniforme.
[0259] Fig. 31 mostra os resultados do algoritmo 2D para rastreamento de divisoes celulares de estagios de 1 celula a 4 celula. Os resultados mostram que as membranas de celulas sao extraidas com sucesso pelo algoritmo, mesmo para as celulas na diregao do fundo que estao parcialmente oclrndas. Deve ser notado que na maior parte das aplicagoes de filtro de partfculas, o melhor modelo ‘simples’ e geralmente representado como uma soma ponderada de parametros de estado da distribuigao de partfcula. No entanto, para os resultados apresentados aqui, a particula com a probabilidade mais alta e apresentada.
[0260] Exemplo de rastreamento de celula 3D
[0261] Fig. 32 mostra duas aplicagoes bem sucedidas do algoritmo 3D descrito acima para rastrear do estagio de 1 celula para 4 celulas. Fig. 33 e um diagrama que mostra um exemplo de como as partfculas sao distribwdas durante a divisao de 1 celula para 2- celulas (correspondendo ao primeiro exemplo mostrado na Fig. 32). Este plot mostra que a localizagao 3D dos centros de cada celula. Como as celulas comegam a se dividir, as previsoes mostram uma ambiguidade em termos de que celula filha ficara sobre a outra, mas isto e resolvido dentro de um par de quadros.
[0262] Extraindo Parametros de Previsao
[0263] Uma vez que os embrioes foram modelados usando os metodos anteriormente descritos, certos parametros podem ser extraidos dos modelos. Tipicamente, o melhor modelo ou o mais provavel e usado. Estes parametros incluem, por exemplo, a duragao da primeira citocinese, o tempo entre a primeira e segunda divisoes celulares, e o tempo entre a segunda e terceira divisoes celulares. A duragao da citocinese pode ser aproximadamente mensurando quanto um modelo de uma celula e alongado antes de se separar em duas celulas. O alongamento pode ser medido olhando para a proporgao dos eixos maior para menor da elipse. Outros parametros que podem ser extraidos dos modelos incluem o tempo entre fertilizagao e a primeira divisao celular, formatos e simetrias de celulas e processos de divisao, angulos de divisao, fragmentagao, etc. Parametros podem ser extraidos usando o algoritmo de rastreamento de celula 2D ou o algoritmo de rastreamento de celula 3D.
[0264] A citocinese e definida pelo primeiro aparecimento de sulco de citocinese para a separagao completa de celulas filhas. Uma vez que nossos modelos embriao composto de elipses nao deformaveis, identificando a aparencia do sulco de citocinese e uma tarefa desafiadora. Um metodo poderia permitir que as elipses se deformem, mas isto resulta em um problema de rastreamento mais complexo. Outro metodo poderia ser olhar para as alteragoes na curvatura na imagem de microscopio pre-processada; no entanto, isto anula a finalidade de amarragao para medir nossos parametros preditivos diretamente dos modelos de embriao. Assim, simplificamos o problema ao aproximar a duragao da primeira citocinese conforme a duragao do alongamento da celula antes da divisao de 1 celula para 2 celulas. O alongamento e quantificado calculando-se a proporgao do eixo principal para um eixo menor b da elipse. Uma celula e considerada alongada se:
Figure img0017
[0265] Este valor de 15% foi escolhido empiricamente e os trabalhos para este conjunto de dados particular; no entanto outros valores podem ser usados. Uma vez que um modelo embriao se dividiu em 2 celulas, podemos extrair a duragao aproximada da primeira citocinese calculando a duragao do alongamento para o modelo de 1 celula.
[0266] Em prindpio, a medigao do tempo entre eventos de mitose e simples. Por exemplo, o tempo entre a primeira e segunda mitose podem ser medidos como o tempo entre o modelo de 2 celulas e o modelo de 3 celulas. No entanto, em alguns casos os embrioes podem apresentar comportamento nao usual e aleatorio. Isto inclui, por exemplo, um embriao que passa de 1 celula para 2 celulas, de 2 celulas para um aparente 3 ou 4 celulas, e em seguida de volta para 2 celulas. O algoritmo descrito e capaz de rastrear este tipo de comportamento, mas possui um desafio para a determinagao do intervalo de tempo entre eventos de mitose.
[0267] Uma forma de lidar com este comportamento e como a seguir: Ao inves de medir o tempo entre um modelo de 2 celulas e de 3 celulas (para encontrar o tempo entre a primeira e segunda mitoses), isto pode ser aproximado por simples contagem de numero de quadros de imagem nos quais um modelo de 2 celulas e mais provavel. Isto trabalha bem em alguns casos, mas nao e sempre representativo do tempo real entre os eventos de mitose. Pode-se ainda lidar com estes eventos ao aplicar uma restrigao nos modelos baseados no numero de celulas. Ou seja, quando escolhe-ser o modelo melhor ou mais provavel da distribuigao em cada iteragao, pode-ser requerer que o numero de celulas no modelo seja sempre a mesma ou aumente, mas nunca diminua. Apos aplicacao desta restrigao, e simples calcular o tempo entre eventos de mitose. Esta restrigao e tambem util para filtrar os resultados de rastreamento que podem apresentar quantidades pequenas de vibragoes, que podem ocasionalmente ocorrer quando um modelo troca vem- e-volta entre um modelo de 1 celula e 2 celulas, por exemplo.
