ES2353622T3 - Evaluación de la calidad del embrión basada en la división y el movimiento del blastómero. - Google Patents

Abstract

Método para determinar la calidad del embrión que comprende monitorizar el embrión durante un periodo de tiempo antes de que el embrión experimente compactación, teniendo dicho periodo de tiempo una duración suficiente para comprender al menos un periodo de división celular y al menos una parte de un periodo entre divisiones, y determinar el grado de movimiento celular durante la al menos parte de un periodo entre divisiones obteniendo de ese modo una medida de la calidad del embrión.

Description

Evaluación de la calidad del embrión basada en la división y el movimiento del blastómero.

La presente invención se refiere a un método para seleccionar embriones para la fertilización in vitro basándose en la sincronización y el grado de divisiones celulares observadas y el movimiento celular asociado.

Antecedentes

La esterilidad afecta a más de 80 millones de personas en todo el mundo. Se estima que el 10% de todas las parejas experimentan esterilidad primaria o secundaria (Vayena et al. 2001). La fertilización in vitro (IVF) es un tratamiento médico de elección que puede proporcionar a una pareja que no ha podido concebir de otra manera una oportunidad de lograr un embarazo. Es un procedimiento en el que se toman óvulos (ovocitos) de los ovarios de una mujer y entonces se fertilizan con espermatozoides en el laboratorio. Entonces, los embriones creados en este procedimiento se colocan en el útero para lograr su implantación potencial. Para evitar embarazos múltiples y nacimientos múltiples, sólo se transfieren unos pocos embriones (normalmente menos de cuatro e idealmente sólo uno (Bhattacharya et al. 2004)). La selección de los embriones apropiados para su transferencia es una etapa crítica en cualquier tratamiento de IVF. La mayoría de los procedimientos de selección actuales se basan completamente en la evaluación morfológica del embrión en diferentes puntos de tiempo durante su desarrollo y particularmente en una evaluación en el momento de la transferencia usando un estereomicroscopio convencional. Sin embargo, se reconoce ampliamente que el procedimiento de evaluación necesita mejoras cualitativas así como cuantitativas.

División celular temprana. Un nuevo enfoque prometedor es usar la "división temprana" hasta la fase de 2 células, (es decir, antes de 25-27 h tras la inseminación/inyección), como un indicador de la calidad. En este enfoque, los embriones se inspeccionan visualmente 25-27 horas tras la fertilización para determinar si se ha completado la primera división celular. Varios estudios han demostrado una fuerte correlación entre la segmentación temprana y el potencial de desarrollo posterior de embriones individuales. (Shoukir et al., 1997; Sakkas et al., 1998, 2001; Bos-Mikich et al., 2001; Lundin et al., 2001; Petersen et al., 2001; Fenwick et al., 2002; Neuber et al. 2003; Salumets et al., 2003; Windt et al., 2004). Varios observadores han señalado la necesidad de una observación más frecuente. Sin embargo, las observaciones visuales frecuentes con transferencias asociadas del incubador a un microscopio invertido inducen una tensión física que puede dificultar o incluso detener el desarrollo del embrión. También requiere mucho tiempo y es difícil de incorporar en la rutina diaria de las clínicas de IVF.

Varios investigadores han realizado adquisición de imágenes a intervalos regulares durante el desarrollo del embrión. Esto se ha realizado principalmente colocando un microscopio de investigación dentro de un incubador o construyendo una "platina con incubador" sobre una platina de microscopio con adquisición de imágenes automatizada. El "incubador" mantiene una temperatura (37ºC), humedad (> 90%) y composición de gases (un 5% de CO_{2} y en algunos casos concentración de oxígeno reducida) aceptables. La evaluación manual de las imágenes a intervalos regulares ha proporcionado información importante sobre la sincronización y el intervalo de tiempo entre el comienzo de divisiones celulares consecutivas (Grisart et al. 1994, Holm et al. 1998, Majerus et al. 2000, Holm et al. 2002, Holm et al. 2003, Lequarre et al. 2003, Motosugi et al. 2005).

Tokura et al. (1993) dan a conocer que en los embriones de ratón cultivados in vitro que muestran un bloqueo del desarrollo, se inhibió la translocación mitocondrial tras la agregación en la fase de dos células temprana.

Squirrell et al. (2003) notifican que la acumulación definida de mitocondrias entre los pronúcleos en los óvulos fertilizados antes de la singamia se correlaciona positivamente con el desarrollo hasta la fase de blastocisto en embriones de primates.

En Squirrell et al. (1999) se rastrearon las mitocondrias en embriones vivos hasta las fases de blastocisto usando microscopía multifótonica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para facilitar la selección de embriones óptimos que van a implantarse tras fertilización in vitro (IVF) basándose en la sincronización, la duración, la distribución espacial y el grado de divisiones celulares observadas y el movimiento celular y de orgánulos asociado.

Por consiguiente, en un primer aspecto la invención se refiere a un método para determinar la calidad del embrión que comprende monitorizar el embrión durante un periodo de tiempo antes de que el embrión experimente compactación, teniendo dicho periodo de tiempo una duración suficiente para comprender al menos un periodo de división celular y al menos una parte de un periodo entre divisiones, y determinar el grado de movimiento celular durante la al menos parte de un periodo entre divisiones obteniendo de ese modo una medida de la calidad del embrión.

Entonces, puede usarse la medida de la calidad del embrión obtenida para identificar y seleccionar embriones adecuados para su trasplante en el útero de una mujer con el fin de proporcionar un embarazo y un bebé nacido con vida.

Por tanto, en un aspecto adicional la invención se refiere a un método para seleccionar un embrión adecuado para su trasplante, comprendiendo dicho método monitorizar el embrión tal como se definió anteriormente, obtener un medida de la calidad del embrión y seleccionar el embrión que tiene la medida de calidad del embrión más alta.

La invención puede aplicarse en un sistema que tiene medios para llevar a cabo los métodos descritos anteriormente. Dicho sistema puede ser cualquier sistema adecuado, tal como un ordenador que comprende partes de códigos informáticos que constituyen medios para ejecutar los métodos tal como se describieron anteriormente. El sistema puede comprender además medios para obtener imágenes del embrión a diferentes intervalos de tiempo, tal como el sistema descrito en el documento WO2007/042044.

La invención puede aplicarse en un soporte de datos que comprende partes de códigos informáticos que constituyen medios para ejecutar los métodos tal como se describieron anteriormente.

Dibujos

Figura 2. Actividad de blastómeros de dos embriones bovinos representativos "buenos" desarrollados hasta un blastocisto en eclosión. Los "malos" nunca se desarrollaron hasta blastocisto.

Figura 3. Actividad de blastómeros de 41 embriones bovinos. La actividad de blastómeros se muestra como una imagen de pseudogel en la que los picos de motilidad están indicados por bandas oscuras y la inactividad es de color blanco, cada carril corresponde a un único embrión. Las manchas o el patrón de bandas oscuras reflejan periodos de motilidad celular dentro del embrión. Los embriones "buenos" que se desarrollaron hasta blastocistos se muestran por encima de los embriones "malos" que no se desarrollaron hasta la fase de blastocisto. Se observan bandas iniciales más nítidas (habitualmente tres) para los embriones buenos.

Figura 4. Actividad de blastómeros de trece embriones bovinos representativos. Los embriones "buenos" que se desarrollaron hasta un blastocisto en eclosión están representados por curvas verdes. Los embriones "malos" que nunca se desarrollaron hasta blastocisto se muestran en rojo. El eje X es el número de fotogramas, el eje y es la actividad de blastómeros. La adquisición de imágenes se inició 24 horas tras la fertilización y avanzó con 2 fotogramas por hora. Se han desplazado las curvas verdes sobre el eje y añadiendo 30 al valor de la actividad de blastómeros.

