ES2831867T3

ES2831867T3 - Evaluación automática de embriones en incubación in vitro

Info

Publication number: ES2831867T3
Application number: ES13756438T
Authority: ES
Inventors: Niels B Ramsing; Mette Laegdsmand; Jens K Gundersen; Søren Porsgaard; Inge Errebo Agerholm
Original assignee: Unisense Fertilitech AS
Current assignee: Unisense Fertilitech AS
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN104755608A; WO2014033210A1; CN110688985A

Abstract

Un método implementado por ordenador para detectar automáticamente variaciones y/o anomalías en las condiciones de cultivo de embriones en incubación in vitro, comprendiendo el método las etapas de: a) obtener un primer conjunto de datos que comprende parámetros morfocinéticos relacionados con el desarrollo de un primer grupo de embriones, b) obtener un segundo conjunto de datos que comprende los correspondientes parámetros morfocinéticos relacionados con el desarrollo de un segundo grupo de embriones, c) modificar el primer y el segundo conjunto de datos extrayendo valores atípicos de parámetros morfocinéticos del primer conjunto de datos y/o del segundo conjunto de datos, d) calcular la diferencia entre parámetros morfocinéticos concretos del primer conjunto de datos modificado y los parámetros morfocinéticos correspondientes del segundo conjunto de datos modificado, y e) seguir dicha diferencia morfocinética detectando de este modo variaciones en las condiciones de cultivo del primer y el segundo grupo de embriones, y emitir una alerta cuando la diferencia morfocinética está por encima de un nivel predefinido.

Description

DESCRIPCIÓN

Evaluación automática de embriones en incubación in vitro

La presente invención se refiere a un sistema y un método para evaluar automáticamente las condiciones de desarrollo de embriones en incubación in vitro. La presente invención puede aplicarse dentro del control de calidad de la manipulación de embriones en relación con la FIV, para garantizar que se mantenga la calidad de los embriones transferidos. Por tanto, la presente invención puede ser una herramienta para que las clínicas de fertilidad evalúen y mantengan un alto potencial de implantación de embriones en incubación in vitro.

Antecedentes de la invención

La infertilidad afecta a más de 80 millones de personas en todo el mundo. Se estima que el 10 % de todas las parejas experimentan infertilidad primaria o secundaria. La fertilización in vitro (FIV) es un tratamiento médico voluntario que puede brindarle a una pareja, que de otra manera no hubiera podido concebir, la posibilidad de establecer un embarazo. Es un procedimiento en el que se toman óvulos (ovocitos) de los ovarios de una mujer y luego se fertilizan con esperma en el laboratorio. Los embriones creados en este procedimiento se colocan después en el útero para su posible implantación.

El control de calidad (CC) es una cuestión importante en las clínicas de FIV para el seguir la calidad del tratamiento y los distintos procedimientos en las clínicas que tengan un efecto sobre las condiciones de desarrollo del embrión. El control de calidad se puede efectuar siguiendo el desarrollo de promedios móviles en criterios de valoración como • Tasas de embarazos bioquímicos (número de positivos para HCG por embriones transferidos)

• Tasas de latidos cardiacos fetales (número de latidos cardiacos fetales por embriones transferidos)

• Tasa de abortos (número de abortos por embriones implantados)

• Índice KID (el número de implantaciones conocidas (definido como latido cardíaco fetal o positivo para HCG) por resultado conocido)

El valor de este tipo de seguimiento es indiscutible, pero el seguimiento es lento para responder debido a un número limitado de embriones transferidos y una cantidad aún menor de embriones de implantación conocidos en una clínica concreta. Un problema adicional es la demora debida al retraso cuando se espera a los resultados de la prueba de HCG, el resultado de las exploraciones y la información de abortos. La sensibilidad es limitada debido al resultado binomial discreto del procedimiento (embarazada/no embarazada, abortado/no abortado, implantado/no implantado), lo que significa que se necesita una gran población para evaluar si se ha producido un cambio significativo. Esto induce un retraso adicional en el seguimiento del control de calidad.

Herrero J et al. en "Linking successful implantation with the exact timing of cell division events obtained by time-lapse system in the embryoscope", Fertility And Sterility, Elsevier Science Inc, Nueva York, NY, EE.UU., vol. 94, n.° 4, página S149, divulgan un sistema secuencial (time-lapse system) utilizado para la adquisición de imágenes de embriones y el análisis posterior de la temporización exacta de los sucesos de división celular. El fin del estudio es vincular la implantación satisfactoria de embriones con la temporización exacta de los sucesos de división celular. Lemmen J G et al. en "Kinetic markers of human embryo quality using time-lapse recordings of IVF/ICSI-fertilized oocytes", Reproductive Biomedicine Online, Reproductive Healthcare Ltd, RU, vol. 17, n.° 3, páginas 385 - 391, divulgan un sistema secuencial (time-lapse system) utilizado para estudiar la temporización y la coordinación de sucesos durante el desarrollo temprano desde el cigoto hasta el embrión en estadio de segmentación. El objetivo era identificar marcadores vinculados con la implantación y los embriones de buena calidad. La desaparición temprana de los pronúcleos y el inicio de la primera segmentación después de la fertilización se correlacionó con un mayor número de blastómeros el día 2 después de la obtención de ovocitos. Además, la sincronía en la apariencia de los núcleos después de la primera segmentación se asoció de forma significativa con el éxito del embarazo (P < 0,05). El documento EP2282210 divulga un sistema y un método para determinar la calidad de embriones que comprende controlar al embrión durante un período de tiempo, teniendo dicho período de tiempo una longitud suficiente para comprender al menos un período de división celular y al menos una parte de un período entre divisiones, y determinar la duración del al menos un período de división celular; y/o ii) determinar la extensión y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante el período de división celular; y/o iii) determinar la duración de un período entre divisiones; y/o iv) determinar la extensión y/o distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante el período entre divisiones, obteniendo de este modo una medida de la calidad del embrión. Por tanto, la selección de embriones óptimos a implantar después de la fertilización in vitro (FIV) se facilita basándose en la temporización, duración, distribución espacial y extensión de las divisiones celulares observadas, y el movimiento celular y de orgánulos asociado.

M. Meseguer et al, "The Use of Morphokinetics as a Predictor of Embryo Implantation", Human Reproduction, n.° 10, ISSN 0268-1161, páginas 2658 - 2671, divulgan una incubadora de FIV con una cámara incorporada diseñada para adquirir imágenes automáticamente en puntos temporales definidos, para seguir simultáneamente 72 embriones sin retirar los embriones del ambiente controlado. El análisis de los tiempos de segmentación, el tamaño del blastómero y la multinucleación se realizaron para 247 embriones transferidos con implantación fallida o completa. Se descubrió que varios parámetros se correlacionaban con la implantación posterior (por ejemplo, el tiempo de la primera y posteriores segmentaciones, así como el tiempo entre segmentaciones).

Mariabeatrice Dal Canto et al, "Cleavage kinetics analysis of human embryos predicts development to blastocyst and implantation", Reproductive Biomedicine Online, (20120802), vol. 25, n.° 5, ISSN 1472-6483, páginas 474 - 480, divulgan que la cinética de segmentación de los embriones en desarrollo puede utilizarse para indicar la capacidad de los embriones para desarrollarse en blastocisto e implantarse. Se dice que la segmentación del estadio de 2 células al de 8 células se produce progresivamente más temprano en los embriones con capacidad de desarrollarse a blastocisto, de expandirse e implantarse.

Connie Wong et al., "Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage", Nature Biotechnology, (20101001), vol. 28, n.° 10, ISSN 1087-0156, páginas 1115 - 1121, desvelan un enfoque para la obtención de imágenes no invasiva de embriones humanos y concluyen que el éxito y el fracaso del desarrollo embrionario humano está determinado en gran medida por los sucesos anteriores a la activación del genoma embrionario.

Sumario de la invención

Si el control de calidad debe recoger, por ejemplo, la ineficacia para cumplir con mejores prácticas (por ejemplo, errores en la manipulación de los embriones), toxicidad de los utensilios o materiales fungibles del laboratorio (por ejemplo, aceite o medios tóxicos), o cambios ambientales (contaminación del aire del laboratorio), entonces la respuesta debe ser precisa, rápida y sensible. Precisa para que las medidas de corrección solo se establezcan si algo está realmente mal, rápida para que las modificaciones se puedan implementar lo más rápido posible y sensible para que incluso los pequeños cambios en el procedimiento se puedan detectar y corregir. Por lo tanto, se necesita una herramienta sensible y de respuesta rápida para seguir los procedimientos clínicos.

Por lo tanto, una realización de la invención se refiere a un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 1.

Se sabe que las variables morfocinéticas son indicadores importantes de las tasas de éxito de la implantación embrionaria. En la presente invención, los parámetros morfocinéticos se utilizan como indicadores de control de calidad y, por lo tanto, forman una alternativa para seguir las tasas de embarazo o las variables relacionadas que están retrasadas por definición. La gran ventaja de utilizar parámetros morfocinéticos es que el número de embriones en una clínica es de alrededor de una magnitud mayor que el número de embriones transferidos, y las variables están disponibles tan pronto como finaliza la incubación (2-5 días después de la fertilización). Adicionalmente, el número de parámetros morfocinéticos disponibles es de alrededor de una magnitud mayor que el número de embriones, debido a que cada embrión "produce" una pluralidad de parámetros morfocinéticos durante los distintos estadios de desarrollo. Por lo tanto, al seguir los parámetros morfocinéticos en lugar de las tasas de embarazo, se puede aumentar la velocidad y la precisión. Dado que, por ejemplo, las temporizaciones de las segmentaciones son variables continuas en lugar de discretas, la sensibilidad de las pruebas estadísticas que pueden utilizarse para probar si dos grupos son significativamente distintos aumenta considerablemente.

La presente invención se aplica de forma más natural a embriones humanos, pero también se puede aplicar en el seguimiento de cualquier embrión de mamífero.

Definiciones y parámetros de calidad embrionaria

El tiempo de segmentación se define como el primer punto temporal observado cuando los blastómeros recién formados están completamente separados por membranas celulares confluentes, el tiempo de segmentación es, por lo tanto, el tiempo de finalización de una segmentación del blastómero. En el presente contexto, los tiempos se expresan como horas posmicroinyección ICSI (forma siglada del inglés intracytoplasmic sperm injection, inyección intracitoplásmica de espermatozoides) o tiempo posterior a la mezcla de semen y los ovocitos en la FIV, es decir, el momento de la inseminación. Este es el momento de la introducción deliberada de espermatozoides en el óvulo. Sin embargo, en el presente documento, el término fertilización también se utiliza para describir este punto temporal. Por tanto, los tiempos de segmentación son los siguientes:

t2: Tiempo de segmentación a embrión de 2 blastómeros

t3: Tiempo de segmentación a embrión de 3 blastómeros

t4: Tiempo de segmentación a embrión de 4 blastómeros

t5: Tiempo de segmentación a embrión de 5 blastómeros

t6: Tiempo de segmentación a embrión de 6 blastómeros

t7: Tiempo de segmentación a embrión de 7 blastómeros

t8: Tiempo de segmentación a embrión de 8 blastómeros

La duración de los ciclos celulares se define de la siguiente manera:

• cc1 = t2: Primer ciclo celular.

• cc2 = t3-t2: Segundo ciclo celular, duración del período como embrión de 2 blastómeros.

• cc2b = t4-t2: Segundo ciclo celular para ambos blastómeros, duración del período como embrión de 2 y 3 blastómeros.

• cc3 = t5-t3: Tercer ciclo celular, duración del período como embrión de 3 y 4 blastómeros.

• cc2_3 = t5-t2: Segundo y tercer ciclo celular, duración del período como embriones de 2, 3 y 4 blastómeros. • cc4 = t9-t5: Cuarto ciclo celular, duración del período como embrión de 5, 6, 7 y 8 blastómeros.

Ciclos celulares cortos y largos

En un embrión con una segmentación directa, el tiempo entre una de las divisiones celulares parece ser inadecuado para la replicación del ADN de todo el genoma. Para los primeros tres ciclos celulares:

• Ciclo celular 1, cc1, que no es un ciclo celular convencional ya que combina el proceso de fertilización, formación y desaparición de pronúcleos, etc. - hasta el advenimiento de la primera división celular, punto temporal en el que los alelos materno y paterno se han combinado en el genoma embrionario. El genoma combinado presumiblemente se ha replicado antes de la división celular del cigoto a 2 células. cc1=t2.

• Ciclo celular 2, cc2, el tiempo desde la finalización de la primera división celular que da como resultado dos células hasta la siguiente división celular que da como resultado tres células, es decir, cc2 = t3 - t2.