[0268] Metodo para Extrair Parametros de Previsao
[0269] Fig. 35 mostra um fluxograma que sumariza os metodos descritos acima. O fluxograma mostra como um unico embriao pode ser analisado (embora isto possa ser aplicado a multiplos embrioes ou outros tipos de celulas e celulas tronco). Na primeira etapa, uma imagem de um embriao e obtida com um microscopio lapso de tempo (“medigao”). Esta imagem pode ser salva em u m arquivo e aberto posteriormente. A imagem e geralmente pre-processada para aumentar certas caractensticas, embora isto nao seja necessario. Modelos de possiveis configuragoes de embrioes, e imagens sao simuladas a partir destes modelos (“previsao”). A imagem simulada inclui imagens de membranas de celulas, conforme anteriormente descritas, ou imagens que mais precisamente representam as imagens de microscopio antes do pre-processamento. Os modelos sao entao comparados a imagem pre-processada de microscopio (“comparagao”). Usando esta comparagao, a melhor previsao e mantida, enquanto que a pior previsao e descartada. O conjunto resultante de previsoes e entao usado para a imagem seguinte. Apos a realizagao deste processo para multiplas imagens sequenciais, e possivel medir parametros morfologicos diretamente do melhor modelo, como, por exemplo, a duragao da citocinese e o tempo entre eventos de mitose. Estes parametros podem ser usados para avaliar a viabilidade do embriao, conforme anteriormente discutido.
EXEMPLO 7
[0270] Analise automatizada de atividade celular
[0271] Os metodos descritos acima requerem a capacidade de rastrear o desenvolvimento da celula atraves de microscopia. Para embrioes, e desejavel rastrear mutliplos embrioes, que estao sendo cultivados juntos na mesma placa. Os metodos anaHticos usados aqui requerem que as imagens sejam tomadas periodicamente (por exemplo, a cada 1-30 minutos durante 1-5 dias para embrioes; intervalos de tempo diferentes podem ser usados para outros tipos de celulas como celulas tronco). Um metodo de imageamento foi, portanto, concebido para automaticamente rastrear o desenvolvimento do embriao.
[0272] Em microscopia de lapso de tempo, as celulas crescem em condigoes controladas e imageadas sobre um periodo estendido de tempo para monitorar os processos como motilidade (o movimento dentro do ambiente), proliferagao (crescimento e divisao), e alteragoes na morfologia (tamanho e formato). Devido a duragao dos experimentos e as vastas quantidades de dados de imagem gerados, extrair parametros como a duragao de e tempo entre divisoes celulares pode ser uma tarefa tediosa. Isto e particularmente verdadeiro para aplicagoes de alto rendimento onde mutliplas amostras sao imageadas simultaneamente. Assim, ha uma necessidade para software de analise de imagem que pode extrair as informagoes desejadas automaticamente.
[0273] Uma forma de avaliar a viabilidade do embriao e medir a quantidade de “atividade de celula” nas imagens. Isto pode ser conseguido simplesmente tomando pares sequenciais de imagens e comparando-as aos seus valores de pixel. Mais especificamente, para medir a quantidade de atividade de celula para cada nova imagem, calcula-se a soma de diferengas dos quadrados (SSD) em intensidades de pixel entre a nova imagem, denotada como I’, e a imagem anterior, denotada como I’, sobre todos os pixels i de sobreposigao:
Figure img0018
[0274] Para reduzir o rddo, as imagens podem primeiro ser suavizadas com um filtro Gaussian. Fig. 28 mostra um plot da atividade de celula do 1 para o dia 3 para um embriao simples. Conforme mostrado, ha picos mtidos correspondendo a divisao de 1 celula para 2 celulas, a divisao de 2 celulas para 4 celulas, e a divisao de 4 celulas para 8 celulas em um embriao humano. As larguras dos picos sao representativas das duragoes das divisoes celulares.
[0275] Uma das limitagoes desta abordagem e que a metrica SSD somente mede a quantidade de atividade na imagem, e eventos como movimento do embriao (como deslocamento ou rotagao) podem parecer muito semelhantes a divisao celular. Uma solugao para este problema e a realizagao de um registro de imagem antes do calculo de SSD. O registro de imagem e o processo de encontrar uma relagao geometrica entre duas imagens para alinhar os mesmos no mesmo sistema de coordenadas, e pode ser conseguido usando uma variedade de tecnicas diferentes. Por exemplo, pode-ser usar uma variagao de rotina nao linear iterativa de Levenberg-Marquardt, que registra imagens minimizando o SSD na sobreposigao de intensidades de pixel. Algoritmo LM transforma os locais de pixel usando uma matriz de homografia 3x3:
Figure img0019
onde as localizagoes de destino de pixel x’ e y’ sao normalizadas como:
[0276] Assim:
Figure img0020
[0277] A matriz de homografia pode ser aplicada a uma variedade de transformagoes de imagem, e uma escolha razoavel nesta aplicagao poderia ser transformagoes de corpo rigido (Euclidean). Isto poderia se alinhar as imagens dos embrioes em translagao em rotagao em plano (junto com o eixo da camera). No entanto, e possivel generalizar levemente e usar uma transformagao afim, que permite a inclinagao da imagem. Esta generalizagao pode ou nao ser desejavel dependendo do sinal que tenta ser medido. As equagoes de movimento assim se tornam:
Figure img0021
[0278] O primeiro algoritmo LM calcula as derivadas parciais de e com relagao aos parametros de movimento desconhecidos h k usando a regra de cadeia:
Figure img0022
[0279] Para os parametros de movimentos afins, estas derivadas parciais se tornam:
Figure img0023
[0280] Em seguida, usando estes derivadas parciais, o algoritmo LM computa a matriz aproximada de Hessian A (no conjunto de numeros reais de tamanho 6x6) e vetor b de gradiente ponderado (no conjunto de numeros reais de tamanho 6x1) adicionado a contribuigao de cada pixel:
Figure img0024
[0281] Finalmente, os parametros de movimento podem ser atualizados adicionando movimento incremental:
Figure img0025
onde a constante 1 regula o tamanho da etapa da atualizagao do movimento e I e a matriz de identidade.