Figura 5. Actividad de blastómeros promedio para todos los fotogramas adquiridos (zona clara = alta actividad de blastómeros, zona oscura = baja actividad de blastómeros).

Figura 6. Actividad de blastómeros de 21 embriones bovinos que no se desarrollaron hasta blastocistos de alta calidad. Se indican las tres partes de las curvas que se usan para clasificar el patrón de actividad de blastómeros.

Figura 7. Actividad de blastómeros de 18 embriones bovinos que no se desarrollaron hasta blastocistos de alta calidad. Se indican las tres partes de las curvas que se usan para clasificar el patrón de actividad de blastómeros.

Figura 8. Correlación entre las divisiones celulares detectadas manual y automáticamente para 13 embriones representativos. No se detectó aproximadamente el 10% de las divisiones celulares mediante este algoritmo, pero por lo demás la correspondencia es excelente.

Figura 9. Divisiones celulares detectadas manualmente para embriones buenos y malos.

Figura 10. Estimación de parámetros derivados. El gráfico en la esquina superior derecha muestra las actividades de blastómeros originales como función del número de fotogramas. La línea verde y azul indica el inicio del segundo y tercer intervalo de tiempo, respectivamente. El gráfico en la esquina inferior derecha muestra los parámetros derivados, tal como se describieron anteriormente. Las líneas rojas verticales indican el tiempo y el valor de los valores de actividad más alta o más baja dentro de un pico o un valle, respectivamente.

Figura 11. Parámetros derivados (véase la figura anterior) a partir del análisis de la actividad de blastómeros de 94 embriones. Los embriones que se desarrollan hasta un blastocisto expandido de buena calidad se muestran en rojo (ejemplos buenos), aquellos que no lo hacen se muestran en azul (ejemplos malos).

Figura 12. Gráfico de PCA de los primeros cinco ejes de PCA. Un punto rojo es un embrión con buena calidad mientras que uno azul es un embrión con mala calidad.

Figura 13. Valor inicial para la actividad de blastómeros en el segmento de tiempo 3 (es decir, de 76 a 96 horas tras la fertilización) para 94 embriones diferentes. El grado es una medida de la calidad de blastómero del embrión bovino dado tras 7 días de incubación. Los embriones de grado 1 son los de mejor calidad y tienen valores iniciales significativamente superiores a los de grado 5 que son los de calidad más baja y a menudo atrésicos.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Periodo de división celular: el periodo de tiempo desde la primera observación de indentaciones en la membrana celular (lo que indica el comienzo de la división citoplasmática) hasta que la división celular citoplasmática se completa de manera que se segrega el citoplasma de las consiguientes células hijas en dos células separadas.

Periodo entre divisiones: el periodo de tiempo desde el final de un periodo de división celular hasta el comienzo del periodo de división celular subsiguiente.

Ciclo de división: El intervalo de tiempo entre el comienzo de divisiones celulares consecutivas, es decir desde el inicio de un periodo de división celular hasta el inicio de la división celular subsiguiente.

Redisposición de la posición celular = movimiento celular (véase a continuación)

Movimiento celular: Movimiento del centro de la célula y de la membrana celular externa. El movimiento interno de los orgánulos dentro de la célula NO es movimiento celular. La membrana celular externa es una estructura dinámica, de modo que el límite celular cambiará continuamente su posición ligeramente. Sin embargo, estas ligeras fluctuaciones no se consideran movimiento celular. El movimiento celular es cuando el centro de gravedad para la célula y su posición con respecto a otras células cambia así como cuando se dividen las células. El movimiento celular puede cuantificarse calculando la diferencia entre dos imágenes digitales consecutivas de la célula en movimiento. Un ejemplo de tal cuantificación se describe en detalle en el documento WO 2007/042044. Sin embargo, pueden preverse otros métodos para determinar el movimiento del centro de gravedad celular, y o la posición de la membrana citoplasmática, por ejemplo usando el software FertiMorph (ImageHouse Medical, Copenhague, Dinamarca) para trazar de manera semiautomática el límite de cada blastómero en secciones transversales ópticas consecutivas a través de un embrión.

Movimiento de orgánulos: Movimiento de orgánulos internos y membranas de orgánulos dentro del embrión que puede ser visible mediante microscopía. El movimiento de orgánulos no es movimiento celular en el contexto de esta solicitud.

Movimiento: redisposición espacial de los objetos. Los movimientos se caracterizan y/o cuantifican y/o describen mediante muchos parámetros diferentes incluyendo pero sin limitarse a: el grado de movimiento, el área y/o volumen implicados en el movimiento, la rotación, los vectores de traslación, la orientación del movimiento, la velocidad del movimiento, el redimensionamiento, el crecimiento/decrecimiento, etc. Por tanto, pueden usarse diferentes mediciones del movimiento celular o de orgánulos para diferentes fines, algunos de los cuales reflejan el grado o la magnitud del movimiento, algunos la distribución espacial de los objetos en movimiento, algunos las trayectorias o los volúmenes que se ven afectados por el movimiento.

Embrión: En algunos casos el término "embrión" se usa para describir un ovocito fertilizado tras la implantación en el útero hasta las 8 semanas tras la fertilización, fase en la que se convierte en un feto. Según esta definición, el ovocito fertilizado se denomina a menudo preembrión hasta que se produce la implantación. Sin embargo, en toda esta solicitud de patente se usará una definición más amplia del término embrión, que incluye la fase de preembrión. Por tanto, abarca todas las fases del desarrollo desde la fertilización del ovocito hasta la mórula, las fases de blastocistos en eclosión y la implantación.

La calidad del embrión es una medida de la capacidad de dicho embrión para implantarse y desarrollarse satisfactoriamente en el útero tras su transferencia. Los embriones de alta calidad se implantarán y se desarrollarán satisfactoriamente en el útero tras su transferencia mientras que los embriones de baja calidad no lo harán.

La viabilidad del embrión es una medida de la capacidad de dicho embrión para implantarse y desarrollarse satisfactoriamente en el útero tras su transferencia. Los embriones de alta viabilidad se implantarán y se desarrollarán satisfactoriamente en el útero tras su transferencia mientras que los embriones de baja viabilidad no lo harán. Viabilidad y calidad se usan de manera intercambiable en este documento.

La medición de la calidad (o viabilidad) del embrión es un parámetro que pretende reflejar la calidad (o viabilidad) de un embrión de manera que los embriones con altos valores del parámetro de calidad tienen una alta probabilidad de ser de alta calidad (o viabilidad) y baja probabilidad de ser de baja calidad (o viabilidad). Mientras que los embriones con un bajo valor asociado para el parámetro de calidad (o viabilidad) sólo tienen una baja probabilidad de tener una alta calidad (o viabilidad) y una alta probabilidad de ser de baja calidad (o viabilidad).

Embrión

Un embrión es aproximadamente esférico y está compuesto por una o más células (blastómeros) rodeadas por una envuelta similar a gelatina, la matriz acelular conocida como zona pelúcida. La zona pelúcida realiza una variedad de funciones hasta que el embrión eclosiona, y es un buen punto de referencia para la evaluación del embrión. La zona es esférica y traslúcida, y debe poder distinguirse claramente de los residuos celulares.

Un embrión se forma cuando se fertiliza un ovocito mediante fusión o inyección de un espermatozoide (espermatozoos). El término se usa tradicionalmente también tras la eclosión (es decir, la ruptura de la zona pelúcida) y la consiguiente implantación. Para los seres humanos, el ovocito fertilizado se denomina tradicionalmente embrión durante las primeras 8 semanas. Después, (es decir, tras ocho semanas y cuando se han formado todos los órganos principales) se denomina feto. Sin embargo, la distinción entre embrión y feto generalmente no está bien
definida.