• Ciclo celular 3, cc3, es el tiempo necesario para el tercer ciclo de replicación del ADN. Cuando un embrión de cuatro células se divide en cinco células, debería tener cinco copias completas del genoma y las dos células más nuevas del embrión de cinco células deberían haber finalizado satisfactoriamente su tercer ciclo de replicación del ADN. Como la célula más rápida en dividirse es probablemente la que apareció inicialmente después de la primera segmentación del embrión de dos células en tres células, la mejor estimación para el ciclo celular más rápido es: cc3 = t5 - t3, el tiempo de segmentación a cinco células menos el tiempo de segmentación a tres células.

Embriones de ciclo celular corto, SCC (forma siglada de short cell cycle, ciclo celular corto)

En embriones de ciclo celular corto se encuentra alguna de las siguientes condiciones:

• cc1 = t2 < 15 horas, o

• cc2 = t3 - t2 < 5 horas, o

• cc3 = t5 - t3 < 5 horas

Embriones de ciclo celular largo, LCC (forma siglada de long cell cycle, ciclo celular largo)

Un concepto similar, que podría ser igualmente útil, es "Embriones de ciclo celular largo". Estos embriones son embriones que se desarrollan muy lentamente con duraciones inusualmente largas para sus ciclos celulares. Los embriones de ciclo celular largo tienen un mal pronóstico similar, y es significativamente menos probable que se implanten, que los embriones más normales (como se muestra a continuación). Sin embargo, la clase de "embriones de ciclo celular largo" está menos claramente definida que los ciclos celulares cortos, ya que la distribución en el extremo superior es continua con un potencial de implantación que disminuye gradualmente. Por lo tanto, es menos claro cómo definir los límites de esta clase. Los límites para la clase de embriones de ciclo celular largo se han elegido de modo que la clase de LCC se correlacione con un potencial de implantación notablemente reducido similar al encontrado para los embriones de ciclo celular corto. Por tanto, se define la clase de ciclo celular largo con un tamaño comparable a la clase de embriones de ciclo celular corto:

Embrión de ciclo celular largo, LCC, implica

• cc1 = t2 > 32 horas, o

• cc2 = t3 - t2 > 20 horas, o

• cc3 = t5 - t3 > 25 horas

Embriones de ciclo celular medio, MCC (forma siglada de medium cell cycle, ciclo celular medio)

Todos los embriones que caen entre los grupos, es decir, embriones en que:

• cc1 es de 15 a 32 horas, y

• cc2 de 5 a 20 horas y

• cc3 de 5 a 25 horas.

se clasifican como embriones de ciclo celular medio. Estos son los embriones "normales" con un patrón de segmentación normal. Los embriones MCC normalmente constituyen aproximadamente el 60 % de todos los embriones, que se puede utilizar para comparar el desarrollo embrionario de una clínica a otra. Por ejemplo, el primer grupo de embriones puede seleccionarse entre embriones de MCC.

Las sincronicidades se definen de la siguiente manera:

• s2 = t4-t3: Sincronía en la división de embriones de 2 blastómeros a 4 embriones de blastómeros.

• s3 = t8-t5: Sincronía en la división de embriones de 4 blastómeros a 8 embriones de blastómeros.

• s3a = t6-t5; s3b = t7-t6; s3c = t8-t7: Duración de las divisiones celulares individuales implicadas en el desarrollo de un embrión de 4 blastómeros a un embrión de 8 blastómeros.

Período de segmentación: El período de tiempo desde la primera observación de hendiduras en la membrana celular (que indica el inicio de la segmentación citoplásmica) hasta que la segmentación de la célula a nivel citoplasmático es completa, de modo que los blastómeros están completamente separados por membranas celulares confluentes. También denominado como duración de la citocinesis.

La fertilización y la segmentación son los principales sucesos morfológicos de un embrión, al menos hasta el estadio de 8 blastómeros. Tiempo de segmentación, ciclo celular, sincronía de la división y período de segmentación son ejemplos de parámetros morfológicos del embrión que se pueden definir a partir de estos sucesos morfológicos primarios y cada uno de estos parámetros morfológicos del embrión se define como la duración de un período de tiempo entre dos sucesos morfológicos, por ejemplo, medido en horas.

Un parámetro embrionario morfológico normalizado se define como la relación de dos parámetros embrionarios morfológicos, por ejemplo, cc2 dividido por cc3 (cc2/cc3), o cc2/cc2_3 o cc3/t5 o s2/cc2.

La duración de una pluralidad de ciclos celulares (por ejemplo, CC1, CC2, CC3 y CC4) se puede combinar para formar un parámetro normalizado común:

en que CCi, por ejemplo, se selecciona de CC1 a CC4. En una realización de la invención, un alto valor de CCnorm indica una mala calidad del embrión ya que una o más de las variables CCi está lejos de la mediana, es decir, no se utilizan los valores absolutos de CCi, sino la relación mutua de las variables. La mediana puede calcularse basándose en la población total o partes de la población (por ejemplo, embriones con implantación positiva y conocida). Otra variable equivalente que utiliza en cambio el valor logarítmico (ICCnorm) también puede ser útil para valorar la calidad del embrión.

Asimismo, la sincronicidad Si de divisiones celulares (por ejemplo, S2, S3 y S4) se puede combinar para formar un parámetro normalizado común:

En una realización de la invención, un alto valor de Snorm indica una mala calidad del embrión ya que una o más de las sincronicidades son largas en comparación con. Otra variable equivalente que utiliza en cambio el valor logarítmico (ISnorm) también puede ser útil para valorar la calidad del embrión.

Las variables CCnorm y Snorm pueden calcularse basándose en el primer, segundo, tercer o cuarto ciclo celular, dependiendo de la duración de la incubación.

En algunos ejemplos, se puede establecer un parámetro morfocinético para embriones que se utiliza en conformidad con determinadas realizaciones de la invención, combinando una pluralidad de características morfocinéticas relacionadas con el desarrollo de los respectivos embriones. Por ejemplo, en algunas implementaciones, el parámetro morfocinético puede obtenerse obteniendo valores para una pluralidad de características morfocinéticas relacionadas con el desarrollo de un embrión durante un período de observación, por ejemplo, características tales como los tiempos de segmentación celular (t2, t3, t4...) y / o diferencias entre los tiempos / divisiones de segmentación celular posteriores (t3-t2, t4-t3, t5-t4...) y / o duraciones del ciclo (cc1, cc2, cc3... etc). A continuación, se puede determinar un valor para una variable continua combinando diferencias entre los valores obtenidos para la pluralidad de características y los valores de referencia correspondientes de una manera predefinida. Los valores de referencia pueden, por ejemplo, determinarse a partir de los valores de la pluralidad de características obtenidas para uno o más embriones de referencia de potencial de desarrollo conocido (por ejemplo, embriones positivos para KID). Por tanto, a partir de la variable continua puede establecerse un parámetro morfocinético para un embrión que se va a utilizar en conformidad con determinadas realizaciones de la invención. En este sentido, el parámetro morfocinético puede corresponder con el potencial de desarrollo de un embrión determinado en conformidad con los principios establecidos en la solicitud de patente en trámite junto con la presente PCT/EP2013/063240, presentada el 25 de junio de 2013, cuyo contenido completo se incorpora por referencia en el presente documento.

En conformidad con algunas implementaciones de ejemplo, la etapa de combinar las diferencias entre los valores obtenidos para la pluralidad de características morfocinéticas y los valores de referencia correspondientes puede tener en cuenta los valores de ponderación asociados con cada uno de los valores de referencia. Los valores de ponderación pueden, por ejemplo, determinarse estadísticamente a partir de valores para la pluralidad de características obtenidas para una pluralidad de embriones de referencia de potencial de desarrollo conocido. Por ejemplo, los valores de ponderación pueden determinarse a partir de una variación de los valores de interés obtenidos para la pluralidad de embriones de referencia.

Algunas implementaciones de ejemplo de la presente invención pueden comprender además obtener valores para una pluralidad adicional de características relacionadas con el desarrollo del embrión durante el período de observación; determinar un valor para una variable continua adicional combinando diferencias entre los valores obtenidos y los valores de referencia correspondientes para la pluralidad adicional de características de una manera predefinida adicional; y establecer el potencial de desarrollo para el embrión basándose también en el valor determinado para la variable continua adicional.

En algunos ejemplos, una característica morfocinética de los embriones se puede determinar combinando / añadiendo diferencias para diversas características observadas para cada embrión y los valores de referencia correspondientes (por ejemplo, determinados para una población de embriones positiva para KID), para generar lo que podría denominarse una variable de irregularidad generalizada (GIV, forma siglada de generalized irregularity variable), que en algunos casos se puede definir como:

En que cci es una serie de duraciones del ciclo celular observadas para un embrión, ccim es la serie correspondiente de duraciones promedio del ciclo celular observadas en un grupo de embriones de referencia (por ejemplo, una población positiva para KID de pacientes menores de 35 años), y cciv son los valores de varianza correspondientes asociados con la población de referencia. El parámetro n es el número de duraciones del ciclo celular que comprende la serie cci. Las diferencias (cci - ccim) se normalizan mediante los valores de varianza cciv como parte de la combinación. Esto significa que las diferencias para ciclos celulares particulares (valores de i) que presentan una varianza relativamente alta en la población de muestra contribuyen menos al valor de la GIV que las diferencias para el ciclo celular que presentan una varianza relativamente baja en la población de muestra. Las diferencias (cci -ccim) están al cuadrado en la combinación, y esto significa que la contribución a la GIV es la misma para una diferencia dada, independientemente de si es positiva o negativa (es decir, si cci es más largo o más corto que ccim). La serie cci puede comprender duraciones para diversos ciclos celulares distintos en distintas implementaciones, como se describe más adelante.

En términos generales, la GIV, tal como se define anteriormente, es baja cuando el embrión de estudio presenta un patrón de segmentación regular y es alta cuando el embrión presenta un patrón de segmentación irregular.

En algunos ejemplos, una característica morfocinética de los embriones puede denominarse variable de tiempo generalizada (GTV, forma siglada de generalized time variable), definida como:

En que Atj es una serie de diferencias en los tiempos para las divisiones celulares posteriores observadas para un embrión, Atjm es la serie correspondiente de valores promedio observados en un grupo de embriones de referencia (por ejemplo, la población positiva para KID de pacientes menores de 35 años), y Atjv son los valores de varianza correspondientes asociados con la población de referencia. El parámetro k es el número de valores que comprenden la serie Atj. Las diferencias (Atj - Atjm) se normalizan mediante los valores de varianza Atjv como parte de la combinación. Esto significa que las diferencias para divisiones celulares particulares (valores de j) que presentan una varianza relativamente alta en la población de muestra contribuyen menos al valor de la GTV que las que presentan una varianza relativamente baja en la población de muestra. En este ejemplo, la contribución a la GTV para cada diferencia de tiempo depende de si la diferencia de tiempos para una pareja particular de divisiones celulares posteriores es más rápida o más lenta que el promedio observado en la población positiva para KID (es decir, si la diferencia es positiva o negativa).

La solicitud en trámite PCT/DK2012/050236, presentada el 29.06.2012 y titulada "Criterios adaptativos de selección de embriones optimizados mediante la personalización iterativa y la colaboración" del mismo solicitante se refiere a la cuestión de la adaptación de los criterios de calidad de los embriones entre poblaciones de cultivos de embriones en distintas condiciones de incubación, por ejemplo, en distintas clínicas. Esta solicitud se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad. Sin embargo, parámetros de calidad como CCnorm, ICCnorm, S puede ayudar a garantizar que los modelos de calidad sean directamente aplicables a distintas poblaciones de embriones cultivados en distintas condiciones de incubación, debido a que se basan en variables que son insensible a las diferencias en las condiciones de ejecución. Otro ejemplo de eso son los parámetros de calidad basados en períodos de tiempo relativos (por ejemplo, CC2/CC3), las variables divididas con una estimación central de esa variable (por ejemplo, media o mediana, por ejemplo, cc2/cc2_median) o el uso de intervalos diana en que se ajusta la escala del centro de acuerdo con una estimación central y se ajusta la escala de los límites de acuerdo con una estimación de la varianza (por ejemplo, varianza, desviación típica, percentiles).

Se pueden utilizar las siguientes variables discretas (binarias)

MN2: Multinucleación observada en el estadio de 2 blastómeros; puede tomar los valores "Verdadero" o Falso". MN2val: el número de células multinucleares en el estadio de 2 células (0,1,2).

MN4: Multinucleación observada en el estadio de 4 blastómeros; puede tomar los valores "Verdadero" o Falso". MN4val: el número de células multinucleares en el estadio de 4 células (0,1,2,3,4).

EV2: Uniformidad de los blastómeros en el embrión de 2 blastómeros; puede tomar los valores "Verdadero" (es decir, uniforme) o "Falso" (es decir, desigual).