[0282] Em cada iteragao do algoritmo, a primeira imagem e deformada de acordo com a estimativa de movimento atualizado e comparado a segunda imagem pela computagao de SSD de intensidades de pixel em areas de sobreposigao. O presente pedido assume que o movimento do embriao entre imagens consecutivas e muito pequeno, e, portanto, somente um numero pequeno fixado de iteragoes sao realizados. Fig. 28B mostra um plot de atividade de celula sem (28A) e com (28B) registros de imagem realizados para cada par de imagens. Uma vez que a fungao de erro da rotina de Levenberg-Marquardt e o SSD, um simplesmente plota o erro residual para cada registro. Fig. 29 compara os plots de atividade de celula para o desenvolvimento normal e anormal do embriao. No dia 3, o ponto no qual um embriologista poderia tipicamente avaliar a morfologia, os embrioes parecem semelhantes e poderia potencialmente ambos serem considerados viaveis. No entanto, seus plots de atividade de celula sao drasticamente diferentes, conforme um dos embrioes passa uma tipica de divisoes celulares enquanto o outro se divide de um embriao de 1 celula em celulas multiplas e fragmentos. Conforme esperado, o embriao tem um plot de atividade normal, que, em ultima analise atinge blastocisto pelo dia 5,5.
[0283] Outros tipos de registro de imagem podem ser usados antes de calcular o SSD nas intensidades de pixel. Isto inclui, por exemplo, correlagao cruzada, correlagao cruzada normalizada, correlagao de fase cruzada, informagoes mutuas, detecgao de caracteristica e rastreamento, transformagao de caracteristica invariante de escala (SIFT), fluxo optico, e gradiente descendente. O pre-processamento da imagem pode ou nao ser desejavel antes do registro, como caracteristica ou melhora do contraste.
[0284] Modelo para avaliar a viabilidade do embriao.
[0285] Fig. 13 mostra um modelo para desenvolvimento humano do embriao em imageamento correlacionado e analise molecular. E mostrado o cronograma de desenvolvimento do zigoto a blastocisto incluindo tempos curtos criticos para a previsao de desenvolvimento bem sucedido de blastocisto e um diagrama de desenvolvimento do embriao. Os principais dados moleculares, como diagramados, indicam que embrioes humanos comegam a vida com um conjunto distinto de RNAs de oocitos que sao herdados da mae. Este conjunto de RNAs e mantido e empacotado adequadamente por programas espedficos de gestao de RNA no ovo. Apos a fertilizagao, a degradagao de um subconjunto de RNAs maternos espedficos para o ovo (ESSP1; Padrao Espedfico de Estagio Embrionariol) deve ser degradado conforme a transigao de oocito para embriao comega. Em paralelo, outros RNAs sao idealmente divididos igualmente para cada blastomero conforme o desenvolvimento continua (ESSP4). A degradagao bem sucedida e o particionamento de RNAs culminam com ativagao do genoma embrionario (EGA) e transcrigao dos genes de ESSP2 de uma maneira celula autonoma. Notavelmente, durante as divisoes de clivagem, blastomeros embrionarios podem ser interrompidos ou progredirem de forma independente. O resultado de desenvolvimento da celula autonoma nao embriao e que blastomeros individuais podem interromper ou progredir e conforme o embriao de 8 celulas progride para o estagio de morula e alem, a qualidade do blastocisto sera afetada pelo numero de celulas que sao interrompidas ou progridem alem de 8 celulas. Imageamento de dados demonstra que existem periodos criticos de desenvolvimento que preveem sucesso ou fracasso: primeira citocinese, a segunda divisao de clivagem e sincronicidade das segunda e terceira divisoes de clivagem. Estes parametros podem ser medidos automaticamente usando o algoritmo de rastreamento de celulas e software previamente descrito. Os sistemas e metodos descritos podem ser utilizados para diagnosticar embrioes resultados com preditores chave de imageamento e podem permitir a transferencia de embrioes menores precocemente no desenvolvimento (antes da EGA). Comparagao de analise de imagem automatizada vs. manual
[0286] Fig. 34 mostra uma comparagao de analise de imagem automatizada para analise de imagem manual para um conjunto de 14 embrioes. Embrioes 1 a 10 (conforme rotulado nos plots) atingiram o estagio de blastocisto com morfologia variante. Embrioes 11 a 14 interrompidos e que nao alcangaram blastocisto. Fig. 34A mostra a comparagao para medigao da duragao da primeira citocinese, e Fig. 34B mostra a comparagao para medir o tempo entre 1a e 2a mitose. Conforme mostrado, os dois metodos apresentam bom acordo em geral. As quantidades pequenas de discrepancia para a duragao da primeira citocinese sao esperados, conforme podem ser atribwdos ao fato de que nossas analises automatizadas fazem uma aproximagao ao medir o alongamento, conforme anteriormente discutido. Em alguns casos, ha um desacordo maior entre a analise automatizada e manual para ambos a duragao da citocinese bem como do tempo entre 1a e 2a mitose. Isto ocorre para alguns dos embrioes anormais, e e causado por comportamento nao usual que e dificil para caracterizar tanto manualmente quanto automaticamente. Para este grupo de embrioes, e usando justo os dois primeiros criterios (duragao da primeira citocinese e tempo entre 1a e 2a mitose), o algoritmo automatizado tem zero de falsos positivos. Isto poderia ser extremamente importante em um procedimento IVF onde os falsos positivos devem ser evitados. A analise de imagem manual teve um falso negativo (embriao 9), enquanto que o algoritmo automatizado teve dois falsos negativos (embrioes 9 e 10). No entanto, enquanto ambos os embrioes 9 e 10 tecnicamente atingiram o estagio de blastocisto, eles mostraram uma fraca morfologia comparado a outros blastocistos e poderia ser menos otimos candidatos para transferencia. Para analise de imagem manual, o embriao 14 poderia ser um falso positivo baseado nestes dois criterios, e o terceiro parametro de duragao entre 2a e 3a mitose e necessario para gerar um negativo verdadeiro. No entanto, o algoritmo automatizado toma a previsao correta usando somente os primeiros dois criterios. Estes resultados indicam que nosso algoritmo automatizado pode prever com sucesso blastocisto vs. nao- blastocisto bem como se diferenciar entre qualidades diferentes de blastocisto. Assim, para situagoes quando multiplos embrioes sao determinados como tendo bom potencial de desenvolvimento, e possivel calcular uma classificagao de suas qualidades relativas, para selecionar os embrioes top 1 ou 2 para transferir durante os procedimentos IVF.
