EA025172B1 - Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты - Google Patents

Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты Download PDF

Info

Publication number
EA025172B1
EA025172B1 EA201270300A EA201270300A EA025172B1 EA 025172 B1 EA025172 B1 EA 025172B1 EA 201270300 A EA201270300 A EA 201270300A EA 201270300 A EA201270300 A EA 201270300A EA 025172 B1 EA025172 B1 EA 025172B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cell
embryos
embryo
time
cytokinesis
Prior art date
Application number
EA201270300A
Other languages
English (en)
Other versions
EA025172B9 (ru
EA201270300A1 (ru
Inventor
Конни С. Вонг
Кевин Э. Лоуке
Томас М. Баэр
Рене А. Реййо-Пера
Барри Бер
Original Assignee
Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Лелэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42799722&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA025172(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Лелэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити filed Critical Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Лелэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити
Publication of EA201270300A1 publication Critical patent/EA201270300A1/ru
Publication of EA025172B1 publication Critical patent/EA025172B1/ru
Publication of EA025172B9 publication Critical patent/EA025172B9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/42—Gynaecological or obstetrical instruments or methods
    • A61B17/425—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61B17/435—Gynaecological or obstetrical instruments or methods for reproduction or fertilisation for embryo or ova transplantation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/06—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for in vitro fertilization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/698—Matching; Classification
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B45/00—ICT specially adapted for bioinformatics-related data visualisation, e.g. displaying of maps or networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1029—Particle size
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/103—Particle shape
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1493—Particle size
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1497—Particle shape
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10004—Still image; Photographic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30044—Fetus; Embryo

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)