Parámetros relacionados con blastocistos

Un criterio de calidad de blastocistos es un ejemplo de criterio de calidad de embriones. Se pueden utilizar los siguientes parámetros relacionados con blastocistos:

Compactación inicial (IC, forma siglada de initial compaction) describe la primera vez que se observa una compactación entre 2 o más blastómeros. La compactación es un proceso en donde una intensificación de los contactos entre los blastómeros con uniones estrechas y desmosomas da como resultado la reducción del espacio intercelular y una difuminación de los contornos de las células (véase la fig. 3). La compactación se puede observar en el estadio de 6-8 células, pero rara vez los embriones se segmentan a 16 células o más antes de que se produzca la compactación.

Compactación/Mórula (M) se define como la primera vez en que no es visible ninguna membrana plasmática entre los blastómeros. Cuando finaliza la compactación, no son visibles las membranas plasmáticas entre ninguno de los blastómeros que forman la compactación y el embrión puede definirse como una mórula. El estadio se caracteriza por un proceso con una intensificación de los contactos entre los blastómeros con uniones estrechas y desmosomas, dando como resultado la reducción del espacio intercelular y una difuminación de los contornos de las células. La compactación/mórula en ocasiones se puede observar en el estadio de 6-8 células durante el período de la 3a división (sincronía) (S3), pero con mayor frecuencia se observa compactación/mórula después de S3, cerca o justo al comienzo del cuarto período de sincronía (S4). Rara vez los embriones se segmentan a 16 células o más antes de que se produzca la compactación.

Diferenciación inicial del trofectodermo (IDT, forma siglada de initial differentiation of trophectoderm) se define como la primera vez durante el estadio de compactación en que se reconocen distintas células de trofectodermo. Describe el inicio de la diferenciación de las células del trofectodermo. Los blastómeros se aplanan y alargan gradualmente creando una barrera entre el entorno exterior y la parte celular interna de la mórula.

Inicio de la cavitación/blastocisto temprano/blastocisto (Bl) se define como la primera vez que una cavidad llena de líquido, el blastocele, se puede observar. Describe el inicio del período de transición entre la compactación y el estadio de blastocisto del embrión. Los embriones a menudo permanecen en este estadio de transición durante un período de tiempo antes de entrar en el estadio de blastocisto real. El inicio de la cavitación suele aparecer inmediatamente después de la diferenciación de las células del trofectodermo. La capa externa de la mórula en contacto con el entorno exterior comienza a bombear activamente sal y agua al espacio intercelular, como resultado de lo cual comienza a formarse una cavidad (el blastocele).

Diferenciación inicial de la masa celular interna (IDCIM, forma siglada de initial differentiation of inner cell mass), definido como la primera vez después del OC (forma siglada de onset of cavitation, inicio de la cavitación) que puede reconocerse la masa celular interna. La IDCIM describe el inicio del desarrollo de la masa celular interna. Un agrupamiento de células colocadas excéntricamente conectadas por uniones comunicantes en que los límites entre las células no parecen estar bien definidos.

Inicio de la expansión del blastocisto (EB, forma siglada de expansion of the blastocyst) se define como la primera vez que el embrión tiene lleno el espacio perivitelino y comienza a moverse/expandirse la zona pelúcida. El EB describe el inicio de la expansión de los embriones. A medida que el blastocisto se expande, la zona pelúcida se vuelve visiblemente más delgada.

Blastocisto en eclosión (HB, forma siglada de hatching blastocyst) se define como la primera vez que una célula del trofectodermo ha escapado a/penetrado en la zona pelúcida.

Blastocisto completamente eclosionado (FH, forma siglada de fully hatched) se define como cuando la eclosión finaliza, con el desprendimiento de la zona pelúcida.

Número de contracciones (NC (X)) describe el número de contracciones (X) que experimenta el embrión después del inicio de la cavitación. En muchos embriones, las contracciones pueden ser bastante grandes y dar lugar a una gran reducción del volumen embrionario. Una contracción se define como una reducción en el área de la sección transversal del embrión de más del 15 %.

Grado de vacuolización (VC (X): X={0, 1, 2, 3}) describe el grado de vacuolización después de que el embrión ha experimentado compactación. El grado de vacuolas se clasifica mediante una escala de 0-3 (0 = sin vacuolización; 1 = grado pequeño de vacuolización en que aparecen pequeñas vacuolas después de la compactación, pero el desarrollo embrionario no parece verse afectado; 2 = grado moderado de vacuolización en que aparecen grandes vacuolas después de la compactación y el desarrollo embrionario se ve afectado en cierta medida; 3 = vacuolización extensa donde aparecen vacuolas muy grandes después de la compactación y el desarrollo embrionario se ve gravemente afectado. En esta incidencia, las vacuolas pueden confundirse con la cavitación del blastocisto.

Compactación - descompactación-compactación (CDC) describe un fenómeno en que había comenzado una compactación inicial del embrión pero se interrumpe la segmentación. Los límites celulares de los blastómeros se vuelven de nuevo visibles, pero después de un tiempo el embrión vuelve a tener una composición compacta.

Compactación parcial (PC, forma siglada de partial compaction) describe una compactación desigual, donde uno o más de los blastómeros no están incluidos en la compactación.

En los seres humanos, la activación de genes embrionarios (EGA, forma siglada de embryonic gene activation) se produce normalmente en el día 3, alrededor del estadio de 8 células. Antes de la eGa , se observa que los embriones traducen solo el ARNm heredado de la madre, es decir, el ARNm que está presente en el ovocito cuando se fertiliza. El ARNm está localizado en distintas partes del ovocito, de modo que a medida que el oocito/cigoto se divide, se segrega en distintos blastómeros. Se cree que esta segregación es la base de gran parte de la diferenciación de las células que se produce antes de la EGA. Después de EGA, el embrión comienza a transcribir su propio ADN, las células se vuelven móviles y la división celular se vuelve asincrónica. Dado que las células ahora están transcribiendo su propio ADN, este estadio es donde se observa por primera vez la expresión diferencial de los genes paternos. La transición alrededor de la EGA también se denomina transición de la midblastula o midblastula.

Reorganización de la posición celular = movimiento celular (ver más abajo) Movimiento celular: Movimiento del centro de la célula y la membrana celular externa. El movimiento interno de los orgánulos dentro de la célula NO es un movimiento celular. La membrana celular externa es una estructura dinámica, por lo que el límite de las células cambiará ligeramente de posición de forma continua. Sin embargo, estas ligeras fluctuaciones no se consideran movimiento celular. El movimiento celular es cuando el centro de gravedad de la célula y su posición con respecto a otras células cambian, así como cuando las células se dividen. El movimiento celular se puede cuantificar calculando la diferencia entre dos imágenes digitales consecutivas de la célula en movimiento. Un ejemplo de tal cuantificación se describe en detalle en la solicitud PCT en trámite titulada "Determinación de un cambio en una población celular", presentada el 16 de octubre de 2006. Sin embargo, se pueden prever otros métodos para determinar el movimiento del centro de gravedad celular y/o la posición de membranas citoplasmáticas, por ejemplo, utilizando el programa informático FertiMorph (ImageHouse Medical, Copenhague, Dinamarca) para delinear semiautomáticamente el límite de cada blastómero en cortes transversales ópticos consecutivos a través de un embrión.

Otros parámetros

Movimiento de orgánulos: Movimiento de orgánulos internos y de membranas de orgánulos dentro del embrión que pueden ser visibles al microscopio. El movimiento de orgánulos no es un movimiento celular en el contexto de la presente solicitud.

Movimiento: reorganización espacial de los objetos. Los movimientos se caracterizan y/o cuantifican, y/o describen, mediante muchos parámetros distintos, incluidos, pero no restringidos a: extensión del movimiento, área y/o volumen implicado en el movimiento, rotación, vectores de traslado, orientación del movimiento, velocidad de movimiento, cambio de tamaño, inflación/deflación, etc. Por tanto, se pueden utilizar distintas medidas de movimiento celular o de orgánulos para distintos fines, algunas de las cuales reflejan la extensión o magnitud del movimiento, algunas la distribución espacial de los objetos en movimiento, algunas las trayectorias o volúmenes que se ven afectados por el movimiento.

La calidad del embrión es una medida de la capacidad de dicho embrión para implantarse y desarrollarse satisfactoriamente en el útero después de la transferencia. Los embriones de alta calidad tienen una mayor probabilidad de implantarse y desarrollarse satisfactoriamente en el útero después de la transferencia que los embriones de baja calidad. Sin embargo, incluso un embrión de alta calidad no es garantía de implantación, dado que la transferencia real y la receptividad de la mujer influyen mucho en el resultado final.

La viabilidad y la calidad se utilizan indistintamente en el presente documento. La medición de la calidad (o viabilidad) del embrión es un parámetro destinado a reflejar la calidad (o viabilidad) de un embrión, de modo que los embriones con valores altos del parámetro de calidad tienen una alta probabilidad de ser de alta calidad (o viabilidad) y baja probabilidad de ser de baja calidad (o viabilidad). Mientras que los embriones con un valor bajo asociado para el parámetro de calidad (o viabilidad) solo tienen una baja probabilidad de tener una alta calidad (o viabilidad) y una alta probabilidad de ser de baja calidad (o viabilidad)

Descripción de los dibujos

Fig. 1. Nomenclatura del patrón de segmentación que muestra los tiempos de segmentación (t2-t5), la duración de los ciclos celulares (cc1-cc3) y las sincronías (s1-s3) en relación con las imágenes obtenidas.

Fig. 2: El desarrollo del embrión hasta el estadio de blastocisto. El número se refiere al número de blastómeros en cada estadio. Las letras a a e se refieren a los siguientes parámetros cinéticos, a: Compactación/Mórula (M), b: Diferenciación inicial del trofectodermo (IDT), c: Inicio de la cavitación/blastocisto temprano/blastocisto (Bl), d: Inicio de la expansión del blastocisto (EB), e: Blastocisto en eclosión (HB). La compactación inicial (IC) se puede observar entre t5 y compactación/mórula (a), si está presente, habitualmente la IC precede a la compactación/mórula en minutos a algunas horas. La compactación parcial (PC) se puede observar entre los estadios a y c, si está presente. La vacuolización" (VC(X)) y las contracciones (NC(X)) se pueden observar entre los estadios a y d+, si están presentes.

La Fig. 3 muestra la variación de los parámetros morfocinéticos (en este caso t2, t3 y t5) en función del medio de cultivo en una clínica de fertilidad. El período total va desde febrero de 2011 hasta junio de 2011. De los tres medios utilizados (A, B, C) el medio A proporcionó el peor desarrollo embrionario (la última temporización de división celular y t2, t3 y t5 son todos más altos para el medio A). El Medio A también proporcionó peores tasas de implantación y de embarazo. Tanto el Medio B como el Medio C proporcionaron un desarrollo embrionario normal y altas tasas de implantación y embarazo. La aplicación de la presente invención a la evaluación de los parámetros morfocinéticos de los embriones en desarrollo en distintos medios puede revelar estos problemas en directo a medida que evolucionan.

Fig. 4a. Una serie de imágenes que muestran que se observa que el tiempo de t2 (tiempo de segmentación en que se crea un embrión de 2 blastómeros, es decir, el tiempo de resolución de la división celular) se produce a las 22,9 horas.

Fig. 4b. Una serie de imágenes que muestran la segmentación directa de un embrión de 3 blastómeros. La segmentación de 1 a 3 células se produce en un fotograma, por tanto t3 = t2, y CC2 es de este modo menor de 5 horas, es decir, un ejemplo de un embrión SCC.

Fig. 5. Desarrollo de embriones de ratón con temperatura variable del medio de incubación (véase el ejemplo 1). Fig. 6. Duración entre diversas divisiones celulares para embriones de ratón para temperaturas variables del medio de incubación (véase el ejemplo 1).

Fig. 7a-c. La segmentación directa se ha analizado en un gran material de datos que contiene 4.181 tratamientos de FIV de ocho clínicas de FIV, que implican un total de 32.382 ovocitos obtenidos que se inseminaron y colocaron en incubadoras EmbryoScope. Se han evaluado 18.024 embriones anotados de los cuales se transfirieron 5.491. Como se muestra en la fig. 7a, se encontraron ciclos celulares cortos en 4709 de los 18024 embriones anotados (26,1 %) y ciclos celulares largos en 2464 de 18024 embriones (13,7 %). Los 10851 embriones restantes (60,2 %) fueron MCC. La abundancia de SCC y LCC se redujo entre los embriones transferidos: SCC del 14,1 % (776 de 5491) y el 9,2 % (503/5491), como se muestra en la fig. 7b. El 76,7 % restante eran embriones de MCC que se dividían "normalmente". La relación de KID se muestra en la fig. 7c. Las dos clases anómalas SCC y LCC presentan una relación de KID significativamente reducida. La tasa de implantación relativa se redujo a 8,3 %/17,7 % = 47 % de la tasa de MCC para embriones de SCC y 7,2 %/17,7 % = 41 % de la tasa de MCC para embriones de LCC. En una realización de la invención, los embriones de SCC y/o LCC se definen, por lo tanto, como embriones con valores atípicos de parámetros morfocinéticos. Además, la variación en la cantidad relativa de embriones de SCC y/o LCC puede ser un indicador de cambio en las condiciones de cultivo y al seguir esta variación se pueden proporcionar alertas tempranas.