[0287] O anterior meramente ilustra os prindpios da invengao. Sera apreciado que os especialistas na tecnica serao capazes de conceber varios arranjos, embora nao explicitamente descritos ou mostrados aqui, realizam os prindpios da invengao e sao inclwdos dentro de seu espmto e escopo. Alem disso, todos os exemplos e linguagens condicionais recitados aqui sao principalmente pretendidos para auxiliar no entendimento dos prindpios da invengao e os conceitos contribwdos pelos inventores a promover a tecnica, e sao interpretados como sendo sem limitagao a ditos exemplos e condigoes especificamente recitados. Alem disso, todas as declaragoes que aqui indicam prindpios, aspectos e modalidades da invengao bem como exemplos espedficos dos mesmos, prentedem incluir ambos equivalentes estruturas e funcionais dos mesmos. Alem disso, entende-se que ditos equivalentes incluem ambos os equivalentes conhecidos e os equivalentes desenvolvidos no futuro, ou seja, qualquer elemento desenvolvido que realiza a mesma fungao, independentemente da estrutura. O escopo da presente invengao, portanto, nao tem a intengao de ser limitado as modalidades exemplares e descritos aqui. Pelo contrario, o escopo e esprnto da presente invengao e realizado pelas reivindicagoes anexadas.

Claims (8)

1. Metodo para selecionar um ou mais embrioes humanos que provavelmente alcangarao o estagio de blastocisto, caracterizado por compreender as etapas de: - cultivar um ou mais embrioes humanos em condigoes suficientes para desenvolvimento de embriao; - realizar o imageamento por lapso de tempo dos ditos um ou mais embrioes durante pelo menos um evento de citocinese ou ciclo celular; - medir de pelo menos um parametro celular compreendendo: (a) a duragao da primeira citocinese; ou (b) o tempo entre a primeira e a segunda mitose; ou (c) o tempo entre a segunda e a terceira mitose; e - selecionar um embriao quando o dito pelo menos um parametro celular for: (i) uma duragao da primeira citocinese que e de 0 minutos ate 33 minutos; ou (ii) um intervalo de tempo entre a primeira e a segunda mitose que e de 7,8 a 14,3 horas; ou (iii) um intervalo de tempo entre a segunda e a terceira mitose que e de 0 a 5,8 horas; - para entao selecionar um embriao que provavelmente alcangara o estagio de blastocisto.
2. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: - medir: (a) a duragao da primeira citocinese; e (b) o tempo entre a primeira e a segunda mitose; e - selecionar um embriao quando: (i) a duragao da primeira citocinese for 0 minutos ate 33 minutos; e (ii) o intervalo de tempo entre a primeira e a segunda mitose for 7,8 a 14,3 horas.
3. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: - medir: (a) a duragao da primeira citocinese; e (c) o tempo entre a segunda e a terceira mitose; e - selecionar um embriao quando: (i) a duragao da primeira citocinese for 0 minutes ate 33 minutes; e (iii) o intervalo de tempo entre a segunda e a terceira mitose for 0 a 5,8 horas.
4. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: - medir: (b) o tempo entre a primeira e a segunda mitose; e (c) o tempo entre a segunda e a terceira mitose; e - selecionar um embriao quando: (ii) o intervalo de tempo entre a primeira e a segunda mitose for 7,8 a 14,3 horas; e (iii) o intervalo de tempo entre a segunda e a terceira mitose for 0 a 5,8 horas.
5. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: - medir: (a) a duragao da primeira citocinese; e (b) o tempo entre a primeira e a segunda mitose; e (c) o tempo entre a segunda e a terceira mitose; e - selecionar um embriao quando: (i) a duragao da primeira citocinese for 0 minutos ate 33 minutos; e (ii) o intervalo de tempo entre a primeira e a segunda mitose for 7,8 a 14,3 horas; e (iii) o intervalo de tempo entre a segunda e a terceira mitose for 0 a 5,8 horas.
6. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender a medigao da duragao da primeira citocinese e selegao de um embriao quando a duragao da primeira citocinese for 0 minutos ate 33 minutos.
7. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender a medigao do tempo entre a primeira e a segunda mitose e selegao de um embriao quando o intervalo de tempo entre a primeira e a segunda mitose for 7,8 a 14,3 horas.
8. Metodo, de acordo com a reinvindicação 1, caracterizado por compreender a medigao do tempo entre a segunda e a terceira mitose e selegao de um embriao quando o intervalo de tempo entre a segunda e a terceira mitose for 0 a 5,8 horas.