Abstract

В изобретении предложен способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты, включающий культивирование одного или более эмбрионов человека в условиях, подходящих для развития эмбриона; цейтраферную съемку у одного или более эмбрионов длительности по меньшей мере одного явления цитокинеза или клеточного цикла; измерение по меньшей мере одного клеточного параметра, включающего (а) длительность первого цитокинеза; или (б) время между первым и вторым митозом; или (в) время между вторым и третьим митозом; и идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, когда указанный по меньшей мере один клеточный параметр для указанного эмбриона соответствует (i) длительности первого цитокинеза, составляющей до 33 мин; или (ii) времени между первым и вторым митозом, составляющим от около 7,8 до 14,3 ч; или (iii) времени между вторым и третьим митозом, составляющим до 5,8 ч.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биологических и клинических исследований и, в частности, к визуализации и оценке зигот/эмбрионов, яйцеклеток и стволовых клеток, полученных как от человека, так и от животных.
Уровень техники
Бесплодие является распространенной проблемой, затрагивающей 10-15% пар репродуктивного возраста. Только в Соединенных штатах в 2006 г. было выполнено примерно 140000 циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (сйс.доу/ай). Это привело к культивированию более чем миллиона эмбрионов ежегодно с различной, и часто неопределенной, способностью к имплантации и развитию до времени родов. Доля живорождений, на цикл, после ЭКО составляла всего 29%, при этом в среднем 30% живорождений давали многоплодные беременности (сйс.доу/ай). Многоплодные беременности имеют хорошо задокументированные нежелательные последствия как для матери, так и для плодов, такие как выкидыши, преждевременные роды и низкий уровень рождаемости. Возможные причины неблагоприятного исхода ЭКО разнообразны; однако со времени появления ЭКО в 1978 г. одной из основных сложностей было определение эмбрионов, которые в наибольшей степени пригодны для переноса и с наибольшей вероятностью в результате приведут к доношенной беременности.
В данной области понимание основ развития эмбрионов ограничено, так как исследования в области биологии эмбрионов человека остаются трудной задачей и часто лишены помощи фондов, финансирующих научные исследования. Вследствие этого, большая часть имеющихся сейчас знаний о развитии эмбрионов получена в исследованиях модельных организмов. Однако, хотя эмбрионы организмов разных видов проходят через схожие стадии развития, временные характеристики у разных видов отличаются. Эти и многие другие различия делают невозможным прямую экстраполяцию от одного вида на другой (Тай, КБ. (2008) ТЬегюдепо1о§у 69(1): 10-16). Общие пути развития человека, а также лежащие в их основе молекулярные детерминанты, являются уникальными для развития эмбриона человека. Например, у мышей эмбриональная транскрипция активируется примерно через 12 ч после оплодотворения, одновременно с первым делением дробления, тогда как у человека эмбриональная активация генов (ЕОА) происходит на 3 день, примерно на 8-клеточной стадии (Ве11, С.Е., е! а1. (2008) Мо1. Нит. Вергой. 14:691-701; Вгаийе, Р., е! а1. (1988) Ыа1иге 332:459-461; Ната!ат, Т. е! а1. (2004) Ргос. ЫаЙ. Асай. §ск 101:10326-10331; ЭоЪюп. Т. е! а1. (2004) Нитап Мо1еси1аг Оепейск 13 (14):1461-1470). Кроме того, гены, активность которых модулируется на ранних стадиях развития человека, являются уникальными (ЭоЪюп. Т. е! а1. (2004) Нитап Мо1еси1аг Оепейск 13(14): 1461-1470). Более того, у других видов, таких как мышь, более 85% эмбрионов, культивируемых ш νίϋΌ, достигают стадии бластоцисты, одной из первых основных вех в развитии млекопитающих, в то время как культивируемые эмбрионы человека имеют среднюю частоту образования бластоцисты примерно 30-50%, с высокой встречаемостью мозаицизма и аномальных фенотипов, таких как фрагментация и блок развития (Κΐοπζΐ, Ь. е! а1. (2005) Кергой. Вютей. Опйпе 10:669-681; Айкат, М., е! а1. (2005) Мо1. Нит. Кергой. 11:335-344; Ке1и, Μ.Ό., е! а1. (2006) Регй1. §!егй. 86:321-324; Ргепсй, Ό.Β., е! а1. (2009) Регй1. §!егй.). Несмотря на такие различия, большинство научных данных о доимплантационном развитии эмбрионов получено на модельных организмах, и их трудно соотнести с развитием эмбрионов человека (2егшска-0оеи, М. (2002) ^еνе1ортеп! 129:815-829; №ап§, р., е! а1. (2004) 1)е\ Се11. 6:133-144; Ве11, С.Е., е! а1. (2008) Мо1. Нит. Кергой. 14:691-701; 2егтскаСоеЧ. М. (2006) Сигг. Орт. Оепе!. Эе\'. 16:406-412; М!апдо, Ν.Κ., е! а1. (2008) 1п!. Ке\'. Се11. Мо1. Вю1. 268:223-290).
Традиционно, в проводящих ЭКО клиниках жизнеспособность эмбриона человека оценивают по простым морфологическим признакам, таким как наличие одинаковых по размеру, одноядерных бластомеров и степень клеточной фрагментации (Кушйеге Р.М., 1ап§еп С.А.М. (1998) Нит Кергой 13:2869-73; Мйк1 А.А., е! а1. (2002) Регй1 §!егй 77:1191-5). В последние годы для оценки качества эмбрионов стали также использовать дополнительные способы, такие как длительное культивирование эмбрионов (до стадии бластоцисты на 5 день) и анализ состояния хромосом посредством преимплантационной генетической диагностики (ПГД) (Мйк1 А., е! а1. (2000) Регй1 §!егй 73:126-9; Ргадоий Е., (2009) Регй1 §!егй 1ип 21 [ЕРиЪ айеай оГ рпп!]; Е1-Тоикйу Т., е! а1. (2009) Нит Кергой 6:20; Уаппе8!е Е., е! а1. (2009) ΝηΙ Мей 15:577-83). Однако у этих способов существуют также потенциальные риски, так как приходится увеличивать период культивирования и нарушать целостность эмбриона (МашраМга!п §., е! а1. (2009) Регй1 §!ей1 91:305-15; Ма§!епЪгоек §., е! а1. (2007) N Еп§1 1. Мей. 357:9-17).
Недавно было показано, что цейтраферная съемка может быть полезным приемом для наблюдения за ранним развитием эмбрионов. В некоторых способах цейтраферная съемка применяется для контроля за развитием эмбрионов человека после внутриплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ) (№щу е! а1. (1994) Нитап Кергойисйоп. 9 (9): 1743-1748; Раупе е! а1. (1997) Нитап Кергойисйоп. 12:532-541). Были проанализированы экструзия полярных телец и образование пронуклеуса, и установлено соотно- 1 025172 шение этих процессов с правильной морфологией на 3 день. Однако ни один параметр не коррелировал с образованием бластоцисты или исходом беременности. В других способах в качестве критерия для прогноза в отношении жизнеспособности эмбрионов человека рассматривают начало первого деления дробления (Рентск, е! а1. (2002) Нитап Кергобисйоп, 17:407-412; ЬипФп, е! а1. (2001) Нитап Кергобисйоп 16:2652-2657). Однако в этих способах не учитывают важность длительности цитокинеза или временных интервалов между ранними делениями.
В других способах цейтраферная съемка применяется для измерения хронометража и продолжительности клеточных делений во время раннего развития эмбриона (^0/2007/144001). Однако в этих способах раскрыт только основной и общий способ цейтраферной съемки эмбрионов коровы, которые существенно отличаются от эмбрионов человека с точки зрения способности к развитию, морфологических особенностей, молекулярных и эпигенетических программ, и хронометража, и характеристик, связанных с переносом. Например, эмбрионам коровы необходимо существенно больше времени для имплантации, чем эмбрионам человека (30 и 9 дней соответственно) (Тай, (2008) ТЬеподепо1о§у 69(1):1016). Более того, не раскрыты типичные параметры визуализации или временные интервалы, которые могли бы быть применены для прогноза в отношении жизнеспособности эмбрионов человека.
Совсем недавно цейтраферную съемку применили для наблюдения за развитием эмбриона человека в течение первых 24 ч после оплодотворения (Ьеттеп е! а1. (2008) Кергобисйуе ВюМебюше ОпПпе 17 (3): 385-391). Обнаружено, что синхронность поведения ядер после первого деления коррелирует с исходом беременности. Однако в этой работе сделано заключение, что ранние первые деления дробления не были важным прогностическим параметром, что противоречит предшествующим исследованиям (Реп№1ск, е! а1. (2002) Нитап Кергобисйоп 17:407-412; Ьипбш, е! а1. (2001) Нитап Кергобисйоп 16:2652-2657).
Наконец, не было проведено исследований по оценке пригодности параметров визуализации с точки зрения корреляции с молекулярными программами или хромосомным набором эмбрионов. Таким образом, способы оценки эмбрионов человека неудовлетворительны в нескольких отношениях и могут быть улучшены с помощью настоящих способов, которые включают новые применения цейтраферной микроскопии, анализ изображений и выявление связей между параметрами изображений и молекулярными профилями и хромосомным набором. Настоящее изобретение направлено на рассмотрение этих проблем.
Сущность изобретения
Предложены способы, композиции и наборы для определения способности к развитию одного или нескольких эмбрионов или плюрипотентных клеток, в одном или нескольких эмбрионах или плюрипотентных клетках. Эти способы, композиции и наборы находят применение при идентификации ш уПго эмбрионов и яйцеклеток, имеющих хорошую способность к развитию, т.е. способность или возможность развиться в бластоцисту, которые, таким образом, полезны для применения в способах лечения бесплодия у человека и т.п.
В некоторых воплощениях изобретения предложены способы для определения способности к развитию эмбриона или плюрипотентной клетки. В таких воплощениях измеряют один или несколько клеточных параметров эмбриона или плюрипотентной клетки с получением показателя клеточного параметра. После этого клеточный параметр используют для определения способности к развитию эмбриона или плюрипотентной клетки, и это определение может быть применено как определяющее клинический образ действия. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является морфологическим явлением, которое может быть измерено с помощью цейтраферной микроскопии. В некоторых вариантах воплощения, например, при анализе эмбриона одним или несколькими клеточными параметрами являются длительность явления цитокинеза, например цитокинеза 1; временной интервал между цитокинезом 1 и цитокинезом 2; и временной интервал между цитокинезом 2 и цитокинезом 3. В некоторых воплощениях длительность клеточного цикла 1 также применяют в качестве клеточного параметра. В некоторых вариантах воплощения показатель клеточного параметра применяют путем сравнения его с соответствующим показателем клеточного параметра для референсного эмбриона и применения результатов этого сравнения с целью определения способности эмбриона к развитию. В некоторых воплощениях эмбрион является эмбрионом человека. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является уровнем экспрессии гена, который измеряют с получением показателя экспрессии гена. В некоторых вариантах воплощения показатель экспрессии гена применяют путем сравнения его с показателем экспрессии гена для референсной плюрипотентной клетки или эмбриона, или одной или нескольких его клеток, при этом результаты такого сравнения применяют с целью определения способности к развитию плюрипотентной клетки или эмбриона. В некоторых воплощениях эмбрион является эмбрионом человека.
В некоторых воплощениях изобретения предложены способы для ранжирования эмбрионов или плюрипотентных клеток по их способности к развитию относительно других эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе. В таких воплощениях один или несколько клеточных параметров эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе измеряют с получением показателя клеточного параметра каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток. После этого показатели клеточного параметра используют для определения способности к развитию каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе в
- 2 025172 сравнении друг с другом, и это определение может быть применено как определяющее клинический образ действия. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является морфологическим явлением, которое может быть измерено с помощью цейтраферной микроскопии. В некоторых вариантах воплощения, например, при ранжировании эмбрионов одним или несколькими клеточными параметрами есть длительность явления цитокинеза, например цитокинеза 1; временной интервал между цитокинезом 1 и цитокинезом 2; и временной интервал между цитокинезом 2 и цитокинезом 3. В некоторых воплощениях также измеряют длительность клеточного цикла 1. В некоторых вариантах воплощения клеточный параметр является уровнем экспрессии одного или нескольких генов. В некоторых вариантах воплощения один или несколько показателей клеточного параметра используют путем сравнения показателей клеточного параметра для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе друг с другом с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. В некоторых вариантах воплощения показатели одного или нескольких клеточных параметров используют путем сравнения показателя каждого клеточного параметра с показателем клеточного параметра для референсного эмбриона или плюрипотентной клетки с целью определения способности к развитию каждого эмбриона или плюрипотентной клетки, а также путем сравнения этих способностей к развитию с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга.
В некоторых воплощениях изобретения предложены способы для получения эмбрионов с хорошей способностью к развитию для переноса в организм женщины при вспомогательной репродукции (ЭКО). В таких воплощениях один или несколько эмбрионов культивируют в условиях, подходящих для развития эмбриона. После этого измеряют один или несколько клеточных параметров у одного или нескольких эмбрионов с получением показателя клеточного параметра. Потом показатель клеточного параметра используют с целью определения способности к развитию одного или нескольких эмбрионов. Один или несколько эмбрионов, демонстрирующие хорошую способность к развитию, после этого переносят в организм женщины.
Краткое описание чертежей
Пониманию сути изобретения лучше всего способствует чтение следующего подробного описания одновременно с обращением к сопутствующим графическим материалам. Следует обратить внимание, что в соответствии с обычной практикой различные детали графических материалов приведены не в масштабе. Наоборот, пространственные размеры различных деталей произвольно увеличены или уменьшены для лучшего понимания. В графические материалы включены следующие чертежи.
Фиг. 1 представляет схему, демонстрирующую способы, применяемые для оценки эмбрионов.
На фиг. 2 представлена серия фотографий, демонстрирующая клеточное дробление и деление в течение периода 6 дней. На изображениях проставлены метки от 1 до 6 дня. Масштабная метка соответствует 50 мкм.
На фиг. 3 представлена столбчатая диаграмма, демонстрирующая процентное отношение случаев успешного развития в бластоцисту из 1-клеточных эмбрионов (зигот). В серии из 4 независимых экспериментов в сумме 100 эмбрионов исследовали до 5-6 дня с применением цейтраферной микроскопии. Показано процентное соотношение клеток, достигших каждой из указанных стадий (бластоциста, 8клеточная, 4-7-клеточная, 2-3-клеточная и 1-клеточная).
На фиг. 4 представлена серия из трех различных эмбрионов, за которыми велось наблюдение в течение указанных периодов времени (верхний, средние и нижний ряды).
На фиг. 5 представлена диаграмма, демонстрирующая временные промежутки между стадиями, используемые при проведении данных оценок, включая длительность первого цитокинеза, время между первым и вторым делением (измеряемое как временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2) и время между 2-м и 3-м митозом (измеряемое как временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3).
На фиг. 6 представлена трехмерная точечная диаграмма, демонстрирующая показатели трех явлений, включая длительность первого цитокинеза, временной интервал между первым и вторым клеточными делениями (измеряемый как временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2) и временной интервал между вторым и третьим клеточными делениями (измеряемый как временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3), для большой группы эмбрионов. Показано, что эмбрионы, которые достигли стадии бластоцисты (обозначенные кружками), образуют общий кластер на трехмерной диаграмме, в то время как эмбрионы с блоком развития (обозначенные крестиками) до достижения стадии бластоцисты дают разброс значений по всей диаграмме.
На фиг. 7 приведен график, демонстрирующий характерную кривую обнаружения (КОС) для прогнозирования образования бластоцисты с применением 3 динамических морфологических параметров.
На фиг. 8 приведена радиальная диаграмма, демонстрирующая уровни экспрессии 52 генов для шести 1-2-клеточных эмбрионов с блоком развития и 5 нормальных 1-2-клеточных эмбрионов. Различие уровней экспрессии между нормальными и отклоняющимися от нормы эмбрионами было статистически значимым для генов, выделенных желтым цветом и обозначенных звездочкой, согласно оценке по критерию Манна-Уитни.
- 3 025172
На фиг. 9 приведена столбчатая диаграмма, демонстрирующая уровни экспрессии различных генов у 2-клеточных эмбрионов с блоком развития и нормальных 2-клеточных эмбрионов. Выбранное количество цейтраферных изображений 2-клеточных эмбрионов с блоком развития показано сверху.
На фиг. 10 приведена столбчатая диаграмма, демонстрирующая сравнительный анализ тех же генов, что представлены на фиг. 9, у 4-клеточных эмбрионов с блоком развития и нормальных 4-клеточных эмбрионов. Выбранное количество цейтраферных изображений 4-клеточных эмбрионов с блоком развития показано сверху.
На фиг. 11 представлена серия столбчатых диаграмм, демонстрирующих профили экспрессии генов (ΕδδΡ), имеющих 4 характерных профиля. Указаны временные точки раннего переноса до эмбриональной активации генов (2 день) и экспрессия в типичном случае переноса на 3 день.
На фиг. 12 демонстрируется экспрессия генов в единичных бластомерах на различных стадиях. а. Экспрессия двух генов, ΟΤΝΝΒ1 и СЭХ2. в единичных бластомерах, нанесенная на график при различных клеточных стадиях и показывающая изменения уровней экспрессии этих генов на различных стадиях, например 2-клеточной, 3-клеточной, стадиях морулы и бластоцисты. Ь. Профили экспрессии генов в виде столбцов, представляющих гены, экспрессируемые в соответствии с материнской программой, в сравнении с генами, экспрессируемыми в соответствии с зиготической программой.
На фиг. 13 представлено графическое изображение модели применения анализа цейтраферных изображений совместно с молекулярным анализом для оценки жизнеспособности эмбрионов.
На фиг. 14 представлена серия фотографий, демонстрирующих три стадии развития в ходе созревания яйцеклетки ίη νίίτο.
На фиг. 15 представлена серия фотографий, демонстрирующих процесс развития эмбриона после созревания яйцеклетки ίη νίίτο.
На фиг. 16 представлена схема, демонстрирующая способы, применяемые для оценки яйцеклеток.
На фиг. 17 представлена схема, демонстрирующая способы, применяемые для оценки стволовых клеток и плюрипотентных стволовых клеток.
На фиг. 18 представлена серия фотографий, демонстрирующих процесс дифференцации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в нейронные розетки.
На фиг. 19 представлена таблица категорий, на которые можно разделить гены, для которых проводится количественное определение уровня экспрессии, включающая указание количества генов в каждой категории.
На фиг. 20 представлена таблица четырех типичных эмбриональных стадий профилей (ΕδδΡδ), которые были идентифицированы в ходе анализа экспрессии генов у 141 нормально развивающегося отдельного эмбриона и единичных бластомеров, а также указано разделение на категории генов в каждой из этих категорий.
На фиг. 21 показан автоматизированный анализ изображений, демонстрирующий возможность с помощью параметров обработки изображения прогнозировать образование бластоцисты. а) Показаны результаты применения алгоритма слежения за единичным эмбрионом. Ь) Показан набор из 14 проанализированных эмбрионов. с) Показано сравнение ручного анализа изображений и автоматизированного анализа для случая оценки длительности цитокинеза и времени между первым и вторым митозами. ά) Показано сравнение хорошей морфологии бластоцисты и плохой морфологии бластоцисты.
На фиг. 22 представлено схематическое изображение темнопольного микроскопа по настоящему изобретению; вставка слева демонстрирует схему произведенного с помощью лазера темнопольного фильтра.
На фиг. 23 представлена фотография комплекса из трех микроскопов, показанных на фиг. 22, смонтированных на подложке для установки в инкубатор и для соединения с компьютером. На фиг. 23А показаны микроскопы, а на фиг. 23В показаны микроскопы внутри инкубатора.
На фиг. 24 приведен снимок экрана программного обеспечения для захвата изображения, применяемого в настоящей работе, который демонстрирует изображение эмбрионов, полученное с 3 каналов.
На фиг. 25(а)-(б) приведена серия из четырех фотографий, демонстрирующих избранные цейтраферные изображения, полученные в эксперименте 2, станция 2. Фиг. 25(а) и (Ь) - изображения, захваченные до замены среды, а фиг. 25(с) и (ά) - это изображения, захваченные после замены среды.
На фиг. 26(а) и (Ь) представлены графики (слева) и фотографии клеток (справа), демонстрирующие клеточную активность нормальных и отклонившихся от нормы эмбрионов. При совместном рассмотрении фиг. 26(а) и (Ь) можно наблюдать, что на 3 день эмбрионы обладают схожей морфологией, но их графики клеточной активности существенно различны, и только один из них развивается в бластоцисту.
На фиг. 27А и 27В представлены графические изображения стандартной чашки Петри с микролунками. На фиг. 27А показано графическое изображение чашки с указанием размеров, а на фиг. 27В показано трехмерное изображение микролунок.
На фиг. 28(а) и (Ь) представлены графики, демонстрирующие клеточную активность с предварительной регистрацией изображения и без нее. Фиг. 28(а) и (Ь) при совместном рассмотрении демонстрируют, что регистрация очищает результаты и убирает примесные пики, вызванные сдвигом или вращением эмбриона.
- 4 025172
На фиг. 29(а) и (Ь) представлены графики (слева) и фотографии клеток (справа), демонстрирующие клеточную активность нормальных и отклонившихся от нормы эмбрионов. При совместном рассмотрении фиг. 29(а) и (Ь) можно наблюдать, что на 3 день эмбрионы обладают схожей морфологией, но их графики клеточной активности существенно различны, и только один из них развивается в бластоцисту.
На фиг. 30 представлен график, демонстрирующий различие в интенсивности пикселей между последовательными парами изображений, полученных по мере развития эмбриона. Эти данные можно использовать сами по себе для оценки жизнеспособности эмбрионов, или как средство для улучшения других алгоритмов, таких как фильтр частиц, путем определения, сколько частиц (моделей прогнозируемых эмбрионов) следует использовать.
На фиг. 31 Л-0 приведена серия из семи фотографий, демонстрирующих результаты двумерного слежения на различных клеточных стадиях. Прогрессивное развитие клеток указано с помощью номеров кадров, относящихся к каждой паре изображений: кадр 15 (фиг. 31 А), 45 (В), 48 (С), 189 (И), 190 (Е), 196 (Р) и 234 (0). В нижнем ряду показаны полученные наложением модельные изображения. Контуры представляют видимые клеточные мембраны, а пунктирные белые линии - скрытые от взгляда мембраны. Захват кадров изображения производят каждые 5 мин, и приведены только некоторые из них.
На фиг. 32 А и В приведена серия фотографий и графических изображений, демонстрирующих два успешных случая трехмерного слежения за клетками. Иллюстрации под каждой фотографией эмбриона демонстрируют вид сверху вниз на трехмерную модель, за исключением кадра 314 и кадра 228, на которых показан вид сбоку на модели, представленные на кадре 314 и кадре 228 соответственно. Захват кадров изображения производили каждые 5 мин.
На фиг. 33 в виде диаграммы представлены результаты, полученные с помощью фильтра частиц, для делений на 1-клеточной и 2-клеточной стадиях. Точки данных представляют пространственное расположение центров клеток. Показаны точки для 1-клеточных моделей, 2-клеточных моделей, 3клеточных моделей и 4-клеточных моделей. В верхнем ряду показаны частицы после предсказания, а в нижнем ряду показаны частицы после повторного отбора проб.
На фиг. 34(а) и (Ь) показаны графики, демонстрирующие сравнение автоматизированного и ручного анализа изображений для группы из 14 эмбрионов. На фиг. 34(а) показано сравнение для длительности первого цитокинеза, а на фиг. 34(Ь) показано сравнение для времени между 1-м и 2-м митозом.
На фиг. 35 показана схема, демонстрирующая, как анализ изображений применяется для создания моделей эмбрионов и измерения некоторых морфологических параметров.
Детальное описание изобретения
Перед тем как приступить к описанию настоящих способов и композиций, следует отметить, что при этом понимается, что данное изобретение не ограничивается конкретным описанным способом или композицией, так как они, безусловно, могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в этом документе, предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и не подразумевается, что она является ограничивающей, так как объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
В случае, когда приведен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение с точностью до десятой доли единицы измерения нижнего предела, если иное не диктуется явно контекстом, между верхним и нижним пределами этого диапазона также явно относится к изобретению. Каждый более мелкий диапазон между любыми указанными значениями или промежуточное значение в указанном диапазоне, и любое другое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне, включены в объем изобретения. Верхний и нижний пределы этих более мелких диапазонов могут быть независимо включены или исключены из диапазона, и каждый диапазон, в котором либо ни один, либо оба предела включены в более мелкие диапазоны, также включен в объем изобретения, за исключением любого специально исключенного предела в указанном диапазоне. В случае если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, в которых исключены один или оба эти включенные пределы, также включены в объем изобретения.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, использованные в этом документе, имеют те значения, которые есть общепринятыми в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения возможно применение любых способов и материалов, схожих или эквивалентных описываемым в этом документе, некоторые возможные и предпочтительные способы и материалы будут описаны здесь. Все публикации, указанные в этом документе, включены сюда в качестве ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми эти публикации процитированы. При этом понимается, что настоящее раскрытие замещает собой любое раскрытие во включенной публикации, если имеются противоречия.
Следует отметить, что при использовании в этом документе и в прилагаемой формуле изобретения формы слов в единственном числе включают ссылку на слова во множественном числе, если иное не диктуется явно контекстом. Таким образом, например, при употреблении слова клетка подразумевает, что сюда включено множество таких клеток, и употребление слова пептид подразумевает, что сюда включены один или несколько пептидов и их эквивалентов, например полипептидов, известных специа- 5 025172 листам в данной области, и так далее.
Публикации, обсуждаемые в этом документе, приведены исключительно из-за их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто из изложенного в этом документе не следует толковать как допущение, что настоящее изобретение не имеет права датировать задним числом такую публикацию на основании предшествующего изобретения. Кроме того, указанные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут требовать независимого подтверждения.
Определения.
Предложены способы, композиции и наборы для определения способности к развитию одного или нескольких эмбрионов или плюрипотентных клеток и/или наличия хромосомных нарушений в одном или нескольких эмбрионах или плюрипотентных клетках. Данные способы, композиции и наборы находят применение при идентификации ίη νίΐτο эмбрионов и яйцеклеток, которые наиболее полезны для применения при лечении бесплодия у людей. Эти и другие цели, преимущества и особенности изобретения будут очевидны специалистам в данной области при чтении подробного описания рассматриваемых способов и композиций, которые более подробно описаны ниже.
Термин способность к развитию применяется в этом документе для обозначения способности или возможности здорового эмбриона или плюрипотентной клетки расти или развиваться.
Термин эмбрион применяется в этом документе для обозначения как зиготы, образовавшейся, когда две гаплоидные клетки гамет, например неоплодотворенная яйцеклетка II порядка и клетка спермы, сливаются с образованием диплоидной тотипотентной клетки, например оплодотворенной яйцеклетки, так и эмбриона, образующегося в результате следующих сразу последовательных клеточных делений, т.е. эмбрионального дробления, вплоть до этапа морулы, т.е. 16-клеточной стадии, и стадии бластоцисты (с дифференцированными трофэктодермой и внутренней клеточной массой).
Термин плюрипотентная клетка применяется в этом документе для обозначения любой клетки, обладающей способностью дифференцироваться во множество типов клеток в организме. Примеры плюрипотентных клеток включают стволовые клетки, яйцеклетки и 1-клеточные эмбрионы (т.е. зиготы).
Термин стволовая клетка применяется в этом документе для обозначения клетки или популяции клеток, которые (а) способны к самовоспроизведению и (Ь) обладают способностью давать начало различным типам дифференцированных клеток. Часто стволовая клетка обладает способностью давать начало многим линиям клеток. При использовании в этом документе стволовая клетка может являться тотипотентной стволовой клеткой, например оплодотворенной яйцеклеткой, которая дает начало всем эмбриональным и экстраэмбриональным тканям организма; плюрипотентной стволовой клеткой, например эмбриональной стволовой клеткой (Е§), эмбриональной половой клеткой (ЕС) или индуцированной плюрипотентной стволовой клеткой (ίΡδ), которая дает начало всем эмбриональным тканям организма, т.е. эндодермальной, мезодермальной и эктодермальной линиям; мультипотентной стволовой клеткой, например мезенхимной стволовой клеткой, которая дает начало по меньшей мере двум эмбриональным тканям организма, т.е. по меньшей мере двум линиям из эндодермальной, мезодермальной и эктодермальной, или она может являться тканехарактерной стволовой клеткой, которая дает начало множеству типов дифференцированных клеток в составе конкретной ткани. Тканехарактерные стволовые клетки включают тканехарактерные эмбриональные клетки, которые дают начало клеткам конкретной ткани, и соматические стволовые клетки, которые располагаются во взрослых тканях и могут давать начало клеткам конкретной ткани, например нейрональные стволовые клетки, которые дают начало всем клеткам центральной нервной системы, сателлитные клетки, которые дают начало скелетной мускулатуре, и гематопоэтические стволовые клетки, которые дают начало всем клеткам гематопоэтической системы.
Термин яйцеклетка применяется в этом документе для обозначения неоплодотворенной женской половой клетки, или гаметы. Яйцеклетки в рассматриваемой заявке могут являться яйцеклетками I порядка, и в этом случае они позиционируются как вступающие или проходящие стадию мейоза I, или яйцеклетками II порядка и в этом случае они позиционируются как вступающие или проходящие стадию мейоза II.
Под мейозом понимаются явления клеточного цикла, в результате которых образуются гаметы. В ходе первого мейотического клеточного цикла, или мейоза I, хромосомы клеток удваиваются и разделяются между двумя дочерними клетками. После этого данные дочерние клетки делятся в ходе второго мейотического клеточного цикла, или мейоза II, который не сопровождается синтезом ДНК, в результате чего образуются гаметы с гаплоидным числом хромосом.
Под стадией зародышевого пузырька понимается стадия созревания яйцеклетки I порядка, которая коррелирует с профазой I мейоза I клеточного цикла, т.е. перед первым делением ядерного материала. Яйцеклетки на этой стадии также называют яйцеклетками с зародышевым пузырьком, из-за наличия характерного крупного ядра, именуемого зародышевым пузырьком. В нормальной яйцеклетке человека, культивируемой ίη νίΐτο, зародышевый пузырек появляется примерно через 6-24 ч после начала созревания.
Под стадией метафазы I понимается стадия созревания яйцеклетки I порядка, которая коррелирует с метафазой I клеточного цикла мейоза I. По сравнению с яйцеклетками с зародышевым пузырьком, яйцеклетки метафазы I не содержат крупное, явно выраженное ядро. В нормальной яйцеклетке человека,
- 6 025172 культивируемой ίη νίίτο, метафаза I наступает примерно через 12-36 ч после начала созревания.
Под стадией метафазы II понимается стадия созревания яйцеклетки II порядка, которая коррелирует с метафазой II клеточного цикла мейоза II. Отличительным признаком метафазы II является экструзия первого полярного тельца. В нормальной яйцеклетке человека, культивируемой ίη νίίτο, метафаза II наступает примерно через 24-48 ч после начала созревания.
Под митотическим клеточным циклом понимаются явления в клетке, которые приводят к удвоению хромосом клетки и делению этих хромосом и содержимого цитоплазмы на две дочерние клетки. Митотический клеточный цикл подразделяют на две фазы: интерфаза и митоз. Во время интерфазы клетка растет и реплицирует свою ДНК. Во время митоза клетка начинает и завершает клеточное деление, сначала разделяя свой ядерный материал, а после этого деля содержимое своей цитоплазмы и свой разделенный ядерный материал (в ходе цитокинеза) на две отдельные клетки.
Под первым митотическим клеточным циклом или клеточным циклом 1 понимается временной интервал от оплодотворения до завершения явления первого цитокинеза, т.е. деление оплодотворенной яйцеклетки на две дочерние клетки. В тех случаях, когда яйцеклетки оплодотворяют ίη νίίτο, в качестве замены этого временного интервала можно применять временной интервал между инъекцией хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (обычно вводимого перед извлечением яйцеклетки) до завершения явления первого цитокинеза.
Под вторым митотическим клеточным циклом или клеточным циклом 2 подразумевается явление второго клеточного цикла, наблюдаемое у эмбриона, временной интервал между образованием дочерних клеток из оплодотворенной яйцеклетки в результате митоза и образованием первого комплекта третичных клеток из одной из этих дочерних клеток (лидирующей дочерней клетки, или дочерней клетки А) в результате митоза. По завершении клеточного цикла 2 эмбрион состоит из 3 клеток. Иначе говоря, клеточный цикл 2 можно визуально определить как время между эмбрионом, содержащим 2 клетки и эмбрионом, содержащим 3 клетки.
Под третьим митотическим клеточным циклом или клеточным циклом 3 подразумевается явление третьего клеточного цикла, наблюдаемое у эмбриона, в типичном случае временной интервал от образования дочерних клеток из оплодотворенной яйцеклетки в результате митоза и образованием второго комплекта третичных клеток из второй дочерней клетки (запаздывающей дочерней клетки, или дочерней клетки В) в результате митоза. По завершении клеточного цикла 3 эмбрион состоит из 4 клеток. Иначе говоря, клеточный цикл 3 можно визуально определить как время между эмбрионом, содержащим 3 клетки и эмбрионом, содержащим 4 клетки.
Под явлением первого дробления подразумевается первое деление, т.е. деление яйцеклетки на две дочерние клетки, т.е. клеточный цикл 1. По завершении явления первого дробления эмбрион состоит из 2 клеток.
Под явлением второго дробления подразумевается второй комплект делений, т.е. деление лидирующей дочерней клетки на две третичные клетки и деление запаздывающей дочерней клетки на две третичные клетки. Иначе говоря, явление второго дробления состоит из клеточного цикла 2 и клеточного цикла 3. По завершении второго дробления эмбрион состоит из 4 клеток.
Под явлением третьего дробления подразумевается третий комплект делений, т.е. деления всех третичных клеток. По завершении явления третьего дробления эмбрион состоит из 8 клеток.
Под цитокинезом или делением клетки подразумевается фаза митоза, в которой клетка претерпевает деление. Иначе говоря, это стадия митоза, на которой разделенный ядерный материал и содержимое цитоплазмы клетки делятся с образованием двух дочерних клеток. Период цитокинеза можно определить как период, или промежуток, времени между первым наблюдением перетяжки клеточной мембраны (борозды дробления) и завершением явления образования перетяжки, т.е. образованием двух дочерних клеток. Начало образования борозды дробления можно визуально определить как точку, в которой линия изгиба клеточной мембраны изменяет форму с выпуклой (закругленной наружу) на вогнутую (изогнутую внутрь с формированием вмятины или вдавливания). Это проиллюстрировано на верхней панели фиг. 4 с помощью белых стрелок, указывающих на 2 борозды дробления. Начало удлинения клетки также может применяться как метка начала цитокинеза, и в этом случае период цитокинеза определяют как период времени между началом удлинения клетки и завершением деления клетки.
Под первым цитокинезом или цитокинезом 1 подразумевается явление первого деления клетки после оплодотворения, т.е. деление оплодотворенной яйцеклетки с образованием двух дочерних клеток. Первый цитокинез обычно происходит примерно через один день после оплодотворения.
Под вторым цитокинезом или цитокинезом 2 подразумевается явления второго деления клетки, наблюдаемое у эмбриона, т.е. деление дочерней клетки оплодотворенной яйцеклетки (лидирующей дочерней клетки или дочерней клетки А) на первый комплект из двух третичных клеток.
Под третьим цитокинезом или цитокинезом 3 подразумевается явления третьего деления клетки, наблюдаемое у эмбриона, т.е. деление второй дочерней клетки оплодотворенной яйцеклетки (запаздывающей дочерней клетки или дочерней клетки В) на второй комплект из двух третичных клеток.
Термины масштабная метка или координатная метка обозначают объект, помещаемый в поле зрения системы формирования изображений, который появляется на полученном изображении с целью
- 7 025172 использования в качестве точки привязки или измерения. Это может быть либо что-то помещенное внутрь или на объект для визуализации, либо метка или набор меток на окулярной шкале оптического прибора.
Термин микролунка относится к контейнеру, имеющему размеры, сопоставимые по масштабам с клеточными, предпочтительно для обеспечения размещения одиночной эукариотической клетки.
Представляющие интерес плюрипотентные клетки и эмбрионы.
В способах по изобретению один или несколько эмбрионов или плюрипотентных клеток оценивают по их способности к развитию путем измерения одного или нескольких клеточных параметров у эмбриона(ов) или плюрипотентной(ых) клетки(ок) и применения этих значений измерения для определения способности к развитию эмбриона(ов) или плюрипотентной(ых) клетки(ок). Информацию, полученную таким образом, можно применять для принятия решений в клинической практике, например переносить или нет полученный оплодотворением ίη νίΐτο эмбрион, трансплантировать или нет культивируемую клетку или клетки.
Примеры эмбрионов, оценку которых можно осуществлять с применением способов по изобретению, включают 1-клеточные эмбрионы (также называемые зиготами), 2-клеточные эмбрионы, 3клеточные эмбрионы, 4-клеточные эмбрионы, 5-клеточные эмбрионы, 6-клеточные эмбрионы, 8клеточные эмбрионы и т.д., в типичном случае - вплоть до и включая 16-клеточные эмбрионы, любой из которых может быть получен любым стандартным способом, например из яйцеклетки, созревшей в организме, или из яйцеклетки, созревшей ίη νίΐτο.
Примеры плюрипотентных клеток, оценку которых можно осуществлять с применением способов по изобретению, включают тотипотентные стволовые клетки, например яйцеклетки, такие как яйцеклетки I порядка и яйцеклетки II порядка; плюрипотентные стволовые клетки, например клетки Εδ, клетки ЕС, клетки ίΡδ и т.п.; мультипотентные клетки, например мезенхимные стволовые клетки; и тканеспецифичные стволовые клетки. Они могут быть получены на любой стадии жизни, например эмбриональной, неонатальной, ювенальной или от взрослого организма, и принадлежать любому из полов, т.е. XX или ΧΥ.
Эмбрионы и плюрипотентные клетки могут происходить от любого организма, например от любого вида млекопитающих, например человека, примата, лошади, коровы, свиньи, собаки, кошки и т.д. Предпочтительно, чтобы они были получены от человека. Они могут быть ранее заморожены, например эмбрионы, подвергнутые криоконсервации на 1-клеточной стадии и затем размороженные, или замороженные и размороженные яйцеклетки и стволовые клетки. В качестве альтернативного варианта они могут быть свежеприготовленными, например эмбрионы, свежеприготовленные из яйцеклеток с применением методики экстракорпорального оплодотворения; яйцеклетки, являющиеся свежеизвлеченными и/или созревшими без предварительной заморозки с применением методик манипуляций ίη νίΐτο, или полученные из плюрипотентных стволовых клеток, дифференциировавшихся ίη νίΐτο в половые клетки и созревших в яйцеклетки; стволовые клетки, свежеприготовленные путем дезагрегации и культивирования тканей способами, известными специалистам в данной области; и т.п. Они могут культивироваться в любых стандартных условиях, известных специалистам в данной области, для обеспечения выживания, роста и/или развития образца, подвергаемого оценке, например, в случае эмбрионов, в таких условиях, как условия, применяемые в области экстракорпорального оплодотворения; смотрите, например, патент США № 6610543, патент США № 6130086, патент США № 5837543, открытия, которые включены сюда в качестве ссылок; в случае яйцеклеток, в таких условиях, как условия, применяемые в данной области для обеспечения созревания яйцеклеток; смотрите, например, патент США № 5882928 и патент США № 6281013, открытия, которые включены сюда в качестве ссылок; в случае стволовых клеток, в таких условиях, как условия, применяемые в данной области для обеспечения пролиферации; смотрите, например, США № 6777233, патент США № 7037892, патент США № 7029913, патент США № 5843780 и патент США № 6200806, заявку на патент США № 2009/0047263; заявку на патент США № 2009/0068742, открытия, которые включены сюда в качестве ссылок. Часто эмбрионы/плюрипотентные клетки культивируют в имеющейся в продаже среде, такой как ΚηοοΚοιιΙ ΌΜΕΜ, ΌΜΕΜ-Ρ12 или среда Дульбекко в модификации Искова, с добавлением сыворотки или заменителя сыворотки, аминокислот и факторов роста, адаптированных к потребностям конкретного эмбриона/плюрипотентной клетки, предназначенных для оценки.
Анализ с применением цейтраферной съемки.
В некоторых вариантах воплощения эмбрионы/плюрипотентные клетки оценивают путем измерения клеточных параметров с применением цейтраферной съемки. Эмбрионы/плюрипотентные клетки можно культивировать в стандартных культуральных чашках. В качестве альтернативы эмбрионы/плюрипотентные клетки можно культивировать в изготовленных на заказ культуральных чашках, например изготовленных на заказ чашках с микролунками оптического качества, как описано ниже. В таких изготовленных на заказ чашках в каждой микролунке помещается одиночный эмбрион/плюрипотентная клетка, и поверхность дна каждой микролунки имеет полировку оптического качества, таким образом, может быть получено изображение целой группы эмбрионов в пределах одной чашки одновременно с помощью одного миниатюрного микроскопа с разрешением, достаточным для наблюде- 8 025172 ния за процессами клеточного митоза. Целая группа микролунок делит между собой одну и ту же каплю среды в культуральной чашке, и также может включать наружную стенку, расположенную вокруг микролунок, для стабилизации капли среды, а также масштабные метки, расположенные рядом с микролунками. Гидрофобность поверхности можно контролировать с применением плазменного травления или другой обработки для предотвращения образования пузырьков в микролунках при наполнении средой. Независимо от того, применяются стандартные культуральные чашки или изготовленные на заказ культуральные чашки во время культивирования, один или несколько развивающихся эмбрионов можно культивировать в одной и той же культуральной среде, например можно культивировать от 1 до 30 эмбрионов на чашку.
Изображения получают в течение определенного периода времени и потом анализируют для получения показателей для одного или нескольких клеточных параметров. Цейтраферную съемку можно производить с применением любого управляемого компьютером микроскопа, который оборудован для хранения и анализа цифровых изображений, например инвертированных микроскопов, оборудованных нагревательными платформами и камерами для инкубирования, или изготовленных на заказ составными комплектами миниатюрных микроскопов, которые помещают в стандартный инкубатор. Комплект миниатюрных микроскопов позволяет проводить одновременное культивирование множества чашек с образцами в одном и том же инкубаторе, а также позволяет проводить масштабирование для обеспечения наличия множества каналов без ограничения минимального временного интервала между последовательными захватами изображения. Применение множества микроскопов освобождает от необходимости перемещать образец, что повышает точность системы и общую надежность системы. Отдельные микроскопы в инкубаторе могут быть частично или полностью изолированными, обеспечивая каждой культуральной чашке свою собственную контролируемую окружающую среду. Это позволяет перемещать чашки в установку для получения изображений и из нее, не нарушая окружающую среду других образцов.
В системе формирования изображений для цейтраферной съемки могут применяться светлопольное освещение, темнопольное освещение, фазовый контраст, модуляционный контраст Хоффмана, дифференциально интерференционный контраст или флуоресценция. В некоторых вариантах воплощения темнопольное освещение может применяться для получения усиленного контраста изображения с целью последующего выделения признаков и анализа изображения. Кроме того, источники красного и ближнего инфракрасного света могут применяться для снижения фототоксичности и улучшения контрастности между клеточными мембранами и внутриклеточной частью.
Полученные изображения можно сохранять непрерывно, как при живом видео, или периодически, как при цейтраферной фотографии, когда получают повторяющиеся изображения объекта в виде стопкадра. Предпочтительно временной интервал между изображениями должен составлять от 1 до 30 мин для того, чтобы запечатлеть значимые морфологические явления, как описано ниже. В соответствии с другим вариантом воплощения, временной интервал между изображениями может меняться в зависимости от интенсивности клеточной активности. Например, во время активных периодов изображения могут получать каждые несколько секунд или каждую минуту, в то время как во время неактивных периодов изображения могут получать каждые 10 или 15 мин или через более длинные промежутки. Анализ изображений в реальном времени в отношении захваченных изображений можно применять для определения того, когда и каким образом изменять временные интервалы. В предложенных нами способах подсчитано, что суммарное количество света, полученного образцами за 5 дней визуализации, эквивалентно примерно 2 4 мин непрерывной экспозиции при низкой освещенности. Интенсивность света в системе для цейтраферной съемки существенно ниже, чем интенсивность света, применяемого в типичном случае в микроскопе, используемом в области вспомогательной репродукции, благодаря низкой мощности светодиодов (ЬЕЭЦ (например, применение 1 Вт ΕΕΌ, по сравнению с типичной 100 Вт галогеновой лампой) и высокой чувствительности сенсора камеры. Таким образом, суммарное количество световой энергии, получаемой эмбрионом при применении системы для цейтраферной съемки, сопоставимо или ниже, чем количество энергии, получаемой во время стандартных процедур в клинике для проведения ЭКО. Кроме того, время экспозиции можно существенно уменьшить с целью снижения суммарного количества световой экспозиции эмбриона/плюрипотентной клетки. В случае 2-дневного анализа, с захватом изображений каждые 5 мин при 0,5 с световой экспозиции на каждое изображение, суммарное количество экспозиции при низкой освещенности составляет менее 5 мин.
После получения изображений последние подвергают выделению и анализу в отношении различных клеточных параметров, например размера клеток, толщины блестящей оболочки (ζοηα рсПисЮа), степени фрагментации, симметрии дочерних клеток, образующихся в результате клеточного деления, временных интервалов между несколькими первыми митозами и длительности цитокинеза.
Клеточные параметры, которые можно измерить с применением цейтраферной съемки, обычно представляют собой морфологические явления. Например, при оценке эмбрионов цейтраферную съемку можно применять для измерения длительности явления цитокинеза, например цитокинеза 1, цитокинеза 2, цитокинеза 3 или цитокинеза 4, при этом длительность явления цитокинеза определяют как временной интервал между первым наблюдением появления борозды дробления (началом цитокинеза) и разделением борозды дробления на две дочерние клетки (т.е. образованием двух дочерних клеток). Другим пред- 9 025172 ставляющим интерес параметром есть длительность клеточного цикла, например клеточного цикла 1, клеточного цикла 2, клеточного цикла 3 или клеточного цикла 4, при этом длительность клеточного цикла определяют как временной интервал между образованием клетки (в случае клеточного цикла 1 - при оплодотворении яйцеклетки; в случае последующих клеточных циклов - при завершения цитокинеза) и образованием двух дочерних клеток из этой клетки. Другие представляющие интерес клеточные параметры, которые можно измерить с применением цейтраферной съемки, включают временные интервалы, которые определяют в отношении следующих клеточных явлений: например, (а) временной интервал между цитокинезом 1 и цитокинезом 2, определяемый как любой из интервалов между началом цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2, интервал между завершением цитокинеза 1 и завершением цитокинеза 2, интервал между началом цитокинеза 1 и завершением цитокинеза 2; или интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2; или (Ь) временной интервал между цитокинезом 2 и цитокинезом 3, определяемый как любой из интервалов между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, или интервал между завершением цитокинеза 2 и завершением цитокинеза 3, или интервал между началом цитокинеза 2 и завершением цитокинеза 3, или интервал между завершением цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3.
Считается, что для целей экстракорпорального оплодотворения полезен перенос эмбриона в матку на ранней стадии развития, например на 2 день или 3 день, т.е. вплоть до 8-клеточной стадии, для снижения вероятности потери эмбриона из-за неблагоприятного воздействия условий культивирования, относящихся к окружающей среде ίη νίίτο, а также для снижения потенциальных нежелательных исходов, связанных с эпигенетическими ошибками, которые могут возникнуть во время культивирования (Ка1ап е! а1. (2009) Нит Μοί Оепе!. 18 (20):3769-78; Зерикеба е! а1. (2009) РетШ δίβτίΐ. 91(5):1765-70). Исходя из этого, предпочтительно, чтобы измерение клеточных параметров производились в течение 2 дней после оплодотворения, хотя более длинные периоды проведения анализа, например примерно 36 ч, примерно 54 ч, примерно 60 ч, примерно 72 ч, примерно 84 ч, примерно 96 ч или более, также рассматриваются в условиях применения существующих способов.
Примеры клеточных параметров созревающей яйцеклетки, которые можно оценить с применением цейтраферной съемки, включают, в частности, изменения морфологии мембраны яйцеклетки, например скорость и степень отделения от блестящей оболочки; изменения морфологии ядра яйцеклетки, например, начало, завершение и скорость разрушения зародышевого пузырька (ΟΥΒΌ); скорость и направление движения гранул в цитоплазме и ядре; цитокинез яйцеклетки и первого полярного тельца и движение и/или длительность экструзии первого полярного тельца, другие параметры включают длительность цитокинеза зрелой яйцеклетки II порядка и второго полярного тельца.
Примеры клеточных параметров стволовой клетки или популяции стволовых клеток, которые можно оценить с применением цейтраферной съемки, включают, в частности, длительность явлений цитокинеза, время между явлениями цитокинеза, размер и форму стволовых клеток перед и во время явлений цитокинеза, количество дочерних клеток, образующихся в результате явления цитокинеза, пространственное расположение борозды дробления, скорость и/или количество наблюдаемых асимметричных делений (т.е. делений, при которых одна дочерняя клетка остается стволовой клеткой, а другая дифференцируется), скорость и/или количество наблюдаемых симметричных делений (т.е. делений, при которых обе дочерние клетки либо остаются стволовыми клетками, либо дифференцируются) и временной интервал между завершением явления цитокинеза и моментом, когда стволовая клетка начинает дифференцироваться.
Параметры можно измерять вручную или их можно измерять автоматически, например, с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Если применяют программное обеспечение для анализа изображений, могут применять алгоритмы анализа изображений, в которых используется методика оценки вероятностных моделей, основанная на поэтапном применении метода Монте-Карло, например, путем генерирования распределений, предложенных гипотезой моделей эмбрионов/плюрипотентных клеток, моделирования изображений на основании простой оптической модели и сравнения этих смоделированных изображений с данными наблюдаемых изображений. При применении таких оценок вероятностных моделей клетки можно моделировать как имеющие любую подходящую форму, например как совокупности эллипсов в двумерном пространстве, совокупности эллипсоидов в трехмерном пространстве и т.п. Для учета окклюзии и неоднозначностей определения глубины способ может обеспечивать соблюдение пространственных ограничений, которые соответствуют ожидаемым физическим характеристикам. Для улучшения устойчивости изображения можно делать захват в одной или нескольких фокальных плоскостях. Анализ экспрессии генов В некоторых вариантах воплощения эмбрионы или плюрипотентные клетки оценивают путем измерения экспрессии генов. В таких воплощениях клеточным параметром является уровень экспрессии гена или профиль экспрессии генов. Определение экспрессии одного или нескольких генов, т.е. получение экспрессионного профиля или оценку экспрессии, можно осуществлять путем измерения представленных нуклеиновыми кислотами транскриптов, например мРНК, одного или нескольких целевых генов, например профиля экспрессии на уровне нуклеиновых кислот; или путем измерения уровней одного или нескольких различных белков/полипептидов, являющихся продуктами экспрессии одного или нескольких целевых генов, например