Durante el desarrollo embrionario, los números de blastómeros aumentan geométricamente (1-2-4-8-16-etc.). La división celular sincrónica se mantiene generalmente hasta la fase de 16 células en los embriones. Después, la división celular se vuelve asincrónica y finalmente las células individuales poseen su propio ciclo celular. Para los embriones bovinos: los blastómeros que componen el embrión deben poder identificarse fácilmente hasta al menos las fases de 16 células como células esféricas. Aproximadamente en la fase de 32 células (fase de mórula), los embriones experimentan compactación, debido a que se produce adhesión entre células cuando se expresan proteína de adhesión. Como resultado, las células individuales en el embrión son difíciles de evaluar y enumerar más allá de esta fase. Para los embriones humanos, la compactación se produce un poco antes y los blastómeros individuales no pueden identificarse fácilmente en la fase de 16 células. Los embriones humanos producidos durante el tratamiento de esterilidad se transfieren habitualmente al receptor antes de la fase de mórula, mientras que a menudo otros embriones de mamíferos se cultivan experimentalmente hasta una fase de desarrollo adicional (blastocistos expandidos) antes de su transferencia al receptor o su eliminación. En algunos casos, los embriones humanos también se cultivan hasta la fase de blastocisto antes de su transferencia. Esto se realiza preferiblemente cuando están disponibles muchos embriones de buena calidad o es necesaria una incubación prolongada para aguardar el resultado de un diagnóstico genético preimplantación (PGD). Por consiguiente, el término embrión se usa a continuación para indicar cada una de las fases de ovocito fertilizado, cigoto, 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, mórula, blastocisto, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado, así como todas las fases entre éstas (por ejemplo, 3 células o 5 células).

Determinación de la calidad

La presente invención proporciona una medición de la calidad del embrión [véase la definición de medición de calidad del embrión más arriba] que se basa en una o más determinaciones del embrión, tal como determinar el grado de movimiento celular en al menos dos periodos entre divisiones obteniendo de ese modo una medida de la calidad del embrión.

La invención se basa en la observación de que las posiciones celulares habitualmente son relativamente estacionarias entre divisiones celulares (es decir, poco movimiento celular), excepto durante un intervalo de tiempo corto alrededor de cada división celular, en el que la división de una célula en dos conduce a una redisposición breve pero considerable de las células en división así como las células circundantes (es decir, movimiento celular pronunciado).

Un uso particular contemplado por esta solicitud es evaluar series de imágenes de embriones en desarrollo (imágenes a intervalos regulares). Estas imágenes a intervalos regulares pueden analizarse mediante la formación de imágenes de diferencias (véase el documento WO 2007/042044). Las imágenes de diferencias resultantes pueden usarse para cuantificar la cantidad de cambio que se produce entre fotogramas consecutivos en una serie de imágenes.

La solicitud puede aplicarse al análisis de datos de imágenes de diferencias, en el que las posiciones cambiantes de los límites celulares (es decir, membranas celulares) como consecuencia del movimiento celular hacen que un intervalo de parámetros derivados de la imagen de diferencias aumente temporalmente (véase el documento WO 2007/042044). Estos parámetros incluyen (pero no se limitan a) un aumento en la varianza o intensidad absoluta media. Por tanto, pueden detectarse las divisiones celulares y su duración y redisposición celular relacionada mediante el cambio temporal, un aumento o una disminución, en la desviación estándar para todos los píxeles en la imagen de diferencias o cualquier otro de los parámetros derivados para la "actividad de blastómeros" enumerados en el documento WO 2007/042044. Sin embargo, los criterios de selección también pueden aplicarse a las observaciones visuales y al análisis de imágenes a intervalos regulares y a otros datos resueltos temporalmente (por ejemplo, excreción o captación de metabolitos, cambios en el aspecto físico o químico, difracción, dispersión, absorción, etc.) relacionados con el desarrollo del embrión que no están relacionados con la actividad de blastómeros tal como se define en el documento WO 2007/042044.

Son particularmente interesantes el comienzo, la magnitud y la duración de las divisiones celulares que pueden cuantificarse como picos o valles, en los valores de parámetros derivados. Estos extremos, picos o valles, frecuentemente indican acontecimientos de división celular. La sincronización y la duración de estos acontecimientos así como los valores de parámetros observados durante y entre los acontecimientos se usan para caracterizar el embrión, y para evaluar su potencial de desarrollo. La forma de cada pico también proporciona información adicional al igual que el tamaño del pico en general. Un pico también puede indicar un colapso súbito de un blastómero y la concurrente muerte celular. Sin embargo, puede ser posible separar acontecimientos de división celular y acontecimientos de muerte celular mediante la forma del pico y el cambio en los valores de base antes y tras el acontecimiento. El nivel inicial de la mayoría de los parámetros no se ve afectado habitualmente por la división celular mientras que la lisis celular va acompañada frecuentemente por un cambio marcado en el valor inicial (para la mayoría de los parámetros en una disminución tras la lisis).

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Otro interés particular es la distribución espacial del movimiento tanto celular como de orgánulos. Los volúmenes dentro de la zona pelúcida que están desprovistos de movimiento (o zonas de manera similar en una imagen 2D proyectada del embrión que permanece estacionario) son una indicación de zonas "muertas" dentro del embrión. Cuanto más grandes y más sean estas zonas "muertas" inmóviles, menor será la probabilidad de desarrollo satisfactorio del embrión. Zonas grandes dentro de una serie a intervalos regulares de imágenes del embrión sin ningún tipo de movimiento (es decir, ni movimiento celular ni de orgánulos) indican baja viabilidad. El movimiento de orgánulos debe poder detectarse generalmente en todo el embrión incluso cuando sólo se comparan dos o unos pocos fotogramas consecutivos. El movimiento celular puede estar más localizado especialmente en las últimas fases del desarrollo del embrión, sin embargo, cuando se evalúan muchos fotogramas sucesivos, el movimiento celular debe poder detectarse en todo el volumen dentro de la zona pelúcida, lo que indica que todos los blastómeros dentro del embrión se dividen y cambian de posición.

Por tanto, la medida de la calidad del embrión según la solicitud comprende información acerca del movimiento celular y de orgánulos durante al menos una división celular, y/o al menos una parte de un periodo entre divisiones tal como i) la duración del al menos un periodo de división celular; y/o ii) determinar el grado y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante el periodo de división celular; y/o iii) determinar la duración de un periodo entre divisiones; y/o iv) determinar el grado y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante el periodo entre divisiones. La medida de la calidad del embrión puede comprender información de dos o más de las determinaciones descritas en el presente documento, tal como tres o más de las determinaciones descritas en el presente documento. La medida de la calidad del embrión puede comprender información de todas las determinaciones descritas en el presente documento. En particular, la medida de la calidad del embrión comprende información acerca de la duración del periodo de división celular y la duración del periodo entre divisiones, o la medida de la calidad del embrión comprende información acerca del movimiento en el periodo de división celular y el movimiento en el periodo entre divisiones. La medida de la calidad del embrión puede comprender información acerca de la duración de un periodo y el movimiento en el mismo periodo.