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JP (2) JP5951487B2 (pt)
KR (1) KR101747983B1 (pt)
CN (2) CN102576027B (pt)
AU (1) AU2010286740B2 (pt)
BR (1) BR112012003847B1 (pt)
CA (1) CA2761231C (pt)
CL (1) CL2012000456A1 (pt)
DK (4) DK2827150T6 (pt)
EA (1) EA025172B9 (pt)
ES (3) ES2399711T3 (pt)
HK (3) HK1166521A1 (pt)
HU (1) HUE052071T2 (pt)
IL (1) IL218239A (pt)
IN (1) IN2012DN02452A (pt)
MX (1) MX2012002266A (pt)
MY (1) MY180473A (pt)
NZ (1) NZ598293A (pt)
PL (1) PL2827150T3 (pt)
PT (1) PT2827150T (pt)
SG (1) SG178536A1 (pt)
WO (1) WO2011025736A1 (pt)
ZA (1) ZA201201363B (pt)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5879666A (en) * 1996-10-24 1999-03-09 The Procter & Gamble Company Methods and compositions for reducing body odor
HUP0900431A2 (en) * 2009-07-10 2011-01-28 Cryo Innovation Kft Sample imaging system and pocedure for transmitting imager of cells or tissues located in breeder space towards a data processing device
CN102576027B (zh) 2009-08-22 2014-10-01 里兰斯坦福初级大学理事会 成像并评估胚胎、卵母细胞和干细胞
US8621943B2 (en) * 2009-09-30 2014-01-07 Weyerhaeuser Nr Company Method of singulating embryos
DE102010009853B4 (de) * 2010-03-02 2012-12-06 Bruker Daltonik Gmbh Bestimmung von Gewebezuständen mittels bildgebender Massenspektrometrie
CN103517676A (zh) 2010-09-27 2014-01-15 奥克索金股份有限公司 用于胚胎、卵母细胞和干细胞的自动化成像和评价的装置、方法和系统
US20130217061A1 (en) * 2010-10-25 2013-08-22 Masahiko Sato Apparatus for Systematic Single Cell Tracking of Distinctive Cellular Events
DK2678675T3 (en) * 2011-02-23 2018-01-15 Univ Leland Stanford Junior METHODS FOR DETECTING ANEUPLOIDY IN HUMAN EMBRYONS
EP2811016B1 (en) * 2011-05-31 2017-10-04 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastomere cleavage and morphology
US8934698B2 (en) * 2011-06-22 2015-01-13 The Johns Hopkins University System and device for characterizing cells
US9410939B2 (en) 2011-07-01 2016-08-09 Cambridge Enterprise Limited Methods for predicting mammalian embryo viability
JP5887766B2 (ja) * 2011-08-31 2016-03-16 株式会社ニコン 顕微鏡制御装置、画像処理装置、顕微鏡装置およびプログラム
WO2013056002A1 (en) * 2011-10-12 2013-04-18 University Of Iowa Research Foundation Use of microrna for assessing embryos grown in vitro and improving culture media
WO2013069452A1 (ja) * 2011-11-08 2013-05-16 浜松ホトニクス株式会社 幹細胞の観察方法、分化傾向状態の細胞領域の除去方法、及び、幹細胞の観察装置
KR101697512B1 (ko) * 2011-12-15 2017-01-19 한국전자통신연구원 영상 정합 장치 및 방법
US20160151090A1 (en) * 2011-12-22 2016-06-02 Previvo Genetics, Llc Recovery and processing of human embryos formed in vivo
US9216037B2 (en) 2013-06-21 2015-12-22 Previvo Genetics, Llc Uterine lavage for embryo retrieval
US20150272622A1 (en) * 2011-12-22 2015-10-01 Previvo Genetics, Llc Recovery and processing of human embryos formed in vivo
US9282995B2 (en) * 2011-12-22 2016-03-15 Previvo Genetics, Llc Recovery and processing of human embryos formed in vivo
EP2802872A4 (en) 2012-01-13 2015-09-09 Univ Leland Stanford Junior MECHANICAL BIOMARKERS FOR THE VITABILITY OF OOCYTES AND EMBRYOS
WO2013113707A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-08 Ventana Medical Systems, Inc. System for detecting genes in tissue samples
US20130225431A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Assessment of cellular fragmentation dynamics for detection of human embryonic aneuploidy
JP2013230145A (ja) 2012-04-30 2013-11-14 Masahiko Sato 細胞集団の状態を評価するための方法、候補化合物の発癌性を評価するための方法、潜在的な抗癌化合物の抗癌活性を評価するための方法及び治療用細胞集団の品質を評価するための方法
US20140017717A1 (en) * 2012-05-31 2014-01-16 Auxogyn, Inc. In vitro embryo blastocyst prediction methods
EP2855664B1 (en) * 2012-05-31 2017-10-04 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastocyst development
ITRM20120257A1 (it) * 2012-06-05 2013-12-06 Advanced Comp Systems A C S S P A Metodo per la quantificazione del grado di regolarità morfologica della zona pellucida in embrioni e ovociti.
US20150169842A1 (en) 2012-06-25 2015-06-18 Unisense Fertilitech A/S Method and apparatus
ES2831867T3 (es) * 2012-08-30 2021-06-09 Unisense Fertilitech As Evaluación automática de embriones en incubación in vitro
US9829482B2 (en) * 2012-09-13 2017-11-28 Purdue Research Foundation Motility-contrast imaging for oocyte and embryo viability assessment
PL2951574T3 (pl) * 2013-02-01 2019-12-31 Ares Trading Sa Pomiar rozwoju zarodka i potencjału do zagnieżdżenia wraz z czasem i parametrami fenotypu pierwszych cytokinez
US10241108B2 (en) * 2013-02-01 2019-03-26 Ares Trading S.A. Abnormal syngamy phenotypes observed with time lapse imaging for early identification of embryos with lower development potential
EP2962101A4 (en) * 2013-02-28 2016-10-19 Progyny Inc APPARATUS, METHOD AND SYSTEM FOR CLASSIFYING HUMAN EMBRYONIC CELLS FROM IMAGES
US10667499B2 (en) 2013-03-14 2020-06-02 FUJIFILM Irvine Scientific, Inc. Method and quality control molecular based mouse embryo assay for use with in vitro fertilization technology
BR112015022446B1 (pt) * 2013-03-14 2022-05-17 Fujifilm Irvine Scientific, Inc Método e ensaio com embrião de camundongo em base molecular para controle de qualidade destinado a uso com tecnologia de fertilização in vitro
WO2014172608A2 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Parthenolide derivatives and their modulation of processes controlled by regulated translation