Las Fig. 8 y 9 muestran la variación en el promedio de los parámetros morfocinéticos t2, t3, t4, t5, t8, s2, cc3 y t8-t5 para cultivos de embriones en distintos lotes de aceite. Las diferencias se observan claramente y, especialmente, el lote de aceite "L1" es significativamente distinto, posiblemente debido a una pequeña cantidad de una sustancia tóxica que conduce a una calidad embrionaria notablemente inferior. Se observa que los embriones cultivados en L1 se desarrollan más lentamente y con un ciclo celular más largo (cc3). Para los tiempos de segmentación, la diferencia es más pronunciada para los últimos parámetros morfocinéticos t5 y t8. Por tanto, el seguimiento de los parámetros morfocinéticos es una herramienta sensible y de respuesta rápida para evaluar la calidad de los embriones en incubación.

Fig. 10-14. Los experimentos se realizaron con cantidades controladas de TX-100 (Triton X-100) en medios de cultivo para embriones de ratones híbridos. Las columnas más a la izquierda son el grupo de control sin TX-100 y los otros cinco grupos tienen cantidades crecientes de TX-100, hasta el 0,002 %. La fig. 11 muestra la tasa de blastocistos a las 96 horas, es decir, la tasa de embriones que han alcanzado el estadio de blastocisto a las 96 horas. Solo el grupo 5, con el máximo de TX-100, es significativamente distinto. La fig. 12 muestra la variación de t2, t3, t4, t5 y t8 en los grupos, y se observa una tendencia hacia un desarrollo más lento con cantidades crecientes de TX-100, con las diferencias más pronunciadas en los últimos tiempos de segmentación. La fig. 13 muestra la variación de s2, cc3 y t8-t5 en los grupos, sin tendencias claras aparte de que la mayoría de los grupos tienen valores más altos que el grupo de control. La fig. 14 muestra la variación de las temporizaciones de distintos estadios del blastocisto y se observa una clara tendencia hacia un desarrollo más lento con cantidades crecientes de TX-100.

Descripción detallada de la invención

Una forma de identificar un embrión viable en una cohorte de embriones de un tratamiento de FIV sería comparar el patrón temporal registrado de división celular, representado por los parámetros morfocinéticos, con respecto a los patrones temporales registrados de división celular de embriones en ciclos de tratamiento anteriores. Un embrión viable se caracterizaría por tener parámetros morfocinéticos que coinciden con los parámetros morfocinéticos registrados de embriones que se implantaron y dieron como resultado un recién nacido vivo en el pasado. En la selección del embrión para la transferencia que muestre parámetros morfocinéticos que se asemejen a los de los embriones positivos (es decir, embriones de embarazos en curso o completados con éxito) y difieran, cuando sea posible, de la mayoría de los embriones negativos (es decir, los embriones que no se implantaron o dieron lugar a abortos clínicos), sería posible mejorar la probabilidad de obtener un embarazo y lograr el resultado deseado del tratamiento de fertilidad. La presente invención invierte este principio conocido: Mediante el seguimiento de los parámetros morfocinéticos, las diferencias o tendencias no convenientes pueden detectarse mucho antes y esto puede dar lugar a alerta tempranas que indiquen, por ejemplo, diferencias no deliberadas en la manipulación de embriones. Por otro lado, la evaluación de los parámetros morfocinéticos también se puede utilizar para mitigar los temores después de múltiples fracasos de implantación, debido a que el análisis de los parámetros morfocinéticos puede mostrar que el desarrollo embrionario es en efecto normal.

Se ha demostrado que varios factores afectan el desarrollo embrionario, por ejemplo, la temporización de las divisiones celulares. Los factores que se ha demostrado que influyen en el desarrollo embrionario y, en consecuencia, los parámetros morfocinéticos derivados, incluyen: la temperatura, la composición de los medios, el pH, el CO²y el oxígeno, los factores de crecimiento, el recipiente de cultivo, etc. Diversos científicos han propuesto que otros factores, tales como la edad de la paciente, la etiología, el IMC, el protocolo de estimulación (agonista/antagonista, tipo de hormona rFSH/hMG), manipulación de embriones (pipetas, método de fertilización, eclosión asistida, eliminación de blastómeros, cuerpos polares o células del trofectodermo mediante biopsia), influyen en el desarrollo embrionario y, en particular, en la temporización de los sucesos celulares, tales como la división celular.

Por tanto, una realización de la invención se aplica dentro del control de calidad en una clínica de fertilidad mediante la comparación de patrones de segmentación promedio de embriones en ciclos de tratamiento recientes con patrones de segmentación de ciclos pasados. Los cambios temporales en los parámetros morfocinéticos generales para embriones de buena calidad pueden indicar un cambio no deliberado en el protocolo, tal como una mala cantidad de medio, problemas con las incubadoras, puntas de pipeta, etc.

Para un seguimiento continuo, las etapas del método reivindicado se pueden repetir y, por tanto, el segundo conjunto de datos se puede actualizar continuamente con los datos de embriones más recientes, tal como los datos de embriones más recientes seleccionados de un período de tiempo concreto o seleccionados de un número predefinido de los embriones más recientes, tal como los embriones más recientes de un período de tiempo predefinido, tal como un número de horas, días, semanas o meses. Dicho número predefinido de embriones o período de tiempo predefinido puede determinarse ventajosamente como una entrada del usuario. De este modo, las condiciones de cultivo se pueden evaluar continuamente.

El método se implementa por ordenador y, por tanto, la funcionalidad de emitir una alerta cuando la diferencia morfocinética está por encima de un nivel predefinido puede implementarse ventajosamente. El tipo de alerta puede depender de la gravedad de la diferencia detectada, por ejemplo, luz verde para normal, luz amarilla para posibles problemas y luz roja para un problema de calidad importante.

El primer grupo de embriones será normalmente un grupo de referencia o grupo de control y el segundo grupo de embriones puede ser el grupo de embriones que se sigue y compara con el grupo de control. La diferencia morfocinética detectada entre los grupos de embriones se puede determinar mediante métodos estadísticos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, se puede determinar el nivel predefinido para emitir una alerta como un nivel predefinido por encima de la desviación típica de uno o más de los parámetros morfocinéticos del primer conjunto de datos.

Los valores atípicos de los parámetros morfocinéticos pueden definirse como valores atípicos relativos, es decir, el 3 % más extremo de la población. Sin embargo, puede ser una ventaja definir los valores atípicos de los parámetros morfocinéticos como valores atípicos absolutos, es decir, un parámetro morfocinético se define como un valor atípico si está fuera de un número absoluto predefinido. Este es el caso de los embriones de SCC y los embriones de LCC, como se define en el presente documento, que son ejemplos de valores atípicos absolutos. El límite inferior de 5 horas para los embriones de SCC proviene del hecho de que 5 horas no es tiempo suficiente para la replicación del ADN de todo el genoma.

Los valores atípicos de los parámetros morfocinéticos pueden excluirse del primer conjunto de datos y/o del segundo conjunto de datos. El seguimiento de la variación en los parámetros morfocinéticos puede ser un buen indicador de problemas de calidad, ya que muchos de los parámetros morfocinéticos son parámetros de calidad para la calidad del embrión. Sin embargo, puede ser una ventaja seguir el número o la frecuencia, o distribución de valores atípicos morfocinéticos, en particular en el segundo conjunto de datos, ya que cualquier variación en los valores atípicos puede ser un indicador de problemas de calidad.

Solo los parámetros morfocinéticos concretos que son valores atípicos pueden excluirse del conjunto de datos. Sin embargo, puede ser una ventaja excluir todos los datos de embriones concretos que tengan uno o más valores atípicos morfocinéticos en su desarrollo.

Puede ser que el segundo grupo de embriones sea un subconjunto del primer grupo de embriones, de modo que el segundo conjunto de datos sea un subconjunto del primer conjunto de datos.

El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los parámetros morfocinéticos se seleccionan del grupo de:

el tiempo de la segmentación en un embrión de n blastómeros, tn, en que n = {1, ..., 8},

duración de los ciclos celulares cc1, cc2, cc2b, cc3, cc2_3 y cc4,

sincronicidades s2, s3, s3a, s3b y s3c,

número de blastómeros en puntos temporales predefinidos concretos,

la temporización, extensión o duración del movimiento celular y/o de orgánulos,

cualquier combinación de estos parámetros morfocinéticos.

Se puede seleccionar lo siguiente como parámetro morfocinético:

en donde i = {1,2,3,4), cci^m es el valor medio o el valor mediano de cci y cci, es la varianza de cci.

En una realización de la invención, el primer y/o segundo grupo de embriones son embriones que han sido fertilizados, conservados y/o incubados en un conjunto concreto de condiciones. El primer grupo de embriones puede haber sido fertilizado en un conjunto de condiciones distintas al segundo grupo de embriones. Estas condiciones pueden seleccionarse del grupo de: tipo de tratamiento de fertilización, conservación, tal como la crioconservación, temperatura de incubación, tipo de medio, incubadora concreta, tratamiento concreto tal como tratamiento hormonal, tratamiento hormonal, aspiración, factor masculino, incubadora concreta, temperatura de la incubación, tipo de medio, tipo de aceite, tratamiento de DPG, transferencia, crioconservación, descongelación, tiempo fuera de la incubadora, número de tratamientos de fertilización.

En una realización de la invención, el segundo grupo de embriones son embriones que se originan a partir de donantes de embriones predefinidos. Los donantes de embriones predefinidos pueden seleccionarse del grupo de: individuos más jóvenes o mayores que una edad predefinida, donantes de embriones en un protocolo de tratamiento o estimulación concreto, donantes de embriones en un tratamiento de fertilización concreto, donantes de embriones con un diagnóstico concreto, tal como enfermedades cromosómicas hereditarias, Hiv, Hep, OPQ, individuos con exposición actual o pasada a radiación o sustancias químicas peligrosas, individuos con consumo de drogas actual o pasado, individuos con un IMC más alto o más bajo que un nivel predefinido, fumadores, no fumadores, individuos con ciclo menstrual normal o anómalo.

El segundo grupo de embriones puede seleccionarse como embriones de grupos de pacientes concretos (por ejemplo, pacientes más jóvenes), pacientes con un diagnóstico concreto (por ejemplo, endometriosis), tratamientos de fertilización concretos (por ejemplo, ICSI), embriones que han recibido un pretratamiento especial (por ejemplo, crioconservados).

Surge un problema concreto si la clínica ocasionalmente tiene pacientes con patrones de segmentación muy desviados. Entonces, el número de estos pacientes puede influir fuertemente en el promedio de las temporizaciones. En este caso, el seguimiento de las variables mencionadas anteriormente en grupos seleccionados de embriones puede ser una solución.

Las longitudes de los ciclos celulares cci (cc1, cc2, cc3 y cc4) son variables importantes para determinar la calidad del embrión. Las combinaciones de los parámetros morfocinéticos pueden utilizarse para construir un nuevo parámetro morfocinético que sea resistente a los extremos que raramente se producen en la temporización de los sucesos de segmentación concretos

En que el CCim es el valor mediano (promedio) de cci y cciv es la varianza de cci. Estos pueden, por ejemplo, calcularse en el grupo de embriones positivos para KID, de todos los embriones transferidos o de todos los embriones. Si se establece un límite máximo x para CCnorm (por ejemplo, 3), significa que si los CCi del segundo grupo de embriones caen en promedio más de x desviaciones típicas (de los positivos para KID, transferidos o todos) del valor promedio del primer grupo de embriones (por ejemplo, positivos para KID, transferidos o todos), esos datos se excluirán.

Para seguir que se están cumpliendo las mejores prácticas de laboratorio, será posible aislar embriones que se hayan sometido a un tratamiento concreto para seguir las variables de estos embriones, para observar si hay un cambio en el tiempo, es decir, el segundo grupo de embriones se selecciona de los embriones con este tratamiento concreto. Además, se pueden seleccionar grupos de embriones que haya manipulado una persona concreta del laboratorio o personal de la clínica como el segundo grupo de embriones, para evaluar si se han producido cambios a lo largo del tiempo o si existe una diferencia general en el desempeño de personal.

En una realización adicional de la invención, el primer grupo de embriones comprende datos de preimplantación de embriones implantados que han dado lugar a embarazos en curso, bebés nacidos vivos, latido cardíaco fetal (LCF) y/o sacos gestacionales. Es decir, el primer grupo se selecciona para reflejar embriones de alta calidad con un historial comprobado.

En otra realización más de un conjunto de datos de embriones (por ejemplo, un primer o segundo conjunto de datos de embriones) comprende parámetros morfocinéticos para 12

1) todos los embriones en un grupo de embriones seguidos, o

2) un subgrupo definido funcionalmente del grupo de embriones.

Es decir, todos los embriones del grupo de embriones seguidos (es decir, todos los embriones seguidos alguna vez en una determinada clínica) pueden seleccionarse como marco de referencia para los cálculos estadísticos.

O simplemente se selecciona un subgrupo, donde este subgrupo está definido funcionalmente. Ejemplos de subgrupos definidos funcionalmente:

- todos los embriones fecundados del grupo,

- embriones que se han dividido al menos a un número predefinido de células en un número predefinido de horas después de la inseminación, tal como dividido a al menos 7 células 68 horas después de la inseminación,

- embriones que tienen menos de un porcentaje predefinido de fragmentación a las horas predefinidas después de la inseminación, por ejemplo, menos del 20 % de fragmentación 68 horas después de la inseminación, - embriones que no están multinucleados en un determinado estadio celular, por ejemplo, en el estadio de cuatro células,

- embriones que un embriólogo experto haya clasificado como "embriones de buena calidad" (GQE, forma siglada de good quality embryos),

- embriones que se han elegido para congelar o transferir,

- embriones que se han seleccionado para transferir, y/o

- embriones que se han implantado.

- Embriones seleccionados excluyendo los embriones con desarrollo deficiente, por ejemplo, excluyendo embriones de Scc y/o Lcc, o empleando otros criterios de exclusión como, por ejemplo, los descritos en las solicitudes en trámite PCT/DK2012/05018 o EP 12174432.0, esta última presentada el 29.06.2012 y titulada "Valoración de la calidad del embrión basada en el desarrollo de blastocistos".

En una realización adicional de la invención, los parámetros morfocinéticos se seleccionan del grupo de:

- la temporización y/o la duración de los períodos de división celular y los períodos entre divisiones,

- la temporización y/o duración de: los tiempos de segmentación, períodos de segmentación y tiempos de ciclo celular;

- las temporizaciones y/o duración de los estadios divisionales y los estadios en reposo,

- sincronía de divisiones celulares;

- temporización, extensión o duración del movimiento celular y/o de orgánulos,

- temporización, extensión o duración de los criterios de calidad, tal como los criterios de calidad descritos en el documento PCT/DK2012/05018

- Criterios de calidad de blastocistos como se describe en el documento EP 12174432.0

- la temporización y/o la duración de los períodos de división celular y los períodos entre divisiones, determinado por la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y/o sexta división celular;

- la temporización y/o duración de: los tiempos de segmentación, períodos de segmentación y tiempos de ciclo celular determinados para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y/o sexta división celular;

- la temporización y/o duración de los estadios divisionales y los estadios en reposo para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y/o sexta división celular;

- sincronía de la segunda y tercera división celular;

- temporización, extensión o duración del movimiento celular y/o de orgánulos determinado para la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y/o sexta división celular;

- temporización, extensión o duración del movimiento celular y/o de orgánulos determinado entre la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y/o sexta división celular;

En una realización adicional de la invención, dicho segundo grupo de conjuntos de datos de embriones es sustancialmente más pequeño que el primer grupo de embriones, tal como 2 veces más pequeño, tal como 5 veces más pequeño, tal como 10 veces más pequeño, tal como 50 veces más pequeño, tal como 100 veces más pequeño, tal como 200 veces más pequeño, tal como 500 veces más pequeño, tal como 1000 veces más pequeño.

En una realización adicional de la invención, los embriones se cultivan y/o siguen en una incubadora. Preferentemente, los embriones se siguen mediante adquisición de imágenes, por ejemplo, por medio de un equipo de microscopía secuencial (time-lapse microscopy), tal como la adquisición de imágenes al menos una vez por hora, preferentemente adquisición de imágenes al menos una vez cada media hora, tal como adquisición de imágenes al menos una vez cada veinte minutos, tal como la adquisición de imágenes al menos una vez cada quince minutos, tal como la adquisición de imágenes al menos una vez cada diez minutos, tal como la adquisición de imágenes al menos una vez cada cinco minutos, tal como la adquisición de imágenes al menos una vez cada dos minutos, como la adquisición de imágenes al menos una vez por minuto.

El método de acuerdo con la invención puede implementarse por ordenador o al menos implementarse parcialmente por ordenador, proporcionando de este modo una herramienta adaptable eficaz para las clínicas de fertilidad. Es decir, el método de acuerdo con la invención puede implementarse en sistemas de incubadoras automatizadas para el cultivo y seguimiento de embriones, tal como embriones humanos. Al implementar la presente invención en tales sistemas de incubadoras automatizadas, los procedimientos de selección y el control de calidad de, por ejemplo, medios de cultivo y otras condiciones de cultivo, pueden ser más o menos automatizados, es decir, totalmente manuales asistiendo el programa informático a los usuarios en las decisiones propuestas, semiautomático o completamente automático, tomando el sistema de incubadora todas las decisiones, incluidas las alertas tempranas, basándose en el análisis de datos.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un sistema que tiene medios para llevar a cabo los métodos descritos anteriormente. Dicho sistema puede ser cualquier sistema adecuado, tal como un ordenador que comprende partes de código informático que constituyen medios para ejecutar los métodos descritos anteriormente. El sistema puede comprender además medios para adquirir imágenes del embrión en distintos intervalos de tiempo, tal como el sistema descrito en el documento WO 2007/042044.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un soporte de datos que comprende partes de código informático que constituyen medios para ejecutar los métodos descritos anteriormente.

Seguimiento de estadios tardíos

La búsqueda de factores pronósticos que predigan el desarrollo embrionario y el resultado de un tratamiento de fertilización in vitro (FIV) ha atraído una considerable atención de la investigación, ya que se prevé que el conocimiento de tales factores puede mejorar los tratamientos futuros de FIV. Un factor predictivo prometedor es la temporización precisa de los sucesos clave en el desarrollo embrionario temprano. Los estudios que implican obtención de imágenes se han limitado a mediciones del desarrollo temprano, tales como la formación y fusión pronuclear, y el tiempo hasta la primera segmentación (Nagy, Z.P. 1994, Fenwick, J. 2002, Lundin, K. 2001, Lemmen, J.G. 2008). Un hallazgo importante del análisis secuencial (time-lapse analysis) es una correlación entre el patrón de segmentación temprano al estadio de 4 células y el desarrollo posterior al estadio de blastocisto. Además, se han publicado análisis morfocinéticos sobre el desarrollo de embriones bovinos, donde la temporización, la duración y los intervalos entre las segmentaciones celulares en el desarrollo embrionario temprano predijeron satisfactoriamente el desarrollo posterior al estadio de blastocisto expandido (Ramsing 2006, Ramsing 2007).

Los presentes inventores han realizado un gran estudio clínico que implicó muchos embriones humanos y siguieron el desarrollo, no solo hasta la formación de un blastocisto, sino también hasta el signo de la implantación del embrión. En este estudio se observaron diferencias importantes en los patrones temporales de desarrollo entre los embriones que se implantaron (es decir, los embriones que se transfirieron y posteriormente dieron lugar a una implantación satisfactoria) y los que no (es decir, los embriones que se transfirieron pero no dieron lugar a una implantación satisfactoria). Al utilizar la implantación como criterio de valoración, no solo se valora la aptitud del embrión para la formación de blastocistos, sino también los procesos posteriores altamente esenciales, tal como la eclosión y la implantación satisfactoria en el útero.

Se ha descubierto que existe un intervalo de tiempo óptimo para los parámetros que caracterizan las divisiones de células embrionarias. Las observaciones apoyan la hipótesis de que la viabilidad de los embriones está asociada con una secuencia altamente regulada de sucesos celulares que comienzan en el momento de la fertilización. En este estudio clínico sobre embriones exclusivamente de buena calidad, se ha confirmado que la capacidad de un embrión para implantarse está correlacionada con numerosos sucesos celulares distintos. La complejidad, la estructura y los parámetros de los modelos deben ser adaptables a distintas situaciones clínicas, como la temperatura de la incubación, el momento de la transferencia, los medios de cultivo y otros.

La temporización de los sucesos tempranos en el desarrollo embrionario se correlaciona con el desarrollo a un blastocisto, y el desarrollo a un blastocisto es una necesidad para una implantación satisfactoria y, por tanto, la formación de un blastocisto es un parámetro de calidad en sí mismo. Sin embargo, se ha descubierto que el desarrollo en un blastocisto no se correlaciona necesariamente con la implantación satisfactoria del embrión.

Los partidarios de la implantación temprana en el día 2 han argumentado que el cultivo extendido de embriones al estadio de blastocisto alrededor del día 5 da lugar a riesgos potenciales debido a que el período de cultivo se prolonga significativamente, lo que puede alterar la integridad del embrión. Sin embargo, un período de cultivo prolongado hasta el estadio de blastocisto tiene varias ventajas. Los embriones humanos cultivados tienen una tasa promedio de formación de blastocistos de solo aprox. el 30-50 %, y al extender el período de cultivo una gran parte de los embriones de baja calidad se han excluido automáticamente, al no formar el blastocisto. Adicionalmente, después de la EGA alrededor del estadio de 5-8 blastómeros, el propio ADN de los embriones controla el desarrollo. Al evaluar los embriones en el estadio de blastocisto, se pueden identificar embriones de alta calidad con un mayor grado de certeza.

Por tanto, los datos permiten la detección de criterios de desarrollo relacionados con los blastocistos para el potencial de implantación. Los resultados indican en particular que la temporización de los sucesos tardíos, tal como el inicio de la cavitación, es uniformemente un buen indicador del potencial de implantación, y que la discriminación entre embriones implantados y no implantados mejora cuando se utilizan criterios de calidad de blastocistos, por ejemplo, tBI a diferencia de los sucesos anteriores (t2, t3 y t4). Los datos indican que la incubación de los embriones hasta el estadio de blastocisto puede proporcionar información adicional importante que mejorará la capacidad de seleccionar un embrión viable con alto potencial de implantación. Adicionalmente, el seguimiento de los embriones en los últimos estadios hasta los estadios de blastocisto puede proporcionar una mejor indicación de los problemas de calidad y, como se muestra en las fig. 10-14, las consecuencias de, por ejemplo, un aceite tóxico, son más pronunciadas en los estadios posteriores. Por lo tanto, puede ser una ventaja incluir criterios de calidad de blastocistos en los parámetros morfocinéticos seleccionados en el presente documento, es decir, seleccionados para la evaluación de la calidad.

A continuación se enumeran una serie de criterios de calidad (selección) de embriones y criterios de calidad de blastocistos que pueden aplicarse individualmente o combinados en grupos, para valorar la calidad de los embriones y, en consecuencia, valorar los problemas de calidad al seguir y valorar automáticamente las condiciones de cultivo. Múltiples variables

Al elegir los criterios de selección pueden utilizarse múltiples variables. Cuando se utilizan múltiples variables, puede ser una ventaja que las variables se seleccionen progresivamente de modo que, inicialmente, se elijan una o más de las variables que se pueden determinar temprano con una alta precisión, por ejemplo, t2, t3, t4 o t5. Posteriormente se pueden utilizar otras variables que pueden ser más difíciles de determinar y que están asociadas a una mayor incertidumbre.

Parámetros normalizados o relativos

Es poco probable que los criterios de selección derivados de los parámetros morfocinéticos sean de aplicación universal, dado que las condiciones de cultivo pueden variar de una clínica a otra. Por lo tanto, puede ser una ventaja definir parámetros morfocinéticos normalizados, por ejemplo, parámetros morfológicos normalizados basados en dos, tres, cuatro, cinco o más parámetros seleccionados del grupo de t2, t3, t4, t5, t6, t7 y t8. Al normalizar los parámetros, el tiempo de fertilización puede "eliminarse" de la valoración de la calidad del embrión. Además, un parámetro embrionario morfológico normalizado puede describir mejor la uniformidad y/o la regularidad de la tasa de desarrollo de un embrión concreto, independientemente de las condiciones ambientales, porque en lugar de comparar con intervalos de tiempo absolutos determinados "globalmente" que pueden depender de las condiciones ambientales locales, el uso de parámetros normalizados garantiza que las relaciones concretas de los intervalos de tiempo se puedan comparar con los parámetros normalizados determinados "globalmente", proporcionando de este modo información adicional del desarrollo embrionario. Además, los parámetros morfocinéticos normalizados pueden proporcionar aspectos adicionales relacionados con la calidad en el desarrollo del embrión.

Por tanto, un criterio de calidad de blastocistos puede ser determinar 1) la duración de un primer período de tiempo desde la fertilización hasta que finaliza la traducción del ARNm heredado de la madre en los blastómeros y 2) se determina la duración de un segundo período de tiempo desde el inicio de la transcripción del ADN propio de los blastómeros hasta dicho estadio de blastocisto, y en donde un criterio de calidad de blastocistos es la relación entre dichos primer y segundo períodos de tiempo.

Por tanto, un criterio de calidad de blastocistos puede ser determinar 1) la duración de un primer período de tiempo desde la fertilización hasta un embrión de 5 blastómeros y 2) se determina la duración de un segundo período de tiempo desde el embrión de 5 blastómeros hasta dicho estadio de blastocisto, y en donde un criterio de calidad de blastocistos es la relación entre dichos primer y segundo períodos de tiempo.

El tiempo desde la fertilización hasta el estadio de blastocisto se divide de este modo en dos períodos de tiempo y la relación entre estos períodos de tiempo es un criterio de calidad de blastocistos. La razón para dividir en el estadio de 5 blastómeros es que este es aprox. el momento de la activación de los genes embrionarios. Por tanto, se determina 1) la duración de un primer período de tiempo desde la fertilización hasta que finaliza la traducción del ARNm heredado de la madre en los blastómeros y 2) se determina la duración de un segundo período de tiempo desde el inicio de la transcripción del ADN propio de los blastómeros hasta dicho estadio de blastocisto, y en donde un criterio de calidad de blastocistos es la relación entre dichos primer y segundo períodos de tiempo.

Se puede proporcionar un criterio de calidad de blastocistos correspondiente determinando 1) la duración de un primer período de tiempo desde la fertilización hasta el blastocisto, y 2) la duración de un segundo período de tiempo desde el inicio de la transcripción del ADN propio de los blastómeros hasta dicho estadio de blastocito y tomando la relación de estos períodos de tiempo. Esta relación proporciona información sobre cuánto del período de tiempo total desde la fertilización hasta el blastocisto está bajo control el propio ADN del embrión.

Estas relaciones pueden verse como medidas de la velocidad de desarrollo relativa en un determinado período con respecto a la velocidad de desarrollo global hasta ese estadio. Cualquier variación en estas relaciones puede indicar que los embriones están acelerando o desacelerando su desarrollo, y esto puede ser un indicador de problemas de calidad en las condiciones de cultivo.

El estadio de blastocisto mencionado anteriormente puede seleccionarse del grupo de: compactación inicial (IC), compactación/mórula (M), diferenciación inicial de las células del trofectodermo (IDT), blastocisto temprano (ERB), inicio de cavitación/blastocisto (Bl), expansión de blastocisto (EB), primera contracción (CPS(1)), segunda contracción (CPS(2)), tercera contracción (CPS(3)), cuarta contracción (CPS(4)), quinta contracción (CPS(5)), sexta contracción (CPS(6)), séptima contracción (CPS(7)), eclosión (HB, forma sigla de hatching blastocyst, blastocisto en eclosión) y completamente eclosionado (FH, forma sigla de fully hatched). Por tanto, tIC es el tiempo desde la fertilización hasta la compactación inicial, tM es el tiempo desde la fertilización hasta la compactación/mórula, etc. Ejemplos de criterios de calidad del embrión

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación de tBi - ti, en donde tBi se selecciona del grupo de {tM, tBI, tEB} y ti se selecciona del grupo de {t5, t6, t7 y t8}.

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación de (tBi - ti) / ti, en donde tBi se selecciona del grupo de {tM, tBI, tEB} y ti se selecciona del grupo de {t5, t6, t7 y t8}.

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación de (tBi -ti) / tBi, en donde tBi se selecciona del grupo de {tM, tBI, tEB} y ti se selecciona del grupo de {t5, t6, t7 y t8}.

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación del tiempo desde la fertilización hasta el estadio de blastocisto.

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación de uno o más de los siguientes parámetros morfológicos de blastocistos:

tIC = tiempo desde la fertilización hasta la compactación inicial,

tM = tiempo desde la fertilización hasta compactación/mórula,

tIDT = tiempo desde la fertilización hasta la diferenciación inicial de las células del trofectodermo,

tERB = tiempo desde la fertilización hasta el blastocisto temprano,

tBI = tiempo desde la fertilización hasta el inicio de la cavitación,

tEB = tiempo desde la fertilización hasta la expansión del blastocisto,

tCPS(1) = tiempo desde la fertilización hasta la primera contracción,

tCPS(2) = tiempo desde la fertilización hasta la segunda contracción,

tCPS(3) = tiempo desde la fertilización hasta la tercera contracción,

tHB = tiempo desde la fertilización hasta la eclosión y

tFH = tiempo desde la fertilización hasta la eclosión completa.

tB I- tM,

tEB - tB,

tHE - tEB,

tEB - tM

tBI - tCPS(1),

tBI - tCPS(2),

tEB - tCPS(1),

tEB - tCPS(2),

tCPS(2) - tCPS(1),

tCPS(3) - tCPS(2).

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación de la expansión bidimensional y/o tridimensional absoluta o relativa del blastocisto.

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación del diámetro y/o el volumen del embrión al inicio de la expansión.

Un criterio de calidad de blastocistos es la determinación del diámetro máximo y/o el volumen máximo del blastocisto antes de la eclosión.

El parámetro embrionario morfológico normalizado puede seleccionarse del grupo de

cc2/cc2_3 = (t3-t2)/(t5-t2),

cc3/cc2_3 = (t5-t3)/(t5-t2),

cc3/t5 = 1 - t3/t5,

s2/cc2 = (t4-t3)/(t3-t2),

s3/cc3 = (t8-t5)/(t5-t3),

y

cc2/cc3 = (t3-t2)/(t5-t3).

Un criterio de calidad es la determinación del grado de irregularidad de la temporización de las divisiones celulares cuando el embrión se desarrolla de 4 a 8 blastómeros.

Un criterio de calidad es la determinación del tiempo máximo de segmentación para cada blastómero cuando el embrión se desarrolla de 4 a 8 blastómeros.

Un criterio de calidad es la determinación de la relación entre el tiempo máximo de segmentación de cada blastómero cuando el embrión se desarrolla de 4 a 8 blastómeros y la duración del período de tiempo total de 4 a 8 blastómeros; máx(s3a,s3b,s3c)/s3.

Combinación con mediciones de movimiento

Los criterios de calidad analizados anteriormente también pueden combinarse con determinaciones del movimiento del embrión, tal como i) la determinación de la extensión y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante el período de segmentación celular; y/o ii) la determinación de la extensión y/o distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante el período entre segmentaciones, obteniendo de este modo una medida de la calidad del embrión.

Los volúmenes dentro de la zona pelúcida que están desprovistos de movimiento (o áreas similares en una imagen bidimensional proyectada del embrión que permanecen estacionarias) son una indicación de zonas "muertas" dentro del embrión. Cuanto más grandes sean estas zonas "muertas" inmóviles, menor será la probabilidad de un desarrollo embrionario satisfactorio. Grandes áreas dentro de una serie secuencial de imágenes de embriones sin ningún tipo de movimiento (es decir, ni movimiento celular ni de orgánulos) indican baja viabilidad. El movimiento de orgánulos generalmente debe ser detectable en todo el embrión, incluso cuando solo se comparan dos o unos pocos fotogramas consecutivos. El movimiento celular puede estar más localizado, especialmente en las últimas fases del desarrollo embrionario.

Las posiciones de las células son habitualmente relativamente estacionarias entre las segmentaciones celulares (es decir, poco movimiento celular), excepto por un breve intervalo de tiempo alrededor de cada segmentación celular, en que la segmentación de una célula en dos conduce a un reordenamiento breve pero considerable de las células en división, así como de las células circundantes (es decir, un movimiento celular pronunciado). Es preferente el menor movimiento entre segmentaciones. Por tanto, cualquier variación inesperada en el movimiento celular o de orgánulos puede ser un indicador de problemas de calidad en relación con las condiciones de cultivo.

En relación con el movimiento durante los períodos de segmentación y entre segmentaciones, los inventores también se refieren a la solicitud PCT WO 2007/144001.

Ejemplos adicionales de parámetros morfocinéticos

Como se ha indicado anteriormente, los parámetros morfocinéticos a utilizar en conformidad con determinadas realizaciones de la invención pueden establecerse combinando una pluralidad de características morfocinéticas relacionadas con el desarrollo de embriones. Por ejemplo, en algunas implementaciones, un parámetro morfocinético puede obtenerse obteniendo valores para una pluralidad de características morfocinéticas relacionadas con el desarrollo de un embrión durante un período de observación, por ejemplo, características relacionadas con cualquiera de los tiempos de segmentación celular, diferencias de tiempo entre parejas de divisiones celulares, y duraciones del ciclo celular. Se puede determinar un valor para una variable continua combinando diferencias entre los valores obtenidos y los valores de referencia correspondientes. Los valores de referencia pueden, por ejemplo, determinarse a partir de los valores de la pluralidad de características obtenidas para uno o más embriones de referencia de potencial de desarrollo conocido (por ejemplo, embriones positivos para KID). Un parámetro morfocinético puede basarse entonces en el valor determinado para la variable continua.

Por tanto, un método para la determinación de un parámetro morfocinético para un embrión (denominado en este caso embrión de estudio) mediante la generación de un valor para una variable continua a partir de una pluralidad de características relacionadas con el desarrollo del embrión en conformidad con una implementación de una realización de la invención, puede comprender diversas etapas, como sigue: En una primera etapa S1 se obtienen una pluralidad de características relacionadas con el desarrollo del embrión de estudio durante un período de observación. Estas características pueden basarse fundamentalmente en tiempos de segmentación determinados utilizando obtención convencional de imágenes secuenciales de embriones. Una o más características pueden basarse en la temporización del desvanecimiento/desaparición de los pronúcleos (tPNfading (o tPNf), forma siglada de timing of pronuclei fading).

En un ejemplo, las características pueden comprender una serie de duraciones del ciclo celular cci para una secuencia de ciclos celulares. Por ejemplo, la pluralidad de características puede comprender una serie de valores: cc2a (= t3 - t2); cc2b (= t4 - t2); cc3a (= t5 -t3), cc3b (= t6 - t3), cc3c (= t7 - t4), cc3d (= t8 - t4). Es decir, para este ejemplo, la secuencia comprende las duraciones para todos los ciclos celulares desde cc2a hasta cc3d (es decir, todas las duraciones del ciclo celular hasta un embrión de ocho blastómeros, excepto para cc1). Si hay duraciones particulares del ciclo celular que no se miden para un embrión dado (por ejemplo, porque la temporización de un suceso de segmentación de interés no se puede determinar adecuadamente debido a una medición inadecuada o porque el suceso de segmentación no se ha producido al final del tiempo de incubación (tFinal)), el ciclo (o ciclos) celular faltante puede quedar fuera de la secuencia.

En una segunda etapa S2 se obtienen valores promedio y de varianza observados en una población de uno o más embriones de referencia de potencial de desarrollo conocido (por ejemplo, embriones positivos para KID), para las características correspondientes a las obtenidas para el embrión de estudio en la etapa S1. Estos pueden, por ejemplo, leerse de una memoria u otro almacenamiento de un aparato que ejecuta el método. Los valores promedio y de varianza pueden obtenerse mediante análisis retrospectivo de imágenes de embriones que procedieron a una implantación satisfactoria. Los embriones para los que se obtienen los valores promedio y de varianza para un embrión de estudio dado pueden denominarse embriones de referencia. En algunos casos, los embriones de referencia pueden comprender embriones que se esperaban en la misma clínica que el embrión de estudio, por ejemplo, para ayudar a tener en cuenta las variaciones entre clínicas asociadas con distintas condiciones de incubación. Es decir, la etapa S2 también puede comprender la selección de un grupo apropiado de embriones de referencia para los cuales obtener los valores promedio y de varianza basados en las características del embrión de estudio. Los valores promedio y de varianza se pueden determinar en conformidad con técnicas de análisis estadístico convencionales, por ejemplo, que impliquen potencialmente el descarte de datos atípicos, y así sucesivamente. Se apreciará que el término "promedio" se utiliza de forma amplia en el presente documento para referirse a un valor típico/representativo/indicativo para un parámetro observado en una población de muestra. A este respecto, el promedio puede, por ejemplo, corresponden a un valor de la media, moda o mediana de la característica de interés para la población de referencia (población positiva para KID).