- 10 025172 протеомного профиля экспрессии. Иначе говоря, термины экспрессионный профиль и оценка экспрессии широко используются как включающие профиль экспрессии генов на уровне РНК или на уровне белка.
В некоторых вариантах воплощения экспрессию генов можно оценивать путем получения экспрессионного профиля на уровне нуклеиновых кислот, при этом определяют количество или уровень одной или нескольких нуклеиновых кислот в пробе, например, представленного нуклеиновой кислотой транскрипта одного или нескольких целевых генов. В этих вариантах воплощения проба, которую количественно оценивают для получения экспрессионного профиля, является пробой нуклеиновой кислоты. Проба нуклеиновой кислоты включает множество или популяцию отдельных нуклеиновых кислот, которая содержит информацию об экспрессии целевых генов в оцениваемом эмбрионе или клетке. Нуклеиновая кислота может включать нуклеиновые кислоты, относящиеся к РНК или ДНК, например мРНК, кРНК, кДНК и т.д., при условии, что проба сохраняет информацию об экспрессии в клетке-хозяине или в ткани, из которой она получена. Пробу можно приготовить с применением ряда различных способов, известных специалистам в данной области, например, путем выделения мРНК из клетки, при этом выделенную мРНК используют как есть, амплифицируют, используют для получения кДНК, кРНК и т.д., как это известно специалистам в области анализа дифференциальной экспрессии. Пробу можно приготовить из единичной клетки, например плюрипотентной клетки из культуры целевых плюрипотентных клеток или из единичной клетки (бластомера) из целевого эмбриона; или из нескольких клеток, например из части культуры плюрипотентных клеток, или 2, 3 или 4 или более бластомеров из целевого эмбриона, применяя стандартные протоколы.
Экспрессионный профиль может быть получен из исходной пробы нуклеиновой кислоты с применением любого стандартного протокола. Хотя известно множество различных способов получения экспрессионных профилей, таких как применяемые в области анализа дифференциальной экспрессии генов, одними из типичных и распространенных типов протоколов для получения экспрессионных профилей есть протоколы получения экспрессионных профилей, основанные на применении чипов. Такие типы применения представляют собой гибридизационный анализ, при котором для получения профилей применяют нуклеиновую кислоту, предоставляющую являющиеся нуклеиновыми кислотами зонды для каждого из генов, который будет анализироваться/наноситься на профиль. При анализе такого типа сначала приготавливают пробу целевой нуклеиновой кислоты из исходной анализируемой пробы нуклеиновой кислоты, при этом приготовление может включать маркировку целевых нуклеиновых кислот меткой, например, принадлежащей к системе, продуцирующей сигнал. После приготовления пробы целевой нуклеиновой кислоты эта проба контактирует с чипом в условиях гибридизации, посредством чего образуются комплексы между целевыми нуклеиновыми кислотами и комплементарными последовательностями зондов, присоединенных к поверхности чипа. После этого детектируют наличие гибридизованных комплексов, качественно или количественно.
Специфичная гибридизационная технология, которую можно применять на практике для получения экспрессионных векторов, применяемых в рассматриваемых способах, включает технологию, описанную в патентах США №№: 5143854; 5288644; 5324633; 5432049; 5470710; 5492806; 5503980; 5510270; 5525464; 5547839; 5580732; 5661028; 5800992; содержание каждого из которых включено сюда в качестве ссылок; а также в АО 95/21265; АО 96/31622; АО 97/10365; АО 97/27317; ЕР 373 203; и ЕР 785280. В этих способах чип с зондами, являющимися нуклеиновыми кислотами, который содержит зонд для каждого из определяющих фенотип генов, экспрессию которых оценивают, контактирует с целевыми нуклеиновыми кислотами, как описано выше. Контакт происходит в условиях гибридизации, например, жестких условиях гибридизации, и несвязанная нуклеиновая кислота удаляется. Термин жесткие условия анализа при использовании в этом документе означает условия, совместимые с получением комплементарно связанных пар нуклеиновых кислот, например связанных с поверхностью и находящихся в растворе нуклеиновых кислот, обладающих достаточной степенью комплементарности для обеспечения желаемого уровня специфичности анализа, и которые одновременно в меньшей степени совместимы с образованием комплементарно связанных пар между взаимодействующими членами с недостаточной степенью комплементарности для обеспечения желаемой специфичности. Жесткие условия анализа являются суммой или комбинацией (совокупностью) условий как гибридизации, так и отмывки.
Выявленные в результате паттерны гибридизованных нуклеиновых кислот дают информацию относительно экспрессии каждого из генов, у которого был маркер, при этом информация об экспрессии представлена с точки зрения того, экспрессируется ген или нет и, в типичном случае, на каком уровне при этом данные об экспрессии, т.е. экспрессионный профиль (например, в форме транскриптома), может быть как качественным, так и количественным.
В соответствии с другим вариантом для количественного определения уровня одной или нескольких нуклеиновых кислот в пробе могут применять способы, не основанные на использовании чипов, включая те, которые основаны на протоколах амплификации, например анализ на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая количественную ПЦР, обратную транскрипцию с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР), ПЦР в реальном времени и т.п.
В некоторых вариантах воплощения экспрессию генов можно оценивать путем получения экспрес- 11 025172 сионного профиля на уровне протеома, при этом определяют количество или уровень одного или нескольких белков/полипептидов в пробе, например белка/полипептида, кодируемого целевым геном. В этих вариантах воплощения проба, которую количественно оценивают для получения применяемого в данных способах экспрессионного профиля, есть белковой пробой. В том случае, если экспрессионный профиль есть экспрессионным профилем на уровне протеома, т.е. профилем уровней одного или нескольких белков в пробе, могут применять любой стандартный протокол для оценки уровней белка, при этом определяют уровень одного или нескольких белков в анализируемой пробе.
Хотя специалистам в данной области известно множество различных способов анализа уровней белка, одним из характерных и распространенных типов протоколов для оценки уровней белка является ЕЬТЗА (твердофазный иммуноферментный анализ). При ЕЬ1§А и анализе, основанном на ЕЬ1§А, одно или несколько антител, характерных для целевых белков, могут быть иммобилизованы на выбранной твердой поверхности, предпочтительно поверхности, обладающей аффинностью к белкам -такой как лунки титрационного микропланшета из полистирола. После отмывки для удаления не адсорбировавшегося полностью материала лунки аналитического планшета покрывают неспецифичным блокирующим белком, о котором известно, что он антигенно нейтрален по отношению к испытуемой пробе, таким как бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин или растворы сухого молока. Это позволяет блокировать все места нетипичной адсорбции на иммобилизующей поверхности, тем самым снижая фоновый сигнал, вызванный неспецифичным связыванием антигена на поверхности. После отмывки для удаления не связанного блокирующего белка иммобилизующая поверхность контактирует с испытуемой пробой в условиях, способствующих образованию иммунного комплекса (антиген/антитело). Такие условия включают разбавление пробы разбавителем, таким как БСА или бычий гамма-глобулин (БГГ) в фосфатно-солевом буфере (РВ§)/Твин или РВ§/Тритон-Х 100, что также способствует снижению неспецифичного фонового сигнала, и способствует инкубации пробы в течение 2-4 ч при температуре порядка 25-27°С (хотя можно применять и другие температурные значения). После инкубации проконтактировавшую с антисывороткой поверхность отмывают так, чтобы удалить не связанный в иммунокомплексы материал. Характерная методика отмывки включает отмывку таким раствором, как РВБ/Твин, РВ§/Тритон-Х 100 или боратным буфером. Наличие и количественную характеристику образования иммунокомплексов можно определить путем последующего исследования связанных иммунокомплексов с помощью второго антитела, обладающего типичностью для целевой молекулы, отличной от типичности первого антитела, и детекции связывания второго антитела. В некоторых воплощениях второе антитело будет нести связанный фермент, например уреазу, пероксидазу или щелочную фосфатазу, который будет обеспечивать образование окрашенного осадка при инкубации с соответствующим хромогенным субстратом. Например, можно применять 1§С против белков человека, которые конъюгированные с уреазой или пероксидазой, в течение периода времени и в условиях, способствующих проявке образования иммунокомплексов (например, инкубация в течение 2 ч при комнатной температуре в содержащем РВ§ растворе, таком как РВБ/Твин). После такой инкубации со вторым антителом и отмывки для удаления несвязанного материала проводят количественное определение маркера, например, путем инкубации с хромогенным субстратом, таким как мочевина и бромкрезоловый пурпурный в случае маркировки уреазой, или 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (АВТБ) и Н2О2, в случае маркировки пероксидазой. После этого количественное определение достигается путем измерения степени развившегося окрашивания, например, с применением спектрофотометра для видимой части спектра.
Вышеуказанный формат может быть изменен посредством связывания на первом этапе пробы с аналитическим планшетом. После этого с аналитическим планшетом инкубируют первое антитело, после чего детектируют связывание первого антитела с применением маркированного второго антитела, обладающего специфичностью для первого антитела.
Твердая подложка, на которую иммобилизуют антитело или антитела, может быть изготовлена из большого множества материалов и в самых разнообразных формах, например титрационный микропланшет, микрошарик, щуп, частица смолы и т.д. Подложка может быть выбрана так, чтобы сделать максимальным соотношение сигнал-шум, минимизировать фоновое связывание, а также с учетом простоты разделения и цены. Отмывки можно проводить таким способом, который наиболее пригоден для используемой подложки, например, путем удаления шарика или щупа из резервуара, удаления или разбавления содержимого резервуара, такого как лунка титрационного микропланшета, или промывка шарика, частицы, хроматографической колонки или фильтра промывочным раствором или растворителем.
Как альтернативу, для измерения уровней одного или нескольких белков в пробе можно применять методы, не основанные на ЕЬТЗА. Типичные примеры включают, но не есть ограничивающими для массспектрометрии, протеомных чипов, технологии применения микросфер хМАР™, проточной цитометрии, Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии.
Полученные в результате данные предоставляют информацию относительно экспрессии каждого из маркерованных генов, при этом информация об экспрессии представлена с точки зрения того, экспрессируется ген или нет и, в типичном случае, на каком уровне, при этом данные об экспрессии могут быть как качественными, так и количественными.
При получении экспрессионного профиля в некоторых вариантах воплощения пробу исследуют для
- 12 025172 получения экспрессионного профиля, который содержит данные об экспрессии по меньшей мере для одного гена/белка, иногда для множества генов/белков, при этом под множеством понимают как минимум два различных гена/белка, и часто как минимум около 3, в типичном случае миниум около 10 и наиболее часто минимум около 15 различных генов/белков или более, например 50 или более, или 100 или более и т.д.
В самом широком смысле оценка экспрессии может быть качественной или количественной. По существу, если определение качественное, способы обеспечивают толкование или оценку, например оценку того, присутствует ли целевой аналит, например нуклеиновая кислота или продукт экспрессии, в анализируемой пробе. В других вариантах воплощения способы обеспечивают количественное определение того, присутствует ли целевой аналит в анализируемой пробе, т.е. оценку или определение фактического количества или относительного количества целевого аналита, например нуклеиновой кислоты или белка, в анализируемой пробе. В таких воплощениях количественное определение может быть абсолютным или, если способ есть способом определения в пробе двух или нескольких различных аналитов, например нуклеиновых кислот или белков, относительным. По существу, термин количественное определение, при использовании в контексте количественного определения в пробе целевого аналита, например нуклеиновой(ых) кислоты (кислот) или белка(ов), может означать абсолютное или относительное количественное определение. Абсолютное количественное определение может быть осуществлено путем включения известной(ых) концентрации(ий) одного или нескольких контрольных аналитов и сравнения с контролем, т.е. нормирования определенного уровня целевого аналита с известным контрольным аналитом (например, путем построения стандартной кривой). В соответствии с другим вариантом, относительное количественное определение может быть осуществлено путем сравнения определенных уровней или количеств между двумя или несколькими различными целевыми аналитами для получения относительного количественного значения для каждого из двух или нескольких различных аналитов, например, относительно друг друга.
Примеры генов, уровни экспрессии которых есть прогностическими в отношении способности зиготы к развитию, включают гены кофилина (ΝΜ_005507), ΟΙΑΡΗ1 (ΝΜ_001079812,
ΝΜ_005219) , ЕСТ2 (ΝΜ_018098) , МУЬС2/МУЬ5 (ΝΜ_002477) , ОСЗСК8 (ΝΜ_02272ΰ) , Е1сег/О1СЕЕ1 (ΝΜ_030621, ΝΜ_177438), ΤΑΕΒΡ2 (ΝΜ_004178, ΝΜ_134323, ΝΜ_134324), СРЕВ1 (ΝΜ_001079533,
ΝΜ_001079534 , ΝΜ_001079535, ΝΜ__030594), симплекина/ЗУМРК (ΝΜ
004819), ΥΒΧ2 (ΝΜ_015982), ΣΑΚΙ (ΝΜ_175619) , СТ1ЛТВ1 (ΝΜ_001098209, ΝΜ_001098210, ΝΜ_001098210, ΝΜ 001904), ϋΝΜΤ3Β (ΝΜ_006892, ΝΜ_175848, ΝΜ_175849, ΝΜ_175850), ΤΕΚΤ (ΝΜ_198253,
ΝΜ_198255), ΥΥ1 (ΝΜ_003403), ΙΡΟΕ2/ΙΕΝΟΕ2 (ΝΜ_005534), ΒΤΓ3 (ΝΜ_001037637, ΝΜ_001207) и ΝΕΙ,Γ (ΝΜ_001130969, ΝΜ_001130970,
ΝΜ_001130971, ΝΜ_015537).
Другие гены, уровни экспрессии которых могут служить в качестве клеточного параметра, прогностического в отношении способности эмбриона к развитию, представлены на фиг. 8. При проведении количественного определения уровня экспрессии гена уровень экспрессии часто оценивают и потом нормируют относительно стандартного контроля, например уровня экспрессии в пробе гена, о котором известно, что его уровень экспрессии постоянен в течение периода развития, например ΟΑΡΌΗ или КРЬРО, или гена, для которого известен уровень экспрессии в данной временной точке.
Уровни экспрессии генов можно определить для одной клетки, например бластомера из целевого эмбриона, или выделенной яйцеклетки, или выделенной клетки из культуры стволовых клеток и т.д., или их можно определить для эмбриона, например 2, 3 или 4 или более бластомеров целевого эмбриона, вплоть до и включая весь целевой эмбрион, или для множества клеток из культуры стволовых клеток, вплоть до и включая всю культуру стволовых клеток и т.д.
Другой особенностью настоящего изобретения является то, что оно включает протокол для одновременного проведения генотипирования и анализа экспрессии генов для единичной клетки. В случае эмбрионов, этот протокол можно применять для улучшения преимплантационной генетической диагностики (ПГД), процедуры, при которой из эмбриона извлекают единичную клетку и исследуют ее ДНК на наличие кариотипических дефектов или присутствие генов, характерных для заболеваний. Наш способ позволяет одновременно проводить генетический анализ и анализ экспрессии генов. Способ включает следующие этапы: (1) отбор единичной клетки в небольшом объеме среды или буфера, (2) проведение за один этап обратной транскрипции и амплификации в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением смеси праймеров для генотипирования и для анализа экспрессии генов, (3) отбор аликвот амплифицированной кДНК менее чем через 18 циклов ПЦР для сохранения линейности амплификации, (4) использование аликвот кДНК для проведения анализа экспрессии генов с применением стандартных методик, таких как количественная ПЦР в реальном времени, (5) использование оставшейся пробы для проведения второго раунда ПЦР с целью дополнительной амплификации генетической информации для
- 13 025172 задач генотипирования и (6) проведение генотипирования с применением стандартных методик, таких как гель-электрофорез.
Определение способности к развитию с помощью анализа изображений и/или экспрессии гена.
После получения показателей клеточных параметров эти показатели применяют для определения способности к развитию эмбриона/плюрипотентной клетки. Как обсуждалось выше, термин способность к развитию означает способность или возможность плюрипотентной клетки или ткани расти или развиваться. Например, в случае яйцеклетки или эмбриона способность к развитию может представлять собой способность или возможность этих яйцеклетки или эмбриона расти или развиться в здоровую бластоцисту. В качестве еще одного примера, в случае стволовой клетки способность к развитию является способностью или возможностью расти или развиться в одну или несколько представляющих интерес клеток, например в нейрон, мышечную клетку, В- или Т-клетку и т.п. В некоторых вариантах воплощения способность к развитию яйцеклетки или эмбриона является способностью или возможностью этих яйцеклетки или эмбриона развиться в здоровую бластоцисту; успешно имплантироваться в матку; пройти беременность; и/или в результате привести к живорождению. В некоторых вариантах воплощения способность к развитию плюрипотентной клетки является способностью или возможностью этой плюрипотентной клетки развиться в одну или несколько представляющих интерес клеток, например в нейрон, мышечную клетку, В- или Т-клетку и т.п.; и/или войти в состав представляющей интерес ткани ίη νίνο.
Под хорошей способностью к развитию понимают, что существует статистически значимая вероятность, что эмбрион/плюрипотентная клетка разовьется необходимым образом, т.е. существует 55, 60, 70, 80, 90, 95% или более высокая вероятность, например 100% вероятность, развития необходимым образом. Иными словами, 55 из 100, 60 из 100, 70 из 100, 80 из 100, 90 из 100, 95 из 100 или 100 из 100 эмбрионов или плюрипотентных клеток, демонстрирующих показатели клеточных параметров, ранее приведшие к определению хорошей способности к развитию, на самом деле продолжают развиваться необходимым образом. И наоборот, под плохой способностью к развитию понимают, что не существует статистически значимой вероятности, что эмбрион/плюрипотентная клетка разовьется необходимым образом, т.е. существует 50, 40, 30, 20, 10, 5% или менее вероятность, например 0% вероятность, развития необходимым образом. Иными словами, только 50 из 100, 40 из 100, 30 из 100, 20 из 100, 10 из 100, 5 из 100 или менее эмбрионов или плюрипотентных клеток, демонстрирующих показатели клеточных параметров, ранее приведшие к определению плохой способности к развитию, на самом деле продолжают развиваться необходимым образом. При использовании в этом документе нормальные или здоровые эмбрионы и плюрипотентные клетки демонстрируют хорошую способность к развитию, тогда как эмбрионы и плюрипотентные клетки с отклонениями от нормы демонстрируют плохую способность к развитию.
В некоторых вариантах воплощения показатель клеточного параметра применяют непосредственно для определения способности к развитию эмбриона/плюрипотентной клетки. Иначе говоря, абсолютное значение показателя само по себе является достаточным для определения способности к развитию. Примеры этого в воплощениях с применением цейтраферной съемки для измерения клеточных параметров включают, в частности, следующие примеры, каждый из которых отдельно или в сочетании служат признаком хорошей способности к развитию у эмбриона человека: (а) цитокинез 1, длящийся примерно 0-30 мин, например примерно 6-20 мин, в среднем примерно 12-14 мин; (Ь) клеточный цикл 1, длящийся примерно 20-27 ч, например около 25-27 ч; (с) временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2, составляющий примерно 8-15 ч, например около 9-13 ч, со средним значением примерно 11+/-2,1 ч; (ά) временной интервал, т.е. синхронность, между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, составляющий примерно 0-5 ч, например около 0-3 ч, со средним временем примерно 1+/-1,6 ч. Примеры прямых показателей, каждый из которых отдельно или в сочетании служат признаком плохой способности к развитию у эмбриона человека, включают, в частности: (а) цитокинез 1, длящийся более чем примерно 30 мин, например около 32, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 мин или более; (Ь) клеточный цикл 1, длящийся более чем примерно 27 ч, например 28, 29 или 30 или более часов; (с) временной интервал между завершением цитокинеза 1 и началом цитокинеза 2, длящийся более чем 15 ч, например около 16, 17, 18, 19 или 20 или более часов, или менее чем 8 ч, например около 7, 5, 4 или 3 или менее часов; (ά) временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, составляющий 6, 7, 8, 9 или 10 или более часов.
В некоторых вариантах воплощения показатель клеточного параметра применяют путем сравнения его с показателем клеточного параметра для референсного, или контрольного, эмбриона/плюрипотентной клетки, и применения результатов этого сравнения с целью определения способности эмбриона/плюрипотентной клетки к развитию. Термины референсный объект или контроль при использовании в этом документе означают стандартизированный эмбрион или клетку, которые применяют для интерпретации показателей клеточных параметров данного эмбриона/плюрипотентной клетки и установления определения их способности к развитию. Референсный объект или контроль могут являться эмбрионом/плюрипотентной клеткой, о которых известно, что они обладают требуемым фенотипом, например хорошей способностью к развитию, и вследствие этого могут служить положительным
- 14 025172 референсным или контрольным эмбрионом/плюрипотентной клеткой. В соответствии с другим вариантом, референсным/контрольным эмбрионом/плюрипотентной клеткой может быть эмбрион/плюрипотентная клетка, о которых известно, что они не обладают требуемым фенотипом, и вследствие этого являются отрицательным референсным/контрольным эмбрионом/плюрипотентной клеткой.
В некоторых воплощениях полученный(е) показатель(и) клеточного параметра сравнивают с сопоставимым показателем(ями) клеточного параметра для единичного референсного/контрольного эмбриона/плюрипотентной клетки с целью получения информации относительно фенотипа анализируемого эмбриона/плюрипотентной клетки. В других воплощениях полученный(е) показатель(и) клеточного параметра сравнивают с сопоставимым показателем(ями) клеточного параметра для двух или более референсных/контрольных эмбрионов или плюрипотентных клеток с целью получения более подробной информации относительно фенотипа анализируемого эмбриона/клетки. Например, полученные показатели клеточного параметра для эмбриона(ов) или плюрипотентной(ых) клетки (клеток) можно сравнить как с положительным, так и с отрицательным контрольным эмбрионом или плюрипотентной клеткой с целью получения достоверной информации о том, имеет ли эмбрион/клетка целевой фенотип.
В качестве примера цитокинез 1 у нормального эмбриона человека, т.е. с хорошей способностью к развитию, занимает примерно 0-30 мин, чаще около 6-20 мин, в среднем примерно 12-14 мин, т.е. около 1, 2, 3, 4 или 5 мин, чаще около 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мин, в некоторых случаях 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или вплоть до примерно 30 мин. Более длинный период времени для завершения цитокинеза 1 у оцениваемого эмбриона, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. В качестве второго примера, клеточный цикл 1 у нормального эмбриона, т.е. период от времени оплодотворения до завершения цитокинеза 1, в типичном случае завершается примерно через 20-27 ч, чаще примерно через 25-27 ч, т.е. примерно 15, 16, 17, 18 или 19 ч, чаще около 20, 21, 22, 23 или 24 ч, и чаще около 25, 26 или 27 ч. Клеточный цикл 1, длящийся у оцениваемого эмбриона дольше, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. В качестве третьего примера, завершение цитокинеза 1 и начало цитокинеза 2 у нормального эмбриона человека занимает примерно 8-15 ч, чаще около 9-13 ч, со средним значением примерно 11 + /-2,1 ч; т.е. 6, 7 или 8 ч, чаще около 9, 10, 11, 12, 13, 14 или вплоть до примерно 15 ч. Более длинный или более короткий клеточный цикл 2 у оцениваемого эмбриона, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. В качестве четвертого примера, временной интервал между началом цитокинеза 2 и началом цитокинеза 3, т.е. синхронность второго и третьего митозов, у нормального эмбриона человека обычно составляет примерно 0-5 ч, чаще около 0, 1, 2 или 3 ч, со средним временем примерно 1+/-1,6 ч; более длинный интервал между завершением цитокинеза 2 и цитокинеза 3 у оцениваемого эмбриона, по сравнению с таковым, наблюдаемым у нормального референсного эмбриона, является признаком плохой способности к развитию. Наконец, в качестве примера приложения данного воплощения, при использовании в качестве параметров для оценки способности к развитию уровней экспрессии генов, более низкие уровни экспрессии генов кофилина, ΌΙАРН1, ЕСТ2, МУ1.С2. ПССН8. 1)1сег. ТАКВР2, СРЕВ1, симплекина, ΥΒΧ2, ΖΑΚ1, ΟΓΝΝΒ1, ΌΝΜΤ3Β, ТЕКТ, ΥΥ1, ΙΡΟΚ2, ВТР3 и/или ΝΕΕΡ, т.е. в 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 или 100 раз более низкие уровни экспрессии, у оцениваемых 2-клеточных эмбрионов, по сравнению с таковыми, наблюдаемыми у нормального референсного 2-клеточного эмбриона, являются признаком плохой способности к развитию, тогда как уровни экспрессии, равные или выше, чем таковые, наблюдаемые у нормального референсного 2-клеточного эмбриона, являются признаком хорошей способности к развитию. Другие примеры могут быть получены из эмпирических данных, например, путем наблюдения одного или нескольких референсных эмбрионов или плюрипотентных клеток параллельно с оцениваемыми эмбрионами/плюрипотентными клетками. Можно использовать любой референсный эмбрион/плюрипотентную клетку, например нормальный референсный образец с хорошей способностью к развитию или референсный образец с отклонением от нормы с плохой способностью к развитию. В некоторых случаях можно использовать более одного референсного образца, например можно использовать одновременно и нормальный референсный образец, и референсный образец с отклонением от нормы.
В некоторых вариантах воплощения предпочтительнее применение показателей клеточных параметров, полученных с применением цейтраферной микроскопии или выяснения профиля экспрессии, но не с применением одновременно и цейтраферной микроскопии, и выяснения профиля экспрессии. В других вариантах воплощения предпочтительнее применение показателей клеточных параметров, полученных с применением цейтраферной микроскопии, а также показателей клеточных параметров, полученных с применением выяснения профиля экспрессии.
Как обсуждалось выше, для определения способности к развитию эмбриона или плюрипотентной клетки могут быть измерены и использованы один или несколько параметров. В некоторых вариантах воплощения для достижения определения способности к развитию может быть достаточно показателя единичного параметра. В некоторых вариантах воплощения может быть желательно использование показателей более, чем одного параметра, например 2 клеточных параметра, 3 клеточных параметра или 4 или более клеточных параметра.
- 15 025172
В некоторых воплощениях желательным есть проведение анализа множества параметров, так как проведение анализа множества параметров может обеспечить более высокую чувствительность и типичность. Под чувствительностью понимается доля фактических положительных образцов, которые правильно определены как положительные. Это можно выразить математически как:
(Количество истинных положительных образцов)
Чувствительность -(Количество истинных положительных образцов +
Количество ложных отрицательных образцов)
Таким образом, в способе, где положительными образцами есть эмбрионы, обладающие хорошей способностью к развитию, т.е. те, которые разовьются в бластоцисты, а отрицательными образцами есть эмбрионы, обладающие плохой способностью к развитию, т.е. те, которые не разовьются в бластоцисты, чувствительность, равная 100%, означает, что испытание распознает, по существу, все эмбрионы, которые разовьются в бластоцисты. В некоторых вариантах воплощения чувствительность анализа может составлять примерно 70, 80, 90, 95, 98% или более, например 100%. Под типичностью понимается доля отрицательных образцов, которые правильно определены как отрицательные. Это можно выразить математически как (Количество истинных положительных образцов)
Типичность -(Количество истинных отрицательных образцов + Количество ложных положительных образцов)
Таким образом, в способе, где положительными образцами являются эмбрионы, обладающие хорошей способностью к развитию, т.е. те, которые разовьются в бластоцисты, а отрицательными образцами являются эмбрионы, обладающие плохой способностью к развитию, т.е. те, которые не разовьются в бластоцисты, специфичность, равная 100%, означает, что испытание распознает, по существу, все эмбрионы, которые не разовьются в бластоцисты, т.е. претерпят блок развития до достижения стадии бластоцисты. В некоторых вариантах воплощения типичность анализа может составлять примерно 70, 80, 90, 95, 98 или более, например 100%.
Как демонстрируется в разделе примеров ниже и на фиг. 7, применение трех параметров обеспечивает чувствительность 94% и типичность 93%, с пороговой точкой, равной трем стандартным отклонениям распределения бластоцист. Иначе говоря, способы по изобретению способны правильно определять количество эмбрионов, которые в дальнейшем разовьются в бластоцисты в 94% случаев (чувствительность) и количество эмбрионов, которые в дальнейшем претерпят блок развития до достижения стадии бластоцисты, в 93% случаев (типичность). Кроме того, указанные средние значения и/или пороговые точки могут быть изменены в зависимости от набора данных, используемого для вычисления этих значений, а также от типичных использований.
В некоторых вариантах воплощения оценка эмбриона или плюрипотентной клетки включает составление письменных отчетов, которые содержат оценку специалистом исследуемого эмбриона/плюрипотентной клетки, например, оценку способности к развитию, оценку хромосомных нарушений и т.д. Таким образом, рассматриваемый способ может дополнительно включать этап составления или вывода отчета, представляющего результаты такой оценки, при этом данный отчет может быть представлен в электронной форме (например, электронный дисплей компьютерного монитора) или в материальной форме (например, отчет, напечатанный на бумаге или ином материальном носителе).
Отчет согласно описанию в этом документе является электронным или материальным документом, содержащим элементы отчета, которые сообщают представляющую интерес информацию относительно оценки, полученной с применением способов по изобретению. Указанный отчет может быть полностью или частично составлен с помощью электронных средств. Указанный отчет содержит, по меньшей мере, оценку способности к развитию исследуемого эмбриона или плюрипотентной клетки, оценку вероятности существования хромосомных нарушений и т.д. Указанный отчет может дополнительно содержать один или несколько из пунктов: 1) информацию, касающуюся испытательного оборудования; 2) информацию о поставщике услуги; 3) данные о субъекте исследования; 4) данные об образце; 5) подробный раздел отчета об оценке, сообщающий информацию о том, как была получена оценка, например а) об определяемых показателях клеточных параметров, Ь) о применяемых референсных значениях, если они использовались; и 6) другие характеристики.
Отчет может содержать информацию об испытательном оборудовании, при этом данная информация относится к больнице, клинике или лаборатории, в которых проводили отбор образцов и/или получение данных. Отбор образцов может содержать информацию о том, как получали образец, например как его извлекали у субъекта и/или как его культивировали и т.д. Получение данных может содержать информацию о том, как получали изображения или анализировали профили экспрессии генов. Эта информация может содержать одно или несколько подробных описаний, относящихся, например, к названию и расположению испытательного оборудования, личности технического сотрудника лаборатории, проводившего анализ и/или вводившего входные данные, дате и времени проведения исследования и/или анализа данных, месту хранения образца и/или полученных в результате данных, номеру серии реагентов
- 16 025172 (например, набора и т.д.), использованных при проведении анализа, и т.п. Разделы отчета с этой информацией в общем случае могут быть заполнены с использованием информации, предоставляемой пользователем.
Отчет может содержать информацию о поставщике услуг, который может располагаться вне учреждения здравоохранения, в котором находится пользователь, или в составе учреждения здравоохранения. Примеры такой информации могут содержать название и месторасположение поставщика услуг, название органа надзора и, если это необходимо или желательно, имя сотрудника, который осуществлял приготовление образца и/или получение данных. Разделы отчета с этой информацией в общем случае могут быть заполнены с использованием данных, введенных пользователем, которые могут быть выбраны из заранее заданных вариантов (например, с помощью выпадающего меню). Другая информация о поставщике услуг в отчете может содержать контактную информацию для получения технической информации о результатах и/или об интерпретирующем отчете.
Отчет может содержать раздел данных субъекта исследования, заключающий в себе историю болезни субъекта, от которого были получены яйцеклетки или плюрипотентные клетки, возраст пациента, характеристики цикла экстракорпорального оплодотворения (например, частота оплодотворения, уровень фолликулстимулирующего гормона (ФСГ) на 3 день) и, при получении яйцеклеток, - параметры когорты зигот/эмбрионов (например, суммарное количество эмбрионов). Эти данные субъекта исследования могут быть использованы для улучшения оценки эмбриона и/или для того, чтобы помочь определить оптимальное количество эмбрионов для переноса. Отчет может также содержать административные данные субъекта (т.е. данные, которые не существенны для оценки способности к развитию), такие как информация для идентификации субъекта (например, имя, дату рождения (ΌΟΒ) субъекта, пол, почтовый адрес и адрес проживания, номер истории болезни (ΜΡΝ), номер палаты и/или кровати в учреждении здравоохранения), информацию о страховании и т.п.), имя лечащего врача субъекта или другого работника здравоохранения, заказавшего проведение оценки способности к развитию, и, если это не был врач, заказавший исследование, имя штатного врача, ответственного за обслуживание субъекта (например, основного лечащего врача).
Отчет может содержать раздел, посвященный данным образца, в котором может быть представлена информация об анализируемом при оценке биологическом образце, такая как тип образца (эмбрион или плюрипотентная клетка, и тип плюрипотентной клетки), условия работы с образцом (например, температура хранения, протоколы приготовления) и дата и время получения. Разделы отчета с этой информацией в общем случае могут быть заполнены с использованием данных, введенных пользователем, некоторые из которых могут быть представлены в виде заранее заданных вариантов (например, с помощью выпадающего меню).
Отчет может содержать раздел отчета об оценке, который может заключать в себе информацию, относящуюся к тому, как были получены оценки/определения, как описано в этом документе. Интерпретирующий отчет может вмещать, например, цейтраферные изображения оцениваемого эмбриона или плюрипотентной клетки и/или результаты анализа экспрессии генов. Оценочная часть отчета может также необязательно содержать раздел рекомендаций. Например, в случае, если результаты свидетельствуют о хорошей способности эмбриона к развитию, рекомендации могут содержать совет во время лечения бесплодия трансплантировать в матку ограниченное количество эмбрионов, как рекомендуют специалисты в данной области.
Совершенно ясно, что отчеты могут содержать дополнительные элементы или измененные элементы. Например, если отчет электронный, то он может содержать гиперссылки, указывающие на внутренние и внешние базы данных, в которых представлена более подробная информация о выбранных элементах отчета. Например, элемент отчета с данными пациента может содержать гиперссылку на электронную карту больного или на сайт, на котором можно получить доступ к такой карте больного, при этом карта больного хранится в конфиденциальной базе данных. Данный последний вариант воплощения может представлять интерес для больничных и клинических систем. Если отчет представлен в электронной форме, его записывают на подходящий физический носитель, такой как машиночитаемый носитель, например, в память компьютера, на ΖΙΡ-диск, СИ, ЭУЭ и т.д.
Совершенно ясно, что отчет может содержать все или некоторые из перечисленных выше элементов, при условии, что отчет в общем случае содержит, по меньшей мере, элементы, достаточные для обеспечения аналитических данных, необходимых пользователю (например, оценку способности к развитию).
Полезность.
Как обсуждалось выше, способы по изобретению могут применяться для оценки эмбрионов или плюрипотентных клеток с целью определения их способности к развитию. Определение способности к развитию может применяться для принятия решений и/или действий в клинической практике. Например, для повышения частот возникновения беременности, клиницисты часто переносят в организм пациентки множество эмбрионов, что потенциально может привести к многоплодной беременности, что, в свою очередь, создает риски для здоровья как матери, так и плодов. При применении результатов, полученных с помощью способов по изобретению, способность к развитию эмбрионов, предназначенных для перено- 17 025172 са с развитием в плод, определяют до трансплантации, что позволяет практикующему врачу принять решение, сколько эмбрионов переносить с таким расчетом, чтобы максимизировать шанс на успех с полностью доношенной беременностью, при этом минимизировав риск.
Оценки, произведенные с применением следующих способов по изобретению, могут также найти применение для ранжирования эмбрионов или плюрипотентных клеток в группе эмбрионов или плюрипотентных клеток по их способности к развитию. Например, в некоторых случаях множество эмбрионов могут иметь возможность развиться в бластоцисты, т.е. будут иметь хорошую способность к развитию. Однако некоторые эмбрионы будут обладать большей вероятностью достижения стадии бластоцисты или давать бластоцисту более высокого качества, чем другие, т.е. они будут обладать лучшей способностью к развитию, чем другие эмбрионы. В таких случаях способы по изобретению можно применять для ранжирования эмбрионов в группе. В таких способах один или несколько клеточных параметров для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки измеряют с получением показателя клеточного параметра для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки. Один или несколько показателей клеточного параметра для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток после этого используют с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. В некоторых вариантах воплощения показатели клеточного параметра для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток применяют путем их сравнения непосредственно друг с другом с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток. В некоторых вариантах воплощения показатели клеточных параметров для каждого из эмбрионов или плюрипотентных клеток используют путем сравнения показателей клеточных параметров с показателями клеточных параметров для референсного эмбриона/плюрипотентной клетки с целью определения способности к развитию для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки, и потом сравнивая определенные способности к развитию для каждого эмбриона/плюрипотентной клетки с целью определения способности к развитию эмбрионов или плюрипотентных клеток относительно друг друга. Таким образом, практикующий врач, оценивающий, например, множество зигот/эмбрионов, может выбрать для переноса только эмбрионы с наилучшим качеством, т.е. те из них, которые обладают наилучшей способностью к развитию, так, чтобы максимизировать шанс на успех с полностью доношенной беременностью, при этом минимизировав риск.
Оценки, полученные с применением следующих способов по изобретению, также могут найти применение для определения способности к развитию яйцеклеток, которые созрели ш νίΙΐΌ, и стволовых клеток, которые культивируют ш уйго. Информация о способности к развитию яйцеклеток, полученная способами по изобретению, может служить руководством для выбора практикующим врачом яйцеклетки для оплодотворения, что приведет к более высокой вероятности успешного получения бластоцист из таких яйцеклеток. Точно так же, информация о способности к развитию стволовых клеток может помочь практикующему врачу сделать выбор стволовых клеток для применения в ходе процедур, например, для восстановления или замещения ткани ш У1уо у нуждающегося в этом субъекта.
Реагенты, устройства и наборы.
Также предложены реагенты, устройства и их наборы для применения в практике одного или нескольких из описанных выше способов. Указанные реагенты, устройства и наборы могут существенно варьировать. Представляющие интерес реагенты и устройства содержат те, которые упомянуты выше в связи со способами измерения любого из вышеуказанных клеточных параметров, при этом такие реагенты могут содержать культуральные чашки, культуральную среду, микроскопы, программное обеспечение для получения изображений, программное обеспечение для анализа изображений, праймеры в виде нуклеиновых кислот, чипы с маркерами в виде нуклеиновых кислот, антитела, реагенты сигналпродуцирующих систем и т.д., в зависимости от конкретного выполняемого протокола измерения. Например, реагенты могут содержать праймеры для ПЦР, типичные для одного или нескольких генов кофилина, И1АРН1, ЕСТ2, МУЕС2/М¥Ь5, ИССК8, Икег/ИГСЕКТ, ТАКВР2, СРЕВ1, симплекина/δΥΜΡΚ, ΥΒΧ2, ΖΑΚ1, ΟΓΝΝΒ1, ΌΝΜΤ3Β, ТЕКТ, ΥΥ1, ΙΡΟΚ2/ΙΡΝΟΚ2, ВТР3 и ИЕЬР, как описано выше. Другие примеры реагентов содержат чипы с маркерами, характерные для одного или нескольких целевых генов, или антитела к белкам, кодируемым этими целевыми генами.
В дополнение к вышеуказанным компонентам, рассматриваемые наборы будут дополнительно содержать инструкции для практического применения рассматриваемых способов. Эти инструкции могут присутствовать в рассматриваемых наборах во множестве форм, одна или несколько из которых могут находиться в наборе. Одной из форм, в которой могут находиться эти инструкции, это информация в печатном виде на подходящем носителе или основе, например лист или листы бумаги, на которых напечатана информация, на упаковке набора, на листовке-вкладыше в упаковке и т.д. Другим способом может быть использование машиночитаемых носителей, например, дискет, СИ и т.д., на которые была записана информация. Еще одним способом, который может применяться, есть адрес веб-сайта, который можно использовать посредством Интернета для доступа к информации на удаленном веб-сайте. Любые доступные способы могут применяться в наборах.
- 18 025172
Автоматизированная визуализация клеток с применением комплекта микроскопов.
Некоторые из описанных выше способов требуют возможности наблюдать за развитием эмбриона и стволовой клетки посредством цейтраферной съемки. Это может быть достигнуто применением системы, состоящей из миниатюрного многоканального комплекта микроскопов, который может поместиться внутри стандартного инкубатора. Это позволяет получать быстро и одновременно изображения множества образцов без физического перемещения чашек. Один из иллюстративных прототипов, показанный на фиг. 20, состоит из 3-канального комплекта микроскопов с темнопольным освещением, хотя могут применяться и другие типы освещения. Под трехканальным необходимо понимать, что имеется три независимых микроскопа, дающих изображения трех различных чашек одновременно. Шаговый двигатель используют для регулировки положения фокуса с целью фокусировки или получения трехмерных стеков изображений. Для освещения применяют светодиоды (ЬЕОк) белого света, хотя мы наблюдали, что в случае эмбрионов человека применение светодиодов (ЪЕЭЦ красного или ближнего инфракрасного (ИК) света может улучшить контрастность между клеточными мембранами и внутриклеточной частью. Эта улучшенная контрастность может быть полезна как при ручном, так и при автоматизированном анализе изображений. Кроме того, смещение в инфракрасную область спектра может снизить фототоксичность по отношению к образцу. Изображения захватывают с применением недорогих веб-камер с высоким разрешением, но могут использоваться и камеры других типов.
Как показано на фиг. 22, каждый микроскоп описанной выше прототипной системы используется для получения изображения культуральной чашки, которая может содержать примерно 1-30 эмбрионов. Микроскоп собирает свет от светодиода (ЬЕО) белого света, соединенного с теплоотводом, способствующим рассеиванию любой тепловой энергии, образованной светодиодом (ЬЕО), которая очень мала в случае коротких периодов экспозиции. Свет проходит через стандартный темнопольный фильтр для отсечения прямого света, через линзы конденсора и падает на образец, обозначенный чашка Петри, который представляет собой культуральную чашку, содержащую эмбрионы для культивирования и исследования. Культуральная чашка может содержать лунки, которые помогают сохранять порядок расположения эмбрионов и не позволяют им перемещаться, когда чашку переносят в инкубатор и из него. Лунки могут располагаться достаточно близко друг к другу, так, чтобы эмбрионы находились в одной и той же капле среды. После этого рассеянный свет проходит через объектив микроскопа, потом через ахроматический дублет и падает на КМОП-матрицу. КМОП-матрица действует как цифровая камера и соединена с компьютером для анализа изображений и слежения, как описано выше.
Данную схему легко масштабировать для обеспечения существенно большего количества каналов и различных методик освещения, и она может быть изменена с целью размещения струйных элементов для подачи питательной среды к образцам. Кроме того, схема может быть интегрирована с системой управления с обратной связью, при этом условия культивирования, такие как температура, СО2 (для контроля рН) и среда, оптимизируются в реальном времени на основании обратной связи и исходя из данных визуализации. Данную систему применяли для получения цейтраферного видео развития эмбриона человека, что полезно при определении жизнеспособности эмбрионов для методик экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Другие применения включают терапию с применением стволовых клеток, лекарственный скрининг и тканевую инженерию.
В одном из вариантов воплощения устройства освещение обеспечивается с применением белых светодиодов (ЬЕО) фирмы Ьихеоп, смонтированных на алюминиевом теплоотводе и получающих питание от стабилизированного источника тока фирмы ВискРиск. Свет от ЬЕО проходит через коллиматорную линзу. После этого коллимированный свет проходит через изготовленный на заказ с помощью лазера фильтр, как показано на фиг. 22, и фокусируется в виде полого конуса света с применением асферической конденсорной линзы. Свет, который напрямую проходит через образец, не воспринимается объективом, тогда как свет, рассеянный образцом, собирается. В одном из вариантов воплощения применяют объективы фирмы О1ушри8 с 20-кратным увеличением, хотя может применяться меньшее увеличение для увеличения поля зрения, или может применяться большее увеличение для повышения разрешающей способности. После этого собранный свет проходит через ахроматический дублет линз (т.е. тубусную линзу) для снижения влияния хроматических и сферических аберраций. В альтернативном варианте собранный свет от формирующего изображение объектива может проходить через еще один объектив, направленный в противоположном направлении, который действует как замена тубусной линзы. В одной конфигурации формирующий изображение объектив может являться объективом с 10-кратным увеличением, в то время как объектив тубусной линзы может являться объективом с 4-кратным увеличением. Сформированное в результате изображение захватывается КМОП-матрицей с разрешением 2 мегапикселя (1600х 1200 пикселей). Также могут применяться различные типы матриц и разрешений.
На фиг. 23А показана фотография многоканального комплекта микроскопов, содержащего 3 идентичных микроскопа. Все оптические компоненты смонтированы в тубусах объектива. При эксплуатации системы комплекта микроскопов чашки Петри расположены на акриловых платформах, которые установлены на ортостатических подставках, наклон которых можно регулировать вручную по 2-м осям, что позволяет регулировать положение плоскости изображения относительно оптической оси. Эти подставки закреплены на основании микроскопа и не перемещаются после первоначального выравнивания. Модули
- 19 025172 освещения, состоящие из светодиодов, коллиматорные линзы, фильтры и конденсорные линзы смонтированы на подставках, позволяющих осуществлять перемещение вручную в пространстве в трех направлениях для расположения и фокусировки освещающего света. Модули формирования изображения, состоящие из объективов, ахроматических линз и КМОП-матриц, также смонтированы на подставках, позволяющих осуществлять перемещение вручную в пространстве в трех направлениях для расположения поля зрения и фокусировки объективов. Все 3 модуля формирования изображения присоединены к линейным направляющим и поддерживаются одноплечевой консолью, которую приводят в движение с помощью шагового двигателя. Это позволяет производить контролируемое компьютером фокусирование и автоматический захват стеков изображений. Могут применяться другие способы автоматического фокусирования, а также приведения в действие.
Комплект микроскопов поместили внутрь стандартного инкубатора, как показано на фиг. 23В. КМОП-матрицы соединены посредством υδΒ-соединения с общим концентратором, расположенным внутри инкубатора, который выведен к внешнему ПК вместе с другими коммуникационными и электрическими проводами. Все электрические кабели выходят из инкубатора через центр каучуковой пробки, герметично закупоренной силиконовым клеем.
Описанный выше комплект микроскопов применяли для регистрации цейтраферных изображений на ранних стадиях развития эмбриона человека и задокументировали рост от стадии зиготы вплоть до стадии бластоцисты. В сумме в четырех независимых экспериментах провели наблюдение за 2 42 эмбрионами. Из этой группы для 100 получали снимки вплоть до 5 или 6 дня; другие были удалены из установок для получения изображений в различных временных точках для анализа экспрессии генов. Снимок экрана программного обеспечения для захвата изображения и изображений эмбрионов показан на фиг. 24. Изображения захватывали каждые 5 мин с примерно 1-секундной экспозицией при низкой освещенности для каждого изображения. Суммарное количество света, полученного образцами, было эквивалентно 24 мин непрерывной экспозиции, подобно суммарному уровню, получаемому при работе с материалом в клинике по проведению ЭКО. 1-секундная длительность световой экспозиции на изображение может быть уменьшена. Перед проведением работ с эмбрионами человека были проведены всесторонние контрольные эксперименты на преимплантационных эмбрионах мыши для того, чтобы убедиться, что как на скорость образования бластоцисты, так и на профили экспрессии генов не влияет процесс визуализации.
На фиг. 25 и 26 показаны избранные изображения из цейтраферных последовательностей. Показаны изображения для временных точек: 1, 2,5, 4 и 5,5 дней. В случае последовательности, показанной на фиг. 25, 3 из 9 эмбрионов развились в бластоцисты, а в случае последовательности, показанной на фиг. 26, 5 из 12 эмбрионов развились в бластоцисты. За отдельными эмбрионами наблюдали в течение определенного периода времени, несмотря на то, что их положение в фотографическом поле изменилось, так как эмбрионы претерпели смену среды на 3 день. Применение последовательной смены среды необходимо для удовлетворения специфичных для стадии потребностей развивающихся эмбрионов. Во время смены среды эмбрионы вынимали из установки для получения изображений на несколько минут и перемещали в новые чашки Петри. Для того чтобы проследить за идентичностью каждого из эмбрионов при смене среды, перенос образцов из одной чашки в другую записывали на видео, чтобы убедиться, что эмбрионы не были перепутаны. Этот процесс также применяли во время отбора образцов для анализа экспрессии генов. Проблема слежения за идентичностью эмбрионов может быть облегчена применением лунок, помогающих располагать эмбрионы в определенном порядке.
Чашки Петри с микролунками.
При перемещении чашек Петри между различными установками иногда эмбрионы могут перемещаться, что делает трудным задачу слежения за идентичностью эмбрионов. Это создает трудности при осуществлении цейтраферной съемки на одной установке, а потом эмбрионы перемещают во вторую установку для выбора эмбрионов и переноса. Один из способов - это культивирование эмбрионов в индивидуальных чашках Петри. Однако в этом случае у каждого эмбриона буде своя капля среды. При типичной методике ЭКО обычно желательно культивировать все полученные эмбрионы пациентки в одной чашке Петри и в одной и той же капле среды. Для решения этой проблемы нами была разработана изготовляемая на заказ чашка Петри с микролунками. Это позволяет предотвратить перемещение эмбрионов и сохранить их расположение на чашке Петри при перемещении в инкубатор или установку для получения изображений и из них. Кроме того, лунки достаточно малы и расположены близко друг к другу, таким образом, что они могут делить между собой одну и ту же каплю среды и могут все одновременно находиться в поле зрения одного и того же микроскопа. Поверхность дна каждой микролунки имеет полировку оптического качества. На фиг. 27А показан чертеж с размерами для одного воплощения. В этом варианте имеется 25 микролунок, расположенных близко друг к другу в пределах поля зрения размером 1,7 х 1,7 мм. На фиг. 27В приведено трехмерное изображение микролунок, которые углублены в поверхность чашки примерно на 100 мкм. Координатные маркеры, включая буквы, числа и другие маркеры, нанесены на чашку для помощи при идентификации.