La medida de la calidad del embrión se basa en las siguientes observaciones:

a)

Divisiones celulares súbitas en las que la división real del citoplasma avanza rápidamente y la consiguiente redisposición de las posiciones de los otros blastómeros que se produce rápidamente (por ejemplo, picos de actividad de blastómeros agudos) son indicativas de un embrión de alta calidad. La duración prolongada de la división citoplasmática y la redisposición espacial extensa de los otros blastómeros después de eso (es decir, movimiento celular) indican un embrión de mala calidad (por ejemplo, picos de actividad de blastómeros anchos). (Ejemplo 1)

b)

Poca redisposición de la posición de blastómeros entre divisiones celulares indica un embrión de alta calidad mientras que el movimiento entre divisiones celulares visibles a menudo indica un embrión de mala calidad. (Ejemplo 1)

c)

La redisposición prolongada de la posición celular entre la división celular (por ejemplo, picos de actividad de blastómeros anchos) a menudo está asociada con una mala calidad del embrión, división celular asincrónica y fragmentación extensa. (Ejemplo 1)

d)

Se observa un periodo de tranquilidad de muy poco movimiento celular para la mayoría de mamíferos cuando se activa el genoma embrionario y la síntesis de proteínas cambia de transcritos maternos a embrionarios. Si este periodo tiene: i) comienzo temprano, ii) muy baja actividad (= poco movimiento celular = tranquilidad) y iii) terminación temprana, entonces es una fuerte indicación de un embrión de alta calidad. El comienzo del periodo de tranquilidad a menudo se retrasa, y a veces el periodo se ve interrumpido por el movimiento celular en embriones de mala calidad. Los embriones de mala calidad también pueden tener un nivel inicial elevado de movimiento celular en el periodo de "tranquilidad" sin división celular detectable (ejemplo 2)

e)

En embriones de mala calidad que posteriormente cesan su desarrollo, a menudo se observan regiones persistentemente inmóviles y particulares que persisten y en última instancia conducen a la detención del desarrollo. Tales regiones inmóviles pueden estar asociadas con extensa fragmentación o lisis y muerte de blastómeros. Si estas regiones son más grandes que un porcentaje dado en una fase del desarrollo dada, entonces el embrión tiene muy baja probabilidad de sobrevivir. En embriones de alta calidad, la motilidad celular que sigue brevemente tras cada acontecimiento de división citoplasmática se distribuye inicialmente sobre toda la superficie del embrión (es decir, todos los blastómeros se mueven ligeramente), sólo tras la compactación en la fase de mórula se observa movimiento localizado (ejemplo 3).

f)

Se encuentra generalmente una distribución espacial uniforme del movimiento de orgánulos en embriones de alta calidad viables, mientras que se encuentran frecuentemente zonas "muertas" desprovistas de motilidad para los embriones de baja calidad. Se han realizado observaciones similares para el movimiento celular, pero se requiere observación durante una ventana de tiempo más prolongada para determinar la uniformidad espacial del movimiento celular (ejemplo 3).

g)

La cantidad de movimiento celular en diferentes intervalos de tiempo es un buen indicador de la calidad del embrión. Puede calcularse un parámetro relacionado con la calidad a partir de una razón de movimiento promedio en diferentes segmentos de tiempo y/o una razón de desviaciones estándares en diferentes segmentos de tiempo. Pueden establecerse procedimientos de selección de embriones basados en el valor de estos parámetros. (Ejemplo 4).

h)

Una disminución gradual o súbita en el nivel inicial de la motilidad celular y la motilidad de orgánulos está asociada frecuentemente con una baja calidad del embrión y una alta probabilidad de detención del desarrollo. El cambio en el nivel inicial puede estar asociado con la aparición de zonas/regiones inactivas (véanse (e) y (f) anteriores). (Ejemplo 6)

i)

El comienzo temprano de la primera división celular es una indicación de la alta calidad del embrión. El comienzo tardío de la primera (y posteriores divisiones celulares) indica embriones de baja calidad. Sin embargo, para la mayoría de los embriones, el comienzo exacto de la primera división celular sola no proporciona una indicación clara de la calidad del embrión (ejemplo 4).

j)

Para la mayoría de los parámetros derivados que describen el movimiento celular y de orgánulos, puede definirse un intervalo normal de manera que los valores fuera del intervalo normal (por ejemplo anómalamente altos o anómalamente bajos) sean ambos indicativos de la mala calidad del embrión. (Ejemplo 6)

k)

Los intervalos entre divisiones celulares consecutivas son indicadores importantes (y específicos de especie) de la viabilidad del embrión, un ejemplo sería la razón entre el intervalo entre la división celular 1 \rightarrow 2 y la 2 \rightarrow 4 y el intervalo entre la división celular 2\rightarrow4 y la 4\rightarrow8. La razón de estos intervalos debe estar dentro de un intervalo dado para embriones viables.

l)

Se encuentra en su mayor parte división celular sincronizada en las fases tardías (por ejemplo 2\rightarrow4, 4\rightarrow8) para embriones de alta calidad mientras que a menudo se observa división celular asincrónica para embriones de baja calidad (por ejemplo 2\rightarrow3\rightarrow4\rightarrow5\rightarrow6\rightarrow7\rightarrow8) (Ejemplo 1)

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Las siguientes determinaciones conducen a la medida de la calidad del embrión más alta:

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Periodos de división celular cortos, en los que corto se define como inferior a 2 horas.

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Poco movimiento celular en los periodos entre divisiones, en el que poco se define como prácticamente sin cambios en la posición celular más allá de las oscilaciones habituales y los movimientos de orgánulos que siempre contribuyen a la imagen de diferencias. Poco movimiento celular implica que el centro de gravedad celular es estacionario (movimiento < 3 \mum) y las membranas citoplasmáticas están en gran parte inmóviles (< 3 \mum).

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Comienzo temprano del primer periodo de división celular, es decir, antes de 25 horas tras la fertilización para embriones humanos (antes de 30 horas tras la fertilización para embriones bovinos).

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Cortos periodos de movimientos celulares en periodos entre divisiones, en los que corto se define como inferior a 3 horas.

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Distribución uniforme del movimiento celular dentro de la zona pelúcida a lo largo del tiempo, es decir, ausencia de áreas/zonas/volúmenes inactivos del embrión en los que no se observa movimiento celular a lo largo de un periodo más largo de tiempo (es decir, > 24 horas). Tales zonas inmóviles podrían deberse a fragmentos y blastómeros muertos o en proceso de muerte, que pueden impedir el desarrollo adicional.

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Valores iniciales constantes o ligeramente crecientes para la motilidad celular.

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Todos los parámetros derivados estaban dentro del intervalo normal para el embrión particular.

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Cuanto más cerca llegue la medida de la calidad del embrión a la medida de la calidad más alta, mayor será la calidad para el embrión.

Pueden usarse una red neuronal u otros algoritmos de reconocimiento de patrones cuantitativos para evaluar los patrones de motilidad celular complejos descritos anteriormente. Una red de este tipo puede usarse para encontrar los embriones de mejor calidad para su transferencia en tratamientos de IVF. El ejemplo 6 describe un enfoque para derivar parámetros claves para el desarrollo del embrión a partir de la "actividad de blastómeros" (véase el documento WO 2007/042044) durante el desarrollo del embrión, y posteriormente evaluar los parámetros derivados usando diferentes modelos matemáticos (lineales, análisis de componentes principales, modelos de Márkov, etc.).

Otras mediciones

Una etapa de análisis final podría incluir una comparación de las observaciones realizadas con observaciones similares de embriones de diferente calidad y capacidad de desarrollo, así como la comparación de valores de parámetros para un embrión dado con otras mediciones cuantitativas realizadas en el mismo embrión. Esto puede incluir una comparación con mediciones en línea tales como motilidad de blastómeros, tasa respiratoria, captación de aminoácidos, etc. Es probable que un conjunto de datos combinados de análisis de la motilidad de blastómeros, tasas respiratorias y otros parámetros cuantitativos mejoren la selección del embrión y permitan de manera fiable a los embriólogos elegir los mejores embriones para su transferencia.

El método puede combinarse con otras mediciones con el fin de evaluar el embrión en cuestión, y puede usarse para la selección de embriones competentes para su transferencia al receptor.

Otras mediciones de este tipo pueden seleccionarse del grupo de tasa respiratoria, captación de aminoácidos, análisis de la motilidad, motilidad de blastómeros, morfología, tamaño de blastómeros, granulación de blastómeros, fragmentación, color de blastómeros, orientación de cuerpos polares, nucleación, formación e integridad del huso y otras numerosas mediciones cualitativas. La medición de la respiración puede llevarse a cabo tal como se describe en la publicación PCT n.º WO 2004/056265.