En una tercera etapa S3, se determina una diferencia entre el valor de cada característica observada para el embrión de estudio y la característica promedio correspondiente asociada con la población de embriones con potencial de desarrollo conocido (por ejemplo, positivos para KID).

En una cuarta etapa S4, se determina un parámetro morfocinético para el embrión de estudio (correspondiente a una variable continua) combinando / añadiendo las diferencias determinadas para cada característica de una manera ponderada por los respectivos valores de varianza. Por tanto, en un ejemplo concreto, un parámetro morfocinético (GIV) se define como:

(cci - ccim)2

i cciv

?icia

En que cci es la serie de duraciones del ciclo celular observadas para el embrión de estudio, ccim es la serie correspondiente de duraciones promedio del ciclo celular observadas en un grupo de embriones de referencia (por ejemplo, la población positiva para KID de pacientes menores de 35 años), y cciv son los valores de varianza correspondientes asociados con la población de referencia. El parámetro n es el número de duraciones del ciclo celular que comprende la serie cci. Las diferencias (cci - ccim) se normalizan mediante los valores de varianza cciv como parte de la combinación. Esto significa que las diferencias para ciclos celulares particulares (valores de i) que presentan una varianza relativamente alta en la población de muestra contribuyen menos al valor de la GIV que las diferencias para el ciclo celular que presentan una varianza relativamente baja en la población de muestra. Las diferencias (cci - ccim) están al cuadrado en la combinación, y esto significa que la contribución a la GIV es la misma para una diferencia dada, independientemente de si es positiva o negativa (es decir, si cci es más largo o más corto que ccim).

En términos generales, la GIV es baja cuando el embrión de estudio presenta un patrón de segmentación regular y es alta cuando el embrión presenta un patrón de segmentación irregular.

El parámetro morfocinético particular basado en la secuencia particular de duraciones del ciclo celular cci = cc2a; cc2b; cc3a; cc3b; cc3c y cc3d en este ejemplo pueden denominarse en el presente documento como una primera variable de irregularidad generalizada GIV1.

Por tanto, las etapas S1 a S4 analizadas anteriormente representan un procedimiento para establecer un parámetro morfocinético para un embrión en conformidad con una realización de la invención. Se apreciará que pueden utilizarse métodos similares para establecer un parámetro morfocinético para un embrión utilizando distintas características relacionadas con el desarrollo del embrión de estudio y/o combinando las características de una manera distinta, para generar un parámetro morfocinético distinto.

Por ejemplo, mientras que la primera variable de irregularidad generalizada GIV1 como se describe anteriormente se basa en la duración de los ciclos celulares cc2a, cc2b, cc3a, cc3b, cc3c y cc3d (o al menos las duraciones de las que se miden/no faltan), otras variables de irregularidad generalizada pueden basarse en la duración de otros ciclos celulares. Por ejemplo, pueden definirse las siguientes variaciones para proporcionar distintos parámetros morfocinéticos para su uso en conformidad con las realizaciones de la invención:

GIV2 (segunda variable de irregularidad generalizada): similar a GIV1, pero también incluye cc1, es decir, GIV2 puede calcularse de manera similar a GIV1, pero basándose en cci = cc1, cc2a, cc2b, cc3a, cc3b, cc3c y cc3d. GIV3 (tercera variable de irregularidad generalizada): que incluye solo los ciclos celulares de segunda generación (cc2a y cc2b), es decir, GIV3 puede calcularse de manera similar a GIV1, pero basándose en cci = cc2a y cc2b. GIV4 (cuarta variable de irregularidad generalizada): que incluye solo el ciclo celular más corto para la segunda y tercera generación (cc2a y cc3a), es decir, GIV4 puede calcularse de manera similar a GIV1, pero basándose en cci = cc2a y cc3a.

Mientras que las variables de irregularidad generalizada del ejemplo anterior se basan en las duraciones del ciclo celular definidas con respecto a los tiempos de segmentación celular, se apreciará que otras variables de irregularidad generalizada pueden basarse en otras temporizaciones (y/o duraciones entre temporizaciones) que estén asociadas con otros sucesos del desarrollo embrionario. Por ejemplo, una variable de irregularidad generalizada utilizada como parámetro morfocinético en conformidad con algunas realizaciones de la invención puede establecerse utilizando temporizaciones definidas con respecto al tiempo de desvanecimiento de los pronúcleos (tPNf). Un ejemplo, que se puede denominar GIV5, se puede definir de la siguiente manera:

GIV5 (quinta variable de irregularidad generalizada): que comprende (t3 - tPNf) y cc3a.

En cada caso, si falta para un embrión alguna de las características que comprenden la variable de irregularidad generalizada (por ejemplo, debido a que no se midieron adecuadamente o no se habían producido antes del final del tiempo de incubación), la característica correspondiente puede quedar fuera del cálculo de la variable continua (parámetro morfocinético), reduciéndose correspondientemente el valor de n.

Pueden determinarse otros parámetros morfocinéticos a partir de características relacionadas con el desarrollo del embrión de estudio distintas de la duración del ciclo celular.

Por ejemplo, una variación del método analizado anteriormente con referencia a las etapas S1 a S4 puede comprender las siguientes etapas:

En una primera etapa T1, las características relacionadas con el desarrollo del embrión de estudio pueden comprender, en cambio, una serie de diferencias de tiempo Atj entre divisiones celulares posteriores (o estadios morfológicos). Por ejemplo, la pluralidad de características puede comprender una serie de valores: At1 (= t2); At2 (= t3 - t2); At3 (= t4 - t3); At4 (= t5 - t4), At5 (= t6 - t5), At6 (= t7 - t6), At7 (= t8 - t7) - es decir, las diferencias de tiempo entre las divisiones celulares posteriores hasta el estadio de ocho blastómeros. Es decir, para este ejemplo, la secuencia comprende todos los tiempos entre las divisiones celulares posteriores desde una sola célula hasta un embrión de ocho blastómeros, o al menos todos los tiempos que se consideran medidos adecuadamente (es decir, que no faltan).

En una segunda etapa T2 se obtienen valores promedio y de varianza observados en una población de uno o más embriones de referencia de potencial de desarrollo conocido (por ejemplo, embriones positivos para KID), para las características obtenidas para el embrión de estudio en la etapa T1.

En una tercera etapa T3, se determina una diferencia entre el valor de cada característica observada para el embrión de estudio y la característica promedio correspondiente asociada con la población de embriones con potencial de desarrollo conocido (por ejemplo, positivos para KID). En una cuarta etapa T4, se determina un parámetro morfocinético para el embrión de estudio (correspondiente a una variable continua) combinando / añadiendo las diferencias determinadas para cada característica de una manera ponderada por los respectivos valores de varianza. Por tanto, en un ejemplo concreto, un parámetro morfocinético (GTV) se define como:

en que Atj es la serie de diferencias en los tiempos para las divisiones celulares posteriores para el embrión de estudio, Atjm es la serie correspondiente de valores promedio observados en un grupo de embriones de referencia (por ejemplo, la población positiva para KID de pacientes menores de 35 años), y Atjv son los valores de varianza correspondientes asociados con la población de referencia. El parámetro k es el número de valores que comprenden la serie Atj. Las diferencias (Atj - Atjm) se normalizan mediante los valores de varianza Atjv como parte de la combinación. Esto significa que las diferencias para divisiones celulares particulares (valores de j) que presentan una varianza relativamente alta en la población de muestra contribuyen menos al valor de la GTV que las que presentan una varianza relativamente baja en la población de muestra. En este ejemplo, la contribución a la GTV para cada diferencia de tiempo depende de si la diferencia de tiempos para una pareja particular de divisiones celulares posteriores es más rápida o más lenta que el promedio observado en la población positiva para KID (es decir, si la diferencia es positiva o negativa).

Este parámetro morfocinético GTV puede denominarse en el presente documento variable de tiempo generalizada, GTV. En términos generales, la g Tv es baja cuando el embrión de estudio presenta un desarrollo relativamente rápido y es alta cuando el embrión presenta un desarrollo relativamente lento.

El parámetro morfocinético particular basado en la secuencia particular At1 (= t2); At2 (= t3 - t2); At3 (= t4 - t3); At4 (= t5 - t4), At5 (= t6 - t5), At6 (= t7 - t6), At7 (= t8 - t7), como en este ejemplo, puede denominarse en el presente documento una tercera variable de tiempo generalizada GIV3. Se apreciará nuevamente que se pueden utilizan métodos similares para establecer un parámetro morfocinético para un embrión utilizando distintas características relacionadas con el desarrollo del embrión de estudio.

Por ejemplo, mientras que la tercera variable de tiempo generalizada GTV3 como se describe anteriormente se basa en todos los tiempos entre las divisiones celulares posteriores de una sola célula a un embrión de ocho blastómeros, otras variables de irregularidad generalizada pueden basarse en otras secuencias de diferencias de tiempo. Por ejemplo, pueden definirse las siguientes variaciones para proporcionar distintos parámetros morfocinéticos para su uso en conformidad con las realizaciones de la invención:

GTV1 (primera variable de tiempo generalizada): similar a GTV3 pero utilizando solo la diferencia de tiempo de las dos últimas divisiones celulares observadas hasta el estado de 8 blastómeros. Es decir, Ati=(t8-t7), si t7 y t8 están anotados; o Ati = (t7-t6) si t8 falta y t6 y t7 están anotados; o Ati=(t6-t5) si t8 y t7 faltan y t5 y t6 están anotados; o Ati=(t5-t4) si t8, t7 y t6 faltan y t4 y t5 están anotados; o Ati=(t4-t3) si t5 a t8 faltan y t3 y t4 están anotados; o Ati=(t3-t2) si t4 a t8 faltan y t2 y t3 están anotados; Ati= t2 si t3 a t8 faltan y t2 está anotado. En cada caso, el parámetro k es 1.

GTV2 (segunda variable de tiempo generalizada): similar a GTV1 pero con el tiempo de división (tiempo de segmentación) posterior en una pareja reemplazado por tFinal (el final del tiempo de incubación) donde faltan temporizaciones. Es decir, Ati=(t8-t7), si t7 y t8 están anotados; o Ati = (tFinal-t7) si t8 falta y t7 está anotado; o Ati=(tFinal-t6) si t7 y t8 faltan y t6 está anotado; o Ati=(tFinal-t5) si t6 a t8 faltan y t5 está anotado; o Ati=(tFinal-t4) si t5 a t8 faltan y t4 está anotado; o Ati=(tFinal-t3) si t4 a t8 faltan y t3 está anotado; o Ati=(tFinal-t2) si t3 a t8 faltan y t2 está anotado. Los valores medios y de varianza para la población de referencia se pueden calcular basándose en Ati sin sustitución. Para la GTV2, el parámetro k es siempre 1.

GTV3 (tercera variable de tiempo generalizada): como se analiza anteriormente, este parámetro morfocinético utiliza temporizaciones entre todas las divisiones consecutivas que no faltan en los datos hasta el estadio de 8 blastómeros, es decir, Ati=((t8-t7), (t7-t6), (t6-t5), (t5- t4), (t4-t3), (t3-t2), t2). Si falta un Ati de esta secuencia para un embrión en particular, se omite del cálculo. El parámetro k es el número de Ati utilizado en el cálculo para un embrión en particular.

GTV4 (cuarta variable de tiempo generalizada): similar a GTV3 pero utilizando todas las divisiones consecutivas con sustitución del tiempo de la última división por el tiempo de finalización de la incubación si falta. Ati=((t8-t7),(t7-t6),(t6-t5),(t5-t4),(t4-t3),(t3-t2),t2). Si falta un ti, se sustituye por el tFinal. Los valores medios y de varianza para la población de referencia se pueden calcular basándose en Ati sin sustitución. K es el número de Ati utilizado en el cálculo para ese embrión en particular.

GTV5 (quinta variable de tiempo generalizada): de manera similar a GTV3 pero utilizando temporizaciones para los ciclos celulares completos. Es decir, Ati=((t8-t4), (t4-t2), t2). Si falta un Ati, se omite, k es el número de Ati utilizado en el cálculo para un embrión en particular.

GTV6 (sexta variable de tiempo generalizada): similar a GTV5 pero utilizando todos los ciclos celulares completos con sustitución del último tiempo de división por tFinal si falta. Ati=((t8-t4),(t4-t2), t2). Si falta un ti, se sustituye por tFinal. La media y la varianza se calculan basándose en Ati sin sustitución, k es el número de Ati utilizado en el cálculo para ese embrión en particular.