US9404908B2 (en) * 2013-04-29 2016-08-02 The Board of Truestees of the Leland Stanford Junior University Non-invasive imaging to the blastocyst stage for the detection of human embryonic aneuploidy
GB201312032D0 (en) * 2013-07-04 2013-08-21 Vitrolife Kft Embryo assessment method
WO2015001396A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 At Medical Ltd. A device for monitoring the development of a biological material
JP2015029431A (ja) * 2013-07-31 2015-02-16 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
US10123697B2 (en) * 2013-09-10 2018-11-13 University Of Rochester Apparatus and method for automatic alignment in an optical system and applications
JP6303347B2 (ja) * 2013-09-11 2018-04-04 大日本印刷株式会社 検体画像管理システム及び検体画像管理プログラム
WO2015045012A1 (ja) * 2013-09-24 2015-04-02 富士通株式会社 コロニー検査プログラム、コロニー検査装置およびコロニー検査方法
JPWO2015045183A1 (ja) * 2013-09-30 2017-03-09 富士通株式会社 コロニー画像検査プログラム、コロニー画像検査方法及びコロニー画像検査装置
US9519823B2 (en) * 2013-10-04 2016-12-13 The University Of Manchester Biomarker method
US9953417B2 (en) 2013-10-04 2018-04-24 The University Of Manchester Biomarker method
US10540783B2 (en) * 2013-11-01 2020-01-21 Illumina, Inc. Image analysis useful for patterned objects
US20150125899A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-07 Rebecca Willits Fluorescence-assisted counting apparatus for qualitative and/or quantitative measurement of fluorescently tagged particles
US9469650B2 (en) 2013-11-08 2016-10-18 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Melampomagnolide B derivatives
US9487536B2 (en) 2013-11-08 2016-11-08 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Melampomagnolide B derivatives
US9395346B2 (en) * 2013-11-18 2016-07-19 Zoetis Services Llc Non-contact egg identification system for determining egg viability, and associated method
AU2014374989B2 (en) * 2014-01-03 2019-09-12 Copan Italia S.P.A. Apparatus and method for treatment of diagnostic information relating to samples of microbiological material
JP6343935B2 (ja) * 2014-01-09 2018-06-20 大日本印刷株式会社 成育情報管理システム及び成育情報管理プログラム
JP6343934B2 (ja) * 2014-01-09 2018-06-20 大日本印刷株式会社 成育情報管理システム及び成育情報管理プログラム
GB2524082A (en) * 2014-03-14 2015-09-16 Unisense Fertilitech As Methods and apparatus for analysing embryo development
WO2015143350A1 (en) 2014-03-20 2015-09-24 Auxogyn, Inc. Quantitative measurement of human blastocyst and morula morphology developmental kinetics
US9723831B2 (en) * 2014-07-30 2017-08-08 The Governing Council Of The University Of Toronto System and methods for automated vitrification of biological materials
JP6775911B2 (ja) * 2014-11-14 2020-10-28 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 細胞特性を判定する方法および装置、並びに疾患の検査方法
US9981990B2 (en) 2014-12-03 2018-05-29 Bioventures, Llc Melampomagnolide B dimers
US9723989B2 (en) * 2015-01-19 2017-08-08 Purdue Research Foundation Ex vivo motility contrast imaging
JP2018508234A (ja) * 2015-02-17 2018-03-29 ジェネア アイピー ホールディングス ピーティーワイ リミテッド 生物学的試料を動的に培養するための方法および装置
IL254325B2 (en) 2015-03-13 2024-03-01 Genea Ltd Method and device for microscopy
EP4306955A3 (en) * 2015-03-26 2024-03-06 University of Houston System Integrated functional and molecular profiling of cells
CN107708568B (zh) * 2015-06-30 2020-11-20 佳能美国公司 配准的基准标记、系统和方法
JP6746945B2 (ja) * 2015-06-30 2020-08-26 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理システム及び情報処理方法
US10420626B2 (en) 2015-06-30 2019-09-24 Canon U.S.A., Inc. Fiducial markers, systems, and methods of registration
US10510143B1 (en) * 2015-09-21 2019-12-17 Ares Trading S.A. Systems and methods for generating a mask for automated assessment of embryo quality
US11494578B1 (en) * 2015-09-21 2022-11-08 Ares Trading S.A. Systems and methods for automated assessment of embryo quality using image based features
WO2017132528A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Bioventures, Llc Triazole derivatives of melampomagnolide b and methods of use thereof
CN109312286A (zh) * 2016-06-13 2019-02-05 索尼公司 装置、信息处理装置、程序和信息处理方法
JP6992748B2 (ja) * 2016-06-15 2022-02-03 ソニーグループ株式会社 情報処理装置、観察システム、観察方法及びプログラム
US11249021B2 (en) 2016-06-30 2022-02-15 Esco Medical Aps Apparatus for the incubation of a biological material
JP6776672B2 (ja) * 2016-07-08 2020-10-28 住友電気工業株式会社 品質評価方法及び品質評価装置
JP2018014991A (ja) * 2016-07-13 2018-02-01 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法及び情報処理システム
JP2018022216A (ja) 2016-08-01 2018-02-08 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム
CN107058455B (zh) * 2016-08-10 2021-09-17 黑龙江省农业科学院畜牧研究所 猪2细胞胚胎体积的测量方法
CN109790509A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 南洋理工大学 用于胚胎活检的装置
WO2018100913A1 (ja) * 2016-11-29 2018-06-07 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法、プログラム及び観察システム
US20190376955A1 (en) * 2016-11-30 2019-12-12 Sony Corporation Information processing apparatus, observation system, information processing method, and program
US11436719B2 (en) 2017-02-16 2022-09-06 Kyoto University Cell evaluation method, cell evaluation device, and recording medium storing cell evaluation program
BR112019025849A2 (pt) * 2017-06-13 2020-07-07 Sony Corporation aparelho, sistema e método de processamento de informação, e, programa.
CN107312861B (zh) * 2017-08-01 2020-08-18 北京大学人民医院 一种b-all患者预后风险评估标记物
US11202652B2 (en) 2017-08-11 2021-12-21 Canon U.S.A., Inc. Registration and motion compensation for patient-mounted needle guide
WO2019034328A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Siemens Healthcare Gmbh IDENTIFYING THE QUALITY OF CELLULAR IMAGES ACQUIRED USING DIGITAL HOLOGRAPHIC MICROSCOPY USING CONVOLUTIONAL NEURAL NETWORKS
WO2019068073A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. AUTOMATED EVALUATION OF HUMAN EMBRYOS
JP6414310B1 (ja) * 2017-10-26 2018-10-31 ソニー株式会社 受精卵品質評価方法、プログラム及び情報処理装置
US10426424B2 (en) 2017-11-21 2019-10-01 General Electric Company System and method for generating and performing imaging protocol simulations
US10893911B2 (en) 2017-11-26 2021-01-19 Canon U.S.A., Inc. Automated image cropping for enhanced automatic device-to-image registration
JP2019100940A (ja) * 2017-12-06 2019-06-24 東ソー株式会社 未分化細胞を高感度に検出および回収する方法
FR3077136A1 (fr) * 2018-01-19 2019-07-26 I2S Dispositif d'observation d'une cellule ou d'un ensemble de cellules vivantes
JPWO2019172112A1 (ja) * 2018-03-06 2021-02-18 ゼノアックリソース株式会社 細胞凍結保存用溶液およびその利用
US10552957B2 (en) * 2018-03-24 2020-02-04 Dan Nayot Methods and systems for determining quality of an oocyte
JP7207410B2 (ja) * 2018-06-28 2023-01-18 株式会社ニコン 画像解析方法、システム及びプログラム
TWI669616B (zh) * 2018-08-13 2019-08-21 行政院原子能委員會核能研究所 圓柱狀和圓餅狀數位模型之模擬切割方法
CN113141778A (zh) 2018-09-20 2021-07-20 艾弗夫有限公司 图像特征检测
EP3644228A1 (en) * 2018-10-23 2020-04-29 The Chinese University Of Hong Kong Method and apparatus for segmenting cellular image
US10748290B2 (en) * 2018-10-31 2020-08-18 Fei Company Smart metrology on microscope images
TWI664582B (zh) * 2018-11-28 2019-07-01 靜宜大學 細胞檢測方法、裝置與系統
WO2020144582A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-16 Novocure Gmbh Evaluating quality of segmentation of an image into different types of tissue for planning treatment using tumor treating fields (ttfields)
US11274800B2 (en) * 2019-01-11 2022-03-15 Valeo North America, Inc. IR illuminator with asymetric radiation pattern
CN109829898B (zh) * 2019-01-17 2023-05-16 柳州康云互联科技有限公司 一种用于互联网检测中基于神经网络的测量检测系统及方法
US11386559B2 (en) * 2019-04-03 2022-07-12 The Regents Of The University Of California System and method for tissue viability screening
WO2020198779A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Presagen Pty Ltd Method and system for selecting embryos
WO2020223157A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Animated Dynamics, Inc. Interferometric method and apparatus for non-invasive assessment of oocyte maturity and competency
CN110363218B (zh) * 2019-06-06 2023-07-11 张孝东 一种胚胎无创评估方法及装置
CN110129201A (zh) * 2019-06-13 2019-08-16 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 胚胎时差培养装置
WO2020261555A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30 オリンパス株式会社 画像生成システムおよび画像生成方法
WO2021040870A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Coopersurgical, Inc. Reproductive specimen processing systems and methods
WO2021056046A1 (en) * 2019-09-25 2021-04-01 Presagen Pty Ltd Method and system for performing non-invasive genetic testing using an artificial intelligence (ai) model
BR112022010586A2 (pt) * 2019-12-19 2022-08-16 Pioneer Hi Bred Int Geração e uso de modelo preditivo de cultura de micrósporo
US20210302710A1 (en) * 2020-02-24 2021-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Bragg light source for dark-field imaging devices
EP4211459A1 (en) * 2020-09-08 2023-07-19 AIVF Ltd. System and method for representing a biological process via non-speech audio
CN112382339A (zh) * 2020-11-17 2021-02-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种识别合子型基因激活zga基因的方法及装置
CN112481273B (zh) * 2020-12-29 2023-11-24 南通大学附属医院 结直肠癌抑癌基因及其启动子区高dna甲基化的验证方法
WO2022192436A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Thread Robotics Inc. System and method for automated gamete selection
AU2022289837A1 (en) * 2021-06-10 2023-08-24 Alife Health Inc. Machine learning for optimizing ovarian stimulation
CN113834936A (zh) * 2021-08-20 2021-12-24 李竞宇 生长分化因子9在预测胚胎发育潜力中的应用
WO2023081446A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 Thread Robotics Inc. System and method for automated cell positioning
WO2023225121A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 Overture Life, Inc. Methods, computer programs, and systems for automated microinjection

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
EP0430881A3 (en) 1989-11-29 1991-10-23 Ciba-Geigy Ag Photochromic compounds, process for their preparation and their use
US5288644A (en) 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
JP2775346B2 (ja) 1992-04-03 1998-07-16 アプライド バイオシステムズ，インコーポレイテッド プローブ構成物および方法
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5470710A (en) 1993-10-22 1995-11-28 University Of Utah Automated hybridization/imaging device for fluorescent multiplex DNA sequencing
GB9401833D0 (en) 1994-02-01 1994-03-30 Isis Innovation Method for discovering ligands
US5541081A (en) 1994-03-22 1996-07-30 President And Fellows Of Harvard College Process for assessing oocyte and embryo quality
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
WO1996030496A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Human embryo co-culture system and uses thereof
GB9507238D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
JP3660026B2 (ja) 1995-09-04 2005-06-15 扶桑薬品工業株式会社 体外受精用培地組成物
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
WO1997019345A1 (en) 1995-11-22 1997-05-29 Unisense Aps Microsensor and use of such microsensor