Содержание всех процитированных справочных материалов целиком включено сюда в качестве ссылок.
- 20 025172
Примеры
Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области раскрытие и описание того, как осуществлять и применять настоящее изобретение, и не предназначены для ограничения объема того, что изобретатели рассматривают как свое изобретение, а также они не предназначены для представления точки зрения, что описанные ниже эксперименты являются всеми или единственными проведенными экспериментами. Предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых числовых значений (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать возможность каких-то экспериментальных ошибок и отклонений. Если не указано иначе, части являются частями по массе, молекулярная масса представляет среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, а давление равно или приблизительно равно атмосферному.
Источник образцов.
Все эмбрионы, применяемые в данном исследовании, были собраны в течение многолетнего периода, оплодотворены и подвергнуты криоконсервации множеством эмбриологов. Среднее количество эмбрионов на пациентку в нашем исследовании составило 3, и были включены все возрастные группы, которые обращаются в обычные центры по проведению ЭКО. Следует отметить, что все эмбрионы, применяемые в данных экспериментах, были образованы в результате ЭКО (в противоположность ИКСИ), т.е. эмбрионы были получены с использованием сперматозоидов, обладающих относительно нормальным функционированием (по меньшей мере, с точки зрения их способности проникать через яйценосный бугорок, блестящую оболочку и оолемму и формировать пронуклеус). Протоколами стимуляции были стандартные длинные протоколы с люпроном (сйс.доу/аП). Криоконсервацию избыточных эмбрионов человека проводили путем помещения их в среду для заморозки (1,5 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахароза) на 25 мин при комнатной температуре (22+2°С). После этого эмбрионы замораживали с применением протокола медленной заморозки (от -1°С в течение 7 мин до -6,5°С; выдержать в течение 5 мин; разделить на аликвоты; выдержать в течение 5 мин; со скоростью -0,5°С/мин до -80°С; погрузить в жидкий азот). Комитет. С эмбрионами не была связана какая-либо подлежащая защите информация, касающаяся здоровья.
Большую группу криоконсервированных эмбрионов валидировали и сделали следующие наблюдения: 1) эмбрионы демонстрировали хронометраж, свидетельствующий о нормальном развитии эмбриона с точки зрения основных этапов, в том числе: дробление на 2 клетки (происходило в начале 2 дня), начало деградации РНК (происходило в 1-3 дня), дробление на 4 и 8 клеток (происходило в конце 2 дня и на 3 день соответственно), активация генома эмбриона (на 3 день на 8-клеточной стадии) и образование морулы и бластоцисты (происходило на 4 и 5 день соответственно). 2) Эмбрионы демонстрировали эффективность в достижении стадии бластоцисты, типичную для эмбрионов, полученных в клинических условиях. Причиной этого, вероятно, является тот факт, что эмбрионы были подвергнуты криоконсервации на стадии двух пронуклеусов (2ΡΝ) и представляли собой набор всех эмбрионов, встречающихся в практике клиник по проведению ЭКО, так как перед криоконсервацией на 1-клеточной стадии никакой сортировки на те эмбрионы, которые способны развиваться, и те, которые не способны развиваться, не проводили (подобно тому, как в типичном случае проводят сортировку эмбрионов, подвергаемых криоконсервации на более поздних стадиях развития - на 3 день или на стадии бластоцисты). Таким образом, наши данные подтверждают, что эти эмбрионы проявляют схожие частоты образования бластоцисты, в сравнении с таковыми, наблюдаемыми в типичном случае в клиниках по проведению ЭКО. 3) Предшествующие исследования продемонстрировали, что эмбрионы, которые заморожены на стадии двух пронуклеусов, проявляют схожую способность к развитию, имплантации, клинической беременности и родам, в сравнении со свежеприготовленными эмбрионами. В других исследованиях также показали схожие результаты для замороженных яйцеклеток, и это предполагает, что самые ранние явления в развитии эмбриона человека сохраняют соответствующий хронометраж после криоконсервации. 4) Мы сфокусировались на параметрах, которые не зависели от времени оплодотворения или времени разморозки. Первый параметр, который мы измеряли (длительность первого цитокинеза), имеет малую длительность (примерно 10-15 мин) и не зависит от времени оплодотворения в данном исследовании (его можно измерить независимо для всех эмбрионов, вне зависимости от конечного исхода). Более того, все последующие параметры измеряют относительно этой начальной точки измерений и сравнивают между теми эмбрионами, которые успешно развились до бластоцисты, и теми, которые не смогли развиться. 5) Наконец, следует отметить, что, как известно, свежеприготовленные (не замороженные) эмбрионы с тремя пронуклеусами (3ΡΝ) развиваются в тех же временных рамках, что и свежеприготовленные нормальные эмбрионы; мы провели сравнение параметров для свежеприготовленных эмбрионов с тремя пронуклеусами, полученных из Стенфордской клиники по проведению ЭКО, и показали, что они не отличаются от параметров наших криоконсервированных эмбрионов или данных опубликованных отчетов.
План эксперимента.
В четырех сериях экспериментов прослеживали развитие 242 эмбрионов на пронуклеарной стадии (61, 80, 64 и 37 соответственно). В каждой серии экспериментов зиготы человека размораживали в 1 день и культивировали в небольших группах во множестве чашек. За каждой чашкой наблюдали независимо с применением цейтраферной микроскопии с темнопольным освещением на отдельных установках для
- 21 025172 получения изображений. Приблизительно с 24-часовыми интервалами одну чашку с эмбрионами вынимали из системы формирования изображений и отбирали либо единичные эмбрионы, либо единичные клетки (бластомеры) для проведения анализа экспрессии генов с высокой производительностью с применением количественной ПЦР в реальном времени. Каждая чашка в типичном случае содержала смесь эмбрионов, которые достигли ожидаемой стадии развития на момент сбора (называемых нормальными), и эмбрионов, у которых был блок развития, или задержка на более ранних стадиях развития, или имелась существенная фрагментация (называемых с отклонением от нормы). Эмбрионы анализировали либо как единичные интактные эмбрионы, либо дезагрегировали их на единичные бластомеры с последующей ген-специфичной амплификацией РНК. Для подгруппы эмбрионов (100 из 242) получали изображения вплоть до 5 или 6 дня с целью мониторинга образования бластоцисты.
Культивирование и микроскопия эмбрионов человека.
Эмбрионы человека размораживали путем выемки криофлаконов из резервуара для хранения в жидком азоте и помещения их в условия комнатной температуры. После оттаивания флакона его открывали и проводили визуальный осмотр эмбрионов под препаровальной лупой. После этого содержимое флакона выливали на дно культуральной чашки 3003. Эмбрионы располагались в капле, и проводилась оценка и регистрация выживания каждого эмбриона. При комнатной температуре эмбрионы перенесли в культуральную чашку 3037, содержащую 1,0 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахарозу, на 5 мин, после этого в 0,5 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахарозу на 5 мин и в 0,0 М 1,2-пропандиол + 0,2 М сахарозу на 5 мин. После этого эмбрионы культивировали в среде Квина усовершенствованной для культивирования эмбрионов (Соорег§игд1са1) с добавлением 10% заменителя белков сыворотки Квина (δΡδ; Соорегёигдюа1) с 1 дня по 3 день и в среде Квина усовершенствованной для культивирования бластоцист (Соорегёигд1са1) с 10% δΡδ после 3 дня, с применением микрокапель под слоем масла. Во всех экспериментах использовали один и тот же тип среды на стадии дробления, за исключением двух установок во время первого эксперимента, в которых использовали среду 01оЬа1 тейшт (Ы£еО1оЬа1, Гилфорд, Коннектикут, США). В этой небольшой подгруппе (из 12 эмбрионов) эмбрионы проявляли несколько меньшую частоту образования бластоцисты (3 из 12, или 25%), но чувствительность и специфичность наших прогностических параметров для этой группы в обоих случаях равнялись 100%.
Цейтраферную съемку производили на множестве систем для обеспечения одновременности анализа множества образцов, а также для валидации согласованности данных между различными платформами. Система состояла из 7 отдельных микроскопов: (1) двух модифицированных микроскопов О1утри8 ΙΧ-70/71, оборудованных нагревательными платформами Тока Ηίΐ, светодиодом Ьихеои белого света и апертурой для темнопольного освещения; (2) двух модифицированных микроскопов О1утри8 СКХ40/41, оборудованных нагревательными платформами, светодиодом Ьихеои белого света и освещением по типу модуляционного контраста Хоффмана (примечание: данные системы применяли только во время первого из 4 экспериментов, после чего было принято решение, что темнопольное освещение предпочтительнее для измерения параметров); и (3) изготовленный на заказ 3-канальный комплект миниатюрных микроскопов, который помещается внутри стандартного инкубатора, оборудованного светодиодом Ьихеои белого света и апертурой для темнопольного освещения. Не наблюдалось существенных различий в характеристике развития, частотах образования бластоцисты или профилях экспрессии генов между эмбрионами, культивируемыми в этих различных системах; и действительно, выбранные нами параметры для прогноза образования бластоцисты были стабильны в случае множества систем и экспериментов.
Интенсивность света во всех системах была существенно ниже, чем интенсивность света, применяемого в типичном случае в микроскопе, используемом в области вспомогательной репродукции, благодаря низкой мощности светодиода (по сравнению с типичной 100 Вт галогеновой лампой) и высокой чувствительности сенсоров камер. С применением измерителя оптической мощности определили, что мощность типичного микроскопа, используемого в области вспомогательной репродукции (О1утри8 IX71 модуляционный контраст Хоффмана), при длине волны 473 нм находится в диапазоне примерно от 7 до 10 мВт, в зависимости от увеличения, тогда как измеренные значения мощности наших систем формирования изображений находились от 0,2 до 0,3 мВт при той же длине волны. Изображения захватывали с 1-секундным временем экспозиции каждые 5 мин в течение периода вплоть до 5 или 6 дня, что дало в результате примерно 24 мин непрерывной световой экспозиции. При мощности 0,3 мВт это эквивалентно примерно 1 мин экспозиции в типичном микроскопе, используемом в области вспомогательной репродукции.
Для слежения за идентичностью каждого эмбриона во время скоррелированных экспериментов по визуализации и анализу экспрессии генов установили на стереомикроскоп видеокамеру и регистрировали процесс переноса образцов во время смены среды и отбора образцов. Были проведены контрольные эксперименты на преимплантационных эмбрионах мыши (п=56) и небольшой подгруппе эмбрионов человека (п=22), и не наблюдалось значимых различий (р=0,96) в частотах образования бластоцисты между эмбрионами, для которых получали изображения, и контрольными эмбрионами.
Высокопроизводительный анализ количественной ОТ-ПЦР.
Для проведения анализа количественной ОТ-ПЦР единичного эмбриона или единичного бластоме- 22 025172 ра сначала эмбрионы обрабатывали кислым раствором Тайрода для удаления блестящей оболочки. Для отбора единичных бластомеров эмбрионы инкубировали в среде Квина усовершенствованной, без Са2' и Мд2', с ΗΕΡΕδ (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-№-2-этансульфоновая кислота) (Соорег8игд1са1) в течение 5-20 мин при 37°С с тщательным пипетированием. Образцы отбирали непосредственно в 10 мкл реакционного буферного раствора; далее проводили в один этап обратную транскрипцию и реакцию преамплификации как описано выше. Объединенную смесь 20Х раствора праймеров ΑΒΙ, изготавливаемых на заказ для анализа количественной ПЦР и маркеров (Аррйей Вю8У81ет8) применяли в качестве гентипичных праймеров во время реакций обратной транскрипции и пре-амплификации. Реакции высокопроизводительной количественной ПЦР проводили с применением чипа Р1шФдт Вютагк 96.96 Оупапис Аггау, как описано ранее, с применением маркеров ΑΒΙ, изготавливаемых на заказ для анализа количественной ПЦР. Все образцы наносили в 3 или 4 технических повторах. Анализ данных количественной ОТПЦР проводили с применением цВа8еР1и8 (Β^одаζе11е), М1сго8ой Ехсе1 и изготовленного на заказ программного обеспечения. Некоторые гены были исключены из анализа данных либо из-за низкого качества данных (например, плохого качества кривых амплификации при ПЦР), либо из-за стабильно низкой экспрессии или отсутствия экспрессии в оцениваемых эмбрионах. Для анализа возраста бластомеров применяемая панель материнских транскриптов включает ΌΑΖΕ, ΟΌΡ3, ΙΡΙΤΜ1, ЗТЕЕЬАК, 8УСР3, УАЗА, ΟΌΡ9, РЭСЭ5, ΖΑΚ1 и ΖΡ1, тогда как панель эмбриональных генов включает ΑΤΡ7ΙΡ, ССЫА1, ΕΙΡ1ΑΧ, ΕΙΡ4Α3, Η2ΑΕΖ, НЗР70.1, ΙΑΚΙΌ1Β, Ь8М3, РАВРС1 и 8ΕΚΤΑΌ1. Значения уровней экспрессии каждого гена относительно референсных генов ΟΑΡΌΗ и КРЬР0, а также относительно среднего значения для гена, вычисляли с помощью методов деЫогт и ΔΔΟ. ΟΑΡΌΗ и РРЬР0 были выбраны в качестве референсных генов в данном исследовании эмпирически, исходя из значения стабильности гена и коэффициента вариации: 1,18 и 46% для ΟΑΡ^Η и 1,18 и 34% для РРЬР0. Они были наиболее стабильны среди 10 генов домашнего хозяйства, которые были протестированы, и находились в диапазоне, характерном для типичного набора гетерогенных образцов. Во-вторых, мы наблюдали, что в единичных бластомерах, как и ожидалось, количество транскриптов РРЬР0 и ΟΑΕΌΗ снижалось примерно на значение 1 С! на одно деление в стадиях с 1-клеточной до 8-клеточной, что соответствует ожиданию, что каждая клетка наследует примерно половину пула мРНК при каждом делении дробления, в отсутствие новых транскриптов на этапах до эмбриональной активации генов во время первых 3 дней развития эмбриона человека. В-третьих, мы заметили, что уровень экспрессии этих референсных генов в единичных бластомерах оставался стабильным от 8-клеточной стадии до стадии морулы, после начала эмбриональной активации генов. На уровне интактного эмбриона значения С! как для РРЬР0, так и для ΟΑΕΌΗ оставались в основном постоянными вплоть до развития до стадии морулы, с небольшим повышением на стадии бластоцисты, возможно, из-за повышенных уровней транскриптов в большем количестве присутствующих бластомеров. Однако большая часть анализа экспрессии генов, проводимого в данном исследовании, фокусируется на стадиях развития, предшествующих стадии морулы, когда уровень экспрессии референсных генов был крайне стабилен.
Автоматизированное слежение за клетками.
В нашем алгоритме слежения за клетками применяется вероятностная рамка, основанная на последовательном методе Монте-Карло, которая в области компьютерной визуализации часто называют фильтром частиц. Фильтр частиц следит за развитием с течением времени трех основных переменных: состояние, контроль и показатель. Переменная состояния - это модель эмбриона, представленная как набор эллипсов. Переменная контроля - это входной сигнал, который трансформирует переменную состояния, и она состоит из нашей модели развития и деления клеток. Переменная показателя - это наблюдение состояния, и она состоит из полученных нами путем цейтраферной микроскопии изображений. Наша оценка текущего состояния в каждой временной точке представлена распределением апостериорной вероятности, которое аппроксимировано набором взвешенных образцов, называемых частицами. Мы используем термины частицы и модели эмбрионов как взаимозаменяемые, при этом частица - это одна гипотеза модели эмбриона в данной временной точке. После инициализации фильтр частиц повторяет три этапа: предсказание, измерение и обновление.
Предсказание.
Клетки представлены в виде эллипсов в двумерном пространстве, и каждая клетка обладает ориентацией и индексом перекрывания. Индекс перекрывания задает относительную высоту клетки. В общем случае имеется два типа поведения, которые мы хотим предсказывать: движение клетки и деление клетки. В случае движения клетки наш контрольный входной сигнал достигает частицы и случайным образом вызывает возмущение каждого параметра каждой клетки, включая положение, ориентацию и длину большой и малой осей. Возмущение случайным образом выбирают из нормального распределения с относительно маленькой дисперсией (5% от начальных значений). В случае деления клеток мы применяем следующий подход. В данной временной точке для каждой частицы мы назначаем 50% вероятность того, что одна из клеток будет делиться. Это значение было выбрано эмпирически и охватывает широкий диапазон возможных делений клеток, при этом сохраняя хорошее покрытие текущей конфигурации. Если предсказано деление, то делящуюся клетку выбирают случайным образом. Когда выбрана клетка, которая будет делиться, мы применяем симметричное деление вдоль большой оси эллипса, с образованием
- 23 025172 двух дочерних клеток одинакового размера и формы. После этого мы случайным образом нарушаем равновесное состояние каждого значения для дочерних клеток. Наконец, мы случайным образом выбираем индексы перекрывания двух дочерних клеток, при этом сохраняя их общее перекрывание относительно остальной части клеток.
После применения контрольного входного сигнала мы конвертируем каждую частицу в модельное изображение. Это достигается путем проекции эллиптической формы каждой клетки на модельное изображение с учетом индекса перекрывания. Соответствующие значения пикселей установлены на бинарное значение 1, и они расширены для отображения толщины мембраны, сопоставимой с данными изображений, полученных при наблюдении. Так как эмбрионы частично прозрачны, и собирается несфокусировнный свет, клеточные мембраны нижней части эмбриона видны только иногда. Соответственно скрытые от взгляда клеточные мембраны добавлены с вероятностью 10%. На практике мы обнаружили, что эти точки невидимых взгляду мембран важны для точного моделирования формы, но важно делать их в достаточной степени редкими, так, чтобы они не напоминали видимый край.
Измерение.
После генерирования распределения гипотетических моделей соответствующие модельные изображения сравнивают с фактическим микроскопическим изображением. Микроскопическое изображение предварительно обрабатывают для создания бинарного изображения клеточных мембран с применением метода, основанного на главных кривизнах с последующей пороговой бинаризацией. Точность сравнения оценивают с применением размера симметричного усеченного диагонального сопряжения, который потом применяют для установления веса, или вероятности, для каждой частицы.
Обновление.
После определения весов частицы отбирают пропорционально этим весам с созданием нового набора частиц для следующего повтора. Это смещает распределение частиц в область наибольшей вероятности. Частицы с низкой вероятностью отбрасываются, а частицы с высокой вероятностью умножаются. Повторный отбор частиц проводят с применением метода низкой дисперсии.
После моделирования эмбрионов можно провести выделение динамических параметров визуализации, таких как длительность цитокинеза и время между митозами, как описано в основном тексте. Наше программное обеспечение для слежения за клетками ранее выполнялось в среде Ма!1аЬ, и время вычислений было в диапазоне от пары секунд до половины минуты для каждого изображения, в зависимости от количества частиц. Текущая версия нашего программного обеспечения выполняется в среде С, и время вычислений находится в диапазоне от 1 до 5 с, в зависимости от количества частиц.
Пример 1. Анализ с применением визуализации для определения способности эмбрионов к развитию.
Способы.
Замороженные 1-клеточные эмбрионы человека, также называемые зиготами, разморозили и перенесли в культуру и культивировали в условиях, таких же, как и в методиках ЭКО. Исходя из описания выше, эти эмбрионы, представляют собой наглядный образец типичной популяции после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), так как они были заморожены на стадии двух пронуклеусов и, таким образом, были подвергнуты криоконсервации без проведения отбора. Эта ситуация противоположна той, которая наблюдается в типичном случае при криоконсервации эмбрионов на более поздних стадиях развития, после переноса эмбрионов, отобранных как обладающих наивысшим качеством, во время циклов при свежем приготовлении. В некоторых экспериментах эмбрионы помещали в стандартную культуральную чашку. В других экспериментах эмбрионы культивировали в изготовленной на заказ культуральной чашке с микролунками оптического качества.
За растущими эмбрионами, в типичном случае располагавшимися в количестве от 1 до 30 на чашку, наблюдали индивидуально с применением цейтраферной съемки с помощью контролируемого компьютером микроскопа, оборудованного для хранения и анализа цифровых изображений. В одних случаях цейтраферную съемку проводили с применением инвертированных микроскопов, оборудованных нагревательными платформами и инкубационными камерами. В других случаях цейтраферную съемку проводили с применением изготовленных на заказ комплектов миниатюрных микроскопов, которые помещаются внутри стандартного инкубатора, что позволило проводить одновременное культивирование множества чашек с образцами в одном и том же инкубаторе и позволило проводить масштабирование для обеспечения наличия множества каналов без ограничения в отношении минимального временного интервала между последовательными захватами изображения. Использование множества микроскопов также освободило от необходимости перемещать образец, что повысило точность и общую надежность системы. В системе формирования изображений применяли темнопольное освещение, что обеспечило повышение контрастности изображений для последующего выделения признаков и анализа изображений, хотя было замечено, что другие типы освещения были бы достаточными. Отдельные микроскопы в инкубаторе были изолированы друг от друга, обеспечивая каждой культуральной чашке свою собственную контролируемую окружающую среду. Это позволило перемещать чашки в установку для получения изображений и из нее, не нарушая окружающую среду других образцов.
Цейтраферные изображения собирали для последующего анализа клеточной морфологии, включая
- 24 025172 измерение минимум одного из следующих клеточных параметров: длительность первого цитокинеза, временной интервал между первым и вторым клеточными делениями и временной интервал между вторым и третьим клеточными делениями. Изображения, показанные на чертежах, были сделаны со временем экспозиции 1 с каждые 5 мин в течение периода вплоть до 5 или 6 дня. Как более подробно описано далее, первый цитокинез обычно происходит через один день после оплодотворения и длится примерно 14 мин. Первое и второе клеточные деления обычно разделены в среднем примерно 11 часами. Второе и третье клеточные деления обычно разделены в среднем примерно 1 часом. Таким образом, визуализацию проводили в течение периода времени, длившегося примерно 36 ч (плюс-минус несколько часов) после оплодотворения.
Результаты.
Временную шкалу развития здорового преимплантационного эмбриона человека в культуре документировали в течение шести дней посредством цейтраферной съемки (фиг. 2). Наблюдали, что нормальная зигота человека претерпевает первое деление дробления в начале 2-го дня. Далее эмбрион претерпевает дробление до 4-клеточного и 8-клеточного эмбриона в конце 2-го дня и на 3-й день соответственно перед компактизацией в морулу на 4-й день. Первая морфологически различимая дифференцировка клеток наблюдается на 5-й и 6-й день во время образования бластоцисты, когда тотипотентные бластомеры дифференцируются либо в клетки трофэктодермы, которые дают начало внезародышевым структурам, таким как плацента, либо во внутреннюю клеточную массу, которая развивается в плод ίη νίνο и в плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки ίη νίίτο.
После этого мы проследили развитие 242 нормально оплодотворенных эмбрионов в четырех независимых сериях экспериментов и задокументировали распределение нормальных эмбрионов и эмбрионов с блоком развития среди образцов, которые культивировали вплоть до 5 или 6 дня. Из 242 эмбрионов 100 были в культуре вплоть до 5 или 6 дня, и наблюдаемая частота образования бласто цисты была от 33 до 53%, что схоже с частотой образования бластоцисты в типичном случае для клиник по проведению ЭКО (фиг. 3). У остальных эмбрионов был блок развития на различных стадиях развития, наиболее часто между 2-клеточной и 8-клеточной стадиями, и их определили как имеющие отклонения от нормы (фиг. 3). Для выявления количественных параметров изображения, которые прогнозируют успешное развитие эмбриона до стадии бластоцисты, мы выделили и проанализировали несколько параметров из цейтраферных видеозаписей, включая размер бластомеров, толщину блестящей оболочки, степень фрагментации, длину первого клеточного цикла, временные интервалы между несколькими первыми митозами и длительность первого цитокинеза. В ходе анализа видеоизображений, как нормальных с точки зрения развития эмбрионов, так и с отклонением от нормы, мы наблюдали, что многие эмбрионы с блоком развития претерпевали аберрантный цитокинез во время первого клеточного деления. Нормальные эмбрионы завершали цитокинез в течение узкого временного окна 14,3+/-6,0 мин от появления борозд дробления до полного разделения дочерних клеток, плавным и контролируемым образом. Это показано на фиг. 4 вверху. В противоположность этому, эмбрионы с отклонениями от нормы обычно демонстрировали один из двух аберрантных фенотипов цитокинеза. В случае фенотипа с более мягкими нарушениями морфология и механизм цитокинеза внешне выглядели нормально, но время, необходимое для завершения процесса, было больше, в диапазоне от нескольких дополнительных минут до часа (фиг. 4). Иногда эмбрион, который претерпевал немного более длинный цитокинез, тем не менее, развивался до бластоцисты. При фенотипе с более тяжелыми нарушениями морфология и механизм цитокинеза были нарушены. Например, как показано в примере на нижней панели фиг. 4, эмбрионы образовывали одностороннюю борозду дробления и претерпевали необычные серии явлений активного перемещения в мембране клетки в течение нескольких часов, перед тем, как окончательно фрагментироваться на более мелкие компоненты. Также наблюдались другие варианты подобного поведения. Кроме того, эмбрионы с отклонениями от нормы, демонстрирующие эти фенотипы с более тяжелыми нарушениями, часто фрагментировались, и это напрямую доказывает, что фрагментация эмбриона, вероятно, является побочным продуктом аберрантного цитокинеза, что, в свою очередь, приводит к развитию эмбриона с отклонениями от нормы.
Подробный анализ результатов для полученных нами изображений показал, что нормальные эмбрионы следовали строгому хронометражу при цитокинезе и митозе во время ранних делений, до начала эмбриональной активации генов (ΕΟΆ), и это предполагает, что способность эмбриона к развитию предопределяется наследуемыми материнскими программами. В частности, мы заметили три временных интервала, или параметра, в клеточном цикле эмбриона на ранних стадиях, которые жестко регулировались: (1) длительность первого цитокинеза, (2) временной интервал между первым и вторым митозами и (3) синхронность второго и третьего митозов. Взаимосвязь между этими тремя временными интервалами и морфологическими изменениями показана на фиг. 5. В случае нормальных эмбрионов эти параметры, согласно нашим измерениям, составляли примерно 14,3+/-6,0 мин, 11,1+/-2,1 ч и 1,0+/-1,6 ч соответственно (здесь приведены средние значения плюс-минус стандартное отклонение).
Мы также провели визуализацию небольшого набора (η=10) свежеприготовленных (без криоконсервации) эмбрионов, которые содержали три пронуклеуса (были триплоидными), начиная с одноклеточной стадии. Было показано, что эмбрионы с тремя пронуклеусами следуют той же временной шкале
- 25 025172 основных явлений, что и нормальные свежеприготовленные эмбрионы, в течение минимум первых трех клеточных циклов. Изображения для этих эмбрионов были получены перед началом наших основных экспериментов с целью проверки достоверности систем формирования изображений (но по техническим причинам развитие до бластоцисты прослежено не было). Из этой группы свежеприготовленных эмбрионов 3 эмбриона следовали временной шкале явлений, схожей с таковой для подвергнутых криоконсервации на стадии двух пронуклеусов эмбрионов, с длительностью цитокинеза в диапазоне от 15 до 30 мин, временем между первым и вторым митозами в диапазоне от 9,6 до 13,8 ч и временем между вторым и третьим митозами в диапазоне от 0,3 до 1,0 ч. Однако у 7 эмбрионов наблюдали уникальный фенотип цитокинеза, который характеризовался одновременным появлением 3 борозд дробления, немного более длинным цитокинезом и, в конечном счете, разделением на три дочерние клетки (фиг. 4). У данных эмбрионов длительность цитокинеза находилась в диапазоне от 15 до 70 мин (охарактеризованная как время между началом появления борозд дробления и полным разделением на 3 дочерние клетки), время между первым и вторым митозами (от 3-клеточной до 4-клеточной стадии) - в диапазоне от 8,7 до 12,7 ч и время между вторым и третьим митозами (от 4-клеточной до 5-клеточной стадии) - в диапазоне от 0,3 до 2,6 ч. Это наблюдение, вместе с разнообразным диапазоном фенотипов цитокинеза, проявляемых эмбрионами с отклонениями от нормы, предполагает, что у наших подвергнутых криоконсервации эмбрионов не было задержки в развитии, вызванной процессом криоконсервации, и они показывали поведение, схожее с таковым свежеприготовленных зигот, которые разделяются в ходе дробления на 2 бластомера.
Касательно эмбрионов, которые достигли стадии бластоцисты, можно было сделать прогноз с чувствительностью и типичностью 94 и 93% соответственно, по признакам длительности первого цитокинеза от 0 до 33 мин, времени между первым и вторым митозами от 7,8 до 14,3 ч и времени между вторым и третьим митозами от 0 до 5,8 ч (фиг. 6). И наоборот, для эмбрионов, которые показывали значения, находящиеся вне одного или нескольких из этих окон, был предсказан блок развития. Все нормальные эмбрионы, которые успешно развились в бластоцисту, проявляли схожие значения всех трех параметров. И наоборот, эмбрионы с отклонениями от нормы проявляли высокую степень изменчивости длин временных периодов, необходимых им для завершения процессов (фиг. 6). Мы наблюдали, что (1) более длинный период времени для завершения первого цитокинеза, чем в норме, является признаком плохой способности к развитию; (2) более длинный или более короткий интервал между первым и вторым клеточными делениями, чем в норме, является признаком плохой способности к развитию; и (3) более длинный интервал между вторым и третьим клеточными делениями, чем в норме, является признаком плохой способности к развитию. Таким образом, эти параметры были прогностическими в отношении способности эмбриона продолжать развитие до образования бластоцисты и качества бластоцисты.
Наконец, мы отметили, что в то время, как каждый параметр был автономно прогностическим в отношении способности эмбриона к развитию, применение всех трех параметров обеспечивало чувствительность и типичность, которые в обоих случаях превышали 90%, с пороговой точкой, равной трем стандартным отклонениям. Характеристическая кривая обнаружения (КОС) для данных параметров показана на фиг. 7. Кривая на этом чертеже демонстрирует частоту истинных положительных образцов (чувствительность) относительно частоты ложных положительных образцов (1 - типичность) для различных порогов, выраженных относительно стандартного отклонения. Для построения данной характеристической кривой обнаружения использовали следующие числовые значения: Количество истинных положительных образцов = 34 (правильно предсказано достижение стадии бластоцисты); количество истинных отрицательных образцов = 54 (правильно предсказан блок развития); количество ложных положительных образцов = 4 (неправильно предсказано достижение стадии бластоцисты); количество ложных отрицательных образцов = 2 (неправильно предсказан блок развития).
Обсуждение.
Наш анализ показывает, что эмбрионы, которые следуют строгому хронометражу митоза и цитокинеза во время первых трех делений дробления, с большей вероятностью как разовьются до стадии бластоцисты, так и образуют бластоцисту высокого качества с лучше развитой внутренней клеточной массой (ВКМ). Динамические морфологические параметры можно применять для отбора оптимальных эмбрионов для переноса или криоконсервации во время процедуры ЭКО. Эти параметры также могут быть применены для выявления различных по качеству бластоцист, что позволяет ранжировать эмбрионы в группе по относительной способности к развитию. Стандартной практикой в клиниках по проведению ЭКО является перенос на 8-клеточной стадии (на 3 день). Некоторые клиники выбирают вариант культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты 95 день), так как перенос бластоцист обеспечивает до двух раз более высокую частоту имплантации, по сравнению с переносом на 3 день. Однако во многих клиниках избегают применения длительного культивирования из-за повышенного риска эпигенетических нарушений. Прогностические параметры визуализации можно применять для прогнозирования жизнеспособности эмбрионов до 4-клеточной стадии (на 2 день) и до начала эмбриональной активации генов. Это может позволить переносить или подвергать криоконсервации эмбрионы на целый день раньше, чем это практикуется в типичном случае, и до того как эмбрионы претерпят существенные изменения в их молекулярных программах. Это также может позволить выбирать наиболее оптимальные эмбрионы для ПГД
- 26 025172 или других типов анализа.
Пример 2. Валидация параметров визуализации при помощи анализа экспрессии генов и применение анализа экспрессии генов для определения способности к развитию.
Способы.
Замороженные 1-клеточные эмбрионы человека, также называемые зиготами, разморозили и перенесли в культуру и культивировали в условиях, таких же, как применяют в методиках ЭКО. В некоторых экспериментах эмбрионы помещали в стандартную культуральную чашку. В других экспериментах эмбрионы культивировали в изготовленной на заказ культуральной чашке с микролунками оптического качества.
Эмбрионы вынимали из системы для культивирования и визуализации и собирали в виде либо единичных эмбрионов, либо единичных клеток (бластомеров) для проведения анализа экспрессии генов. Каждая чашка в типичном случае содержала смесь эмбрионов, при этом некоторые из них достигли ожидаемой стадии развития на момент сбора, а у других был блок развития на более ранних стадиях развития или имелась существенная фрагментация. Те эмбрионы, которые достигли ожидаемой стадии развития на момент сбора, классифицировали как нормальные, тогда как те, у которых был блок развития, считали имеющими отклонения от нормы. Например, когда чашку с эмбрионами вынимали из установки для получения изображений в конце 2 дня для отбора образцов, любой эмбрион, достигший 4клеточной стадии или более поздней, был бы определен как нормальный, тогда как те эмбрионы, которые не смогли достигнуть 4-клеточной стадии, были бы помечены как имеющие блок развития. Эти эмбрионы с блоком развития разделили на категории по стадии развития, на которой у них наступил блок, таким образом, что эмбрион, содержащий всего 2 бластомера, в конце 2 дня был бы проанализирован как 2-клеточный эмбрион с блоком развития. Было уделено внимание исключению эмбрионов, которые, согласно морфологическим признакам, были мертвыми и неполными на момент отбора образцов (например, с дегенерировавшими бластомерами). Только эмбрионы, которые выглядели живыми (в случаях как нормальных, так и с блоком развития), применяли для анализа экспрессии генов. Тем не менее, существует вероятность того, что выглядящие как нормальные во время отбора эмбрионы могут в конечном итоге получить блок развития, если им позволить расти до достижения более поздней стадии. Анализ экспрессии генов для эмбрионов, представляющих каждый из этих классов, проводили путем количественной ОТ-ПЦР. С приблизительно 24-часовыми интервалами эмбрионы отбирали из индивидуальных систем формирования изображений для анализа экспрессии генов с применением высокопроизводительной количественной ОТ-ПЦР с множеством реакций для количественного определения вплоть до 96 генов в 96 образцах. Анализ экспрессии генов проводили в системе Ншйфт Вютагк, в которой возможно одновременное проведение до 9216 реакций ОТ-ПЦР на основе метода ТадМап с нанолитровыми объемами проб.
Результаты.
Для разьяснения молекулярных механизмов, которые могут лежать в основе морфологических явлений, выполнили получение профилей скоррелированной экспрессии генов. В каждом образце было проведено количественное определение уровней экспрессии 96 различных генов, принадлежащих к различным категориям, включая гены домашнего хозяйства, маркеры половых клеток, материнские факторы, маркеры эмбриональной активации генов, маркеры трофобласта, маркеры внутренней клеточной массы, маркеры плюрипотентности, эпигенетические регуляторы, транскрипционные факторы, рецепторы гормонов и другие (табл. 1 на фиг. 19). Два незначительно различающихся, но перекрывающихся, набора генов количественно исследовали в двух различных сериях экспериментов, получив в результате уникальный набор генов, пригодных для диагностирования судьбы эмбриона человека. Уникальные наборы генов были составлены, исходя из данных относительно экспрессии генов у эмбрионов модельных организмов или в эмбриональных стволовых клетках человека, а также на основании наших собственных неопубликованных данных анализа на микрочипах. Состояние экспрессии для этих наборов генов в преимплантационных эмбрионах человека выяснено в данном исследовании впервые.
Значения уровней экспрессии каждого гена относительно референсных генов САРЭН и КРЬРО, а также относительно среднего значения для гена вычисляли с помощью методов де№гт (Е1-Тоикйу Т., е! а1. (2009) Нит Кергой) и ААС! (УаппеЧе Е., е! а1. (2009) №Ц Мей 15:577-83). Значения стабильности гена и коэффициента вариации составили 1,18 и 46% для САРЭН и 1,18 и 34% для КРЬРО, эти показатели наиболее стабильны среди 10 генов домашнего хозяйства, которые были протестированы, и находятся в диапазоне, характерном для типичного набора гетерогенных образцов. В единичных бластомерах, как и ожидалось, количество транскриптов КРЬРО и САРЭН снижалось примерно на значение 1 С! на одно деление в стадиях с 1-клеточной до 8-клеточной в результате деления дробления, а также отсутствия эмбриональной активации генов во время первых 3 дней развития эмбриона человека. Уровень экспрессии этих референсных генов в единичных бластомерах оставался стабильным от 8-клеточной стадии до стадии морулы. На уровне интактного эмбриона значения С! как для КРЬРО, так и для САРЭН оставались в основном постоянными вплоть до развития до стадии морулы. Уровень экспрессии КРЬРО и САРЭН значимо повышался на стадии бластоцисты, скорее всего, из-за увеличения количества присутствующих бластомеров. Эти отклонения не влияли на пригодность КРЬРО и САРЭН в качестве референсных генов.
- 27 025172
Большая часть анализа экспрессии генов, проведенного в данном исследовании, фокусировалась на стадиях развития, предшествующих стадии морулы, когда уровень экспрессии референсных генов был крайне стабилен.
Дифференциальная экспрессия генов у нормальных эмбрионов и эмбрионов с отклонениями от нормы. На фиг. 8 показаны средние уровни экспрессии 52 генов для 6 эмбрионов с отклонениями от нормы (1- и 2-клеточных) и 5 нормальных эмбрионов (1- и 2-клеточных), представленные в виде радиальной диаграммы с логарифмической шкалой. Эмбрионы с блоком развития в общем случае показывали снижение количества мРНК, по сравнению с нормальными эмбрионами, при этом наиболее сильному влиянию подвержены гены, связанные с цитокинезом, процессингом РНК и биогенезом микроРНК. Гены, отмеченные звездочкой, демонстрируют статистически значимое различие (р<0,05) между нормальными эмбрионами и эмбрионами с отклонениями от нормы, согласно критерию Манна-Уитни. Этими 18 генами являются гены кофилина, О1АРН1, ЕСТ2, ΜΥΡΟ, ОССК8, Июег, ТАКВР2, СРЕВ1, симплекина, ΥΒΧ2, ΖΑΚ1, СТИЖ1, ИММТ3В, ТЕКТ, ΥΥ1, 1РОК2, ВТР3 и ИЕЬР. Каждый ген принадлежит к одной из групп, указанных на чертеже, а именно к группе цитокинез: ген кофилина, О1АРН1, ЕСТ2 и МуСь2; биогенез микроРНК: ИОСК8, Эюег и ТАКВР2; процессинг РНК: ΥΒΧ2; материнские факторы: ΖΑΚ1; гены домашнего хозяйства: ΟΙΝΝΒ1; плюрипотентность: ИММТ3В, ТЕКТ и ΥΥ1; рецептор: ЮРК2; и транскрипционный фактор: ВТР3 и ΝΞΡΡ. В большинстве случаев экспрессия этих генов была выше в нормальных 1- и 2-клеточных эмбрионах, чем в 1- и 2-клеточных эмбрионах с блоком развития.
Интересно отметить, что некоторые категории генов были более подвержены влиянию в эмбрионах с отклонениями от нормы, чем другие. Например, у эмбрионов с отклонениями от нормы большинство генов домашнего хозяйства, рецепторов гормонов и материнских факторов не было подвержено существенному изменению их экспрессии, тогда как многие гены, участвующие в цитокинезе и биогенезе микроРНК, демонстрировали существенно сниженную экспрессию. Дополнительно, среди генов, на которые было оказано влияние, некоторые гены демонстрировали намного большее различие между нормальными эмбрионами и эмбрионами с отклонениями от нормы, чем другие. Например, гены, участвующие в путях биогенеза микроРНК, такие как ИОСК8, О1сег и ТАКВР2, проявляли существенно сниженные уровни экспрессии у эмбрионов с отклонениями от нормы. Примечательно, что СРЕВ1 и ген симплекина, два гена, на которые оказывалось наиболее существенное влияние, принадлежали к одному и тому же молекулярному механизму, который регулирует хранение материнских мРНК и реактивацию посредством изменения длины поли(А)-хвоста транскрипта (Вейедо^ба, А. е! а1. (2007) РгоШ. ВюксР 12:3713-3726). Эти данные предполагают, что наличие отклонений от нормы у эмбриона коррелирует с нарушениями у эмбриона программы регуляции мРНК.
Установление корреляции цитокинеза с профилями экспрессии генов.
Анализ экспрессии генов проводили в отношении генов, кодирующих ключевые компоненты цитокинеза. За идентичностью каждого эмбриона следили при помощи установки на стереомикроскоп видеокамеры и видеорегистрации процесса переноса образцов во время смены среды и отбора образцов. При оценке профилей экспрессии генов для эмбрионов с отклонениями от нормы наблюдали сильную корреляцию между аберрантным цитокинезом и низким уровнем экспрессии гена для ключевых компонентов цитокинеза. Интересно отметить, что профили экспрессии генов для эмбрионов с отклонениями от нормы были столь же разнообразны и изменчивы, как и их аберрантные морфологические фенотипы.
Обнаружено, что экспрессия генов цитокинеза варьировала как при сравнении нормальных 2клеточных эмбрионов и 2-клеточных эмбрионов с отклонениями от нормы (фиг. 9), так и при сравнении 4-клеточных эмбрионов - нормальных и с отклонениями от нормы (фиг. 10). На фиг. 9 и 10 показаны относительные уровни экспрессии генов, которые имеют более высокую экспрессию у нормальных 2клеточных эмбрионов (фиг. 9) и нормальных 4-клеточных эмбрионов (фиг. 10), скоррелированные с различными фенотипами цитокинеза. Как показано на фиг. 9, 2-клеточный эмбрион с блоком развития, который демонстрирует аномальное активные перемещения в мембране клетки во время первого цитокинеза, имел существенно сниженный уровень экспрессии всех исследованных генов, регулирующих цитокинез. Гены, демонстрирующие различия на фиг. 9, - это гены аниллина, кофилина, И1АРН1, И1АРН2, ΌΝΜ2, ЕСТ2, МКЬР2, МУСЙ2 и КйоА. Нормальные уровни экспрессии приведены в столбцах справа и, как можно видеть, они выше в случае каждого гена. На приведенных над диаграммой на фиг. 9 фотографиях, демонстрирующих 2-клеточные эмбрионы с отклонениями от нормы, масштабная метка соответствует 50 мкм. На фиг. 10 показаны результаты для 4-клеточного эмбриона с блоком развития, который претерпел аберрантный цитокинез с односторонней бороздой дробления и существенно увеличенной длительностью цитокинеза во время первого деления, и который продемонстрировал снижение экспрессии генов регуляторов цитокинеза аниллина и ЕСТ2. Масштабная метка на фиг. 10 также соответствует 50 мкм.
Типичные для эмбриональных стадий профили экспрессии генов.
На фиг. 11 представлены специфичные для четырех эмбриональных стадий профили (Е88Р), которые были идентифицированы в ходе анализа экспрессии генов у 141 нормально развивающегося единичного эмбриона и единичных бластомеров. Гены, попадающие в каждый из четырех Е88Р, перечислены в
- 28 025172 табл. 2 (фиг. 20). Диаграммы на фиг. 11 были построены путем группировки генов на основании схожих профилей экспрессии и путем усреднения значений их уровней экспрессии (относительно референсных генов). Относительный уровень экспрессии для ΕδδΡ вычисляли путем усреднения уровней экспрессии генов со схожим профилем экспрессии. Уровни экспрессии генов указаны для стадий с различными количествами клеток, т.е. 1с = одноклеточная стадия, М = морула, В = бластоциста. На фиг. 11 относительная экспрессия генов в каждом из четырех ΕδδΡ показана как функция от стадии развития, от 1клеточной (1с) до морулы и бластоцисты. ΕδδΡ1 демонстрирует наследование от матери, ΕδδΡ2 демонстрирует активацию транскрипции генов, ΕδδΡ3 демонстрирует активацию на поздних стадиях и ΕδδΡ4 демонстрирует устойчиво сохраняющиеся транскрипты. Как указано на ΕδδΡ2, в типичном случае точкой осуществления переноса в клиниках по проведению ЭКО является 3 день, когда эмбрионы претерпевают существенные связанные с развитием изменения из-за эмбриональной активации генов. Данные цейтраферной съемки свидетельствуют, что способность к развитию эмбриона можно определить на 4клеточной стадии, тем самым делая возможным более ранний перенос эмбрионов на 2 день и до начала этой активации генов. Данный ранний перенос полезен для улучшения частоты успешного осуществления процедур ЭКО.
В табл. 2 (фиг. 20) перечислены гены, которые принадлежат к каждому из четырех обнаруженных ΕδδΡ. Относительный уровень экспрессии для каждого гена вычисляли относительно референсных генов (СЛРЭН и КРЬРО) и относительно среднего уровня экспрессии генов. Профиль экспрессии каждого гена относительно временной шкалы развития эмбриона следовал одному из следующих четырех ΕδδΡ: профиль ΕδδΡ (1) ранняя стадия: гены, которые сначала имеют высокий уровень, медленно его снижают и полностью прекращают экспрессию до образования бластоцисты; профиль ΕδδΡ (2) средняя стадия: гены, которые активируются после 4-клеточной стадии; профиль ΕδδΡ (3) поздняя стадия: гены, которые активируются на стадии морулы или бластоцисты; и профиль ΕδδΡ (4) постоянно: гены, которые имеют относительно постоянные уровни экспрессии.
ΕδδΡ1 описывает профиль, характерный для генов материнского эффекта. Эти транскрипты сначала имеют высокий уровень экспрессии на стадии зиготы, и в дальнейшем этот уровень снижается по мере развития эмбрионов в бластоцисты. Время полужизни этих транскриптов составляло примерно 21 ч. Классические материнские факторы других модельных организмов, такие как СЭР9 и ΖΑΚ1, а также специфичные для половой клетки (яйцеклетки) гены νΑδΑ и ΌΑΖΕ попадают в эту категорию. ΕδδΡ2 включает активируемые в эмбрионе гены, которые впервые транскрибировались у эмбрионов после 4клеточной стадии. Некоторые гены в этой категории, по-видимому, имеют две волны активации, первую и более слабую на 5- и 6-клеточной стадии и вторую и более сильную на 8-клеточной стадии. Известные гены, подверженные эмбриональной активации генов, у других модельных организмов, такие как ΕΙΡ1ΑΧ31 и ΪΑΚΙΌ1 В32, попадают в эту категорию. ΕδδΡ3 содержал поздно активируемые гены, которые не экспрессировались до стадии бластоцисты, включая маркер трофобласта ^Μ1. ΕδδΡ4 содержал постоянно присутствующие транскрипты, которые сохраняли стабильную экспрессию относительно референсных генов в течение всего развития. Время полужизни продуктов этих генов составляло 193 ч, примерно в 9 раз больше, чем в случае ΕδδΡ1. Данная категория включала смесь генов домашнего хозяйства, транскрипционных факторов, эпигенетических регуляторов, рецепторов гормонов и других. Данные четыре профиля экспрессии генов были подтверждены с еще одной серии экспериментов с применением 61 образца единичных нормальных эмбрионов и бластомеров.
Эмбрионы с отклонениями от нормы, демонстрирующие аберрантное прохождение цитокинеза и митоза во время первых делений, имели корреляцию с содержащими большое количество ошибок профилями экспрессии, особенно в случае генов, участвующих в регуляции эмбриональных РНК. Таким образом, можно объединить данные методологии для получения способов, которые могут быть применены для прогнозирования жизнеспособности преимплантационных эмбрионов. Результаты дают предпосылки считать, что эмбрионы с отклонениями от нормы начинают жизнь с нарушенными программами процессинга РНК и биогенеза микроРНК, что приводит к чрезмерной деградации мРНК материнского эффекта. Стохастическая природа такой нерегулируемой деградации РНК приводит к случайному разрушению транскриптов, что является причиной широкого разнообразия аберрантных фенотипов, наблюдаемых у эмбрионов с отклонениями от нормы. Пониженный уровень микроРНК вызывает нарушения регулируемой деградации мРНК материнского эффекта, вызывая блок развития на различных стадиях.
Анализ индивидуальных бластомеров.
С целью выяснения, когда начинается молекулярная дифференцировка у преимплантационных эмбрионов человека, проанализировали уровень экспрессии СЭХ2 в единичных бластомерах, отобранных у 17 эмбрионов на различных стадиях развития. На фиг. 12а показан относительный уровень экспрессии двух генов, СТВВЫ1 (темные столбцы) и СЭХ2 (светлые столбцы), как функция от стадии развития, от 2-клеточной до бластоцисты. Как можно видеть, СЭХ2 экспрессировался спорадически с низкими уровнями в некоторых единичных бластомерах, взятых у эмбрионов до 4-клеточной стадии (фиг. 12а). Однако, начиная с 6-клеточной стадии и далее, каждый эмбрион содержал по меньшей мере 1 бластомер, в котором СЭХ2 экспрессировался на существенном уровне. Уровень экспрессии гена домашнего хозяйства ΟΤΝΝΒ1, также показанный на фиг. 12а, оставался постоянным между бластомерами из одного и
- 29 025172 того же эмбриона, что свидетельствует о том, что гетерогенный профиль экспрессии СЭХ2 не был артефактом количественной ПЦР. Данные независимого эксперимента демонстрируют схожие наблюдения. Эти результаты свидетельствуют, что молекулярная дифференцировка в преимплантационных эмбрионах человека может происходить очень рано - непосредственно после 4-клеточной стадии.
Интересно отметить, что проверка профилей экспрессии генов в единичных бластомерах выявила эмбрионы, которые содержали бластомеры с характером экспрессии генов, соответствующим различным возрастам развития. Профиль экспрессии гена любого данного эмбриона в любое данное время равняется сумме деградации мРНК материнского эффекта и эмбриональной активации генов. Более молодой бластомер с более ранним возрастом развития в типичном случае содержит большое количество транскриптов материнского эффекта и малое количество продуктов генов зиготы, и обратная ситуация характерна для более старшего бластомера с более продвинутым возрастом развития. В данном эксперименте материнскую программу определяли как средние значения экспрессии для 10 маркеров ЕЗЗР1 (материнских транскриптов), и эмбриональную программу -как средние значения экспрессии 10 маркеров ЕЗЗР2 (эмбриональные транскрипты). Применяемая панель материнских транскриптов включает ΌΑΖΕ, ΟΌΡ3, 1Р1ТМ1, БТЕЕЬАК, ЭТСР3, νΑδΑ, ΟΌΡ9, РИСИ5, ΖΑΚ1 и ΖР1, тогда как панель эмбриональных генов включает ΑΤΡ7IР, ^ΝΑ1, Е1Р1 АХ, ΕIΡ4Α3, Η2ΑΕΖ, НЗР70.1, ΪΑΚΙΌ1 В, ЬЗМ3, РАВРС1 и ЗΕКΤΑ^1. Из 6 бластомеров, успешно отобранных из данного конкретного 8-клеточного эмбриона, 3 бластомера демонстрировали характерные особенности экспрессии генов, схожие с бластомерами из образца нормального 3-клеточного эмбриона, тогда как другие 3 бластомера были схожи с бластомерами из образца нормального 8-клеточного эмбриона (фиг. 12Ь). Наиболее вероятным объяснением данного наблюдения является блок развития подпопуляции клеток в составе эмбриона. Данный фенотип частичного блока развития также наблюдали среди исследованных образцов у еще одного 9-клеточного эмбриона и у 2 морул. Тот факт, что уровень материнских транскриптов сохранялся высоким в бластомерах с блоком развития, которые провели такое же количество времени в культуре, как и их нормальные сестринские клетки, указывает на то, что деградация материнских РНК не является спонтанным процессом, который просто имеет место с течением времени, но, что наиболее вероятно, требует функционирования специфичных механизмов деградации РНК, таких как механизмы с участием микроРНК. Эти данные также обеспечивают дополнительное доказательство того, что деградация материнских мРНК является консервативным явлением в ходе развития при эмбриогенезе млекопитающих и является необходимой для нормального развития эмбриона (Вейедо^Ьа, Α., с1 а1. (2008) Кергой. Регй1. Эсу. 20:45-53). Кроме того, эти данные предполагают, что индивидуальные бластомеры в составе эмбриона являются автономными и могут развиваться независимо друг от друга. Дополнительно, полеченные результаты свидетельствуют, что можно применять исследования уровней экспрессии генов, описанные в этом документе, для определения уровня мРНК (что является показателем уровня экспрессии гена) в исследуемой клетке, где РНК принадлежит гену, о котором известно, что он является частью материнской программы, и тогда сохраняемость такого уровня экспрессии на более поздней стадии развития эмбриона коррелирует с вероятностью исхода с отклонениями от нормы, или он является частью эмбриональной программы, и тогда отсутствие с течением времени является признаком вероятности исхода с отклонениями от нормы. Исследованными в данной работе генами материнской программы являются ΖΑΚ1, РИСИ5, ΝΕΚΓ5, Н5Р1, ΟΌΡ9 и ΒNС2. Известны и могут применяться и другие гены материнского эффекта.
Эмбриональная активация генов.