GTV7 (séptima variable de tiempo generalizada): similar a GTV2 pero utilizando solo el período desde la inseminación hasta la última temporización anotada. Es decir, Ati = t8 si t8 está anotado, Ati = t7 si t8 falta y t7 está anotado, Ati = t6 si t7 y t8 faltan y t6 está anotado, y así sucesivamente. Para la GTV7, el parámetro k es siempre 1. GTV8 (octava variable de tiempo generalizada): similar a GTV3 pero utilizando t8 si está anotado y de lo contrario utilizando tFinal si falta t8. Para la GTV8, el parámetro k es siempre 1.

GTV9 (novena variable de tiempo generalizada): similar a GTV2 pero utilizando estadios hasta el estadio de blastocistos para la evaluación el día 5 posinseminación. Ati=(tB-tSB), si tanto tSB como tB están anotados; o Ati=(tFinal-tSB), si tB falta y tSB está anotado; o Ati=(tFinal-tM), si tSB y tB faltan y tM está anotado; o Ati=(tM-t8), si tM a tB faltan y t8 está anotado; o Ati=(tFinal-t7), si t8 a tB falta y t7 está anotado; o Ati=(tFinal-t6) si t7 a tB faltan y t6 está anotado; o Ati=(tFinal-t5) si t6 a tB faltan y t5 está anotado; o Ati=(tFinal-t4) si t5 a tB faltan y t4 está anotado; o Ati=(tFinal-t3) si t4 a tB faltan y t3 está anotado; o Ati=(tFinal-t2) si t3 a tB faltan y t2 está anotado. La media y la varianza se pueden calcular basándose en Ati sin sustitución. Para la GTV9, el parámetro k es siempre 1.

GTV10 (décima variable de tiempo generalizada): similar a GTV4 pero utilizando todos los estadios hasta el estadio de blastocisto. Para la evaluación en el día 5 posinseminación. Ati=((tB-tSB),(tSB-tM),(tM-t8), (t8-t7),(t7-t6),(t6-t5),(t5-t4),(t4-t3),(t3-t2),t2). Si falta una temporización, se sustituye por el tFinal. La media y la varianza se calculan sobre la base de Ati sin sustitución. Para GTV10, el parámetro k es el número de Ati utilizado en el cálculo para ese embrión en particular.

Embrión

En algunos casos, el término "embrión" se utiliza para describir un ovocito fertilizado, después de la implantación en el útero hasta 8 semanas después de la fertilización, estadio en que se convierte en feto. De acuerdo con esta definición, el ovocito fertilizado a menudo se denomina preembrión hasta que se produce la implantación. Sin embargo, a lo largo de la presente solicitud de patente los inventores utilizarán una definición más amplia del término embrión, que incluye la fase preembrionaria. Por tanto, abarca todos los estadios del desarrollo desde la fertilización del ovocito hasta la mórula, estadios del blastocisto, eclosión e implantación.

Un embrión es aproximadamente esférico y está compuesto por una o más células (blastómeros) rodeadas por una capa similar a la gelatina, la matriz acelular conocida como zona pelúcida. La zona pelúcida realiza una diversidad de funciones hasta que el embrión eclosiona y es un buen punto de referencia para la evaluación del embrión. La zona pelúcida es esférica y translúcida, y debe distinguirse claramente de los restos celulares.

Un embrión se forma cuando un ovocito es fertilizado por fusión con o inyección de una célula espermática (espermatozoides). El término se utiliza también, tradicionalmente, después de la eclosión (es decir, la rotura de la zona pelúcida) y la implantación posterior. Para los seres humanos, el ovocito fertilizado se denomina tradicionalmente embrión durante las primeras 8 semanas. Después de eso (es decir, después de ocho semanas y cuando se han formado todos los órganos principales) se le llama feto. Sin embargo, la distinción entre embrión y feto generalmente no está bien definida.

Durante el desarrollo embrionario, el número de blastómeros aumenta geométricamente (1-2-4-8-16- etc.). La segmentación celular sincrónica generalmente se mantiene hasta el estadio de 16 células en los embriones. Después de eso, la división celular se vuelve asincrónica y finalmente las células individuales poseen su propio ciclo celular. Los embriones humanos producidos durante un tratamiento de infertilidad habitualmente se transfieren a la receptora antes del estadio de 16 blastómeros. En algunos casos, los embriones humanos también se cultivan hasta el estadio de blastocisto antes de la transferencia. Esto se hace preferentemente cuando hay muchos embriones de buena calidad disponibles o cuando es necesaria una incubación prolongada para esperar el resultado de un diagnóstico genético preimplantacional (DGP).

Por consiguiente, el término embrión se utiliza a continuación para indicar cada uno de los estadios del ovocito fertilizado, cigoto, 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, mórula, blastocisto, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado, así como todos los estadios intermedios (por ejemplo, 3 células o 5 células)

Ejemplos

Ejemplo 1

Se investigó el desarrollo de tres grupos distintos de embriones de ratón incubados en tres temperaturas distintas del medio de incubación, en condiciones similares, es decir, solo difería la temperatura entre los tres distintos grupos. La temperatura del medio de incubación se valoró midiendo la temperatura del soporte de portaobjetos utilizando un termómetro de precisión YSI.

Las tres temperaturas distintas fueron 36,5 °C (33 embriones), 37,5 °C (63 embriones) y 38,5 °C (35 embriones), respectivamente. Casi todos los embriones de ratón alcanzaron el estadio de blastocisto como se observa en la siguiente tabla.

Temperatura del soporte de portaobjetos (°C) N Tasa de blastocistos (%)

36,5 33 100

37,5 63 98

38,5 35 100

La siguiente tabla muestra la temporización promedio medida para distintas divisiones celulares, el estadio de mórula y de blastocisto.

Estos datos se han representado en tres gráficas que se muestran en la fig. 5. La diferencia entre diversas divisiones celulares se muestra en la fig. 6. Los datos y las gráficas demuestran que el aumento de la temperatura del medio acelera claramente el desarrollo.

Para valorar la diferencia en el desarrollo, puede definirse un coeficiente de tasa relativa k. Si k se establece en 1 a temperatura base (T^b) se puede asumir la siguiente relación:

k(T) = 1+a*(T^b-36.5)

en que T es la temperatura en °C y a es el coeficiente de dependencia de la temperatura.

El tiempo esperado t para una temperatura dada T, con respecto t(T>), es inversamente proporcional a k(T):

t(T = t(T^b)/k(T)

La simplificación lineal anterior ofrece la ventaja de que solo precisa la estimación de un único parámetro. En cambio, probablemente solo sea válido dentro de un estrecho intervalo de temperaturas. Sin embargo, en el caso de la incubación de embriones humanos, la extensión de la temperatura máxima esperada sería algo inferior a ± 1 °C, de modo que la influencia práctica de la no linealidad puede considerarse insignificante.

Optimizando k(T) y t(T) mediante la utilización de los datos de embriones de ratón enumerados anteriormente, utilizando el tiempo de división a 5 células (t5), a se estima en 0,080 ± 0,015 (CI del 95 %).

El valor de Q¹⁰se calcula como:

en que R es la tasa y T es la temperatura.

Utilizando el parámetro anterior, los datos de los embriones de ratón y la extensión de ± 1 °C en el experimento, la ecuación anterior produce una Q¹⁰de 2,22, que está dentro del intervalo normalmente esperado de 2 - 3 en sistemas biológicos (Reyes et al., 2008, Mammalian peripheral circadian oscillators are temperature compensated. J. Biol. Rhythms 23: 95-98).

Se han realizado los mismos cálculos para un conjunto de datos de 1397 embriones humanos obtenidos de distintas clínicas. Por lo tanto, las condiciones de incubación de estos embriones humanos no son tan similares a las de los embriones de ratón mencionados anteriormente. Sin embargo, las clínicas pertenecen a la misma cadena de clínicas de FIV que utilizan la misma instrumentación. Todos los embriones se han transferido con procedimientos homogeneizados, además de la temperatura. Utilizando t5 en este caso de nuevo y optimizando de acuerdo con k(T) y t(T), la estimación de a se convierte en 0,058 ± 0,028 (CI del 95 %).

A diferencia de los embriones de ratón, estos embriones humanos se incubaron en condiciones ligeramente distintas. Por lo tanto, los datos extraídos de embriones humanos no son comparables en el mismo grado que los datos de embriones de ratón. Sin embargo, de nuevo, los datos de los embriones humanos indican que una temperatura del medio más alta acelera el desarrollo. Al seguir de forma constante los parámetros morfocinéticos, este aumento en la velocidad de desarrollo puede detectarse y proporcionar una alerta temprana de un problema. Este problema puede estar relacionado con un aumento no conveniente de la temperatura, lo que puede corregirse antes de que se transfieran los embriones.

Ċ

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método implementado por ordenador para detectar automáticamente variaciones y/o anomalías en las condiciones de cultivo de embriones en incubación in vitro, comprendiendo el método las etapas de:

a) obtener un primer conjunto de datos que comprende parámetros morfocinéticos relacionados con el desarrollo de un primer grupo de embriones,

b) obtener un segundo conjunto de datos que comprende los correspondientes parámetros morfocinéticos relacionados con el desarrollo de un segundo grupo de embriones,

c) modificar el primer y el segundo conjunto de datos extrayendo valores atípicos de parámetros morfocinéticos del primer conjunto de datos y/o del segundo conjunto de datos,

d) calcular la diferencia entre parámetros morfocinéticos concretos del primer conjunto de datos modificado y los parámetros morfocinéticos correspondientes del segundo conjunto de datos modificado, y

e) seguir dicha diferencia morfocinética detectando de este modo variaciones en las condiciones de cultivo del primer y el segundo grupo de embriones, y emitir una alerta cuando la diferencia morfocinética está por encima de un nivel predefinido.

2. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las etapas a) - d) se repiten y el segundo conjunto de datos se actualiza continuamente con los datos de embriones más recientes.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho nivel predefinido se determina como un nivel predefinido por encima de la desviación típica de uno o más de los parámetros morfocinéticos del primer conjunto de datos.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los valores atípicos de los parámetros morfocinéticos se excluyen de los conjuntos de datos.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde todos los parámetros morfocinéticos de embriones con uno o más valores atípicos de parámetros morfocinéticos se excluyen de los conjuntos de datos.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los parámetros morfocinéticos se seleccionan del grupo de:

- el tiempo de segmentación a un embrión de n blastómeros, tn, en que n = {1, ..., 8},

- duración de los ciclos celulares cc1, cc2, cc2b, cc3, cc2_3 y cc4,

- sincronicidades s2, s3, s3a, s3b y s3c,

- número de blastómeros en puntos temporales concretos predefinidos,

- cualquier combinación de estos parámetros morfocinéticos.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de calcular los valores de medias móviles o los valores de medianas móviles de los parámetros morfocinéticos.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de calcular los valores medios (promedio), los valores medianos, los valores de la varianza y/o los valores de la desviación típica de la morfocinética.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde lo siguiente es un parámetro morfocinético:

en donde i = {1,2,3,4}, ccim es el valor medio o el valor mediano de cci y cci, es la varianza de cci.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos un parámetro morfocinético para un embrión se establece obteniendo valores para una pluralidad de características relacionadas con el desarrollo del embrión durante un período de observación; y determinando un valor para el al menos un parámetro morfocinético combinando diferencias entre los valores obtenidos y los valores de referencia correspondientes para la pluralidad de características de una manera predefinida.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos uno de los parámetros morfocinéticos se basa en una variable de irregularidad generalizada, GIV, determinada de acuerdo con:

en que cci es una serie de duraciones del ciclo celular de un embrión, ccim es una serie correspondiente de duraciones promedio del ciclo celular observadas en una población de embriones de referencia, cciv es una serie correspondiente de valores de varianza para las respectivas duraciones del ciclo celular observadas en la población de referencia, y n es el número de duraciones del ciclo celular que comprenden la serie de duraciones del ciclo celular,

o

en donde al menos uno de los parámetros morfocinéticos se basa en una variable de tiempo generalizada, GTV, determinada de acuerdo con:

1 y Atj - Atjm

GTV

k todo Ls luos j en A tjv

una secuencia

en que Atj es una serie de diferencias en los tiempos para las divisiones celulares posteriores para un embrión, Atjm es una serie correspondiente de valores promedio observados en una población de embriones de referencia, Atjv es una serie correspondiente de valores de varianza para las respectivas diferencias en los tiempos para las divisiones celulares posteriores observadas en la población de referencia, y k es el número de diferencias en los tiempos que comprenden la serie.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los valores atípicos morfocinéticos se seleccionan del grupo de: segmentación de forma directa de embriones de 1 ^3 células con cc2<5 horas, segmentación de forma directa de embriones de 2 ^ 5 células, embriones de ciclo celular corto, embriones de ciclo celular largo y embriones que experimentan multinuclearidad.

13. Un ordenador que comprende partes de código informático que constituyen medios para ejecutar los métodos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11.