JP2002515738A (ja) 1996-01-23 2002-05-28 アフィメトリックス，インコーポレイティド 核酸分析法
EP0953354A4 (en) 1996-08-13 2002-10-23 Fujisawa Pharmaceutical Co HEMATOPOIETIC STEM CELLS PROLIFERING ACTIVE SUBSTANCES
US6008010A (en) * 1996-11-01 1999-12-28 University Of Pittsburgh Method and apparatus for holding cells
DK172855B1 (da) 1996-11-12 1999-08-16 Unisense Aps Fremgangsmåde til måling af koncentrationen af et medium i et miljø, mikrosensor til brug ved fremgangsmåden og anvendelse
US6166761A (en) 1997-01-09 2000-12-26 Interface Multigrad Technology Method and apparatus for monitoring a biological sample
CA2199663C (en) 1997-03-11 2004-08-10 Ruth Miriam Moses In vitro maturation and fertilization of mammalian oocytes
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US5961444A (en) 1997-10-17 1999-10-05 Medworks Corporation In vitro fertilization procedure using direct vision
CZ20012968A3 (cs) 1999-02-24 2002-01-16 Novo Nordisk A/S Léčení neplodnosti
FR2812004B1 (fr) 2000-07-24 2002-12-27 Ccd Lab Milieux de culture pour fecondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons
CA2468861C (en) * 2001-12-05 2012-06-12 The Regents Of The University Of California Robotic microscopy systems
WO2003055385A1 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Unisense A/S Multifibre sensor for measuring perfusion
US7015031B2 (en) 2002-01-24 2006-03-21 Genx International, Inc. Biological specimen-culturing system and method with onboard specimen development sensors
CA2476072A1 (en) 2002-02-13 2003-09-18 Reify Corporation Method and apparatus for acquisition, compression, and characterization of spatiotemporal signals
GB0215668D0 (en) 2002-07-06 2002-08-14 Weatherford Lamb Coupling tubulars
US20060099570A1 (en) 2002-12-23 2006-05-11 Damgaard Lars R Device and method for non-invasive measurement of the individual metabolic rate of a substantially spherical metabolizing particle
CN2610349Y (zh) * 2003-04-01 2004-04-07 北京舒尔德科技发展有限公司 多功能显微成像仪
US7106502B1 (en) 2003-08-21 2006-09-12 The United States Of America As Represented By The Administrator Of National Aeronautics And Space Administration Operation of a Cartesian robotic system in a compact microscope imaging system with intelligent controls
HU0302888D0 (en) 2003-09-09 2003-11-28 Pribenszky Csaba Dr In creasing of efficacity of stable storage by freezing of embryos in preimplantation stage with pretreatment by pressure
CA2537938C (en) 2003-09-09 2013-01-22 Cryo-Innovation Kft. Improving post-thaw survival of cryopreserved biological material by hydrostatic pressure challenge
GB2409029A (en) 2003-12-11 2005-06-15 Sony Uk Ltd Face detection
US20070054289A1 (en) * 2004-03-29 2007-03-08 Michigan State University Identification of genes involved in fertility, ovarian function and/or fetal/newborn viability
US7572601B2 (en) * 2004-10-15 2009-08-11 Northwestern University Compositions and methods for determining oocyte development potential
EP1828419A1 (en) 2004-11-17 2007-09-05 ReproCure, LLC Methods of determining human egg competency
WO2007042044A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Unisense Fertilitech A/S Determination of a change in a cell population
CN103113463B (zh) 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
JP4921858B2 (ja) * 2006-06-07 2012-04-25 オリンパス株式会社 画像処理装置および画像処理プログラム
CN101495619B (zh) 2006-06-16 2014-01-08 尤尼森斯繁殖技术公司 基于卵裂球分裂和运动的胚胎质量评估
US8428331B2 (en) * 2006-08-07 2013-04-23 Northeastern University Phase subtraction cell counting method
CA2666819A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Universite Laval Mammalian oocyte development competency granulosa markers and uses thereof
US7940978B2 (en) * 2007-06-05 2011-05-10 General Electric Company Automatic characterization of cellular motion
ATE503000T1 (de) 2007-06-29 2011-04-15 Unisense Fertilitech As Vorrichtung, system und verfahren zur beobachtung und/oder kultivierung mikroskopischer objekte
GB0806281D0 (en) 2008-04-07 2008-05-14 Univ Leeds Markers of Oocyte viability
US20110092763A1 (en) * 2008-05-27 2011-04-21 Gene Security Network, Inc. Methods for Embryo Characterization and Comparison
JP2010004789A (ja) * 2008-06-26 2010-01-14 Nikon Corp 胚観察装置
WO2010003423A2 (en) 2008-07-05 2010-01-14 Unisense Fertilitech A/S One to one identification system
WO2010010201A1 (es) 2008-07-22 2010-01-28 Equipo Ivi Investigacion Sl Perfil de expresion genetica como marcador de la receptividad endometrial
HUP0900431A2 (en) 2009-07-10 2011-01-28 Cryo Innovation Kft Sample imaging system and pocedure for transmitting imager of cells or tissues located in breeder space towards a data processing device
CA2768007A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Bwt Biometrics, Llc Methods of assessing embryo outcome
CN102576027B (zh) 2009-08-22 2014-10-01 里兰斯坦福初级大学理事会 成像并评估胚胎、卵母细胞和干细胞
WO2011071551A1 (en) 2009-12-08 2011-06-16 Molecular Biometrics, Inc. Sample cell for spectroscopic analysis, systems and uses thereof
EP2348318A1 (en) 2010-01-21 2011-07-27 Equipo Ivi Investigación, S.L. Diagnostic method for endometrial receptivity
GB2484457B (en) 2010-10-02 2015-04-15 Univ Plymouth Method and system for determining characteristics of an embryo and uses thereof
EP2811016B1 (en) 2011-05-31 2017-10-04 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastomere cleavage and morphology
US20140017717A1 (en) 2012-05-31 2014-01-16 Auxogyn, Inc. In vitro embryo blastocyst prediction methods

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