Настоящие способы, по меньшей мере, частично основаны на наблюдениях, свидетельствующих, что отклоняющиеся от нормы эмбрионы с блоком развития часто демонстрируют аберрантный цитокинез и хронометраж митоза во время первых трех делений перед эмбриональной активацией генов ^ΟΑ). Это предполагает, что судьба развития эмбриона в основном определяется материнской наследственностью, и этот результат в значительной степени согласуется с математической моделью преимплантационного развития человека, предложенной Харди (Нагйу) с соавторами в 200134 г. Более того, аномалии цитоскелета и митоза сильно коррелируют с пониженными уровнями материнских транскриптов генов, которые регулируют биогенез микроРНК и маскирование, хранение и реактивацию материнских мРНК. МикроРНК регулируют трансляцию, способствуя деградации мРНК в ходе различных биологических процессов, включая развитие и дифференцировку организма (В1ака|, Α. & Ын. Н. (2008) ΐ. Βίο1. СЬет. 283:9505-9508; ЗйГат, Ο. & 81аск, Р.к (2008) Ναι. Кеу. Мо1. Се11 Βίο1. 9:219-230). Растущий массив доказательств, полученных на модельных организмах, демонстрирует, что микроРНК могут являться ключевыми регуляторами деградации материнских транскриптов в эмбрионах на ранних стадиях (Βейедο№Йа, Α., е1 а1. (2008) Кергой. РегЫ. Иеу. 20:45-53). Таким образом, нарушения биогенеза микроРНК, вероятно, будут приводить к развитию эмбрионов с отклонениями от нормы. С другой стороны, невозможность должным образом регулировать материнские мРНК также может приводить к неправильному эмбриогенезу. Яйцеклетки млекопитающих синтезируют большой набор материнских РНК-транскриптов, необходимых для поддержания роста эмбриона на ранних стадиях, еще до рождения самой матери. Эти транскрипты репрессированы и сохраняются в течение длительного периода времени, до их реактивации после оплодотворения. Нарушения программы регуляции материнских РНК, вероятно, будет влиять на количество и качество материнских транскриптов и, таким образом, подвергать риску шанс на успешное
- 30 025172 развитие.
Модель для оценки жизнеспособности эмбриона.
На фиг. 13 приведена модель развития эмбриона человека, основанная на скоррелированных подходах визуализации и молекулярном анализе. Показана временная шкала развития от зиготы до бластоцисты, включая короткие периоды, критичные для прогнозирования успешного развития в бластоцисту, и диаграмма развития эмбриона. Ключевые молекулярные данные, нанесенные на диаграмму, свидетельствуют, что эмбрион человека начинает жизнь с характерным набором РНК яйцеклетки, которые унаследованы от матери. Этот набор РНК сохраняется и должным образом упакован с помощью типичной программы регуляции РНК в яйцеклетке. После оплодотворения подгруппа материнских мРНК, типичных для яйцеклетки (Ε88Ρ1; типичный эмбриональной стадии профиль 1), должна быть деградирована, когда начинается переход от яйцеклетки к эмбриону. Параллельно этому, другие РНК в идеальном случае равномерно распределяются в каждый бластомер в ходе продолжения развития (Ε88Ρ4). Успешная деградация и распределение РНК завершается эмбриональной активацией генов (Ε0Α) и транскрипцией генов из Ε88Ρ2 в клетке в автономном режиме. Следует отметить, что во время делений дробления бластомеры эмбриона могут претерпевать блок развития или прогрессировать независимо друг от друга. Результатом автономного развития клеток в эмбрионе является то, что индивидуальные бластомеры могут претерпевать блок развития или прогрессировать, и когда 8-клеточный эмбрион прогрессирует до стадии морулы и далее, на качество бластоцисты будет влиять количество клеток, которые находятся в блоке развития или прогрессируют после 8-клеточной стадии. Данные визуализации демонстрируют, что имеются критические периоды развития, которые прогнозируют успех или неудачу: первый цитокинез, второе деление дробления и синхронность второго и третьего делений дробления. Эти параметры можно измерять автоматически, с применением алгоритмов слежения за клетками и программного обеспечения, описанных ранее. Описанные системы и способы могут быть применены для диагностики исхода развития эмбриона по ключевым прогностическим параметрам визуализации и могут позволить переносить меньшее количество эмбрионов на более ранних стадиях развития (до эмбриональной активации генов).
Пример 3. Визуализация созревания яйцеклетки и последующего развития эмбриона.
Результаты.
Одним из основных ограничений, применяемых в настоящее время методик ЭКО, является качество и доступность яйцеклеток. Например, в современных протоколах ЭКО используют яйцеклетки, созревшые в небольшом пуле, соответствующему одному циклу, что, в свою очередь, приводит к малому количеству яйцеклеток (например, 1-20) для оплодотворения. Более того, примерно 20% яйцеклеток, извлеченных после гормональной стимуляции в ходе процедур ЭКО, классифицируют как незрелые, и их обычно отбраковывают из-за сниженной способности к эмбриональному развитию в применяемых сейчас условиях культивирования.
Одним из способов увеличения пула яйцеклеток является созревание ίη νίίτο. На фиг. 14 показаны три стадии развития в ходе созревания ίη νίίτο, включая зародышевый пузырек, метафазу I и метафазу II. Стадии зародышевого пузырька и метафазы Ι классифицируют как незрелые яйцеклетки, тогда как стадию метафазы II классифицируют как зрелые яйцеклетки на основании присутствия первого полярного тельца, которое появляется через 24-48 ч после инициации созревания. На фиг. 15 показано развитие яйцеклетки, которая созревала ίη νίίτο.
Еще один способ увеличения пула яйцеклеток состоит в привлечении яйцеклеток из первичного и вторичного пула, что дает вплоть до нескольких тысяч яйцеклеток. В этой методике покоящиеся фолликулы извлекают из яичника и программируют ίη νίίτο для выработки яйцеклеток с нормальным хромосомным набором, эпигенетическим статусом, экспрессией РНК и морфологией. В соответствии с другим вариантом, яйцеклетки могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток, дифференцированных ίη νίίτο в половые клетки и созревших в яйцеклетки человека.
Как показано на фиг. 14, процесс созревания яйцеклетки ίη νίίτο отмечен несколькими клеточными изменениями, что можно применять для определения клеточных параметров, измерения и анализа при реализации способов по настоящему изобретению. Сюда относятся, например, изменения морфологии мембраны яйцеклетки, например скорость и степень отделения от блестящей оболочки; изменения морфологии ядра яйцеклетки, например начало, завершение и скорость разрушения зародышевого пузырька (0УВИ); скорость и направление движения гранул в цитоплазме и ядре; и движение и экструзия первого полярного тельца.
Пример 4. Визуализация дифференцировки стволовой клетки.
Результаты.
Анализ цейтраферных изображений также можно применять для оценки жизнеспособности, способности к развитию и выхода других типов клеток, таких как стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ίΡ80) и эмбриональные стволовые клетки человека (1ιΕ8ί'.'). Способность стволовых клеток к развитию можно оценивать с применением анализа цейтраферных изображений для измерения изменений морфологии в ходе развития и дифференцировки клетки (фиг. 17). После этого дифференцированные клетки могут быть проанализированы и отобраны для трансплантации ίη νίνο или для другого применения. Несколько параметров стволовых клеток могут быть выделены и проанализи- 31 025172 рованы на основании данных цейтраферных изображений, такие как длительность цитокинеза, время между явлениями митоза, размер и форма клетки, количество клеток, движение клеток, особенности деления, дифференцировка, асимметричное деление (когда одна дочерняя клетка остается стволовой клеткой, а другая дифференцируется), симметричное деление (когда обе дочерние клетки либо остаются стволовыми клетками, либо дифференцируются) и определение судьбы (точно предопределяющее, когда стволовая клетка дифференцируется).
Основным постулатом терапии с применением стволовых клеток является то, что недифференцированные стволовые клетки можно культивировать ίη νίΐτο. дифференцировать их до специфичных типов клеток и в дальнейшем трансплантировать реципиенту для регенерации нарушенных тканей и/или органов. Анализ цейтраферных изображений можно применять в виде высокопроизводительного неинвазивного устройства для идентификации стволовых клеток, которые дают неканцерогенных дифференцированных потомков, способных интегрироваться в зрелые ткани. Возможное применение включает лечение неврологических нарушений, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, нарушений сосудистой системы и заболеваний сердца, нарушений мышц и костей, таких как артрит, аутоиммунных заболеваний и онкологических заболеваний, а также для обнаружения лекарственных средств путем оценки мишеней и новых лекарственных препаратов.
У человека поврежденные ткани в общем случае замещаются путем непрерывного привлечения и дифференцировки стволовых клеток в организме. Однако способность организма к регенерации с возрастом снижается. Одним из примеров этого является недержание мочи в результате недостаточности функции сфинктера. Считается, что старение является одной из основных причин недостаточности функции сфинктера из-за того, что количество мышечных волокон и плотность иннервации с возрастом снижаются. Для лечения пациентов с недержанием могут быть получены 1Р8С из культуры фибробластов, полученной из тканей стенки влагалища, с целью продукции дифференцированных гладкомышечных клеток. Эти дифференцированные клетки после этого можно трансплантировать ίη νίνο. Перед трансплантацией можно применить анализ цейтраферных изображений для охарактеризования 1Р8С в отношении их плюрипотентности, дифференцировки, метилирования и канцерогенности. Другие применения включают цейтраферную съемку 1Р8С, полученных из клеток кожи пациентов с болезнью Паркинсона и дифференцированных в нейроны для трансплантации (фиг. 18).
Пример 5. Проверка достоверности параметров визуализации посредством автоматизированного анализа.
Как это очевидно из наших данных анализа цейтраферных снимков, развитие эмбриона человека является очень изменчивым процессом при сравнении эмбрионов в группе, и эмбрионы могут демонстрировать широкий диапазон особенностей поведения в ходе клеточного деления. Таким образом, определение параметров в ручном режиме для определенных явлений развития, таких как длительность в высокой степени отклоняющегося от нормы цитокинеза (фиг. 4), может быть предметом неоднозначной интерпретации. Для подтверждения достоверности применяемых нами параметров визуализации и способности систематически прогнозировать образование бластоцисты мы разработали алгоритм для автоматического слежения за делениями клеток вплоть до 4-клеточной стадии. В нашем алгоритме слежения применена методика оценки вероятностных моделей, основанная на поэтапном применении методов Монте-Карло. Данная методика работает путем генерирования распределений предложенных гипотезой моделей эмбрионов, моделирования изображений на основании простой оптической модели и сравнения этих смоделированных изображений с данными наблюдаемых изображений (фиг. 21а).
Эмбрионы моделировали в виде эллипсов, обладающих положением, ориентацией и индексом перекрывания (представляющим относительную высоту клеток). Применяя такие модели, можно выделять длительность цитокинеза и время между митозами. Цитокинез в типичном случае определяют от первого появления борозды дробления (при этом биполярные вдавливания образуются вдоль оси дробления) вплоть до полного разделения дочерних клеток. Мы упростили задачу, аппроксимировав цитокинез как длительность удлинения клетки перед разделением 1 клетки на 2 клетки. Клетка рассматривается как удлиненная, если различие между длинами осей превышает 15% (значение выбрано эмпирически). Время между митозами выделяют простым подсчетом количества клеток в каждой модели.
Мы проверили наш алгоритм на группе из 14 эмбрионов человека (фиг. 21Ь) и сравнили автоматизированные измерения с анализом изображений в ручном режиме (фиг. 21с, фиг. 21ά). В этом наборе данных 8 из 14 эмбрионов достигли стадии бластоцисты с хорошей морфологией (фиг. 21е, вверху). Результаты автоматизированных измерений в существенной степени соответствовали результатам измерений в ручном режиме, и было правильно спрогнозировано для всех 8 эмбрионов, что они достигнут стадии бластоцисты. 2 из 14 эмбрионов достигли стадии бластоцисты с плохой морфологией (низким качеством внутренней клеточной массы; фиг. 21е, внизу). Для этих эмбрионов оценка в ручном режиме показала, что 1 достиг бы стадии бластоцисты и 1 претерпел бы блок развития, тогда как автоматизированная оценка спрогнозировала, что оба претерпели бы блок развития. Наконец, 4 из 14 эмбрионов претерпели блок развития до стадии бластоцисты, и для всех них блок развития был спрогнозирован правильно в случае обоих способов.
- 32 025172
Рамка фильтра частиц.
Фильтр частиц - это методика оценки моделей, основанная на моделировании по методу МонтеКарло. Его применяют для оценки неизвестных, или скрытых, моделей путем генерирования распределений предложенных гипотезой моделей и сравнения этих моделей с наблюдаемыми данными. Способность приспосабливаться к случайной динамике движения и неопределенностям измерения делает его идеальным кандидатом для слежения за делениями клеток.
Фильтр частиц следит за развитием с течением времени трех основных переменных: состояние х, контроль и и показатель ζ. Переменная состояния х - это модель эмбриона, которую мы хотим оценить, и которая представляет собой набор эллипсов (для двумерного изображения) или эллипсоидов (для трехмерного изображения). Переменная контроля и - это входной сигнал, который трансформирует переменную состояния, и она состоит из нашей модели развития и деления клеток. Переменная показателя ζ - это наблюдение состояния, и она состоит из полученных нами путем цейтраферной микроскопии изображений. Эти параметры описаны более подробно в следующих разделах.
Оценка каждого текущего состояния х на каждом временном этапе ΐ представлена распределением апостериорной вероятности. Данную апостериорную вероятность часто называют мерой доверия и определяют как условную вероятность текущего состояния х1, с учетом показателей всех предшествующих изображений ζ1:Ι и предшествующих контролей и1:1.
Фильтр частиц аппроксимирует апостериорную вероятность к набору взвешенных образцов, или частиц, обозначенных как
где М - это количество частиц. Термины частицы и модели эмбриона используются в этом документе как взаимозаменяемые. Таким образом, единичная частица х1|т| (где 1<т<М) - это одна гипотеза модели эмбриона во временной точке ΐ.
После инициализации фильтр частиц постоянно повторяет три этапа. Первый этап - это предсказание, при этом каждая частица развивается под воздействием контрольного входного сигнала
Полученный в результате набор частиц является аппроксимацией априорной вероятности. Второй этап - это обновление показателя, при этом каждой частице приписывают весовой коэффициент значимости, соответствующий вероятности текущего показателя ν™ =ρ(Ζί|χ™)
Полученный в результате набор взвешенных частиц является аппроксимацией апостериорной вероятности Ье1(х1).
Ключевой компонент фильтра частиц задействуют на третьем этапе, когда набор частиц подвергают процедуре повторного взятия выборки в соответствии с их весами. Этот этап повторного взятия выборки смещает распределение частиц в область наибольшей вероятности.
Изображение клеток.
Клетки представлены в виде эллипсов в двумерном пространстве. У каждой клетки есть большая ось, малая ось и положение в двумерном пространстве в декартовых координатах, заданные равенством (% - х0)2 (у ~ у0)2 а2 Ь2
Каждый эллипс также обладает направлением курса 6 (поворот в горизонтальной плоскости), что позволяет ему вращаться в плоскости х-у. Так как эллипсы практически всегда перекрываются друг с другом, мы также задали индекс перекрывания Ь, который определяет порядок перекрывания (или относительную высоту клеток). Следовательно, параметры для каждой модели эмбриона во временной точке ΐ задаются как
где N - это количество клеток в данной модели.
Возмущение и деление клеток.
Первый этап фильтра частиц - это предсказание, при этом каждая частица развивается под воздействием контрольного входного сигнала. В случае нашего применения имеется два типа поведения, которые мы хотим смоделировать. Первый тип поведения включает движение клетки, что включает смеще- 33 025172 ние, вращение в пределах угла рыскания и изменения длины большой и малой осей. Второй тип поведения - это деление клетки, при этом клетка разделяется на две новые клетки.
Для моделирования движения клетки заданный нами контрольный входной сигнал выбирает частицу и случайным образом вызывает возмущение каждого значения для каждой клетки: χ0ι, у01, а;, Ь;, 0!. Возмущение случайным образом выбирают из нормального распределения с относительно маленькой дисперсией (в типичном случае установленной на 5% от начальных значений).
Для моделирования деления клеток мы применяем следующий подход. В данной временной точке для каждой частицы мы назначаем 50% вероятность того, что одна из клеток буде делиться. Это значение было выбрано эмпирически и охватывает широкий диапазон возможных делений клеток, при этом сохраняя хорошее покрытие текущей конфигурации. Если предсказано деление, то делящуюся клетку выбирают случайным образом. Более усложненная модель могла бы учитывать дополнительные факторы, такие как количество клеток в частице и историю их характера деления, и потенциально можно создать модель, основанную на наблюдаемом поведении, согласно реально полученным данным.
Когда выбрана клетка, которая будет делиться, применяют симметричное деление вдоль большой оси эллипса, с образованием двух дочерних клеток одинакового размера и формы. После этого каждое значение показателей для дочерних клеток случайным образом подвергают возмущающему воздействию. Возмущение опять выбирают из нормального распределения, но с большей дисперсией (10% от начальных значений), чтобы учесть большую изменчивость форм новых клеток. Наконец, индексы перекрывания двух дочерних клеток выбирают случайным образом, при этом сохраняя их суммарное перекрывание относительно остальных клеток.
Моделирование изображения.
После применения контрольного входного сигнала к каждой частице, представительство частиц необходимо конвертировать в модельное изображение, которое можно сравнить с реальными изображениями. Точное моделирование изображения может быть сложной задачей, и часто требуется применение методик прослеживания прохождения лучей и оптических моделей. Не пытаясь смоделировать реалистичные изображения, способ по настоящему изобретению фокусируется на моделировании характеристик, которые легко идентифицировать на изображениях. А именно моделируются изображения клеточных мембран.
Следует учитывать два физических наблюдения. Первое, хотя микроскоп фокусируют на единичной плоскости в пределах эмбриона, глубина поля достаточно велика и несфокусированный свет собирается практически со всего эмбриона. И второе, эмбрионы частично прозрачны, что означает, что мембраны клеток на нижней части эмбриона иногда (но не всегда) могут быть видны через клетки в верхней части эмбриона.
Учитывая эти физические наблюдения, опишем теперь модель моделирования изображения. Для каждой клетки ее соответствующую эллиптическую форму проецируют на моделируемое изображение, применяя индекс перекрывания Б. Соответствующие значения пикселей установлены на бинарное значение 1, и они расширены для отображения толщины мембраны, сопоставимой с данными изображений, полученных при наблюдении. Индекс перекрывания Б определяет порядок, в котором клетки расположены друг над другом. Так как скрытые от взгляда клеточные мембраны видны только иногда, если обнаруживают скрытые от взгляда точки, их наносят на модельное изображение с низкой вероятностью (в типичном случае примерно 10%). На практике обнаружено, что хотя эти точки невидимых взгляду мембран необходимы для точного моделирования формы, важно делать их в достаточной степени редкими, так, чтобы они не напоминали видимый край.
Предварительная обработка изображения.
Здесь будет дано описание переменной показателя ζ. Целью способа по настоящему изобретению является выделение бинарных изображений клеточных мембран из микроскопических изображений для сравнения с модельными изображениями. Эти мембраны демонстрируют высокую степень кривизны и высокий контраст, но их нелегко выделить с применением методик пороговой бинаризации на основании интенсивности или цвета. Соответственно применяют детектор, основанный на главных кривизнах. В данном способе применяют оператор Гессе
где Ιχχ, 1ху и 1уу - это частные производные второго порядка, оцененные в положении пиксела 8 и Гауссовом масштабируемом пространстве σ. Собственные значения матрицы Гессе 2x2 дают информацию о главных кривизнах, тогда как знаки собственных значений отличают впадины от выступов 43. Для обнаружения выраженных пиков или выступов вычисляют главную кривизну в каждом пикселе следующим образом:
где λ2 - это минимальное собственное значение. Для обнаружения мембран с варьирующей толщиной применяют оператор Гессе на интервале масштабируемых пространств (т.е. σιηίη<σ<σιη3χ) и выде- 34 025172 ляют максимальную кривизну в этом диапазоне. Наконец, Гессианское изображение подвергают пороговой бинаризации для создания бинарного изображения выделенных клеточных мембран. Пороговый уровень обычно устанавливают равным двум стандартным отклонениям значений пикселей на Гессианском изображении.
Веса частиц.
Как описано в разделе, озаглавленном Рамка фильтра частиц, вторым главным этапом фильтра частиц является обновление показателя, при этом частицам приписывают весовой коэффициент значимости, соответствующий вероятности текущего показателя с учетом конкретной модели. В нашем случае весовой коэффициент значимости определяют сравнением микроскопического изображения до обработки, обсужденной выше, с модельным изображением, также обсужденным выше.
Данная проблемы была исследована ранее, при этом веса для фильтра частиц вычисляли путем сравнения модельных изображений с фактическими изображениями с применением нормированной взаимной информации. Этот подход схож с идеей совмещения сеток занятости, при которой ищут расположение пикселей, которые либо оба заняты (значение 1), либо оба свободны (значение 0). Эти способы могут вызывать трудности, когда модельное и фактическое изображения схожи по форме, но немного смещены. В противоположность этому, описываемый способ применяет функцию вероятности, основанную на размере диагонального сопряжения, которое измеряет среднее значение наименьших расстояний от одного набора точек до другого. Задают два набора точек - А (в виде набора действительных чисел размера т) и В (в виде набора действительных чисел размера η), соответствующие ненулевым пикселам на модельном и фактическом изображениях соответственно. Прямой размер диагонального сопряжения от набора точек А до набора точек В задают как κΑδΙΗ-М α,£Λ
Обратный размер диагонального сопряжения задают схожим образом. В данном способе применяют симметричный размер диагонального сопряжения, что обеспечивает меру того, насколько хорошо модельное изображение совмещается с фактическим изображением, а также того, насколько хорошо фактическое изображение совмещается с модельным изображением
На практике единичные показатели расстояния отсекают для снижения влияния шума. С целью уменьшения времени вычислений расстояния определяют путем поиска мест расположения пикселей в преобразованиях расстояний для изображений.
Размер диагонального сопряжения применяют как меру вероятности того, что наши показатели данных соответствуют оцениваемой модели. То есть во временной точке ί, для данного показателя ζί изображения и х![т] модели частицы, весовой коэффициент значимости частицы задают как
Константу А в типичном случае устанавливают равной 1, и это значение можно варьировать для осуществления контроля за сглаженностью распределения вероятности.
Повторное взятие выборки частиц и динамическое распределение.
Третий этап фильтра частиц - это повторное взятие выборки, при котором частицы отбирают пропорционально их весу для создания нового набора частиц. Частицы с низкой вероятностью отбрасываются, а частицы с высокой вероятностью умножаются. Был проведен большой объем предварительных работ по разработке эффективных алгоритмов для повторного взятия выборки. В настоящем способе применяют подход с низкой дисперсией.
Важной проблемой в случае фильтров частиц является выбор количества частиц. Самое простое решение - применять фиксированное значение, например М=1000. После этого на каждом этапе набор из М частиц трансформируют в другой набор такого же размера. В контексте данной заявки, могут присутствовать относительно длинные периоды времени, в течение которых клетки неактивны или лишь незначительно меняют размер и положение. Это наблюдение применяют для снижения нагрузки по обработке данных путем динамического распределения количества частиц в соответствии с количественными показателями клеточной активности. То есть, когда клетки активны и делятся, количество частиц повышают, а когда клетки неактивны, количество частиц снижают.
Для измерения активности клеток вычисляют разницу суммы квадратов интенсивностей пикселей между новым изображением (полученным с применением микроскопа) и предыдущим изображением. Для уменьшения шума изображения сначала сглаживают с помощью фильтра Гаусса и значение разницы суммы квадратов сглаживают с течением времени с применением причинного скользящего среднего. После этого количество частиц динамически регулируют пропорционально данному значению и отсекают, например, в пределах 100<М<1000. На фиг. 30 представлен график, демонстрирующий, как количество частиц может быть распределено для эмбриона, проходящего деления от 1-клеточной до 4клеточной стадии. Следует отметить, что данный способ всего лишь дает меру количества активности
- 35 025172 на изображении, но не делает различия между клеточным делением и движением эмбриона (смещением и/или вращением), так как не проводилась регистрация предыдущего изображения. В такой ситуации (определения количества частиц) это приемлемо, так как количество частиц должно увеличиваться в любом случае. На практике мы также регулировали количество частиц на основании количества клеток в наиболее вероятной модели эмбриона. То есть, большее количество частиц генерируется, когда на изображении присутствует, как полагают, большее количество клеток.
Ограничения слежения в двумерном пространстве.
Алгоритм слежения за клетками в двумерном пространстве, описанный выше, полезен для определения количества клеток в эмбрионе, а также их двумерных форм. Однако он ограничен тем фактом, что в его основе отсутствует физическое представление. Это может быть важно или неважно для автоматического слежения за клеточным делением с целью оценки жизнеспособности эмбрионов. Например, некоторые параметры, такие как длительность цитокинеза и время между клеточными делениями, можно измерить с применением алгоритма слежения за клетками в двумерном пространстве. В следующем разделе мы расширим нашу двумерную модель до трехмерной. Для учета случаев заграждения и неопределенности глубины, которые возникают при оценке форм трехмерных объектов по двумерным изображениям, применяли пространственные ограничения и ограничения в отношении сохранения объема клетки.
Представление клеток и слежение в трехмерном пространстве.
В данном разделе описан алгоритм слежения за клеточным делением в трехмерном пространстве. Многие этапы алгоритма для двумерного пространства перенесены в данный алгоритм, за несколькими ключевыми исключениями. Предложено новое представление клетки для применения в трехмерном пространстве. Теперь клетки представлены в виде эллипсоидов в трехмерном пространстве, задаваемых равенством (* - *о)г , (У - Уо)2 (ζ - ζ0)2 = а2 Ь2 с2
Каждый эллипсоид также обладает направлением курса θ, наклоном ψ и вращением α. Таким образом, представление каждой модели эмбриона во временной точке ΐ задается как
Уо, ΖΟι «1 С1 01 Ψΐ «ι'
*02 Уо2 ζ02 а2 с2 02 ψ2 α2
-Χ°Ν Уом αΝ ь» ск ΘΝ Ψν «Λί.
Одним важным влиянием этой пересмотренной модели является то, что могут существовать неоднозначности, связанные с определением трехмерных форм по двумерным изображениям. Например, клетка, имеющая сферическую форму, выглядела бы одинаково с клеткой, имеющей более длинную большую ось и больший угол наклона. Это не главная проблема, поскольку как будет показано позже, распределение частиц будет сохранять эти множественные гипотезы до тех пор, пока доступно достаточно информации для различения (например, о таком явлении, как клеточное деление).
Эллипсоиды считают жесткими, т.е. деформацию при моделировании не учитывают явно. Однако мы допускали небольшое перекрывание между соседними эллипсоидами, и предполагали, что в этих областях перекрывания границы клеток становятся прямыми при взаимодействии друг с другом. Это важное соображение, так как эта ситуация стандартно наблюдается в эмбрионах, и мы объясняем это в последующих разделах.
Возмущение и деление клеток.
Наши трехмерная модель клеточного деления и возмущения схожа с моделью из разд. 4, Возмущение и деление клеток, кроме нескольких ключевых исключений. Можно применять расчет трехмерной формы для обеспечения сохранения объема. Это не дает клетке расти до произвольно большого размера, в частности, в направлении оси ζ. Сохранение объема применяют в двух ситуациях. Во-первых, в случае возмущения клеток, оси а и Ь изменяются, и с вычисляют так, чтобы объем оставался постоянным для данной единичной клетки. Во-вторых, в случае клеточного деления, применяют следующее ограничение:
где нижний индекс р обозначает родительскую клетку, а нижние индексы ά1 и ά2 обозначают две дочерние клетки. На практике мы допускали незначительное нарушение этих ограничений, позволяя суммарному объему эмбриона флуктуировать в диапазоне ±5% от начального объема. Это применялось для компенсации возможных неточностей в оценке начального объема.
Когда выбрана клетка, которая будет делиться в трехмерном пространстве, ее деление моделируют следующим образом. Во-первых, для выбранной единичной клетки, применяют случай деления вдоль длинной оси эллипса, которая может быть любой из осей а, Ь или с, в зависимости от конфигурации. Дочерние клетки инициализируют так, чтобы они были равными по размеру и равноотстоящими, с учетом
- 36 025172 вращения родительской клетки. После этого их параметры подвергают возмущающему воздействию так, чтобы охватить широкий диапазон возможных конфигураций, снова применяя нормальное распределение с дисперсией, установленной как 10% от начальных значений.
Пространственные ограничения.
Проблемы, касающиеся заграждения и неопределенности глубины частично смягчают при помощи сохранения объема. Однако также необходимы ограничения, затрагивающие пространственные взаимосвязи соседних эллипсоидов. Первым ограничением является то, что клеткам запрещено перекрываться более чем на 20% их радиуса. Для клеток, которые перекрываются в допустимой степени, делают предположение, что их границы становятся прямыми при взаимодействии друг с другом. В описываемой модели частицы данное явление представлено посредством игнорирования точек внутри пересекающихся эллипсоидов во время моделирования изображения. Причиной этого были эмпирические данные, и этот подход хорошо коррелирует с физически наблюдаемым поведением.
Второе накладываемое ограничение заключается в том, что клетки сохраняются в непосредственной близости. Данное ограничение напрямую связано с физическим поведением эмбрионов человека, где клетки ограничены мембраной, называемой блестящей оболочкой (ζοηα ре11ис1Йа). Эту зону моделируют в виде сферической оболочки и используют ее для наложения граничных условий. Радиус зоны устанавливают на 30% больше, чем радиус 1-клеточного эмбриона.
Данные ограничения накладывают следующим образом. К каждой частице в данной временной точке применяют случайно выбранный контрольный входной сигнал с получением новой частицы, как обсуждалось выше. Если какое-либо из физических ограничений было нарушено, новую частицу отбраковывают и применяют новый случайно выбранный контрольный входной сигнал. Если после определенного количества попыток не было получено удовлетворительной новой частицы, то такую частицу отбраковывают.
Моделирование изображения.
Преимущество темнопольного освещения, применяемого в данных примерах, состоит в том, что клеточные мембраны более интенсивно рассеивают свет, чем внутреннее содержимое клетки. Этот эффект особенно явно выражен в областях, где клеточные мембраны расположены параллельно оптической оси (оси ζ). Соответственно для моделирования изображений в наших трехмерных моделях ищут эти области, которые не обязательно расположены на экваторах эллипсоидов из-за их вращения. После этого применяют те же правила в отношении видимых и скрытых от взгляда краев, как обсуждается выше.
Пример слежения за клетками в двумерном пространстве.
Данный пример относится к автоматизированной клеточной микроскопии и в нем применяют описанный выше алгоритм слежения за клеточным делением в двумерном пространстве. Данная модель создана для слежения за количеством клеток на изображении, а также среди двумерных контуров клеточных мембран. Первым этапом является получение изображения, которое служит предпосылкой для выполнения последующих разделов, таких как моделирование изображения и предварительная обработка изображения. Последовательности цейтраферных изображений для данного примера получали с применением изготовленного на заказ инвертированного микроскопа О1утри8 ΙΧ-50 с 10Х объективом. Микроскоп модифицирован для темнопольного освещения, при котором полый конус света фокусируется на образце путем помещения круглой апертуры между источником света и линзой конденсора. Линза объектива собирает свет, который рассеян образцом, и отбрасывает проходящий напрямую свет, давая в результате яркое изображение на темном фоне. Преимущество темнопольного освещения состоит в том, что клеточные мембраны склонны к рассеянию света в большей степени, чем внутреннее содержимое клеток, таким образом, усиливая свою контрастность. Микроскоп оборудован нагревательной платформой и изготовленной на заказ камерой для того, чтобы можно было культивировать эмбрионы в течение периода вплоть до 5 или 6 дня. Изображения захватывали с 5-минутными интервалами с применением цифровой камеры О1утри8 8ЬК, смонтированной на боковом порте микроскопа ΙΧ-50.
Визуализацию эмбрионов начали, когда они находились на стадии зиготы, или оплодотворенной яйцеклетки, и имели сферическую форму. Для инициализации набора частиц провели расчеты пороговой бинаризации Гессианских изображений, как описано в разделе 6, Предварительная обработка изображения, и вписали в него окружность, применяя метод наименьших квадратов. После этого инициализировали все частицы в виде окружностей со случайными ориентациями, выбранными из однородного распределения.
На фиг. 31 показан результат применения двумерного алгоритма для слежения за клеточным делением от 1-клеточной до 4-клеточной стадии. Результаты демонстрируют, что клеточные мембраны успешно выделены с помощью алгоритма, даже в случае клеток, расположенных ближе к нижней части, которые частично скрыты от взгляда. Следует отметить, что в большинстве прикладных задач для фильтра частиц единственная наилучшая модель представлена в виде взвешенной суммы параметров состояния из распределения частиц. Однако в случае результатов, представленных в данном документе, продемонстрированы частицы с наибольшей вероятностью.
- 37 025172
Пример слежения за клетками в трехмерном пространстве.
На фиг. 32 показаны два случая успешного применения описанного выше трехмерного алгоритма для слежения в течение периода от 1-клеточной до 4-клеточной стадии. На фиг. 33 представлена диаграмма, показывающая пример того, как частицы распределены во время деления 1-клеточной стадии до 2-клеточной (соответствует первому примеру, показанному на фиг. 32). На диаграмме показано расположение в трехмерном пространстве центра каждой клетки. Когда клетка начинает делиться, прогнозы демонстрируют неопределенность с точки зрения того, какая из дочерних клеток будет лежать над другой, но эта проблема устраняется в пределах пары кадров.
Извлечение прогностических параметров.
После того как эмбрионы смоделированы с применением описанных ранее способов, из моделей можно выделить определенные параметры. В типичном случае применяют самую лучшую или наиболее вероятную модель. Эти параметры включают, например, длительность первого цитокинеза, время между первым и вторым клеточными делениями и время между вторым и третьим клеточными делениями. Длительность цитокинеза можно аппроксимировать путем измерения времени, в течение которого модель клетки удлиняется перед тем, как разделиться на две клетки. Удлинение можно измерить, наблюдая за соотношением большой и малой осей эллипса. Другие параметры, которые можно выделить из моделей, включают время между оплодотворением и первым клеточным делением, формы и симметричность клеток и процессов деления, углы деления, фрагментация и т.д. Параметры можно выделить, применяя либо алгоритм слежения за клетками в двумерном пространстве, либо алгоритм слежения за клетками в трехмерном пространстве.
Цитокинез определяют как период от первого появления борозды дробления до полного разделения дочерних клеток. Так как наши модели эмбрионов состоят из не деформируемых эллипсов, идентификация появления борозды дробления является трудной задачей. Одним из способов решения было бы позволить эллипсам деформироваться, но это привело бы к более сложным проблемам со слежением. Другим способом могло бы быть наблюдение за изменениями кривизны на предварительно обработанном микроскопическом изображении; однако это не позволило бы соблюсти условие измерения применяемых нами прогностических параметров непосредственно на моделях эмбрионов. Таким образом, мы упрощаем задачу, аппроксимируя длительность первого цитокинеза как длительность удлинения клетки перед разделением 1 клетки на 2 клетки. Удлинение оценивают количественно путем вычисления соотношения большой оси к малой оси эллипса. Клетку считают удлиненной, если:
а — Ь —— > 15%
Ъ
Данное значение 15% было выбрано эмпирически и хорошо работает для этого конкретного набора данных; однако можно применять другие значения. После того, как модель эмбриона разделилась на 2 клетки, можно выделить аппроксимированную длительность первого цитокинеза путем вычисления длительности удлинения 1-клеточной модели.
В принципе, время между явлениями митоза можно измерять непосредственно. Например, время между первым и вторым митозами можно измерить как время между 2-клеточной моделью и 3клеточной моделью. Однако в некоторых случаях эмбрионы могут демонстрировать необычное и случайное поведение. Сюда относится, например, эмбрион, который переходит от 1-клеточной стадии к 2клеточной, от 2-клеточной к кажущейся 3- или 4-клеточной, а затем опять к 2-клеточной. Описанный алгоритм позволяет следить за поведением такого типа, но это ставит задачу определения временного интервала между явлениями митоза.
Один из способов учесть такое поведение состоит в следующем. Вместо того чтобы измерять время между 2-клеточной и 3-клеточной моделями (для определения времени между первым и вторым митозами), можно провести аппроксимацию путем простого подсчета количества кадров изображений, в которых 2-клеточная модель наиболее вероятна. В ряде случаев такой подход хорошо работает, но не всегда дает представление об истинном времени между явлениями митоза. Эти явления также можно учитывать, накладывая на модель ограничение, основанное на количестве клеток. То есть, при выборе наилучшей среди наиболее вероятных моделей из распределения при каждом повторе можно применять требование, чтобы количество клеток в модели всегда оставалось тем же самым или увеличивалось, но никогда не снижалось. После наложения такого ограничения можно проводить прямое вычисление времени между явлениями митоза. Данное ограничение также полезно для фильтрования результатов слежения, которые могут демонстрировать небольшие флуктуационные помехи, которые могут спонтанно возникать при переключении модели, например, вперед и назад между 1-клеточной и 2-клеточной модели.
Способ выделения прогностических параметров.
На фиг. 35 приведена схема, резюмирующая способы, описанные выше. Схема показывает, как может быть проанализирован единичный эмбрион (хотя она может быть применена к множеству эмбрионов или другим типам клеток и стволовых клеток). На первом этапе получают изображение эмбриона с применением цейтраферной микроскопии (измерение). Это изображение можно сохранить в файл и позже повторно открыть. Изображение обычно подвергают предварительной обработке для усиления опреде- 38 025172 ленных свойств, хотя это не является необходимым. Предсказывают модели возможных конфигураций эмбриона и моделируют изображения, исходя из этих моделей (предсказание). Модельное изображение могло бы включать изображения клеточных мембран, как описано ранее, или изображения, которые более точно представляют микроскопические изображения до предварительной обработки. После этого модели сравнивают с предварительно обработанным микроскопическим изображением (сравнение). При применении такого сравнения сохраняются самые лучшие предсказания, тогда как плохие предсказания отбраковываются. После этого полученный в результате набор предсказаний применяют для улучшения предсказаний для следующего изображения. После осуществления данного процесса для множества последовательных изображений появляется возможность измерить морфологические параметры непосредственно у наилучшей(их) модели(ей), например, такие как длительность цитокинеза и время между явлениями митоза. Эти параметры можно применять для оценки жизнеспособности эмбриона, как обсуждалось ранее.
Пример 7. Автоматизированный анализ клеточной активности.
Описанные выше способы требуют возможности следить за развитием клетки посредством микроскопии. В случае эмбрионов желательно следить за множеством эмбрионов, которые культивируют совместно в одной и той же чашке. Применяемые здесь аналитические способы также требуют, чтобы изображения захватывались периодически (например, каждые 1-30 мин в течение 1-5 дней в случае эмбриона; различные временные интервалы могут применяться для других типов клеток, таких как стволовые клетки). По этой причине был разработан способ визуализации для автоматизированного слежения за развитием эмбриона.
При цейтраферной микроскопии клетки выращивают в контролируемых условиях и захватывают изображения в течение продолжительного периода времени для наблюдения за процессами, такими как подвижность (движение в пределах окружающего пространства), пролиферация (рост и деление) и изменение морфологии (размера и формы). Из-за продолжительности времени эксперимента и большого количества генерируемых визуальных данных выделение параметров, таких как длительность и время между клеточными делениями, может являться трудоемкой задачей. Это особенно верно в случае высокопроизводительных прикладных задач, когда одновременно получают изображения для множества образцов. Таким образом, имеется необходимость в программном обеспечении для анализа изображений, которое может выделять требуемую информацию автоматически.
Одним из способов оценки жизнеспособности эмбриона является количественное определение клеточной активности на изображениях. Это можно достигнуть простым отбором последовательных пар изображений и сравнением значений их пикселей. В частности, для количественного определения клеточной активности на каждом новом изображении вычисляют разницу суммы квадратов (δδΌ) интенсивностей пикселей между новым изображением, обозначенным как Ι', и предыдущим изображением, обозначенным как Ι', для всех перекрывающихся пикселей ί
55Ζ) = =2/?
ί ί
Для снижения уровня шума изображения можно предварительно сгладить с применением фильтра Гаусса. На фиг. 28 показан график клеточной активности с 1 дня по 3 день для единичного эмбриона. Как можно видеть, имеются резкие пики, соответствующие делению 1-клеточной стадии до 2-клеточной, делению 2-клеточной стадии до 4-клеточной и делению 4-клеточной стадии до 8-клеточной стадии эмбриона человека. Ширины этих пиков представляют длительность клеточных делений.
Одним из ограничений данного подхода является то, что показатель разницы суммы квадратов измеряет исключительно количество активности на изображении, и такие явления, как движение эмбриона (например, сдвиг или вращение), могут выглядеть достаточно похожими на клеточное деление. Одним из решений данной проблемы является проведение регистрации изображения перед вычислением разницы суммы квадратов. Регистрация изображения - это процесс нахождения геометрической взаимосвязи между двумя изображениями с целью их выравнивания в одной и той же системе координат, и достичь ее можно с применением множества различных методик. Например, можно применить вариант стандартного итерационного нелинейного алгоритма Левенберга-Марквардта, при котором изображения регистрируют путем минимизации разницы суммы квадратов для интенсивностей перекрывающихся пикселей. Алгоритм Левенберга-Марквардта трансформирует положение пикселей с помощью томографической матрицы 3x3
где положение предопределенных пикселей х' и у' нормируют как
- 39 025172
Таким образом
Томографическую матрицу можно применять для различных трансформаций изображения, и разумным выбором в данном применении были бы преобразования твердого тела (евклидовы). Это привело бы к выравниванию изображений эмбрионов при смещении и при вращении в плоскости (вдоль оси камеры). Однако можно немного обобщить и применить аффинное преобразование, которое позволяет производить наклон изображения. Данное обобщение может быть желательным или нежелательным, в зависимости от сигнала, который пытаются измерить. Таким образом, равенство для движения превращается в х' = к^х + куу + к2 у' = А3х + к^у + к$
Алгоритм Левенберга-Марквардта сначала вычисляет частные производные е относительно неизвестных параметров движения Ьк, применяя цепное правило
8е _ 81' 8х' 81' 8у'
8кк~ +'
8х’8кк 8у' 8кк
В случае параметров аффинного движения эти частные производные превращаются в
Далее, используя эти частные производные, алгоритм Левенберга-Марквардта вычисляет приблизительную матрицу Гессе А (в виде набора действительных чисел, с размером 6x6) и определяет вес вектор-градиента Ь (в виде набора действительных чисел, с размером 6x1) путем добавления вклада от каждого пиксела
Наконец, параметры движения можно обновить путем добавления движения приращениями
ΔΗ = (А + АГИЪ где константа λ регулирует размер шага обновления движения и I - единичная матрица.
При каждом повторении алгоритма, первое изображение деформируют в соответствии с обновленной оценкой движения и сравнивают со вторым изображением путем вычисления разницы суммы квадратов для интенсивностей пикселей в областях перекрывания. Настоящее применение подразумевает, что движение эмбриона между последовательными изображениями очень невелико, и поэтому производят только небольшое, фиксированное количество повторов. На фиг. 28(Ь) показан график клеточной активности без регистрации изображения (28(а)) и с регистрацией изображения (28(Ь)), произведенной для каждой пары изображений. Так как функция ошибок стандартного алгоритма ЛевенбергаМарквардта является разницей сумм квадратов, на графике просто откладывают остаточную ошибку для
- 40 025172 каждой регистрации. На фиг. 29 проводится сравнение графиков клеточной активности для развития нормального эмбриона и эмбриона с отклонениями от нормы. На 3 день, во временной точке, в которой эмбриолог в типичном случае проводил бы оценку морфологии, эмбрионы выглядят схоже и, потенциально, оба могли бы быть признаны жизнеспособными. Однако графики их клеточной активности значительно различаются, так как один из эмбрионов претерпевает типичные серии клеточных делений, тогда как другой расщепляется из 1-клеточного эмбриона на множество клеток и фрагментов. Как и ожидалось, эмбрион, имеющий нормальный график активности, в конечном счете достигает стадии бластоцисты в точке 5,5 дней.
Другие типы регистрации изображений можно применять перед вычислением разницы суммы квадратов интенсивностей пикселей. Они включают, например, взаимную корреляцию, нормированную взаимную корреляцию, взаимную фазовую корреляцию, взаимную информацию, обнаружение и слежение за особенностями, масштабно-инвариантную трансформацию возможностей (δΙΡΤ), оптический поток и градиентный спуск. Предварительная обработка изображения перед регистрацией может быть желательной или нежелательной, например, усиление особенностей или контрастности.
Модель для оценки жизнеспособности эмбриона.
На фиг. 13 приведена модель развития эмбриона человека, основанная на скоррелированных визуализации и молекулярном анализе. Показана временная шкала развития от зиготы до бластоцисты, включая короткие периоды, критичные для прогнозирования успешного развития в бластоцисту, и диаграмма развития эмбриона. Ключевые молекулярные данные, нанесенные на диаграмму, свидетельствуют, что эмбрион человека начинает жизнь с характерным набором РНК яйцеклетки, которые унаследованы от матери. Этот набор РНК сохраняется и должным образом упакован с помощью специфичной программы регуляции РНК в яйцеклетке. После оплодотворения подгруппа материнских мРНК, характерный для яйцеклетки (ΕδδΡ1; характерный эмбриональной стадии профиль 1), должна быть деградирована, когда начинается переход от яйцеклетки к эмбриону. Параллельно этому, другие РНК в идеальном случае равномерно распределяются в каждый бластомер в ходе продолжения развития (ΕδδΡ4). Успешная деградация и распределение РНК завершается эмбриональной активацией генов (ΕСΑ) и транскрипцией генов из ΕδδΡ2 в клетке в автономном режиме. Следует отметить, что во время делений дробления бластомеры эмбриона могут претерпевать блок развития или прогрессировать независимо друг от друга. Результатом автономного развития клеток в эмбрионе является то, что индивидуальные бластомеры могут претерпевать блок развития или прогрессировать, и когда 8-клеточный эмбрион прогрессирует до стадии морулы и далее, на качество бластоцисты будет влиять количество клеток, которые находятся в блоке развития или прогрессируют после 8-клеточной стадии. Данные визуализации демонстрируют, что имеются критические периоды развития, которые прогнозируют успех или неудачу: первый цитокинез, второе деление дробления и синхронность второго и третьего делений дробления. Эти параметры можно измерять автоматически, с применением алгоритмов слежения за клетками и программного обеспечения, описанных ранее. Описанные системы и способы могут быть применены для диагностики исхода развития эмбриона по ключевым прогностическим параметрам визуализации и могут позволить переносить меньшее количество эмбрионов на более ранних стадиях развития (до эмбриональной активации генов).
Сравнение автоматизированного и ручного анализа изображений.
На фиг. 34 демонстрируется сравнение автоматизированного анализа изображений и анализа изображений в ручном режиме для группы из 14 эмбрионов. Эмбрионы с 1 по 10 (как указано на графиках) достигли стадии бластоцисты с различной морфологией. Эмбрионы с 11 по 14 претерпели блок развития и не достигли стадии бластоцисты. На фиг. 34(а) показано сравнение показателей длительности первого цитокинеза, а на фиг. 34(Ь) показано сравнение показателей времени между 1-м и 2-м митозом. Как можно видеть, два способа демонстрируют в целом высокую степень совпадения. Небольшое количество несовпадений по длительности первого цитокинеза являются ожидаемыми, так как их появление можно отнести к тому факту, что в примененном нами автоматизированном анализе производят аппроксимацию путем измерения удлинения, как обсуждалось ранее. В нескольких случаях имеется более существенное несоответствие между автоматизированным и ручным анализом как для длительности цитокинеза, так и для времени между 1-м и 2-м митозами. Это отмечено у нескольких эмбрионов с отклонениями от нормы и вызвано необычным поведением, которое, с одной стороны, трудно охарактеризовать в ручном режиме, а с другой - за ним сложно следить в автоматическом режиме. Для этой группы эмбрионов и при применении только первых двух критериев (длительность первого цитокинеза и время между 1-м и 2-м митозами) автоматизированный алгоритм не выдал ни одного ложноположительного результата. Этот факт был бы особенно важен при проведении процедуры ЭКО, когда необходимо избегать ложноположительных результатов. При анализе в ручном режиме был один ложноотрицательный результат (эмбрион 9), тогда как автоматизированный алгоритм дал два ложноотрицательных результата (эмбрионы 9 и 10). Однако, хотя оба эмбриона - 9 и 10, в техническом смысле достигли стадии бластоцисты, они демонстрировали плохую морфологию по сравнению с другими бластоцистами и были бы в меньшей степени оптимальными кандидатами для переноса. В случае анализа в ручном режиме эмбрион 14 дал бы ложноположительный результат, исходя из данных двух критериев, и необходим третий параметр длительность периода между 2-м и 3-м митозами - для определения его как истинного отрицательного об- 41 025172 разца. Однако автоматизированный алгоритм делает правильный прогноз, применяя только первые два критерия. Эти результаты свидетельствуют, что предложенный нами автоматизированный алгоритм может успешно прогнозировать образование эмбрионом бластоцисты и не достижение им стадии бластоцисты, а также делать различие между бластоцистами разного качества. Таким образом, для ситуаций, когда для множества эмбрионов была определена хорошая способность к развитию, имеется возможность произвести расчеты для их ранжирования в соответствии с их относительным качеством с целью выбора наилучших 1 или 2 эмбрионов для переноса в ходе процедур ЭКО.
Предшествующее описание просто иллюстрирует принципы изобретения. Понятно, что специалист в данной области может изменять различные условия, которые, хотя и не описаны или не продемонстрированы явно в этом документе, относятся к принципам изобретения и включены в его сущность и объем. Дополнительно, все примеры и перечисленные в этом документе условные языковые конструкции принципиально предназначены для того, чтобы помочь читателю понять принципы изобретения и концепцию, предложенную авторами изобретения для развития данной области знаний, и должны истолковываться исключительно как такие специально приведенные примеры и условия. Более того, подразумевается, что все утверждения в этом документе, перечисляющие принципы, особенности и варианты воплощения изобретения, а также их конкретные примеры включают как структурные, так и функциональные их эквиваленты.
Дополнительно, подразумевается, что такие эквиваленты включают как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты, которые будут разработаны в будущем, т.е. любые разработанные элементы, которые выполняют ту же функцию, независимо от их структуры. Следовательно, подразумевается, что объем настоящего изобретения не ограничен примерами воплощений, представленными и описанными в этом документе. Точнее, объем и сущность настоящего изобретения включены в прилагаемую формулу изобретения.