Medio de cultivo

Las observaciones pueden llevarse a cabo durante el cultivo de la población celular, tal como cuando la población celular se coloca en un medio de cultivo. En la técnica se conocen medios para cultivar la población celular. Un ejemplo de cultivo de un embrión se describe en la publicación PCT n.º WO 2004/056265.

Soporte de datos

La solicitud se refiere además a un soporte de datos que comprende un programa informático que puede cargarse directamente en la memoria de un dispositivo de procesamiento digital y que comprende partes de códigos informáticos que constituyen medios para ejecutar el método de la invención tal como se describió anteriormente.

El soporte de datos puede ser un disco óptico o magnético o estar en forma de una tarjeta electrónica del tipo EEPROM o Flash, y puede diseñarse para cargarse en medios de procesamiento digital existentes.

Selección o identificación de embriones

La presente invención proporciona además un método para seleccionar un embrión para su trasplante. El método implica que se ha monitorizado el embrión para determinar un cambio en el embrión tal como se describió anteriormente con el fin de determinar cuándo se han producido divisiones celulares y opcionalmente si se ha producido muerte celular así como la calidad de las divisiones celulares y la calidad global del embrión. Se prefiere seleccionar un embrión que tenga una división celular sustancialmente sincrónica que de lugar a parámetros derivados definidos para las imágenes de diferencias, y se prefiere más seleccionar un embrión que no tenga muerte celular.

El método de selección o identificación puede combinarse con otras mediciones tal como se describió anteriormente con el fin de evaluar la calidad del embrión. Los criterios importantes en una evaluación morfológica de los embriones son: (1) la forma del embrión incluyendo el número de blastómeros y el grado de fragmentación; (2) la presencia y calidad de una zona pelúcida; (3) el tamaño; (4) el color y la textura; (5) el conocimiento de la edad del embrión en relación con su fase del desarrollo, y (6) la integridad de la membrana del blastómero.

Entonces, puede llevarse a cabo el trasplante mediante cualquier método adecuado conocido para el experto.

Ejemplo 1 Materiales y métodos

Se aspiraron complejos cúmulus-ovocito (COC) inmaduros bovinos de ovarios obtenidos de matadero, se seleccionaron y se hicieron madurar durante 24 h en placas de cuatro pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Cada pocillo contenía 400 \mul de medio TCM-199 tamponado con bicarbonato (Gibco BRL, Paisley, RU) complementado con suero de ganado al 15% (CS; Danish Veterinary Institute, Frederiksberg, Dinamarca), eCG 10 UI/ml y hCG 5 UI/ml (Suigonan Vet; Intervet Scandinavia, Skovlunde, Dinamarca). Se hicieron madurar los embriones en aceite mineral a 38,5ºC en un 5% de CO_{2} en aire humidificado. Se realizó la fertilización en medio de Tyrode modificado usando espermatozoides seleccionados con Percoll, congelados-descongelados. Tras 22 h, se eliminaron las células del cúmulus mediante agitación con vórtex y se transfirieron presuntos cigotos a 400 \mul de medio de cultivo, compuesto por medio de fluido de oviducto sintético con aminoácidos, citrato e inositol (SOFaaci) complementado con antibióticos (sulfato de gentamicina, 10 mg/ml) y CS al 5% y se incubaron a 38,5ºC en atmósfera de un 5% de CO_{2}, un 5% de O_{2}, un 90% de N_{2} con humedad máxima.

\newpage

Se ha descrito el sistema de incubador en detalle anteriormente y ha demostrado que es adecuado para el cultivo de embriones in vitro (Holm et al. 1998). En resumen, se colocó la placa de cultivo de 4 pocillos en la platina del microscopio (platina de barrido MultiControl 2000, Märzhäuser, Alemania) de un microscopio TMD de Nikon invertido (Diaphot, DFA A/S, Copenhague, Dinamarca). Se acopló una caja para incubador de plexiglás negra regulada mediante un controlador de temperatura de aire (Air-Therm^{TM}, World Precision Instruments, Aston, RU) alrededor de la platina. Se colocó una cubierta de plástico con la parte inferior abierta sobre la placa de cultivo y se condujo la mezcla de gases humidificada al interior de esta cámara de cultivo semicerrada tras haber pasado a través de un frasco de lavado de gases colocado dentro de la caja para incubador.

Se ha demostrado previamente que esta caja de cultivo es útil para el cultivo de embriones in vitro (Holm et al. 1998, 2003), proporcionando condiciones de humedad y temperatura estables. La producción de embriones in vitro rutinaria semanal durante el experimento sirvió como control para determinar la integridad del sistema de cultivo básico.

Sistema de cámara. La grabación a intervalos regulares estaba dirigida mediante un software de análisis de imágenes (ImagePro^{TM}, Unit One, Birkerød, Dinamarca), que controlaba tanto los movimientos de la platina de barrido en los ejes x, y y z, el funcionamiento de la cámara de vídeo altamente sensible a la luz conectada (WAT-902H, Watec, DFA A/S, Copenhague, Dinamarca), así como la grabación y el almacenamiento de las secuencias a intervalos regulares en el disco duro del ordenador. Se grabaron secuencialmente las imágenes a intervalos regulares de cada embrión (aumento total: 265 x) en luz mínima a intervalos de 30 min. durante todo el periodo de cultivo de 7 días. Entre las grabaciones, los embriones se movían fuera del campo de luz.

El análisis manual de la serie de imágenes a intervalos regulares consistió en registrar el tiempo de la primera aparición de las siguientes fases de segmentación/embrión: 2 células, 4 células, 8 células, 16 células y para mórulas y blastocistos con una masa celular coherente visible: mórula compacta de manera máxima, primera expansión del blastocisto, colapsos de blastocistos y eclosión del blastocisto.

El análisis informático automatizado consistió en calcular la desviación estándar de la imagen de diferencias que se calcula como la diferencia entre dos fotogramas consecutivos. Para evitar artefactos de alineación y otros problemas se usó el siguiente procedimiento elaborado:

1) Adquisición de imágenes. (Véase la descripción anterior).

2) Eliminar artefactos de posición fijados (polvo de la cámara) restando una imagen de referencia desenfocada de los artefactos de cada fotografía en la serie.

3) Translocación para compensar el movimiento impreciso de la platina. Una manera muy sencilla de alinear fotografías es comparar la imagen de diferencias original con una imagen de diferencias calculada tras desplazar una de las imágenes originales un único píxel en una dirección dada. Si la varianza de la imagen de diferencias calculada tras la translocación es inferior a la varianza de la imagen de diferencias de las imágenes originales entonces la translocación produjo una mejora de la alineación. Probando sistemáticamente todas las direcciones de translocación posibles y todas las magnitudes de translocación relevantes, es posible obtener una serie temporal alineada. Sin embargo, en el presente caso se usó una macro de ImageJ avanzada para la alineación de imágenes desarrollada por Thévenaz et al. 1998.

4) Identificar la región de interés (ROI) y el área de referencia externa. Es ventajoso comparar el movimiento celular dentro del embrión con respecto al "movimiento" fuera del embrión debido problemas de alineación de movimiento browniano, etc. Esto se consigue delineando el embrión y comparando las imágenes de diferencias dentro del embrión con las diferencias calculadas en un área similar fuera del embrión. Se realizó manualmente la delineación del embrión. Como área de referencia, se eligió una región de la imagen sin ningún embrión.

5) Calcular la diferencia de intensidad.

6) Calcular un parámetro derivado para cada imagen de diferencias. Se calcularon varios parámetros de diferencias pero el único que demostró que era el más informativo fue la desviación estándar de la intensidad para todos los píxeles en la imagen de diferencias. Este parámetro se denomina "actividad de blastómeros" a continuación.

7) Identificar y determinar la forma de los picos en la actividad de blastómeros.

8) Calcular la desviación estándar y los valores promedio para la actividad de blastómeros durante intervalos de tiempo relevantes para el diagnóstico. Véase el ejemplo 4.

Diseño experimental. Se incubaron juntos aproximadamente 20 embriones bovinos en un único pocillo de una placa de 4 pocillos de Nunc durante 7 días con adquisición de imágenes cada 30 min. Este experimento se repitió 5 veces en total dando una serie de imágenes a intervalos regulares de 99 embriones bovinos.

Resultados

Basándose en la evaluación cualitativa de series de imágenes a intervalos regulares de embriones en desarrollo, (esencialmente observando su reproducción como películas numerosas veces y anotando los cambios), se observó que: un indicador de embriones de alta calidad son divisiones celulares súbitas en las que la división real del citoplasma avanza rápidamente y la consiguiente redisposición de las posiciones de los otros blastómeros se produce rápidamente seguida por un periodo de "tranquilidad" con muy poca redisposición de la posición de las células hasta el comienzo súbito de la siguiente división citoplasmática. A menudo, los embriones de mala calidad muestran redisposiciones prolongadas de la posición de los blastómeros tras divisiones citoplasmáticas y entre divisiones celulares citoplasmáticas. Para cuantificar y documentar estas observaciones, se calcula la actividad de blastómeros a partir de una serie de imágenes a intervalos regulares tal como se describe en el documento WO 2007/042044. Se muestran actividades de blastómeros representativas en la figura 2.

Algo de la actividad observada se debe a división celular asincrónica (por ejemplo 2\rightarrow3\rightarrow4\rightarrow5\rightarrow6\rightarrow7\rightarrow8) y fragmentación a diferencia de divisiones celulares sincrónicas (por ejemplo 2\rightarrow4, 4\rightarrow8) observadas para embriones de alta calidad.

La actividad de blastómeros de 41 embriones se muestra como imagen de pseudogel en la figura 1 en la que los picos de motilidad están indicados por bandas oscuras y la inactividad es de color blanco.

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Ejemplo 2 Materiales y métodos

Los mismos que para el ejemplo 1.

Resultados

La síntesis de proteínas inicial en embriones de mamífero usa ARNm materno del ovocito, pero tras unas pocas divisiones celulares se activa, se transcribe y se traduce el genoma embrionario. El cambio de genoma materno a genoma embrionario es una etapa crucial en el desarrollo del embrión. El periodo se produce en la fase de 8 células para bovinos y tiene una duración relativamente larga para embriones humanos, el cambio se produce más temprano en la fase de 4 a 8 células y tiene una duración más corta.

Se observa un periodo de tranquilidad de muy poco movimiento celular para la mayoría de mamíferos cuando se activa el genoma embrionario y la síntesis de proteínas cambia de genes maternos a embrionarios. Si este periodo tiene: i) comienzo temprano, ii) muy baja actividad (= poco movimiento celular = tranquilidad) y iii) terminación temprana entonces es una fuerte indicación de un embrión de alta calidad. A menudo, el periodo de tranquilidad se retrasa, y a veces se ve interrumpido por movimiento celular en embriones de mala calidad. Un ejemplo de esto que muestra la actividad de blastómeros para 13 embriones diferentes se muestra en la figura 4.

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Ejemplo 3 Materiales y métodos

Los mismos que para el ejemplo 1.

Resultados

En embriones de mala calidad que posteriormente cesan su desarrollo, a menudo se observan regiones persistentemente inmóviles y particulares que persisten y en última instancia conducen a la detención del desarrollo. Tales regiones inmóviles pueden estar asociadas con extensa fragmentación o lisis y muerte de blastómeros. Si estas regiones son más grandes que un porcentaje dado en una fase del desarrollo dada, entonces el embrión tiene muy baja probabilidad de sobrevivir. En embriones de alta calidad, la motilidad celular que sigue brevemente tras cada acontecimiento de división citoplasmática se distribuye inicialmente sobre toda la superficie del embrión (es decir, todos los blastómeros se mueven ligeramente), sólo tras la compactación en la fase de mórula se observa movimiento
localizado.

Los embriones que se desarrollan hasta blastocistos tales como el panel izquierdo en la figura 5 tienen actividad de blastómeros distribuida uniformemente. Los embriones que no tienen actividad de blastómeros distribuida uniformemente tal como el panel derecho en la figura 5 nunca se desarrollan en un blastocisto.

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Ejemplo 4 Materiales y métodos

Los mismos que para el ejemplo 1.

Resultados

La cantidad de movimiento celular en diferentes intervalos de tiempo es un buen indicador de la calidad del embrión. Puede calcularse un parámetro relacionado con la calidad a partir de una razón de movimiento promedio en diferentes segmentos de tiempo y/o una razón de desviaciones estándares en diferentes segmentos de tiempo. Pueden establecerse procedimientos de selección de embriones basados en el valor de estos parámetros. Un ejemplo de diferentes segmentos (= partes) se muestra en las figuras 6 y 7. En este caso, la parte 1 es el segmento de tiempo desde 32 hasta 60 horas tras la fertilización, la parte 2 es de 60 a 75 horas tras la fertilización, la parte 3 es desde 75 hasta 96 horas tras la fertilización.

Basándose en la actividad de blastómeros promedio y/o la desviación estándar de la actividad de blastómeros en las diferentes partes, es posible clasificar los embriones.

En el presente caso, se han usado los siguientes criterios de selección basados en:

\bullet

R1 = razón entre la actividad de blastocistos promedio en la parte 1 y en la parte 3 del patrón de actividad de blastocistos para un embrión dado.

\bullet

R2 = razón entre la desviación estándar de la actividad de blastocistos en la parte 2 y en la parte 3 del patrón de actividad de blastocistos para un embrión dado.

Los cálculos se muestran en la tabla 1 a continuación.

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

\newpage

Si (R1 < 1,15 y R2 < 0,50) entonces es un embrión "bueno", De lo contrario es una embrión "malo". Usando estos criterios, 36 de los 39 embriones se clasificaron correctamente según cómo se desarrollaron posteriormente.

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Ejemplo 5 Materiales y métodos

Los mismos que para el ejemplo 1.

Resultados

La figura 8 a continuación muestra la excelente correspondencia entre la determinación manual y automática del comienzo de la división celular. Un comienzo muy temprano de la primera división celular es una indicación de alta calidad del embrión. Un comienzo muy tardío de la primera (y posteriores divisiones celulares) indica embriones de baja calidad. Sin embargo, para la mayoría de los embriones, el comienzo exacto de la primera división celular sola no proporciona una clara indicación de la calidad del embrión tal como se muestra en la figura 8 a continuación. Aunque el comienzo promedio de las divisiones celulares se retrasó para los embriones malos, la gran desviación estándar inherente hace que los valores absolutos sea un criterio de selección malo excepto en casos extremos. Por ejemplo, la primera división antes de 30 horas significa un embrión bueno. La primera división tras 35 horas significa un embrión malo pero la gran mayoría de los embriones bovinos investigados tienen tiempos de división intermedios que no se interpretan fácilmente.

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Ejemplo 6a Materiales y métodos

Los mismos que para el ejemplo 1.

Resultados

Una serie temporal típica de actividades de blastómeros consiste en unas pocas mediciones cada hora durante la incubación (por ejemplo, aproximadamente 150 puntos de datos para cada embrión medidos durante los primeros 2 a 3 días que es la ventana de tiempo interesante para el diagnóstico). La mayoría de los métodos estadísticos tienen dificultades con el análisis de datos con una dimensión tan alta. Por tanto, es importante encontrar métodos robustos para reducir las dimensiones extrayendo parámetros derivados. Para conseguir esto, se dividió la actividad de blastómeros en tres intervalos: 0-32, 32-52 y 52-72 horas tras haberse iniciado la adquisición de imágenes (figura 9). Dentro de cada uno de estos intervalos, se encontraron tres picos usando el siguiente método: el primer pico era la actividad de blastómeros más alta. El segundo pico era el valor de la actividad más alta que era al menos 3,5 h antes o después del primer pico. El tercer pico era la actividad más alta que era al menos 3,5 h desde tanto el primer como el segundo pico. A partir de cada pico, se derivaron los siguientes parámetros: el tiempo, el valor del pico y la media de los valores de la actividad desde 0,5 h antes del pico hasta 1,5 h después del pico. Además, el valle entre dos picos se describió mediante el valor más bajo, el tiempo del valor más bajo y la media (véase la figura 10 para un ejemplo de los parámetros derivados). Si los valores de parámetros derivados para embriones diferentes se normalizan para igualar el valor de la media y la varianza, resulta evidente que se encuentran valores aberrantes (es decir muy altos o muy bajos) para embriones que no se desarrollan apropiadamente (embriones malos = puntos azules en la figura 11). Los embriones que se desarrollan bien (puntos rojos) tienen un intervalo más estrecho de valores. Pueden desarrollarse modelos estadísticos de la calidad del embrión basados en los parámetros derivados anteriormente. Si se ha evaluado cada embrión según el desarrollo final, existen varios métodos estadísticos diferentes para analizar la relación entre los parámetros derivados y el desarrollo final. Estos métodos incluyen: modelos lineales y no lineales, red bayesiana, redes neuronales, modelos ocultos de Márkov, vecinos más cercanos, análisis de componentes principales y otros. La figura 12 a continuación muestra un ejemplo de un análisis de componentes principales (PCA) de los datos.

Puede evaluarse y/o ampliarse el modelo estadístico a medida que se generan nuevos datos. Para facilitar esto, es importante encontrar una estructura de datos robusta y un conjunto de parámetros derivados.

Incluso un análisis muy simple de parámetros individuales tales como parámetro 39 = valor inicial de la actividad de blastómeros en el tercer segmento de tiempo (de 76 a 96 h tras la fertilización) puede separar en cierta medida embriones no viables y anómalos. Basándose en este único parámetro, es posible por tanto seleccionar automáticamente embriones de buena calidad con una exactitud del 72%.

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Ejemplo 6B Materiales y métodos

Los mismos que para el ejemplo 1.

Resultados

Una serie temporal típica de actividades de blastómeros consiste en unas pocas mediciones cada hora durante la incubación (por ejemplo, aproximadamente 150 puntos de datos para cada embrión medidos durante los primeros 2 a 3 días que es la ventana de tiempo interesante para el diagnóstico). La mayoría de los métodos estadísticos tienen dificultades con el análisis de datos con una dimensión tan alta. Por tanto, es importante encontrar métodos robustos para reducir las dimensiones extrayendo parámetros derivados. Para conseguir esto, se dividió la actividad de blastómeros en tres intervalos: 0-32, 32-52 y 52-72 horas tras haberse iniciado la adquisición de imágenes (figura 9). Se seleccionaron los tres intervalos de tiempo para reflejar tres fases del desarrollo para embriones bovinos. Segmento 1: divisiones celulares iniciales desde 1 célula hasta 8 células. Segmento 2: fase de reposo con relativamente pocos movimientos y actividad. Se cree que el genoma embrionario se activa en esta fase. En algunos embriones, la fase de reposo se inicia en el nivel de 8 células, en otros en la fase de 16 células, pero en todos los embriones en desarrollo es un periodo prolongado sin divisiones celulares. Segmento 3: Reanudación de la división celular y desarrollo en una mórula. A menudo es imposible contar blastómeros individuales en esta fase, aunque las imágenes a intervalos regulares revelan que se ha reanudado la división celular. Dentro de cada uno de los tres intervalos de tiempo que reflejan las tres fases del desarrollo, se identificaron tres picos en la actividad de blastómeros usando el siguiente método: el primer pico era la actividad de blastómeros más alta. El segundo pico era el valor de la actividad más alta que era al menos 3,5 h antes o después del primer pico. El tercer pico era la actividad más alta que era al menos 3,5 h desde tanto el primer pico como el segundo.

A partir de cada pico, se derivaron los siguientes parámetros: el tiempo de aparición, el valor del pico y la media de los valores de la actividad desde 0,5 h antes del pico hasta 1,5 h después del pico. Además, el valle entre dos picos se describió mediante el valor más bajo, el tiempo de valor más bajo y la media (véase la figura 9 para un ejemplo de los parámetros derivados).

Por tanto, se obtienen los siguientes parámetros para cada uno de los tres segmentos:

1

Pico 1, valor

2

Tiempo del pico 1

3

Media del pico 1

4

Valle 1, valor

5

Tiempo del valle 1

6

Media del valle 1

7

Pico 2, valor

8

Tiempo del pico 2

9

Media del pico 2

10

Valle 2, valor

11

Tiempo del valle 2

12

Media del valle 2

13

Pico 3, valor

14

Tiempo del pico 3

15

Media del pico 3

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Además, se calcula el valor promedio y la desviación estándar de la actividad de blastómeros en ese segmento:

16

Promedio

17

StDev

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También se usan algunos de los parámetros anteriores para describir la forma del pico que refleja la duración o sincronía del acontecimiento de división celular principal. El pico agudo I en la actividad de blastómeros (es decir, una división celular sincronizada rápida) se caracteriza por una razón baja de media del pico con respecto a valor del pico, mientras que una razón más alta refleja un pico más ancho en el que la media del pico y los valores del pico son más similares. La media del pico dividida entre el valor del pico será siempre < 1, indicando un valor cercano a uno un pico ancho y un valor cercano a 0 un pico muy agudo.

18

(Pico 1, media - Promedio)/(Pico 1, valor - Promedio) = (P1-P16)/(P3-P16)

19

(Pico 2, media - Promedio)/(Pico 2, valor - Promedio) = (P7-P16)/(P9-P16)

20

(Pico 3, media - Promedio)/(Pico 3, valor - Promedio) = (P13-P16)/(P15-P16)

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Finalmente, se calcula la razón del tiempo entre el primer y segundo pico y la razón del tiempo entre el segundo y el tercer pico.

21

(Pico 2, tiempo - Pico 1, tiempo)/(Pico 3, tiempo - Pico 2, tiempo) = (P8-P2)/(P14-P8)

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El conjunto de parámetros de 21 parámetros mostrado anteriormente se usa para un análisis rápido puesto que sólo incluye información que puede obtenerse del primer segmento, es decir, 32 horas de incubación.

El conjunto pequeño contiene información importante que puede usarse para clasificar embriones en viables y no viables. Sin embargo, si están disponibles los datos para los siguientes dos intervalos de tiempo, entonces el análisis puede repetirse para los dos siguientes segmentos. No se calculan las razones (es decir, características de forma e intervalo entre picos) para los siguientes segmentos excepto sólo los picos y valles (es decir, 15 parámetros por segmento). Finalmente, el valor promedio global, la StDev global y el máximo y mínimo globales se incluyen en el conjunto de parámetros completo de 59 parámetros mostrado a continuación:

Promedio Glo

StDev Glo para BlastAct

Mínimo Glo para BlastAct

Máximo Glo para BlastAct

Promedio del SEG1

StDev del SEG1

Pico 1 del SEG1, valor

Posición del pico 1 del SEG1

Media del pico 1 del SEG1

Valle 1 del SEG1, valor

Posición del valle 1 del SEG1

Media del valle 1 del SEG1

Pico 2 del SEG1, valor

Posición del pico 2 del SEG1

Media del pico 2 del SEG1

Valle 2 del SEG1, valor

Posición del valle 2 del SEG1

Media del valle 2 del SEG1

Pico 3 del SEG1, valor

Posición del pico 3 del SEG1

Media del pico 3 del SEG1

Promedio del SEG2

StDev del SEG2

Pico 1 del SEG2, valor

Posición del pico 1 del SEG2

Media del pico 1 del SEG2

Valle 1 del SEG2, valor

Posición del valle 1 del SEG2

Media del valle 1 del SEG2

Pico 2 del SEG2, valor

Posición del pico 2 del SEG2

Media del pico 2 del SEG2

Valle 2 del SEG2, valor

Posición del valle 2 del SEG2

Media del valle 2 del SEG2

Pico 3 del SEG2, valor

Posición del pico 3 del SEG2

Media del pico 3 del SEG2

Promedio del SEG3

StDev del SEG3

Pico 1 del SEG3, valor

Posición del pico 1 del SEG3

Media del pico 1 del SEG3

Valle 1 del SEG3, valor

Posición del valle 1 del SEG3

Media del valle 1 del SEG3

Pico 2 del SEG3, valor

Posición del pico 2 del SEG3

Media del pico 2 del SEG3

Valle 2 del SEG3, valor

Posición del valle 2 del SEG3

Media del valle 2 del SEG3

Pico 3 del SEG3, valor

Posición del pico 3 del SEG3

Media del pico 3 del SEG3

Pico1 de la razón del SEG1

Pico2 de la razón del SEG1

Pico3 de la razón del SEG1

Val1 val2 de la razón del SEG1

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Si los valores de parámetros derivados para diferentes embriones se normalizan para igualar el valor de la media y la varianza, resulta evidente que se encuentran valores aberrantes (es decir, muy altos o muy bajos) para embriones que no se desarrollan apropiadamente (embriones malos = puntos azules en la figura 11). Los parámetros en la figura están en el mismo orden que los anteriores pero se omiten los cuatro parámetros de razones del final. Los embriones que se desarrollan bien (puntos rojos) tienen un intervalo más estrecho de valores.

Pueden desarrollarse modelos estadísticos de la calidad del embrión basados en los parámetros derivados anteriormente. Si se ha evaluado cada embrión según el desarrollo final, existen varios métodos estadísticos diferentes para analizar la relación entre los parámetros derivados y el desarrollo final. Estos métodos incluye pero no se limitan a: modelos lineales y no lineales, red bayesiana, redes neuronales, modelos ocultos de Márkov, vecinos más cercanos, análisis de componentes principales y otros. La figura 11 a continuación muestra un ejemplo de un análisis de componentes principales (PCA) de los datos.

Un ejemplo del uso de un modelo lineal se muestra en el ejemplo 7.

Puede evaluarse y/o ampliarse el modelo estadístico a medida que se generan nuevos datos. Para facilitar esto, es importante encontrar una estructura de datos robusta y un conjunto de parámetros derivados.

Incluso un análisis muy simple de parámetros individuales tales como parámetro 39 = valor inicial de la actividad de blastómeros en el tercer segmento de tiempo (de 76 a 96 h tras la fertilización) puede separar en cierta medida embriones no viables y anómalos. Basándose en este único parámetro, es posible por tanto seleccionar automáticamente embriones de buena calidad con una exactitud del 72%.

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Ejemplo 7 Comparación de la selección de embriones basada en detección automatizada o detección por embriólogo Diseño

Se colocaron 95 embriones bovinos en un microscopio de intervalos regulares con temperatura, humedad y CO_{2} constantes durante siete días. Se adquirieron imágenes dos veces a la hora desde 24 horas hasta 96 horas tras la fertilización. Se evaluó la capacidad del procedimiento de análisis de imágenes para identificar correctamente los 38 embriones que se desarrollaban posteriormente (es decir tras 7 días) hasta blastocistos expandidos y se comparó con las evaluaciones de la calidad por un embriólogo capacitado basándose en las mismas 145 imágenes para cada embrión.

Material y métodos

Se aspiraron complejos cúmulus-ovocito inmaduros bovinos de ovarios obtenidos de matadero, se hicieron madurar durante 24 h antes de la fertilización durante 22 h. Entonces se eliminaron células del cúmulus y se transfirieron presuntos cigotos y se cultivaron en medio de fluido de oviducto sintético. Se adquirieron imágenes a intervalos regulares dentro de una caja para incubador acoplada sobre una platina de microscopio Nikon invertido montada con una cámara de vídeo sensible.

Resultados

El procedimiento de análisis de imágenes completamente automatizado generó una medida cuantitativa de la actividad celular de blastómeros basándose en el movimiento observado entre imágenes consecutivas en la serie a intervalos regulares. Se confirmó la correlación entre la actividad de blastómeros y la división celular comparando el análisis manual y automatizado de la serie de imágenes a intervalos regulares. Se encontró que picos pronunciados en la actividad de blastómeros estaban asociados con divisiones celulares. Pudieron cuantificarse la duración y el comienzo exactos de las divisiones celulares basándose en la posición, la forma y el tamaño de los picos registrados. Por tanto, pudo reducirse el patrón de actividad de blastómeros de un embrión dado a un conjunto de parámetros clave que correspondían a la altura, la posición y la anchura de los picos para picos prominentes así como parámetros similares que describían el nivel de actividad de blastómeros entre los picos. Se usó un total de 55 parámetros para cada embrión en un modelo lineal simple para clasificar el embrión como "viable" o "no viable". Se probó el modelo en un subconjunto de los patrones de embriones observados y se evaluó en un subconjunto independiente diferente. Un embriólogo experto evaluó la misma serie de imágenes a intervalos regulares intentando predecir si el embrión se desarrollaría hasta un blastocisto expandido o no.

Aunque el modelo era sólo un modelo lineal simple con precisión limitada, se observó que el análisis completamente automatizado era mejor en la predicción de qué embriones se desarrollarían hasta blastocistos expandidos (tasa de error: 20%, 24 de los 94), que el embriólogo capacitado (tasa de error del 26%, 19 de los 95). Además, el análisis automatizado también tuvo menos falsos positivos (13 de 45 = 29%, a diferencia del análisis manual que tuvo (23 de 60, 38%). Falsos positivos son los embriones que se cree que tienen una alta viabilidad pero sin embargo cesan el desarrollo y nunca alcanzaron la fase de blastocisto expandido dentro del periodo de observación de 7 días. La transferencia de tales embriones es improbable que dé como resultado un embarazo.

2

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Claims (13)

1. Método para determinar la calidad del embrión que comprende monitorizar el embrión durante un periodo de tiempo antes de que el embrión experimente compactación, teniendo dicho periodo de tiempo una duración suficiente para comprender al menos un periodo de división celular y al menos una parte de un periodo entre divisiones, y determinar el grado de movimiento celular durante la al menos parte de un periodo entre divisiones obteniendo de ese modo una medida de la calidad del embrión.

2. Método según la reivindicación 1, en el que se monitoriza el embrión durante un periodo de tiempo que comprende al menos dos periodos de división celular.

3. Método según la reivindicación 1, en el que se monitoriza el embrión durante un periodo de tiempo que comprende al menos tres periodos de división celular.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina la duración del al menos un periodo de división celular.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina la duración de un periodo entre divisiones.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina el grado y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulos durante los periodos de división celular.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina la duración de cada periodo de división celular.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina la duración de cada periodo entre divisiones.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina el periodo de movimiento celular en al menos dos periodos entre divisiones.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se determina el grado de movimiento celular en al menos dos periodos entre divisiones.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que los al menos dos periodos entre divisiones son periodos entre divisiones subsiguientes.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se realizan la determinación de la duración del al menos un periodo de división celular y la determinación del periodo de movimiento celular durante los periodos entre divisiones.

13. Método para seleccionar un embrión adecuado para su trasplante, comprendiendo dicho método monitorizar el embrión según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, obtener una medida de la calidad del embrión y seleccionar el embrión que tiene la medida de la calidad del embrión más alta.