Claims (25)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты, включающий культивирование одного или более эмбрионов человека в условиях, подходящих для развития эмбриона; цейтраферную съемку у одного или более эмбрионов длительности по меньшей мере одного явления цитокинеза или клеточного цикла; измерение по меньшей мере одного клеточного параметра, включающего:
    (а) длительность первого цитокинеза; или (б) время между первым и вторым митозом; или (в) время между вторым и третьим митозом;
    и идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, когда указанный по меньшей мере один клеточный параметр для указанного эмбриона соответствует:
    (ί) длительности первого цитокинеза, составляющей до 33 мин; или (ίί) времени между первым и вторым митозом, составляющим от около 7,8 до 14,3 ч; или (ίίί) времени между вторым и третьим митозом, составляющим до 5,8 ч.
  2. 2. Способ по п.1, включающий измерение (а) длительности первого цитокинеза и (б) времени между первым и вторым митозом и идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, при (ί) длительности первого цитокинеза до 33 мин и (ίί) времени между первым и вторым митозом от около 7,8 до 14,3 ч.
  3. 3. Способ по п.1, включающий измерение (а) длительности первого цитокинеза и (в) времени между вторым и третьим митозом и идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, при (ί) длительности первого цитокинеза до 33 мин и (ίίί) времени между вторым и третьим митозом до 5,8 ч.
  4. 4. Способ по п.1, включающий измерение (б) времени между первым и вторым митозом и (в) времени между вторым и третьим митозом и идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, при (ί) времени между первым и вторым митозом от около 7,8 до 14,3 ч и (ίίί) времени между вторым и третьим митозом до 5,8 ч.
  5. 5. Способ по п.1, включающий измерение (а) длительности первого цитокинеза; и (б) времени между первым и вторым митозом; и (в) времени между вторым и третьим митозом и идентификацию эмбриона, который обладает большей вероятностью достижения стадии бластоцисты, при (ί) длительности первого цитокинеза до 33 мин; и (ίί) времени между первым и вторым митозом от около 7,8 до 14,3 ч; и (ίίί) времени между вторым и третьим митозом до 5,8 ч.
  6. 6. Способ по п.1, включающий идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, когда длительность первого цитокинеза составляет до 33 мин.
  7. 7. Способ по п.1, включающий идентификацию эмбриона, который обладает способностью достижения стадии бластоцисты, когда время между первым и вторым митозом составляет от около 7,8 до 14,3 ч.
  8. 8. Способ по п.1, включающий идентификацию эмбриона, который обладает способностью дости- 42 025172 жения стадии бластоцисты, когда время между вторым и третьим митозом составляет до 5,8 ч.
  9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно включает измерение длительности первого клеточного цикла.
  10. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что эмбрион обладает способностью достижения стадии бластоцисты, когда длительность первого клеточного цикла составляет от около 20 до около 27 ч.
  11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или более эмбрионов получают оплодотворением яйцеклеток ίη νίΐτο.
  12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что яйцеклетки созревают ίη νίΐτο.
  13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, что к яйцеклеткам, созревшим ίη νίΐτο, добавляют факторы роста.
  14. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или более эмбрионов не были заморожены перед измерением по меньшей мере одного клеточного параметра.
  15. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или более эмбрионов были заморожены перед измерением по меньшей мере одного клеточного параметра.
  16. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерение по меньшей мере одного клеточного параметра автоматизировано.
  17. 17. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификация того, что эмбрион обладает способностью достижения стадии бластоцисты, автоматизирована.
  18. 18. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная цейтраферная съемка получает изображения, хранимые в цифровом устройстве.
  19. 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что в указанной цейтраферной съемке применяют темнопольное освещение.
  20. 20. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный один или более эмбрионов человека помещают в культуральную чашку перед культивированием в условиях, подходящих для развития эмбриона.
  21. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что указанная культуральная чашка содержит микролунки.
  22. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанная культуральная чашка содержит до 30 микролунок.
  23. 23. Способ по п.21, отличающийся тем, что один или более эмбрионов человека помещают в микролунку перед культивированием в условиях, подходящих для развития эмбриона.
  24. 24. Способ по п.1, отличающийся тем, что измерение осуществляют на установке для получения изображений.
  25. 25. Способ по п.1, отличающийся тем, что один или более эмбрионов человека, идентифицированных как обладающие способностью достижения стадии бластоцисты, обладают способностью успешно имплантироваться в матку.
EA201270300A 2009-08-22 2010-08-23 Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты EA025172B9 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23608509P 2009-08-22 2009-08-22
US33265110P 2010-05-07 2010-05-07
PCT/US2010/046343 WO2011025736A1 (en) 2009-08-22 2010-08-23 Imaging and evaluating embryos, oocytes, and stem cells

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA201270300A1 EA201270300A1 (ru) 2013-01-30
EA025172B1 true EA025172B1 (ru) 2016-11-30
EA025172B9 EA025172B9 (ru) 2017-01-30

Family

ID=42799722

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270300A EA025172B9 (ru) 2009-08-22 2010-08-23 Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты

Country Status (24)

Country Link
US (9) US8721521B2 (ru)
EP (4) EP2430454B1 (ru)
JP (2) JP5951487B2 (ru)
KR (1) KR101747983B1 (ru)
CN (2) CN102576027B (ru)
AU (1) AU2010286740B2 (ru)
BR (1) BR112012003847B1 (ru)
CA (1) CA2761231C (ru)
CL (1) CL2012000456A1 (ru)
DK (4) DK2827150T6 (ru)
EA (1) EA025172B9 (ru)
ES (3) ES2399711T3 (ru)
HK (3) HK1166521A1 (ru)
HU (1) HUE052071T2 (ru)
IL (1) IL218239A (ru)
IN (1) IN2012DN02452A (ru)
MX (1) MX2012002266A (ru)
MY (1) MY180473A (ru)
NZ (1) NZ598293A (ru)
PL (1) PL2827150T3 (ru)
PT (1) PT2827150T (ru)
SG (1) SG178536A1 (ru)
WO (1) WO2011025736A1 (ru)
ZA (1) ZA201201363B (ru)

Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5879666A (en) * 1996-10-24 1999-03-09 The Procter & Gamble Company Methods and compositions for reducing body odor
HUP0900431A2 (en) * 2009-07-10 2011-01-28 Cryo Innovation Kft Sample imaging system and pocedure for transmitting imager of cells or tissues located in breeder space towards a data processing device
CN102576027B (zh) 2009-08-22 2014-10-01 里兰斯坦福初级大学理事会 成像并评估胚胎、卵母细胞和干细胞
US8621943B2 (en) * 2009-09-30 2014-01-07 Weyerhaeuser Nr Company Method of singulating embryos
DE102010009853B4 (de) * 2010-03-02 2012-12-06 Bruker Daltonik Gmbh Bestimmung von Gewebezuständen mittels bildgebender Massenspektrometrie
CN103517676A (zh) 2010-09-27 2014-01-15 奥克索金股份有限公司 用于胚胎、卵母细胞和干细胞的自动化成像和评价的装置、方法和系统
US20130217061A1 (en) * 2010-10-25 2013-08-22 Masahiko Sato Apparatus for Systematic Single Cell Tracking of Distinctive Cellular Events
DK2678675T3 (en) * 2011-02-23 2018-01-15 Univ Leland Stanford Junior METHODS FOR DETECTING ANEUPLOIDY IN HUMAN EMBRYONS
EP2811016B1 (en) * 2011-05-31 2017-10-04 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastomere cleavage and morphology
US8934698B2 (en) * 2011-06-22 2015-01-13 The Johns Hopkins University System and device for characterizing cells
US9410939B2 (en) 2011-07-01 2016-08-09 Cambridge Enterprise Limited Methods for predicting mammalian embryo viability
JP5887766B2 (ja) * 2011-08-31 2016-03-16 株式会社ニコン 顕微鏡制御装置、画像処理装置、顕微鏡装置およびプログラム
WO2013056002A1 (en) * 2011-10-12 2013-04-18 University Of Iowa Research Foundation Use of microrna for assessing embryos grown in vitro and improving culture media
WO2013069452A1 (ja) * 2011-11-08 2013-05-16 浜松ホトニクス株式会社 幹細胞の観察方法、分化傾向状態の細胞領域の除去方法、及び、幹細胞の観察装置
KR101697512B1 (ko) * 2011-12-15 2017-01-19 한국전자통신연구원 영상 정합 장치 및 방법
US20160151090A1 (en) * 2011-12-22 2016-06-02 Previvo Genetics, Llc Recovery and processing of human embryos formed in vivo
US9216037B2 (en) 2013-06-21 2015-12-22 Previvo Genetics, Llc Uterine lavage for embryo retrieval
US20150272622A1 (en) * 2011-12-22 2015-10-01 Previvo Genetics, Llc Recovery and processing of human embryos formed in vivo
US9282995B2 (en) * 2011-12-22 2016-03-15 Previvo Genetics, Llc Recovery and processing of human embryos formed in vivo
EP2802872A4 (en) 2012-01-13 2015-09-09 Univ Leland Stanford Junior MECHANICAL BIOMARKERS FOR THE VITABILITY OF OOCYTES AND EMBRYOS
WO2013113707A1 (en) * 2012-02-01 2013-08-08 Ventana Medical Systems, Inc. System for detecting genes in tissue samples
US20130225431A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Assessment of cellular fragmentation dynamics for detection of human embryonic aneuploidy
JP2013230145A (ja) 2012-04-30 2013-11-14 Masahiko Sato 細胞集団の状態を評価するための方法、候補化合物の発癌性を評価するための方法、潜在的な抗癌化合物の抗癌活性を評価するための方法及び治療用細胞集団の品質を評価するための方法
US20140017717A1 (en) * 2012-05-31 2014-01-16 Auxogyn, Inc. In vitro embryo blastocyst prediction methods
EP2855664B1 (en) * 2012-05-31 2017-10-04 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastocyst development
ITRM20120257A1 (it) * 2012-06-05 2013-12-06 Advanced Comp Systems A C S S P A Metodo per la quantificazione del grado di regolarità morfologica della zona pellucida in embrioni e ovociti.
US20150169842A1 (en) 2012-06-25 2015-06-18 Unisense Fertilitech A/S Method and apparatus
ES2831867T3 (es) * 2012-08-30 2021-06-09 Unisense Fertilitech As Evaluación automática de embriones en incubación in vitro
US9829482B2 (en) * 2012-09-13 2017-11-28 Purdue Research Foundation Motility-contrast imaging for oocyte and embryo viability assessment
PL2951574T3 (pl) * 2013-02-01 2019-12-31 Ares Trading Sa Pomiar rozwoju zarodka i potencjału do zagnieżdżenia wraz z czasem i parametrami fenotypu pierwszych cytokinez
US10241108B2 (en) * 2013-02-01 2019-03-26 Ares Trading S.A. Abnormal syngamy phenotypes observed with time lapse imaging for early identification of embryos with lower development potential
EP2962101A4 (en) * 2013-02-28 2016-10-19 Progyny Inc APPARATUS, METHOD AND SYSTEM FOR CLASSIFYING HUMAN EMBRYONIC CELLS FROM IMAGES
US10667499B2 (en) 2013-03-14 2020-06-02 FUJIFILM Irvine Scientific, Inc. Method and quality control molecular based mouse embryo assay for use with in vitro fertilization technology
BR112015022446B1 (pt) * 2013-03-14 2022-05-17 Fujifilm Irvine Scientific, Inc Método e ensaio com embrião de camundongo em base molecular para controle de qualidade destinado a uso com tecnologia de fertilização in vitro
WO2014172608A2 (en) * 2013-04-19 2014-10-23 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Parthenolide derivatives and their modulation of processes controlled by regulated translation
US9404908B2 (en) * 2013-04-29 2016-08-02 The Board of Truestees of the Leland Stanford Junior University Non-invasive imaging to the blastocyst stage for the detection of human embryonic aneuploidy
GB201312032D0 (en) * 2013-07-04 2013-08-21 Vitrolife Kft Embryo assessment method
WO2015001396A1 (en) * 2013-07-05 2015-01-08 At Medical Ltd. A device for monitoring the development of a biological material
JP2015029431A (ja) * 2013-07-31 2015-02-16 大日本印刷株式会社 細胞培養容器
US10123697B2 (en) * 2013-09-10 2018-11-13 University Of Rochester Apparatus and method for automatic alignment in an optical system and applications
JP6303347B2 (ja) * 2013-09-11 2018-04-04 大日本印刷株式会社 検体画像管理システム及び検体画像管理プログラム
WO2015045012A1 (ja) * 2013-09-24 2015-04-02 富士通株式会社 コロニー検査プログラム、コロニー検査装置およびコロニー検査方法
JPWO2015045183A1 (ja) * 2013-09-30 2017-03-09 富士通株式会社 コロニー画像検査プログラム、コロニー画像検査方法及びコロニー画像検査装置
US9519823B2 (en) * 2013-10-04 2016-12-13 The University Of Manchester Biomarker method
US9953417B2 (en) 2013-10-04 2018-04-24 The University Of Manchester Biomarker method
US10540783B2 (en) * 2013-11-01 2020-01-21 Illumina, Inc. Image analysis useful for patterned objects
US20150125899A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-07 Rebecca Willits Fluorescence-assisted counting apparatus for qualitative and/or quantitative measurement of fluorescently tagged particles
US9469650B2 (en) 2013-11-08 2016-10-18 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Melampomagnolide B derivatives
US9487536B2 (en) 2013-11-08 2016-11-08 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Melampomagnolide B derivatives
US9395346B2 (en) * 2013-11-18 2016-07-19 Zoetis Services Llc Non-contact egg identification system for determining egg viability, and associated method
AU2014374989B2 (en) * 2014-01-03 2019-09-12 Copan Italia S.P.A. Apparatus and method for treatment of diagnostic information relating to samples of microbiological material
JP6343935B2 (ja) * 2014-01-09 2018-06-20 大日本印刷株式会社 成育情報管理システム及び成育情報管理プログラム
JP6343934B2 (ja) * 2014-01-09 2018-06-20 大日本印刷株式会社 成育情報管理システム及び成育情報管理プログラム
GB2524082A (en) * 2014-03-14 2015-09-16 Unisense Fertilitech As Methods and apparatus for analysing embryo development
WO2015143350A1 (en) 2014-03-20 2015-09-24 Auxogyn, Inc. Quantitative measurement of human blastocyst and morula morphology developmental kinetics
US9723831B2 (en) * 2014-07-30 2017-08-08 The Governing Council Of The University Of Toronto System and methods for automated vitrification of biological materials
JP6775911B2 (ja) * 2014-11-14 2020-10-28 キヤノンメディカルシステムズ株式会社 細胞特性を判定する方法および装置、並びに疾患の検査方法
US9981990B2 (en) 2014-12-03 2018-05-29 Bioventures, Llc Melampomagnolide B dimers
US9723989B2 (en) * 2015-01-19 2017-08-08 Purdue Research Foundation Ex vivo motility contrast imaging
JP2018508234A (ja) * 2015-02-17 2018-03-29 ジェネア アイピー ホールディングス ピーティーワイ リミテッド 生物学的試料を動的に培養するための方法および装置
IL254325B2 (en) 2015-03-13 2024-03-01 Genea Ltd Method and device for microscopy
EP4306955A3 (en) * 2015-03-26 2024-03-06 University of Houston System Integrated functional and molecular profiling of cells
CN107708568B (zh) * 2015-06-30 2020-11-20 佳能美国公司 配准的基准标记、系统和方法
JP6746945B2 (ja) * 2015-06-30 2020-08-26 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理システム及び情報処理方法
US10420626B2 (en) 2015-06-30 2019-09-24 Canon U.S.A., Inc. Fiducial markers, systems, and methods of registration
US10510143B1 (en) * 2015-09-21 2019-12-17 Ares Trading S.A. Systems and methods for generating a mask for automated assessment of embryo quality
US11494578B1 (en) * 2015-09-21 2022-11-08 Ares Trading S.A. Systems and methods for automated assessment of embryo quality using image based features
WO2017132528A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Bioventures, Llc Triazole derivatives of melampomagnolide b and methods of use thereof
CN109312286A (zh) * 2016-06-13 2019-02-05 索尼公司 装置、信息处理装置、程序和信息处理方法
JP6992748B2 (ja) * 2016-06-15 2022-02-03 ソニーグループ株式会社 情報処理装置、観察システム、観察方法及びプログラム
US11249021B2 (en) 2016-06-30 2022-02-15 Esco Medical Aps Apparatus for the incubation of a biological material
JP6776672B2 (ja) * 2016-07-08 2020-10-28 住友電気工業株式会社 品質評価方法及び品質評価装置
JP2018014991A (ja) * 2016-07-13 2018-02-01 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法及び情報処理システム
JP2018022216A (ja) 2016-08-01 2018-02-08 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法、及びプログラム
CN107058455B (zh) * 2016-08-10 2021-09-17 黑龙江省农业科学院畜牧研究所 猪2细胞胚胎体积的测量方法
CN109790509A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 南洋理工大学 用于胚胎活检的装置
WO2018100913A1 (ja) * 2016-11-29 2018-06-07 ソニー株式会社 情報処理装置、情報処理方法、プログラム及び観察システム
US20190376955A1 (en) * 2016-11-30 2019-12-12 Sony Corporation Information processing apparatus, observation system, information processing method, and program
US11436719B2 (en) 2017-02-16 2022-09-06 Kyoto University Cell evaluation method, cell evaluation device, and recording medium storing cell evaluation program
BR112019025849A2 (pt) * 2017-06-13 2020-07-07 Sony Corporation aparelho, sistema e método de processamento de informação, e, programa.
CN107312861B (zh) * 2017-08-01 2020-08-18 北京大学人民医院 一种b-all患者预后风险评估标记物
US11202652B2 (en) 2017-08-11 2021-12-21 Canon U.S.A., Inc. Registration and motion compensation for patient-mounted needle guide
WO2019034328A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Siemens Healthcare Gmbh IDENTIFYING THE QUALITY OF CELLULAR IMAGES ACQUIRED USING DIGITAL HOLOGRAPHIC MICROSCOPY USING CONVOLUTIONAL NEURAL NETWORKS
WO2019068073A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. AUTOMATED EVALUATION OF HUMAN EMBRYOS
JP6414310B1 (ja) * 2017-10-26 2018-10-31 ソニー株式会社 受精卵品質評価方法、プログラム及び情報処理装置
US10426424B2 (en) 2017-11-21 2019-10-01 General Electric Company System and method for generating and performing imaging protocol simulations
US10893911B2 (en) 2017-11-26 2021-01-19 Canon U.S.A., Inc. Automated image cropping for enhanced automatic device-to-image registration
JP2019100940A (ja) * 2017-12-06 2019-06-24 東ソー株式会社 未分化細胞を高感度に検出および回収する方法
FR3077136A1 (fr) * 2018-01-19 2019-07-26 I2S Dispositif d'observation d'une cellule ou d'un ensemble de cellules vivantes
JPWO2019172112A1 (ja) * 2018-03-06 2021-02-18 ゼノアックリソース株式会社 細胞凍結保存用溶液およびその利用
US10552957B2 (en) * 2018-03-24 2020-02-04 Dan Nayot Methods and systems for determining quality of an oocyte
JP7207410B2 (ja) * 2018-06-28 2023-01-18 株式会社ニコン 画像解析方法、システム及びプログラム
TWI669616B (zh) * 2018-08-13 2019-08-21 行政院原子能委員會核能研究所 圓柱狀和圓餅狀數位模型之模擬切割方法
CN113141778A (zh) 2018-09-20 2021-07-20 艾弗夫有限公司 图像特征检测
EP3644228A1 (en) * 2018-10-23 2020-04-29 The Chinese University Of Hong Kong Method and apparatus for segmenting cellular image
US10748290B2 (en) * 2018-10-31 2020-08-18 Fei Company Smart metrology on microscope images
TWI664582B (zh) * 2018-11-28 2019-07-01 靜宜大學 細胞檢測方法、裝置與系統
WO2020144582A1 (en) * 2019-01-08 2020-07-16 Novocure Gmbh Evaluating quality of segmentation of an image into different types of tissue for planning treatment using tumor treating fields (ttfields)
US11274800B2 (en) * 2019-01-11 2022-03-15 Valeo North America, Inc. IR illuminator with asymetric radiation pattern
CN109829898B (zh) * 2019-01-17 2023-05-16 柳州康云互联科技有限公司 一种用于互联网检测中基于神经网络的测量检测系统及方法
US11386559B2 (en) * 2019-04-03 2022-07-12 The Regents Of The University Of California System and method for tissue viability screening
WO2020198779A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Presagen Pty Ltd Method and system for selecting embryos
WO2020223157A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Animated Dynamics, Inc. Interferometric method and apparatus for non-invasive assessment of oocyte maturity and competency
CN110363218B (zh) * 2019-06-06 2023-07-11 张孝东 一种胚胎无创评估方法及装置
CN110129201A (zh) * 2019-06-13 2019-08-16 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 胚胎时差培养装置
WO2020261555A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30 オリンパス株式会社 画像生成システムおよび画像生成方法
WO2021040870A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Coopersurgical, Inc. Reproductive specimen processing systems and methods
WO2021056046A1 (en) * 2019-09-25 2021-04-01 Presagen Pty Ltd Method and system for performing non-invasive genetic testing using an artificial intelligence (ai) model
BR112022010586A2 (pt) * 2019-12-19 2022-08-16 Pioneer Hi Bred Int Geração e uso de modelo preditivo de cultura de micrósporo
US20210302710A1 (en) * 2020-02-24 2021-09-30 Massachusetts Institute Of Technology Bragg light source for dark-field imaging devices
EP4211459A1 (en) * 2020-09-08 2023-07-19 AIVF Ltd. System and method for representing a biological process via non-speech audio
CN112382339A (zh) * 2020-11-17 2021-02-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种识别合子型基因激活zga基因的方法及装置
CN112481273B (zh) * 2020-12-29 2023-11-24 南通大学附属医院 结直肠癌抑癌基因及其启动子区高dna甲基化的验证方法
WO2022192436A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Thread Robotics Inc. System and method for automated gamete selection
AU2022289837A1 (en) * 2021-06-10 2023-08-24 Alife Health Inc. Machine learning for optimizing ovarian stimulation
CN113834936A (zh) * 2021-08-20 2021-12-24 李竞宇 生长分化因子9在预测胚胎发育潜力中的应用
WO2023081446A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 Thread Robotics Inc. System and method for automated cell positioning
WO2023225121A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 Overture Life, Inc. Methods, computer programs, and systems for automated microinjection

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007042044A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Unisense Fertilitech A/S Determination of a change in a cell population
WO2007144001A2 (en) * 2006-06-16 2007-12-21 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastomere division and movement
WO2008149055A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-11 General Electric Company Automatic characterization of cellular motion

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
EP0430881A3 (en) 1989-11-29 1991-10-23 Ciba-Geigy Ag Photochromic compounds, process for their preparation and their use
US5288644A (en) 1990-04-04 1994-02-22 The Rockefeller University Instrument and method for the sequencing of genome
US5324633A (en) 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
JP2775346B2 (ja) 1992-04-03 1998-07-16 アプライド バイオシステムズ，インコーポレイテッド プローブ構成物および方法
US5503980A (en) 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5858659A (en) 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5470710A (en) 1993-10-22 1995-11-28 University Of Utah Automated hybridization/imaging device for fluorescent multiplex DNA sequencing
GB9401833D0 (en) 1994-02-01 1994-03-30 Isis Innovation Method for discovering ligands
US5541081A (en) 1994-03-22 1996-07-30 President And Fellows Of Harvard College Process for assessing oocyte and embryo quality
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
WO1996030496A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 University Of Alabama At Birmingham Research Foundation Human embryo co-culture system and uses thereof
GB9507238D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
JP3660026B2 (ja) 1995-09-04 2005-06-15 扶桑薬品工業株式会社 体外受精用培地組成物
US5661028A (en) 1995-09-29 1997-08-26 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Large scale DNA microsequencing device
WO1997019345A1 (en) 1995-11-22 1997-05-29 Unisense Aps Microsensor and use of such microsensor
JP2002515738A (ja) 1996-01-23 2002-05-28 アフィメトリックス，インコーポレイティド 核酸分析法
EP0953354A4 (en) 1996-08-13 2002-10-23 Fujisawa Pharmaceutical Co HEMATOPOIETIC STEM CELLS PROLIFERING ACTIVE SUBSTANCES
US6008010A (en) * 1996-11-01 1999-12-28 University Of Pittsburgh Method and apparatus for holding cells
DK172855B1 (da) 1996-11-12 1999-08-16 Unisense Aps Fremgangsmåde til måling af koncentrationen af et medium i et miljø, mikrosensor til brug ved fremgangsmåden og anvendelse
US6166761A (en) 1997-01-09 2000-12-26 Interface Multigrad Technology Method and apparatus for monitoring a biological sample
CA2199663C (en) 1997-03-11 2004-08-10 Ruth Miriam Moses In vitro maturation and fertilization of mammalian oocytes
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
US5961444A (en) 1997-10-17 1999-10-05 Medworks Corporation In vitro fertilization procedure using direct vision
CZ20012968A3 (cs) 1999-02-24 2002-01-16 Novo Nordisk A/S Léčení neplodnosti
FR2812004B1 (fr) 2000-07-24 2002-12-27 Ccd Lab Milieux de culture pour fecondation in vitro, ou pour la culture de follicules, cellules germinales males ou embryons
CA2468861C (en) * 2001-12-05 2012-06-12 The Regents Of The University Of California Robotic microscopy systems
WO2003055385A1 (en) 2001-12-21 2003-07-10 Unisense A/S Multifibre sensor for measuring perfusion
US7015031B2 (en) 2002-01-24 2006-03-21 Genx International, Inc. Biological specimen-culturing system and method with onboard specimen development sensors
CA2476072A1 (en) 2002-02-13 2003-09-18 Reify Corporation Method and apparatus for acquisition, compression, and characterization of spatiotemporal signals
GB0215668D0 (en) 2002-07-06 2002-08-14 Weatherford Lamb Coupling tubulars
US20060099570A1 (en) 2002-12-23 2006-05-11 Damgaard Lars R Device and method for non-invasive measurement of the individual metabolic rate of a substantially spherical metabolizing particle
CN2610349Y (zh) * 2003-04-01 2004-04-07 北京舒尔德科技发展有限公司 多功能显微成像仪
US7106502B1 (en) 2003-08-21 2006-09-12 The United States Of America As Represented By The Administrator Of National Aeronautics And Space Administration Operation of a Cartesian robotic system in a compact microscope imaging system with intelligent controls
HU0302888D0 (en) 2003-09-09 2003-11-28 Pribenszky Csaba Dr In creasing of efficacity of stable storage by freezing of embryos in preimplantation stage with pretreatment by pressure
CA2537938C (en) 2003-09-09 2013-01-22 Cryo-Innovation Kft. Improving post-thaw survival of cryopreserved biological material by hydrostatic pressure challenge
GB2409029A (en) 2003-12-11 2005-06-15 Sony Uk Ltd Face detection
US20070054289A1 (en) * 2004-03-29 2007-03-08 Michigan State University Identification of genes involved in fertility, ovarian function and/or fetal/newborn viability
US7572601B2 (en) * 2004-10-15 2009-08-11 Northwestern University Compositions and methods for determining oocyte development potential
EP1828419A1 (en) 2004-11-17 2007-09-05 ReproCure, LLC Methods of determining human egg competency
CN103113463B (zh) 2005-12-13 2015-02-18 国立大学法人京都大学 核重新编程因子
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
JP4921858B2 (ja) * 2006-06-07 2012-04-25 オリンパス株式会社 画像処理装置および画像処理プログラム
US8428331B2 (en) * 2006-08-07 2013-04-23 Northeastern University Phase subtraction cell counting method
CA2666819A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Universite Laval Mammalian oocyte development competency granulosa markers and uses thereof
ATE503000T1 (de) 2007-06-29 2011-04-15 Unisense Fertilitech As Vorrichtung, system und verfahren zur beobachtung und/oder kultivierung mikroskopischer objekte
GB0806281D0 (en) 2008-04-07 2008-05-14 Univ Leeds Markers of Oocyte viability
US20110092763A1 (en) * 2008-05-27 2011-04-21 Gene Security Network, Inc. Methods for Embryo Characterization and Comparison
JP2010004789A (ja) * 2008-06-26 2010-01-14 Nikon Corp 胚観察装置
WO2010003423A2 (en) 2008-07-05 2010-01-14 Unisense Fertilitech A/S One to one identification system
WO2010010201A1 (es) 2008-07-22 2010-01-28 Equipo Ivi Investigacion Sl Perfil de expresion genetica como marcador de la receptividad endometrial
HUP0900431A2 (en) 2009-07-10 2011-01-28 Cryo Innovation Kft Sample imaging system and pocedure for transmitting imager of cells or tissues located in breeder space towards a data processing device
CA2768007A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Bwt Biometrics, Llc Methods of assessing embryo outcome
CN102576027B (zh) 2009-08-22 2014-10-01 里兰斯坦福初级大学理事会 成像并评估胚胎、卵母细胞和干细胞
WO2011071551A1 (en) 2009-12-08 2011-06-16 Molecular Biometrics, Inc. Sample cell for spectroscopic analysis, systems and uses thereof
EP2348318A1 (en) 2010-01-21 2011-07-27 Equipo Ivi Investigación, S.L. Diagnostic method for endometrial receptivity
GB2484457B (en) 2010-10-02 2015-04-15 Univ Plymouth Method and system for determining characteristics of an embryo and uses thereof
EP2811016B1 (en) 2011-05-31 2017-10-04 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastomere cleavage and morphology
US20140017717A1 (en) 2012-05-31 2014-01-16 Auxogyn, Inc. In vitro embryo blastocyst prediction methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007042044A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Unisense Fertilitech A/S Determination of a change in a cell population
WO2007144001A2 (en) * 2006-06-16 2007-12-21 Unisense Fertilitech A/S Embryo quality assessment based on blastomere division and movement
WO2008149055A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-11 General Electric Company Automatic characterization of cellular motion

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BASILLE, C. ; FRYDMAN, R. ; ALY, A.E. ; HESTERS, L. ; FANCHIN, R. ; TACHDJIAN, G. ; STEFFANN, J. ; LELORC'H, M. ; ACHOUR-FRYDMAN, : "Preimplantation genetic diagnosis: State of the art", EUROPEAN JOURNAL OF OBSTETRICS & GYNECOLOGY AND REPRODUCTIVE BIOLOGY, ELSEVIER IRELAND LTD., IE, vol. 145, no. 1, 1 July 2009 (2009-07-01), IE, pages 9 - 13, XP026219112, ISSN: 0301-2115, DOI: 10.1016/j.ejogrb.2009.04.004 *
BREZINOVA JANA; OBORNA IVANA; SVOBODOVA MAGDA; FINGEROVA HELENA: "Evaluation of day one embryo quality and IVF outcome – a comparison of two scoring systems", REPRODUCTIVE BIOLOGY AND ENDOCRINOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD., GB, vol. 7, no. 1, 3 February 2009 (2009-02-03), GB, pages 9, XP021050489, ISSN: 1477-7827, DOI: 10.1186/1477-7827-7-9 *
FENWICK J; PLATTEAU P; MURDOCH A P; HERBERT M: "Time from insemination to first cleavage predicts developmental competence of human preimplantation embryos in vitro.", HUMAN REPRODUCTION, OXFORD JOURNALS, GB, vol. 17, no. 2, 1 February 2002 (2002-02-01), GB, pages 407 - 412, XP009089687, ISSN: 0268-1161, DOI: 10.1093/humrep/17.2.407 *
HESTERS, L. ; PRISANT, N. ; FANCHIN, R. ; MENDEZ LOZANO, D.H. ; FEYEREISEN, E. ; FRYDMAN, R. ; TACHDJIAN, G. ; FRYDMAN, N.: "Impact of early cleaved zygote morphology on embryo development and in vitro fertilization-embryo transfer outcome: a prospective study", FERTILITY AND STERILITY., ELSEVIER SCIENCE INC, NEW YORK, NY, USA, vol. 89, no. 6, 1 June 2008 (2008-06-01), USA, pages 1677 - 1684, XP022795508, ISSN: 0015-0282, DOI: 10.1016/j.fertnstert.2007.04.047 *
HINKINS M ET AL: "Expression of Polycomb-group genes in human ovarian follicles, oocytes and preimplantation embryos", REPRODUCTION (CAMBRIDGE), vol. 130, no. 6, 1 December 2005 (2005-12-01), pages 883 - 888, XP002605521 *
JOSEPH S. FOTOS ; VIVEK P. PATEL ; NORMAN J. KARIN ; MURALI K. TEMBURNI ; JOHN T. KOH ; DENI S. GALILEO: "Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration", CYTOTECHNOLOGY, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DO, vol. 51, no. 1, 8 August 2006 (2006-08-08), Do, pages 7 - 19, XP019393911, ISSN: 1573-0778, DOI: 10.1007/s10616-006-9006-7 *
LECHNIAK DOROTA, ET AL: "Timing of the first zygotic cleavage as a marker of developmental potential of mammalian embryos.", REPRODUCTIVE BIOLOGY, TOWARZYSTWO BIOLOGII ROZRODU, POLAND, vol. 8, no. 1, 1 March 2008 (2008-03-01), Poland, pages 23 - 42, XP002605520, ISSN: 1642-431X *
PAYNE, J.F. RABURN, D.J. COUCHMAN, G.M. PRICE, T.M. JAMISON, M.G. WALMER, D.K.: "Relationship between pre-embryo pronuclear morphology (zygote score) and standard day 2 or 3 embryo morphology with regard to assisted reproductive technique outcomes", FERTILITY AND STERILITY., ELSEVIER SCIENCE INC, NEW YORK, NY, USA, vol. 84, no. 4, 1 October 2005 (2005-10-01), USA, pages 900 - 909, XP005150066, ISSN: 0015-0282, DOI: 10.1016/j.fertnstert.2005.04.047 *
PENNETIER S. ET AL.: "Spatio-Termporal Expression of the Germ Cell Marker Genes MATER, ZARI, GDF9, BMP15, VASA in Adult Bovine Tissues, Oocytes, and Preimplantation Embryos", BIOLOGY OF REPRODUCTION, NEW YORK, NY [U.A.] : ACADEM. PRESS, US, vol. 71, no. 4, 1 October 2004 (2004-10-01), US, pages 1359 - 1366, XP008100520, ISSN: 0006-3363, DOI: 10.1095/biolreprod.104.030288 *
SHOUKIR YOUSSEF, ET AL: "Early cleavage of in-vitro fertilized human embryos to the 2-cell stage: A novel indicator of embryo quality and viability", HUMAN REPRODUCTION, OXFORD JOURNALS, GB, vol. 12, no. 7, 1 January 1997 (1997-01-01), GB, pages 1531 - 1536, XP002605519, ISSN: 0268-1161 *
WAGNER WOLFGANG ET AL: "Hematopoietic progenitor cells and cellular microenvironment: Behavioral and molecular changes upon interaction", STEM CELLS., ALPHAMED PRESS, DAYTON, OH., US, vol. 23, no. 8, 1 September 2005 (2005-09-01), US, pages 1180 - 1191, XP002605522, ISSN: 1066-5099, DOI: 10.1634/STEMCELLS.2004-0361 *
WEITZMAN, V.N. ; SCHNEE-RIESZ, J. ; BENADIVA, C. ; NULSEN, J. ; SIANO, L. ; MAIER, D.: "Predictive value of embryo grading for embryos with known outcomes", FERTILITY AND STERILITY., ELSEVIER SCIENCE INC, NEW YORK, NY, USA, vol. 93, no. 2, 15 January 2010 (2010-01-15), USA, pages 658 - 662, XP026867470, ISSN: 0015-0282 *
ZHENG PING; DEAN JURRIEN: "Oocyte-specific genes affect folliculogenesis, fertilization, and early development", SEMINARS IN REPRODUCTIVE MEDICINE, THIEME MEDICAL PUBLISHERS, NEW YORK, NY, US, vol. 25, no. 4, 1 July 2007 (2007-07-01), US, pages 243 - 251, XP009140006, ISSN: 1526-8004, DOI: 10.1055/s-2007-980218 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1186521A1 (en) 2014-03-14
CA2761231A1 (en) 2011-03-03
MY180473A (en) 2020-11-30
ES2838698T3 (es) 2021-07-02
ES2838698T7 (es) 2022-02-18
JP2016104018A (ja) 2016-06-09
DK2827150T6 (da) 2021-11-22
AU2010286740A1 (en) 2011-11-24
EP3805762A1 (en) 2021-04-14
HK1201915A1 (en) 2015-09-11
DK201200196A (en) 2012-03-22
AU2010286740A2 (en) 2011-12-15
PL2827150T6 (pl) 2021-05-31
IN2012DN02452A (ru) 2015-08-21
US8337387B2 (en) 2012-12-25
KR20120066023A (ko) 2012-06-21
US20120094326A1 (en) 2012-04-19
CL2012000456A1 (es) 2012-08-03
CA2761231C (en) 2021-07-13
DK2827150T3 (da) 2020-11-16
BR112012003847A2 (pt) 2016-03-22
ZA201201363B (en) 2013-05-29
EP2827150A1 (en) 2015-01-21
DK2430454T3 (da) 2013-02-11
US8721521B2 (en) 2014-05-13
US20130165745A1 (en) 2013-06-27
ES2399711T3 (es) 2013-04-02
CN104293646A (zh) 2015-01-21
HK1166521A1 (en) 2012-11-02
ES2500057T3 (es) 2014-09-29
EA025172B9 (ru) 2017-01-30
CN102576027A (zh) 2012-07-11
EP2430454A1 (en) 2012-03-21
DK2615460T3 (da) 2014-08-25
JP5951487B2 (ja) 2016-07-13
PL2827150T3 (pl) 2021-05-31
US8323177B2 (en) 2012-12-04
US8951184B2 (en) 2015-02-10
EP3805762C0 (en) 2024-02-07
US20110105834A1 (en) 2011-05-05
BR112012003847B1 (pt) 2020-12-01
IL218239A0 (en) 2012-04-30
US20170089820A1 (en) 2017-03-30
US7963906B2 (en) 2011-06-21
IL218239A (en) 2017-03-30
HUE052071T2 (hu) 2021-04-28
US9228931B2 (en) 2016-01-05
US20130162795A1 (en) 2013-06-27
EP2827150B3 (en) 2021-08-18
EP2615460B1 (en) 2014-06-25
EA201270300A1 (ru) 2013-01-30
NZ598293A (en) 2014-06-27
MX2012002266A (es) 2012-09-07
EP2430454B1 (en) 2013-01-23
JP2013502233A (ja) 2013-01-24
PT2827150T (pt) 2020-12-09
EP3805762B1 (en) 2024-02-07
CN102576027B (zh) 2014-10-01
US8989475B2 (en) 2015-03-24
WO2011025736A1 (en) 2011-03-03
SG178536A1 (en) 2012-03-29
EP2827150B1 (en) 2020-10-21
US20110092762A1 (en) 2011-04-21
AU2010286740B2 (en) 2016-03-10
US20150125890A1 (en) 2015-05-07
KR101747983B1 (ko) 2017-06-15
US20120095287A1 (en) 2012-04-19
US20150160117A1 (en) 2015-06-11
EP2615460A1 (en) 2013-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA025172B1 (ru) Способ оценки способности достижения одним или более эмбрионами человека стадии бластоцисты
US9879307B2 (en) Methods of detecting aneuploidy in human embryos

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent