ES2838698T7 - Obtención de imágenes y evaluación de embriones, ovocitos y células madre - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Obtención de imágenes y evaluación de embriones, ovocitos y células madre
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere al campo de los ensayos biológicos y clínicos, y particularmente a la obtención de imágenes y a la evaluación de embriones humanos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La infertilidad es un problema de salud común que afecta al 10-15% de las parejas en edad reproductiva. En los Estados Unidos de América solamente en el año 2006, se llevaron a cabo aproximadamente 140.000 ciclos de fecundación in vitro (FIV) (cdc.gov/art). Esto dio como resultado el cultivo de más de un millón de embriones anualmente con un potencial variable y, con frecuencia impreciso, de implantación y desarrollo a término. La tasa de nacidos vivos por ciclo, después de la FIV fue solo del 29%, mientras que una media del 30% de los nacidos vivos resultaron de gestaciones múltiples (cdc.gov/art). Se han documentado bien las consecuencias adversas de las gestaciones múltiples tanto para la madre como para los fetos, tales como aborto involuntario, parto prematuro y baja tasa de natalidad. Las posibles causas del fracaso de la FIV son diversas; sin embargo, desde la introducción de la FIV en 1978, uno de los retos más importantes ha sido la identificación de los embriones que sean los más adecuados para la transferencia y los que más probablemente den como resultado un embarazo a término.
La comprensión en la técnica del desarrollo embrionario básico es limitada, puesto que los estudios sobre la biología del embrión humano continúan siendo un reto y frecuentemente están excluidos de la financiación de la investigación. En consecuencia, la mayor parte del conocimiento actual de desarrollo embrionario procede de los estudios de organismos modelo. Sin embargo, aunque los embriones de diferentes especies pasan por etapas de desarrollo similares, el tiempo varía según la especie. Estas diferencias, y muchas otras, hacen inapropiado la extrapolación directa de una especie a otra. (Taft, R.E. (2008) Theriogenology 69(1): 10-16). Las vías generales de desarrollo humano, así como los determinantes moleculares fundamentales subyacentes, son únicos para el desarrollo embrionario humano. Por ejemplo, en los ratones, la transcripción embrionaria se activa aproximadamente 12 horas después de la fecundación, simultáneamente con la primera división por escisión, mientras que en los seres humanos la activación del genoma embrionario (EGA) se produce en el día 3, alrededor de la etapa de 8 células (Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Braude, P., et al. (1988) Nature 332:459-461; Hamatani, T. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:10326-10331; Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14):1461-1470). Además, los genes que son modulados en el desarrollo humano temprano son únicos (Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14): 1461- 1470). Por otra parte, en otras especies como el ratón, más del 85% de los embriones cultivados in vitro alcanzan la etapa de blastocisto, uno de los primeros hitos principales en el desarrollo de los mamíferos, mientras que los embriones humanos cultivados tienen una tasa media de formación de blastocistos de aproximadamente 30-50%, con una alta incidencia de mosaicismos y fenotipos anómalos, tales como la fragmentación y detención del desarrollo (Rienzi, L. et al. (2005) Reprod. Biomed. Online 10:669-681; Alikani, M., et al. (2005) Mol. Hum. Reprod. 11:335-344; Keltz, M. D., et al. (2006) Fertil. Steril.86:321-324; French, D. B., et al. (2009) Fertil. Steril.). A pesar de estas diferencias, la mayoría de los estudios de desarrollo embrionario previo a la implantación proceden de organismos modelo, y son difíciles de relacionar con el desarrollo de embriones humanos (Zemicka-Goetz, M. (2002) Development 129:815-829; Wang, Q., et al. (2004) Dev Cell. 6:133-144; Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14:691-701; Zemicka-Goetz, M. (2006) Curr. Opin. Genet. Dev. 16:406-412; Mtango, N. R., et al. (2008) Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 268:223-290).
Tradicionalmente, en las clínicas de FIV, la viabilidad de los embriones humanos se ha evaluado por simples observaciones morfológicas, tales como la presencia de blastómeros mononucleados de tamaño uniforme y el grado de fragmentación celular (Rijinders PM, Jansen CAM. (1998) Hum Reprod 13:2869-73; Milki AA, etal. (2002) Fertil Steril77:1191-5). Más recientemente, otros métodos, tales como el cultivo prolongado de embriones (hasta la etapa de blastocisto en el día 5) y el análisis del estado cromosómico por diagnóstico genético previo a la implantación (DGP) también se han usado para evaluar la calidad de los embriones (Milki A, et al. (2000) Fertil Steril 73:126-9; Fragouli E, Fertil Steril Jun 21 [EPub antes de imprimir]; El-Toukhy T, et al. (2009) Hum Reprod 6:20; Vanneste E, et al. (2009) Nat Med 15:577-83). Sin embargo, también existen riesgos potenciales de estos métodos por cuanto prolongan el período de cultivo y afectan a la integridad del embrión (Manipalviratn S, et al. (2009) Fertil Steril 91:305-15; Mastenbroek S, et al. (2007) N Engl J Med. 357:9-17).
Recientemente se ha demostrado que la obtención de imágenes de lapso de tiempo puede ser una herramienta útil para observar el desarrollo embrionario temprano. Algunos métodos han utilizado la obtención de imágenes de lapso de tiempo para monitorizar el desarrollo embrionario humano después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) (Nagy et al. (1994) Human Reproduction. 9(9): 1743-1748; Payne et al. (1997) Human Reproduction. 12:532-541). Se analizaron la extrusión del cuerpo polar y la formación pronuclear, y se correlacionaron con buena morfología en el día 3. Sin embargo, ningún parámetro se correlacionó con la formación de blastocistos ni con los resultados del embarazo. Otros métodos han observado la aparición de la primera escisión como un indicador para predecir la viabilidad de los embriones humanos (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction, 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652-2657). Sin embargo, estos métodos no reconocen la importancia de la duración de la citocinesis ni de los intervalos de tiempo entre las divisiones tempranas.
Otros métodos han utilizado la obtención de imágenes de lapso de tiempo para medir la cadencia y la extensión de las divisiones celulares durante el desarrollo embrionario temprano (documento WO/2007/144001). Sin embargo, estos métodos solamente describen un método básico y general para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de embriones bovinos, que son sustancialmente diferentes de los embriones humanos en términos de potencial de desarrollo, comportamiento morfológico, programas moleculares y epigenéticos, y cadencia y parámetros relacionados con la transferencia. Por ejemplo, los embriones bovinos tardan mucho más tiempo en ser implantados en comparación con los embriones humanos (30 días y 9 días, respectivamente). (Taft, (2008) Theriogenology 69(1): 10­ 16. Más aún, no se describen parámetros específicos de obtención de imágenes ni de intervalos de tiempo que pudieran ser predictivos de la viabilidad del embrión humano.
Más recientemente, la obtención de imágenes de lapso de tiempo se ha utilizado para observar el desarrollo embrionario humano durante las primeras 24 horas después de la fecundación (Lemmen et al. (2008) Reproductive BioMedicine Online 17(3):385-391). Se encontró que la sincronía de los núcleos después de la primera división estaba correlacionada con los resultados del embarazo. Sin embargo, este trabajo llegó a la conclusión de que la primera escisión temprana no era un parámetro predictivo importante, lo cual contradice estudios previos (Fenwick, et al. (2002) Human Reproduction 17:407-412; Lundin, et al. (2001) Human Reproduction 16:2652-2657).
Finalmente, ningún estudio ha validado los parámetros de la obtención de imágenes a través de la correlación con los programas moleculares o la composición cromosómica de los embriones. De esta manera, los métodos de evaluación de los embriones humanos son deficientes en varios aspectos, y se pueden mejorar por los presentes métodos, los cuales implican nuevas aplicaciones de la microscopía de lapso de tiempo, análisis de imagen, y correlación de los parámetros de obtención de imágenes con los perfiles moleculares y la composición cromosómica. La presente invención aborda estos aspectos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Esta invención es como se define en las reivindicaciones. Se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar el potencial de desarrollo de uno o más embriones. Estos métodos, composiciones y kits encuentran uso para identificar embriones in vitro que tienen un buen potencial de desarrollo, es decir, la habilidad o capacidad para convertirse en un blastocisto, que de este modo son útiles en métodos para tratar la infertilidad en seres humanos, y similares.
En la invención, se proporcionan métodos para determinar el potencial de desarrollo de un embrión. Para llegar a una medida del parámetro celular, se mide el intervalo de tiempo entre la primera y segunda mitosis. El parámetro celular se emplea entonces para proporcionar una determinación del potencial de desarrollo del embrión, determinación que puede usarse para guiar un curso clínico de acción. En algunas realizaciones, el parámetro celular es un evento morfológico que se puede medir mediante microscopía de lapso de tiempo. En determinadas realizaciones descritas aquí, la duración del ciclo celular 1 también se utiliza como parámetro celular. En algunas realizaciones, la medida del parámetro celular se emplea comparándola con una medida del parámetro celular comparable de un embrión de referencia, y usando el resultado de esta comparación para proporcionar una determinación del potencial de desarrollo del embrión. En la invención, el embrión es un embrión humano.
Se proporcionan métodos para clasificar los embriones por su potencial de desarrollo con respecto a los otros embriones del grupo. En tales métodos, se miden uno o más parámetros celulares de los embriones en el grupo para llegar a una medida del parámetro celular para cada uno de los embriones. Las medidas del parámetro celular se emplean entonces para determinar el potencial de desarrollo de cada uno de los embriones o células pluripotentes en el grupo en relación entre sí, determinación que puede usarse para guiar un curso clínico de acción. En algunos métodos, el parámetro celular es un evento morfológico que se puede medir mediante microscopía de lapso de tiempo. En algunos métodos descritos aquí, por ejemplo cuando se clasifican los embriones, el uno o más parámetros celulares son la duración de un evento de citocinesis, por ejemplo citocinesis 1; el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2; y el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3. En determinados métodos descritos aquí, también se mide la duración del ciclo celular 1. En algunos métodos descritos aquí, el parámetro celular es el nivel de expresión de uno o más genes. En algunas realizaciones, la medida del parámetro celular se emplea comparando las medidas del parámetro celular de cada uno de los embriones en el grupo entre sí para determinar el potencial de desarrollo de los embriones entre sí. En algunas realizaciones, la medida del parámetro celular se emplea comparando cada medida del parámetro celular con una medida del parámetro celular de un embrión de referencia para determinar el potencial de desarrollo de cada embrión, y comparando esos potenciales de desarrollo para determinar el potencial de desarrollo de los embriones entre sí.
En algunos aspectos de la invención, se proporcionan métodos para proporcionar embriones con buen potencial de desarrollo para transferirlos a una hembra para reproducción asistida (fiV). En tales aspectos, uno o más embriones se cultivan en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión. A continuación, se mide el parámetro celular en el uno o más embriones para llegar a una medida del parámetro celular. La medida del parámetro celular se emplea entonces para proporcionar una determinación del potencial de desarrollo del uno o más embriones. El uno o más embriones que demuestran un buen potencial de desarrollo se transfieren entonces a una hembra.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Se enfatiza que, según la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.
La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra los procedimientos utilizados para evaluar embriones.
La Figura 2 es una serie de fotografías que muestran la escisión y división celular durante un período de 6 días. Las imágenes están etiquetadas del día 1 al día 6. La barra de escala representa 50 pm.
La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra los porcentajes de desarrollo exitoso en blastocistos a partir de embriones de 1 célula (cigotos). En el transcurso de 4 experimentos separados, se observaron un total de 100 embriones hasta el día 5 al 6 mediante microscopía de lapso de tiempo. Se muestra el porcentaje de células que alcanzan cada etapa indicada (blastocisto, 8 células, 4 a 7 células, 2 a 3 células, y 1 célula).
La Figura 4 es una serie de cuatro embriones diferentes que se siguen durante los tiempos indicados.
La Figura 5 es un diagrama que muestra los lapsos de tiempo entre las etapas utilizadas para las presentes evaluaciones, incluyendo la duración de la primera citocinesis, el tiempo entre la primera y la segunda división (medido como el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2), y el tiempo entre la 2a y la 3a mitosis (medido como el intervalo de tiempo entre el inicio de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3).
La Figura 6 es un gráfico de puntos en 3-D que muestra la medida de tres eventos, incluyendo la duración de la primera citocinesis, el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda división celular (medido como el intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2), y el intervalo de tiempo entre la segunda y la tercera división celular (medido como el intervalo de tiempo entre el inicio de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3), para un gran grupo de embriones. Los embriones que alcanzan la etapa de blastocisto (marcados con círculos) se muestran agrupados en el gráfico tridimensional, mientras que los embriones que se detienen (marcados con X) antes de alcanzar el blastocisto se encuentran dispersos por todas partes.
La Figura 7 es un gráfico que muestra una curva de característica operativa del receptor (ROC) para predecir la formación de blastocistos utilizando los 3 parámetros morfológicos dinámicos.
La Figura 8 es una gráfica de radar que muestra los niveles de expresión génica de 52 genes de 6 embriones detenidos de 1 a 2 células y 5 embriones normales de 1 a 2 células. La diferencia en los niveles de expresión entre embriones normales y anormales fue estadísticamente significativa para los genes resaltados en amarillo y señalados con un asterisco, según lo determinado por la prueba de MannWhitney.
La Figura 9 es una gráfica de barras que muestra los niveles de expresión de diferentes genes en un embrión detenido de 2 células y embriones normales de 2 células. En la parte superior se muestra un número selecto de imágenes de lapso de tiempo para el embrión detenido de 2 células.
La Figura 10 es una gráfica de barras que muestra una comparación de los mismos genes presentados en la Fig. 9, en un embrión detenido de 4 células y embriones normales de 4 células. En la parte superior se muestra un número selecto de imágenes de lapso de tiempo para el embrión detenido de 4 células.
La Figura 11 es una serie de gráficas de barras que muestran patrones de expresión génica (ESSP) que tienen 4 patrones distintos. Se indican los tiempos de transferencia temprana antes de la activación del genoma embrionario (día 2) y la expresión típica el día 3.
La Figura 12 muestra la expresión génica de genes de blastómeros individuales en diferentes etapas. (A) Expresión génica de dos genes, CTNNB1 y CDX2 de blastómeros individuales representados en diferentes etapas celulares y que muestran cambios en estos niveles de expresión génica en diferentes etapas, por ejemplo 2 células, 3 células, mórula y blastocisto. (B) Firmas de expresión génica en barras que representan genes expresados en el programa materno en comparación con genes expresados a partir del programa cigótico.
La Figura 13 es un dibujo de un modelo para utilizar el análisis de imágenes de lapso de tiempo y el análisis molecular correlacionado para evaluar la viabilidad del embrión.
La Figura 14 es una serie de fotografías que muestran tres etapas de desarrollo durante la maduración de los ovocitos in vitro.
La Figura 15 es una serie de fotografías que muestran el proceso de desarrollo del embrión después de la maduración in vitro de los ovocitos.
La Figura 16 es un diagrama de flujo que muestra los procedimientos utilizados para evaluar los ovocitos.
La Figura 17 es un diagrama de flujo que muestra los procedimientos utilizados para evaluar las células madre y las células madre pluripotentes.
La Figura 18 es una serie de fotografías que muestran el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en rosetas de neuronas.
La Figura 19 es una tabla de las categorías en las que se pueden clasificar los genes analizados para determinar el nivel de expresión, incluyendo el número de genes por categoría.
La Figura 20 es una tabla de los cuatro patrones específicos de la etapa embrionaria (ESSP) que se identificaron durante el análisis de la expresión génica de 141 embriones individuales y blastómeros individuales desarrollados normalmente, y la categorización de los genes en cada una de estas categorías.
La Figura 21 muestra un análisis de imágenes automatizado que demuestra la capacidad de los parámetros de la formación de imágenes para predecir la formación de blastocistos. (A) Muestra los resultados del algoritmo de rastreo para un solo embrión. (B) Muestra un conjunto de 14 embriones que fueron analizados. (C) Muestra la comparación del análisis de imágenes manual con el análisis automatizado durante la duración de la citocinesis. (D) Muestra la comparación del análisis de imágenes manual para el tiempo entre la primera y la segunda mitosis. (E) Muestra la comparación de una buena morfología de blastocistos con una mala morfología de blastocistos.
La Figura 22 es un dibujo esquemático de un microscopio de campo oscuro según la presente invención; el recuadro de la izquierda muestra una configuración de parche de campo oscuro mecanizado con láser.
La Figura 23 es una fotografía de una serie de tres microscopios como se ilustra en la Fig. 22, montados en un soporte para su instalación en una incubadora y para conexiones de ordenador. La Fig. 23A muestra los microscopios, y la Fig. 23B muestra los microscopios dentro de una incubadora.
La Figura 24 es una captura de pantalla del software de captura de imágenes utilizado en el presente trabajo, que muestra imágenes de embriones de 3 canales.
La Figura 25 A a D es una serie de cuatro fotografías que muestran una imagen de lapso de tiempo seleccionada del experimento 2, estación 2. Las Figs. 25A y 25B son imágenes capturadas antes del cambio de los medios, y las Figs. 25C y 25D son imágenes capturadas después del cambio de los medios.
La Figura 26 A a D es una serie de cuatro fotografías que muestran imágenes de lapso de tiempo seleccionadas del experimento 1, estación 2. Las Figs. 26A y 26B son imágenes capturadas antes del cambio de los medios, y las Figs. 26C y 26D son imágenes capturadas después del cambio de los medios.
La Figura 27 A y B son dibujos de una placa de Petri personalizada con micropocillos. La Fig. 27A muestra un dibujo de la cápsula con dimensiones, y la Fig. 27B muestra una vista en 3D de los micropocillos.
La Figura 28 A y B son gráficos que muestran la actividad celular con y sin registro de imagen previo. Las Figs.
28A y 28B juntas muestran que el registro limpia los resultados y elimina los picos debidos al desplazamiento o rotación del embrión.
La Figura 29 A y B son gráficas (izquierda) y fotografías de células (derecha) que muestran la actividad celular para embriones normales y anormales. Juntas, la Fig. 29A y la Fig. 29B muestran que, en el día 3, los embriones tienen una morfología similar, pero sus gráficas de actividad celular son drásticamente diferentes y solo uno de ellos se convierte en un blastocisto.
La Figura 30 es una gráfica que muestra la diferencia en la intensidad de los píxeles entre los sucesivos pares de imágenes durante el desarrollo del embrión. Esto se puede utilizar por sí solo para evaluar la viabilidad del embrión, o como una forma de mejorar otros algoritmos, tal como un filtro de partículas, determinando cuántas partículas (modelos de embriones predichos) deben usarse.
La Figura 31 A-G es una serie de siete fotografías que muestran los resultados del rastreo 2D en diversas etapas celulares. Las células progresan según lo indicado por los números de fotogramas asociados con cada par de imágenes: fotograma 15 (Fig. 31 A), 45 (B), 48 (C), 189 (D), 190 (E), 196 (F) y 234 (G). La fila inferior muestra las imágenes simuladas superpuestas. Los contornos son membranas celulares visibles, y las líneas blancas punteadas son membranas ocluidas. Los fotogramas de imagen se capturan cada 5 minutos, y solo se muestran unos pocos.
La Figura 32 A y B es una serie de fotografías y dibujos que muestran dos casos exitosos de rastreo celular en 3D. Las ilustraciones debajo de cada foto de un embrión muestran la vista de arriba hacia abajo del modelo 3D, excepto para el fotograma 314 y el fotograma 228, que muestran vistas laterales de los modelos en el fotograma 314 y fotograma 228, respectivamente. Los fotogramas de la imagen se capturaron cada 5 minutos.
La Figura 33 es una representación esquemática de los resultados del filtro de partículas para una división de 1 a 2 células. Los puntos de datos son la ubicación 3D de los centros de las células. Los puntos se muestran para modelos de 1 célula, modelos de 2 células, modelos de 3 células, y modelos de 4 células. La fila superior muestra las partículas después de la predicción, y la fila inferior muestra las partículas después de volver a muestrear.
La Figura 34 A y B son gráficas que muestran una comparación del análisis de imágenes automatizado frente al manual para un conjunto de 14 embriones. La Fig. 34A muestra la comparación de la duración de la primera citocinesis, y la Fig. 34B muestra la comparación para el tiempo entre la 1a y la 2a mitosis.
La Figura 35 es un diagrama de flujo que muestra cómo se utiliza el análisis de imágenes para modelar embriones y medir ciertos parámetros morfológicos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
También debe entenderse que la terminología utilizada aquí tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el que ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también está incluido dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.
Debe observarse que, como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de tales células, y la referencia a “el péptido” incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, etc.
Las publicaciones discutidas aquí se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.
DEFINICIONES
Se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar el potencial de desarrollo de uno o más embriones. Estos métodos, composiciones y kits encuentran uso para identificar embriones in vitro que son más útiles en el tratamiento de la infertilidad en seres humanos. Estos y otros objetos, ventajas y características de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer los detalles de los métodos y composiciones objeto como se describe más completamente a continuación.
Las expresiones “potencial de desarrollo” y “competencia de desarrollo” se utilizan aquí para referirse a la habilidad o capacidad de un embrión sano o una célula pluripotente para crecer o desarrollarse.
El término “embrión” se utiliza aquí para referirse tanto al cigoto que se forma cuando dos células gaméticas haploides, por ejemplo un ovocito secundario no fertilizado y un espermatozoide, se unen para formar una célula totipotente diploide, por ejemplo un óvulo fertilizado, y al embrión que resulta de las divisiones celulares inmediatamente posteriores, es decir, la escisión embrionaria, hasta la mórula, es decir, la etapa de 16 células y la etapa de blastocisto (con trofoectodermo diferenciado y masa celular interna).
La expresión “célula pluripotente” se usa aquí para significar cualquier célula que tenga la capacidad de diferenciarse en múltiples tipos de células en un organismo. Ejemplos de células pluripotentes incluyen ovocitos de células madre, y embriones de 1 célula (es decir, cigotos).
La expresión “célula madre” se usa aquí para referirse a una célula o población de células que: (a) tiene la capacidad de autorrenovarse, y (b) tiene el potencial para dar lugar a diversos tipos de células diferenciadas. Una célula madre tiene el potencial para dar lugar a múltiples linajes de células. Como se usa aquí, una célula madre puede ser una célula madre totipotente, por ejemplo un ovocito fertilizado, que da lugar a todos los tejidos embrionarios y extraembrionarios de un organismo; una célula madre pluripotente, por ejemplo una célula madre embrionaria (ES), una célula germinal embrionaria (EG), o una célula madre pluripotente inducida (iPS), que da lugar a todos los tejidos embrionarios de un organismo, es decir, linajes de endodermo, mesodermo y ectodermo; una célula madre multipotente, por ejemplo una célula madre mesenquimatosa, que da lugar a al menos dos de los tejidos embrionarios de un organismo, es decir, al menos dos de los linajes de endodermo, mesodermo y ectodermo, o puede ser una célula madre específica de tejido, que da lugar a múltiples tipos de células diferenciadas de un tejido particular. Las células madre específicas de tejido incluyen células embrionarias específicas de tejido, que dan lugar a las células de un tejido particular, y células madre somáticas, que residen en tejidos adultos y pueden dar lugar a las células de ese tejido, por ejemplo células madre neurales, que dan lugar a todas las células del sistema nervioso central, células satélite, que dan lugar al músculo esquelético, y células madre hematopoyéticas, que dan lugar a todas las células del sistema hematopoyético.
El término “ovocito” se utiliza aquí para referirse a una célula germinal femenina no fertilizada, o gameto. Los ovocitos de la aplicación en cuestión pueden ser ovocitos primarios, en cuyo caso están posicionados para pasar o están pasando por la meiosis I, u ovocitos secundarios, en cuyo caso están posicionados para pasar o están pasando por la meiosis II.
Por “meiosis” se entiende los eventos del ciclo celular que dan como resultado la producción de gametos. En el primer ciclo celular meiótico, o meiosis I, los cromosomas de una célula se duplican y se dividen en dos células hijas. Estas células hijas se dividen entonces en un segundo ciclo celular meiótico, o meiosis II, que no se acompaña de síntesis de ADN, lo que da como resultado gametos con un número haploide de cromosomas.
Por etapa de “vesícula germinal” se entiende la etapa de maduración de un ovocito primario que se correlaciona con la profase I del ciclo celular de la meiosis I, es decir, antes de la primera división del material nuclear. Los ovocitos en esta etapa también se denominan “ovocitos de vesícula germinal”, por el núcleo característicamente grande, denominado vesícula germinal. En un ovocito humano normal cultivado in vitro, la vesícula germinal se produce alrededor de 6 a 24 horas después del inicio de la maduración.
Por etapa de “metafase I” se entiende la etapa de maduración de un ovocito primario que se correlaciona con la metafase I del ciclo celular de la meiosis I. En comparación con los ovocitos de vesículas germinales, los ovocitos en metafase I no tienen un núcleo grande y claramente definido. En un ovocito humano normal cultivado in vitro, la metafase I se produce alrededor de 12 a 36 horas después del inicio de la maduración.
Por etapa de “metafase II” se entiende la etapa de maduración de un ovocito secundario que se correlaciona con la metafase II del ciclo celular de la meiosis II. La metafase II se distingue por la extrusión del primer cuerpo polar. En un ovocito humano normal cultivado in vitro, la metafase II ocurre alrededor de 24-48 horas después del inicio de la maduración.
Por un “ciclo celular mitótico”, se entiende los eventos en una célula que dan como resultado la duplicación de los cromosomas de una célula y la división de esos cromosomas y la materia citoplásmica de una célula en dos células hijas. El ciclo celular mitótico se divide en dos fases: interfase y mitosis. En la interfase, la célula crece y replica su ADN. En la mitosis, la célula inicia y completa la división celular, primero dividiendo su material nuclear, y después dividiendo su material citoplásmico y su material nuclear dividido (citocinesis) en dos células separadas.
Por un “primer ciclo celular mitótico” o “ciclo celular 1” se entiende el intervalo de tiempo desde la fertilización hasta la finalización del primer evento de citocinesis, es decir, la división del ovocito fertilizado en dos células hijas. En los casos en los que los ovocitos se fertilizan in vitro, el intervalo de tiempo entre la inyección de gonadotropina coriónica humana (HCG) (generalmente administrada antes de la recuperación de los ovocitos) y la finalización del primer evento de citocinesis puede usarse como intervalo de tiempo sustituto.
Por un “segundo ciclo celular mitótico” o “ciclo celular 2” se entiende el segundo evento del ciclo celular observado en un embrión, el intervalo de tiempo entre la producción de células hijas a partir de un ovocito fertilizado por mitosis y la producción de un primer conjunto de células nietas de una de esas células hijas (la “célula hija principal”, o célula hija A) por mitosis. Una vez completado el ciclo celular 2, el embrión consiste en 3 células. En otras palabras, el ciclo celular 2 se puede identificar visualmente como el tiempo entre el embrión que contiene 2 células y el embrión que contiene 3 células.
Por un “tercer ciclo celular mitótico” o “ciclo celular 3” se entiende el tercer evento del ciclo celular observado en un embrión, típicamente el intervalo de tiempo desde la producción de células hijas a partir de un ovocito fertilizado por mitosis y la producción de un segundo conjunto de células nietas de la segunda célula hija (la “célula hija rezagada” o célula hija B) por mitosis. Una vez completado el ciclo celular 3, el embrión consiste en 4 células. En otras palabras, el ciclo celular 3 se puede identificar visualmente como el tiempo entre el embrión que contiene 3 células y el embrión que contiene 4 células.
Por “primer evento de escisión”, se entiende la primera división, es decir, la división del ovocito en dos células hijas, es decir, el ciclo celular 1. Una vez completado el primer evento de escisión, el embrión consiste en 2 células.
Por “segundo evento de escisión”, se entiende el segundo conjunto de divisiones, es decir, la división de la célula hija principal en dos células nietas, y la división de la célula hija rezagada en dos células nietas. En otras palabras, el segundo evento de escisión consiste tanto en el ciclo celular 2 como en el ciclo celular 3. Una vez completada la segunda escisión, el embrión consiste en 4 células.
Por “tercer evento de escisión”, se entiende el tercer conjunto de divisiones, es decir, las divisiones de todas las células nietas. Una vez completado el tercer evento de escisión, el embrión generalmente consiste en 8 células.
Por “citocinesis” o “división celular” se entiende aquella fase de la mitosis en la que una célula experimenta la división celular. En otras palabras, es la etapa de la mitosis en la que el material nuclear dividido de una célula y su material citoplasmático se dividen para producir dos células hijas. El período de citocinesis es identificable como el período, o ventana, de tiempo entre el momento en que se observa por primera vez una constricción de la membrana celular (un “surco de escisión”) y la resolución de ese evento de constricción, es decir, la generación de dos células hijas. El inicio del surco de escisión puede identificarse visualmente como el punto en el que la curvatura de la membrana celular cambia de convexa (redondeada hacia afuera) a cóncava (curvada hacia adentro con una abolladura o hendidura). Esto se ilustra en el panel superior de la Fig. 4 con flechas blancas que apuntan a 2 surcos de escisión. El inicio del alargamiento celular también se puede utilizar para marcar el inicio de la citocinesis, en cuyo caso el período de citocinesis se define como el período de tiempo entre el inicio del alargamiento celular y la resolución de la división celular.
Por “primera citocinesis” o “citocinesis 1” se entiende el primer evento de división celular después de la fertilización, es decir, la división de un ovocito fertilizado para producir dos células hijas. La primera citocinesis suele ocurrir alrededor de un día después de la fertilización.
Por “segunda citocinesis” o “citocinesis 2”, se entiende el segundo evento de división celular observado en un embrión, es decir, la división de una célula hija del ovocito fertilizado (la “célula hija principal”, o hija A) en un primer conjunto de dos nietas.
Por “tercera citocinesis” o “citocinesis 3”, se entiende el tercer evento de división celular observado en un embrión, es decir, la división de la otra hija del ovocito fertilizado (la “célula hija rezagada”, o hija B) en un segundo conjunto de dos nietas.
La expresión “marcador fiduciario” o “marcador fiducial” es un objeto utilizado en el campo de visión de un sistema de formación de imágenes que aparece en la imagen producida, para uso como punto de referencia o medida. Puede ser algo colocado dentro o sobre el sujeto de la imagen, o una marca o un conjunto de marcas en la retícula de un instrumento óptico.
El término “micropocillo” se refiere a un recipiente que está dimensionado a escala celular, preferiblemente para acomodar una sola célula eucariota.
Embriones de interés
En los métodos de la invención, se evalúa el potencial de desarrollo de uno o más embriones midiendo parámetros celulares del embrión o embriones y empleando estas medidas para determinar el potencial de desarrollo del embrión o embriones. La información así obtenida puede usarse para guiar decisiones clínicas, por ejemplo si transferir o no un embrión fertilizado in vitro, si trasplantar o no una célula o células cultivadas.
Ejemplos de embriones que se pueden evaluar mediante los métodos de la invención incluyen embriones de 1 célula (también denominados cigotos), embriones de 2 células, embriones de 3 células, embriones de 4 células, embriones de 5 células, embriones de 6 células, embriones de 8 células, etc., típicamente hasta e incluyendo embriones de 16 células, cualquiera de los cuales puede obtenerse de cualquier manera conveniente, por ejemplo de un ovocito que ha madurado in vivo o de un ovocito que ha madurado in vitro.
Descritos aquí, los embriones pueden derivar de cualquier organismo, por ejemplo cualquier especie de mamífero, por ejemplo seres humanos, primates, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, etc. En la invención, derivan de un ser humano. Pueden estar previamente congelados, por ejemplo embriones criopreservados en la etapa de 1 célula y después descongelados. Alternativamente, pueden estar recién preparados, por ejemplo embriones recién preparados a partir de ovocitos mediante técnicas de fecundación in vitro; y similares. Pueden cultivarse en cualquier condición conveniente conocida en la técnica para promover la supervivencia, el crecimiento y/o el desarrollo de la muestra que se va a evaluar, por ejemplo para embriones, en condiciones como las que se utilizan en la técnica de la fecundación in vitro; véanse, por ejemplo, Patente US n° 6.610.543, Patente US n° 6.130.086, Patente US n° 5.837.543. A menudo, los embriones se cultivan en un medio comercialmente disponible tal como KnockOut DMEM, DMEM-F12, o medio de Dulbecco modificado de Iscove que se ha suplementado con suero o sustituto de suero, aminoácidos y factores de crecimiento adaptados a las necesidades del embrión particular que se está evaluando.
Análisis de formación de imágenes de lapso de tiempo
En algunas realizaciones, los embriones se evalúan midiendo los parámetros celulares mediante formación de imágenes de lapso de tiempo. Los embriones se pueden cultivar en placas de cultivo estándar. Alternativamente, los embriones se pueden cultivar en placas de cultivo personalizadas, por ejemplo placas de cultivo personalizadas con micropocillos de calidad óptica como se describe aquí. En tales placas de cultivo personalizadas, cada micropocillo contiene un solo embrión/célula pluripotente, y la superficie inferior de cada micropocillo tiene un acabado de calidad óptica de manera que todo el grupo de embriones dentro de una sola placa puede ser fotografiado simultáneamente por un solo microscopio en miniatura con resolución suficiente para seguir los procesos de mitosis celular. Todo el grupo de micropocillos comparte la misma gota de medio en la placa de cultivo, y también puede incluir una pared exterior colocada alrededor de los micropocillos para estabilizar la gota de medio, así como marcadores fiduciales colocados cerca de los micropocillos. La hidrofobia de la superficie se puede ajustar con grabado con plasma u otro tratamiento para evitar que se formen burbujas en los micropocillos cuando se llenan con los medios. Independientemente de si se utiliza una placa de cultivo estándar o una placa de cultivo personalizada, durante el cultivo, se pueden cultivar uno o más embriones en desarrollo en el mismo medio de cultivo, por ejemplo se pueden cultivar entre 1 y 30 embriones por placa.
Las imágenes se adquieren a lo largo del tiempo, y después se analizan para llegar a medidas del uno o más parámetros celulares. La formación de imágenes de lapso de tiempo se puede llevar a cabo con cualquier microscopio controlado por ordenador que esté equipado para el almacenamiento y análisis de imágenes digitales, por ejemplo microscopios invertidos equipados con etapas calentadas y cámaras de incubación, o matrices de microscopios en miniatura construidas de forma personalizada que quepan dentro de una incubadora convencional. La matriz de microscopios en miniatura permite el cultivo simultáneo de múltiples placas de muestras en la misma incubadora, y es escalable para adaptarse a múltiples canales sin limitaciones en el intervalo de tiempo mínimo entre capturas de imágenes sucesivas. El uso de varios microscopios elimina la necesidad de mover la muestra, lo que mejora la precisión del sistema y la fiabilidad general del sistema. Los microscopios individuales en la incubadora se pueden aislar parcial o totalmente, proporcionando a cada placa de cultivo su propio entorno controlado. Esto permite que las placas se transfieran desde y hacia las estaciones de formación de imágenes sin alterar el entorno de las otras muestras.
El sistema de formación de imágenes para la formación de imágenes de lapso de tiempo puede emplear iluminación de campo claro, iluminación de campo oscuro, contraste de fase, contraste de modulación Hoffman, contraste de interferencia diferencial, o fluorescencia. En algunas realizaciones, la iluminación de campo oscuro se puede utilizar para proporcionar un contraste de imagen mejorado para la extracción de características y análisis de imagen posteriores. Además, se pueden usar fuentes de luz roja o infrarroja cercana para reducir la fototoxicidad y mejorar la relación de contraste entre las membranas celulares y la parte interna de las células.
Las imágenes que se adquieren pueden almacenarse de forma continua, tal como en vídeo en directo, o de forma intermitente, tal como en la fotografía de lapso de tiempo, en la que un sujeto se visualiza repetidamente en una imagen fija. Preferiblemente, el intervalo de tiempo entre imágenes debe estar entre 1 y 30 minutos para capturar eventos morfológicos significativos como se describe a continuación. En una realización alternativa, el intervalo de tiempo entre imágenes podría variarse dependiendo de la cantidad de actividad celular. Por ejemplo, durante los períodos activos, las imágenes se pueden tomar cada pocos segundos o cada minuto, mientras que durante los períodos inactivos, las imágenes se pueden tomar cada 10 o 15 minutos o más. El análisis de imágenes en tiempo real en las imágenes capturadas podría usarse para detectar cuándo y cómo variar los intervalos de tiempo. En nuestros métodos, se estima que la cantidad total de luz recibida por las muestras es equivalente a aproximadamente 24 minutos de exposición continua a la luz de bajo nivel durante 5 días de formación de imágenes. La intensidad de la luz para un sistema de formación de imágenes de lapso de tiempo es significativamente menor que la intensidad de la luz que se usa típicamente en un microscopio de reproducción asistida debido a la baja potencia de los LED (por ejemplo, usando un LED de 1W en comparación con una bombilla halógena típica de 100W) y alta sensibilidad del sensor de la cámara. De este modo, la cantidad total de energía luminosa recibida por un embrión que usa el sistema de formación de imágenes de lapso de tiempo es comparable o menor que la cantidad de energía recibida durante la manipulación rutinaria en una clínica de FIV. Además, el tiempo de exposición se puede acortar significativamente para reducir la cantidad total de exposición a la luz del embrión/célula pluripotente. Para 2 días de formación de imágenes, con imágenes capturadas cada 5 minutos a 0,5 segundos de exposición a la luz por imagen, la cantidad total de exposición a la luz de bajo nivel es menor que 5 minutos.
Después de la adquisición de imágenes, las imágenes se extraen y analizan para determinar diferentes parámetros celulares, por ejemplo tamaño celular, grosor de la zona pelúcida, grado de fragmentación, simetría de las células hijas resultante de una división celular, intervalos de tiempo entre las primeras pocas mitosis, y duración de la citocinesis.
Los parámetros celulares que pueden medirse mediante formación de imágenes de lapso de tiempo suelen ser eventos morfológicos. Por ejemplo, al evaluar embriones, se puede usar la formación de imágenes de lapso de tiempo para medir la duración de un evento de citocinesis, por ejemplo citocinesis 1, citocinesis 2, citocinesis 3 o citocinesis 4, en la que la duración de un evento de citocinesis se define como el intervalo de tiempo entre la primera observación de un surco de escisión (el inicio de la citocinesis) y la resolución del surco de escisión en dos células hijas (es decir, la producción de dos células hijas). Otro parámetro de interés es la duración de un evento del ciclo celular, por ejemplo ciclo celular 1, ciclo celular 2, ciclo celular 3, o ciclo celular 4, en el que la duración de un evento del ciclo celular se define como el intervalo de tiempo entre la producción de una célula (para el ciclo celular 1, la fertilización de un óvulo; para ciclos celulares posteriores, en la resolución de la citocinesis) y la producción de dos células hijas a partir de esa célula. Otros parámetros celulares de interés que pueden medirse mediante formación de imágenes de lapso de tiempo incluyen intervalos de tiempo que están definidos por estos eventos celulares, por ejemplo (a) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 1 y la citocinesis 2, definible como uno cualquiera del intervalo entre el inicio de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2, el intervalo entre la resolución de la citocinesis 1 y la resolución de la citocinesis 2, el intervalo entre el inicio de la citocinesis 1 y la resolución de la citocinesis 2; o el intervalo entre la resolución de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2; o (b) el intervalo de tiempo entre la citocinesis 2 y la citocinesis 3, definible como uno cualquiera del intervalo entre el inicio de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3, o el intervalo entre la resolución de la citocinesis 2 y la resolución de la citocinesis 3, o el intervalo entre el inicio de la citocinesis 2 y la resolución de la citocinesis 3, o el intervalo entre la resolución de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3.
Para los fines de la fecundación in vitro, se considera ventajoso que el embrión se transfiera al útero al principio del desarrollo, por ejemplo para el día 2 o el día 3, es decir, hasta la etapa de 8 células, para reducir la pérdida de embriones debido a las desventajas de las condiciones de cultivo con respecto al entorno in vitro, y para reducir los posibles resultados adversos asociados con errores epigenéticos que pueden ocurrir durante el cultivo (Katari et al. (2009) Hum Mol Genet. 18(20):3769-78; Sepulveda et al. (2009) Fertil Steril. 91(5): 1765-70). Por consiguiente, es preferible que la medida de los parámetros celulares tenga lugar dentro de los 2 días posteriores a la fertilización, aunque períodos de análisis más largos, por ejemplo alrededor de 36 horas, alrededor de 54 horas, alrededor de 60 horas, alrededor de 72 horas, alrededor de 84 horas, alrededor de 96 horas, o más, también están contemplados por los presentes métodos.
Descritos aquí, los ejemplos de parámetros celulares en un ovocito en maduración que pueden evaluarse mediante formación de imágenes de lapso de tiempo incluyen, sin limitación, cambios en la morfología de la membrana del ovocito, por ejemplo la velocidad y el grado de separación de la zona pelúcida; cambios en la morfología del núcleo del ovocito, por ejemplo el inicio, finalización y velocidad de degradación de vesículas germinales (GVBD); la velocidad y dirección del movimiento de los gránulos en el citoplasma y el núcleo; la citocinesis del ovocito y el primer cuerpo polar y el movimiento y/o duración de la extrusión del primer cuerpo polar. Otros parámetros incluyen la duración de la citocinesis del ovocito secundario maduro y el segundo cuerpo polar.
Descritos aquí, los ejemplos de parámetros celulares en una célula madre o una población de células madre que se pueden evaluar mediante formación de imágenes de lapso de tiempo incluyen, sin limitación, la duración de los eventos de citocinesis, el tiempo entre los eventos de citocinesis, el tamaño y la forma de las células madre antes de y durante los eventos de citocinesis, el número de células hijas producidas por un evento de citocinesis, la orientación espacial del surco de escisión, la velocidad y/o el número de divisiones asimétricas observadas (es decir, cuando una célula hija mantiene una célula madre mientras que la otra se diferencia), la velocidad y/o número de divisiones simétricas observadas (es decir, cuando ambas células hijas permanecen como células madre o ambas se diferencian), y el intervalo de tiempo entre la resolución de un evento de citocinesis y cuando una célula madre comienza a diferenciarse.
Los parámetros pueden medirse manualmente, o pueden medirse automáticamente, por ejemplo por software de análisis de imágenes. Cuando se emplea software de análisis de imágenes, se pueden utilizar algoritmos de análisis de imágenes que empleen una técnica de estimación de modelos probabilísticos basada en el método secuencial de Monte Carlo, por ejemplo generando distribuciones de modelos hipotéticos de embriones/células pluripotentes, simulando imágenes basadas en un modelo óptico simple, y comparando estas simulaciones con los datos de imagen observados. Cuando se emplean tales estimaciones de modelos probabilísticos, las células pueden modelarse con cualquier forma apropiada, por ejemplo como colecciones de elipses en el espacio 2D, colecciones de elipsoides en el espacio 3D, y similares. Para hacer frente a oclusiones y ambigüedades de profundidad, el método puede imponer restricciones geométricas que corresponden al comportamiento físico esperado. Para mejorar la robustez, las imágenes se pueden capturar en uno o más planos focales.
Análisis de expresión génica
En algunos ejemplos descritos aquí, los embriones o células pluripotentes se evalúan midiendo la expresión génica. En tales ejemplos, el parámetro celular es un nivel de expresión génica o un perfil de expresión génica. La determinación de la expresión de uno o más genes, es decir, la obtención de un perfil de expresión o evaluación de la expresión, puede realizarse midiendo los transcritos de ácido nucleico, por ejemplo ARNm, de uno o más genes de interés, por ejemplo un perfil de expresión de ácido nucleico; o midiendo los niveles de una o más proteínas/polipéptidos diferentes que son productos de expresión de uno o más genes de interés, por ejemplo un perfil de expresión proteómica. En otras palabras, las expresiones “perfil de expresión” y “evaluación de la expresión” se utilizan ampliamente para incluir un perfil de expresión génica a nivel de a Rn o de proteína.
En algunos ejemplos descritos aquí, la expresión de genes puede evaluarse obteniendo un perfil de expresión de ácido nucleico, en el que se determina la cantidad o nivel de uno o más ácidos nucleicos en la muestra, por ejemplo el transcrito de ácido nucleico del uno o más genes de interés. En estas realizaciones, la muestra que se analiza para generar el perfil de expresión es una muestra de ácido nucleico. La muestra de ácido nucleico incluye una pluralidad o población de ácidos nucleicos distintos que incluye la información de expresión de los genes de interés del embrión o célula que se está evaluando. El ácido nucleico puede incluir ácidos nucleicos de ARN o ADN, por ejemplo ARNm, ARNc, ADNc, etc., siempre que la muestra retenga la información de expresión de la célula hospedante o el tejido del que se obtiene. La muestra se puede preparar de varias formas diferentes, como se conoce en la técnica, por ejemplo mediante aislamiento de ARNm de una célula, en el que el ARNm aislado se usa tal cual, se amplifica, se emplea para preparar ADNc, ARNc, etc., como es conocido en la técnica de la expresión diferencial. La muestra se puede preparar a partir de una sola célula, por ejemplo una célula pluripotente de un cultivo de células pluripotentes de interés, o una sola célula (blastómero) procedente de un embrión de interés; o de varias células, por ejemplo una fracción de cultivos de células pluripotentes, o 2, 3 o 4 o más blastómeros de un embrión de interés, utilizando protocolos estándar.
El perfil de expresión se puede generar a partir de la muestra de ácido nucleico inicial usando cualquier protocolo conveniente. Si bien se conocen diversas formas diferentes de generar perfiles de expresión, tales como las empleadas en el campo del análisis diferencial de expresión génica, un tipo de protocolo representativo y conveniente para generar perfiles de expresión son los protocolos de generación de perfiles de expresión génica basados en matrices. Tales aplicaciones son ensayos de hibridación en los que se emplea un ácido nucleico que muestra ácidos nucleicos “sonda” para cada uno de los genes que se van a analizar/perfilar en el perfil que se va a generar. En estos ensayos, en primer lugar se prepara una muestra de ácidos nucleicos diana a partir de la muestra de ácido nucleico inicial que se está analizando, en el que la preparación puede incluir el marcaje de los ácidos nucleicos diana con un marcador, por ejemplo un miembro del sistema productor de señales. Después de la preparación de la muestra de ácido nucleico diana, la muestra se pone en contacto con la matriz en condiciones de hibridación, por lo que se forman complejos entre ácidos nucleicos diana que son complementarios a las secuencias de sonda unidas a la superficie de la matriz. A continuación, se detecta la presencia de complejos hibridados, cualitativa o cuantitativamente.
La tecnología de hibridación específica que se puede practicar para generar los perfiles de expresión empleados en los métodos objeto incluye la tecnología descrita en las Patentes U.S. nos: 5.143.854; 5.288.644; 5.324.633; 5.432.049; 5.470.710; 5.492.806; 5.503.980; 5.510.270; 5.525.464; 5.547.839; 5.580.732; 5.661.028; 5.800.992; así como en los documentos WO 95/21265; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; EP 373 203; y EP 785 280. En estos métodos, una matriz de ácidos nucleicos “sonda”, que incluye una sonda para cada uno de los genes determinantes del fenotipo cuya expresión se está ensayando, se pone en contacto con ácidos nucleicos diana como se describió anteriormente. El contacto se lleva a cabo en condiciones de hibridación, por ejemplo condiciones de hibridación rigurosas, y entonces se elimina el ácido nucleico no unido. La expresión “condiciones de ensayo rigurosas”, como se usa aquí, se refiere a condiciones que son compatibles para producir pares de unión de ácidos nucleicos, por ejemplo ácidos nucleicos en fase de disolución y unidos a la superficie, de complementariedad suficiente para proporcionar el nivel deseado de especificidad en el ensayo, al tiempo que son menos compatibles para la formación de pares de unión entre miembros de unión de complementariedad insuficiente para proporcionar la especificidad deseada. Las condiciones de ensayo rigurosas son la suma o combinación (totalidad) de las condiciones tanto de hibridación como de lavado.
El patrón resultante de ácido nucleico hibridado proporciona información con respecto a la expresión para cada uno de los genes que se han sondado, en el que la información de expresión está en términos de si el gen se expresa o no y, típicamente, a qué nivel, en el que los datos de expresión, es decir, el perfil de expresión (por ejemplo, en forma de transcriptosoma), pueden ser tanto cualitativos como cuantitativos.
Alternativamente, se pueden emplear métodos no basados en matrices para cuantificar el nivel de uno o más ácidos nucleicos en una muestra, incluyendo aquellos basados en protocolos de amplificación, por ejemplo ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo la PCR cuantitativa, PCR transcripción inversa (RT-PCR), PCR en tiempo real, y similares.
En algunas realizaciones descritas aquí, la expresión de genes puede evaluarse obteniendo un perfil de expresión proteómica, en el que se determina la cantidad o nivel de una o más proteínas/polipéptidos en la muestra, por ejemplo la proteína/polipéptido codificado por el gen de interés. En estas realizaciones, la muestra que se analiza para generar el perfil de expresión empleado en los métodos es una muestra de proteína. Cuando el perfil de expresión es un perfil de expresión proteómica, es decir, un perfil de uno o más niveles de proteína en una muestra, se puede emplear cualquier protocolo conveniente para evaluar los niveles de proteína, en el que se determina el nivel de una o más proteínas en la muestra ensayada.
Si bien en la técnica se conocen diversas formas diferentes de analizar los niveles de proteína, un tipo de protocolo representativo y conveniente para analizar los niveles de proteína es ELISA. En los ensayos ELISA y basados en ELISA, se pueden inmovilizar uno o más anticuerpos específicos para las proteínas de interés sobre una superficie sólida seleccionada, preferiblemente una superficie que presente una afinidad proteica tal como los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno. Después del lavado para eliminar el material adsorbido de forma incompleta, los pocillos de la placa de ensayo se recubren con una proteína de “bloqueo” no específica que se sabe que es antigénicamente neutra con respecto a la muestra de ensayo, tal como la seroalbúmina bovina (BSA), caseína, o disoluciones de leche en polvo. Esto permite el bloqueo de sitios de adsorción no específicos en la superficie inmovilizadora, reduciendo así el fondo causado por la unión no específica del antígeno sobre la superficie. Después de lavar para eliminar la proteína de bloqueo no unida, la superficie inmovilizadora se pone en contacto con la muestra que se va a analizar en condiciones que conducen a la formación de complejos inmunes (antígeno/anticuerpo). Dichas condiciones incluyen diluir la muestra con diluyentes tales como BSA o gammaglobulina bovina (BGG) en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS)/Tween o PBS/Triton-X 100, que también tienden a ayudar a reducir el fondo no específico, y que permiten que la muestra se incube durante alrededor de 2-4 horas a temperaturas del orden de alrededor de 25°-27°C (aunque se pueden usar otras temperaturas). Después de la incubación, la superficie en contacto con el antisuero se lava para eliminar el material no inmunocomplejado. Un procedimiento de lavado ejemplar incluye lavar con una disolución tal como PBS/Tween, PBS/Triton-X 100, o amortiguador de borato. La aparición y la cantidad de formación de inmunocomplejos pueden determinarse entonces sometiendo los inmunocomplejos unidos a un segundo anticuerpo que tiene especificidad por la diana que difiere del primer anticuerpo y que detecta la unión del segundo anticuerpo. En determinadas realizaciones, el segundo anticuerpo tendrá una enzima asociada, por ejemplo ureasa, peroxidasa, o fosfatasa alcalina, que generará un precipitado de color al incubar con un sustrato cromogénico apropiado. Por ejemplo, se puede emplear una IgG antihumana conjugada con ureasa o peroxidasa, durante un período de tiempo y en condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación de inmunocomplejos (por ejemplo, incubación durante 2 h a temperatura ambiente en una disolución que contenga PBS tal como PBS/Tween). Después de dicha incubación con el segundo anticuerpo y de lavar para eliminar el material no unido, se cuantifica la cantidad de marcador, por ejemplo mediante incubación con un sustrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol en el caso de un marcador de ureasa, o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolina)-6-sulfónico (ABTS) y H2O2 en el caso de un marcador de peroxidasa. La cuantificación se logra entonces midiendo el grado de generación de color, por ejemplo usando un espectrofotómetro de espectro visible.
El formato anterior se puede alterar uniendo primero la muestra a la placa de ensayo. Después, el anticuerpo primario se incuba con la placa de ensayo, seguido de la detección del anticuerpo primario unido usando un segundo anticuerpo marcado, con especificidad para el anticuerpo primario.
El sustrato sólido sobre el que se inmovilizan el anticuerpo o los anticuerpos puede estar hecho de una amplia variedad de materiales y en una amplia variedad de formas, por ejemplo placa de microtitulación, microperlas, tira reactiva, partícula de resina, etc. El sustrato puede escogerse para maximizar las relaciones de señal a ruido, para minimizar la unión de fondo, así como para facilitar la separación y el coste. Los lavados se pueden realizar de la manera más apropiada para el sustrato que se esté utilizando, por ejemplo retirando una perla o rita reactiva de un recipiente, vaciando o diluyendo un recipiente tal como un pocillo de una placa de microtitulación, o enjuagando una perla, partícula, columna cromatográfica o filtro con una disolución de lavado o disolvente.
Alternativamente, pueden emplearse métodos no basados en ELISA para medir los niveles de una o más proteínas en una muestra. Los ejemplos representativos incluyen, pero no se limitan a, espectrometría de masas, matrices proteómicas, tecnología de microesferas xMAP™, citometría de flujo, transferencia Western, e inmunohistoquímica.
Los datos resultantes proporcionan información con respecto a la expresión para cada uno de los genes que se han sondado, en los que la información de expresión es en términos de si el gen se expresa o no y, típicamente, a qué nivel, y en los que los datos de expresión pueden ser tanto cualitativos como cuantitativos.
Al generar el perfil de expresión, en algunas realizaciones se analiza una muestra para generar un perfil de expresión que incluye datos de expresión para al menos un gen/proteína, a veces una pluralidad de genes/proteínas, en el que por pluralidad se entiende al menos dos genes/proteínas diferentes, y a menudo al menos alrededor de 3, típicamente al menos alrededor de 10, y más habitualmente al menos alrededor de 15 genes/proteínas diferentes o más, tales como 50 o más, o 100 o más, etc.
En el sentido más amplio, la evaluación de la expresión puede ser cualitativa o cuantitativa. Como tal, cuando la detección es cualitativa, los métodos proporcionan una lectura o evaluación, por ejemplo evaluación, de si el analito diana, por ejemplo ácido nucleico o producto de expresión, está presente o no en la muestra que se está analizando. En aún otras realizaciones, los métodos proporcionan una detección cuantitativa de si el analito diana está presente en la muestra que se está ensayando, es decir, una evaluación o valoración de la cantidad real o abundancia relativa del analito diana, por ejemplo ácido nucleico o proteína en la muestra que se está analizando. En tales realizaciones, la detección cuantitativa puede ser absoluta o, si el método es un método para detectar dos o más analitos diferentes, por ejemplo ácidos nucleicos diana o proteína, en una muestra, relativa. Como tal, el término “cuantificar”, cuando se usa en el contexto de cuantificar un analito diana, por ejemplo ácido o ácidos nucleicos o proteína o proteínas, en una muestra puede referirse a cuantificación absoluta o relativa. La cuantificación absoluta se puede lograr mediante la inclusión de concentración o concentraciones conocidas de uno o más analitos de control y haciendo referenciando, es decir, normalizando, el nivel detectado del analito diana con los analitos de control conocidos (por ejemplo, mediante la generación de una curva estándar). Alternativamente, la cuantificación relativa puede lograrse mediante la comparación de niveles o cantidades detectados entre dos o más analitos diana diferentes para proporcionar una cuantificación relativa de cada uno de los dos o más analitos diferentes, por ejemplo unos con respecto a otros.
Ejemplos de genes cuyos niveles de expresión son predictivos del potencial de desarrollo del cigoto incluyen Cofilina (NM_005507), DIAPH1 (NM_001079812, NM_005219), ECT2 (NM_018098), MYLC2/MYL5 (NM_002477), DGCR8 (NM_022720), Dicer/DICERl (NM_030621, NM_177438), TARBP2 (NM_004178, NM_134323, NM_134324), CPEB1 (NMJXH079533, NM_001079534, NM_001079535, NM_030594), Siraplekina/SYMPK (NM_004819), YBX2 (NM _015982), ZAR1 (NM_175619), CTNNB1 (NM_001098209, NMJXH098210, NM_001098210, NM 001904), DNMT3B (NM_006892, NM_175848, NM_175849, NM_175850), TERT (NMJ98253, NM_198255), YY1 (NM_003403), IFGR2/IFNGR2 (NM_005534), BTF3 (NM _001037637, NM_001207), y NELF (NM_001130969, NM_001130970, NM 001130971, NM_015537). En la Fig. 8 se proporcionan otros genes cuyos niveles de expresión pueden servir como parámetros celulares que predicen el potencial de desarrollo del embrión. Al llegar a una medida del nivel de expresión génica, el nivel de expresión a menudo se evalúa y después se normaliza a un control estándar, por ejemplo el nivel de expresión en la muestra de un gen que se sabe que es constante durante el desarrollo, por ejemplo GAPDH o RPLPO, o de un gen cuya expresión se conoce en ese momento.
Los niveles de expresión génica se pueden determinar a partir de una sola célula, por ejemplo un blastómero de un embrión de interés, o un ovocito aislado, o una célula aislada de un cultivo de células madre, etc., o pueden determinarse a partir de un embrión, por ejemplo 2, 3 o 4, o más blastómeros de un embrión de interés, hasta e incluyendo el embrión completo de interés, o múltiples células de un cultivo de células madre, hasta e incluyendo el cultivo completo de células madre, etc.
En otros aspectos descritos aquí, la descripción comprende un protocolo para realizar análisis de expresión génica y genotipado concurrente en una sola célula. Para embriones, esto se puede utilizar para mejorar el diagnóstico genético previo a la implantación (PGD), un procedimiento en el que se extrae una sola célula de un embrión y se analiza su ADN para detectar defectos cariotípicos o la presencia de genes de enfermedades específicas. Nuestro método permite el análisis genético y de expresión génica concurrente. El método implica las siguientes etapas: (1) recolectar una sola célula en un pequeño volumen de medio o amortiguador, (2) realizar la transcripción inversa y la amplificación mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en una sola etapa usando una mezcla de cebadores de análisis de expresión génica y genotipado, (3) recolectar una alícuota del ADNc amplificado después de menos de 18 ciclos de PCR para preservar la linealidad de la amplificación, (4) usar la alícuota del ADNc para realizar análisis de expresión génica con técnicas estándar tal como la p Cr cuantitativa en tiempo real, (5) usar la muestra restante para realizar una segunda ronda de PCR para amplificar aún más la información genética con fines de genotipado, y (6) genotipar usando técnicas estándar tal como la electroforesis en gel.
Se describe aquí cómo determinar el potencial de desarrollo a partir del análisis de imágenes y/o de la expresión génica
Una vez que se han obtenido las medidas de los parámetros celulares, las medidas se emplean para determinar el potencial de desarrollo del embrión. Como se discutió anteriormente, las expresiones “potencial de desarrollo” y “competencia de desarrollo” se refieren a la habilidad o capacidad de una célula o tejido pluripotente para crecer o desarrollarse. Por ejemplo, en el caso de un embrión, el potencial de desarrollo puede ser la habilidad o capacidad de ese ovocito o embrión para crecer o convertirse en un blastocisto sano. En algunas realizaciones, el potencial de desarrollo de un embrión es la habilidad o capacidad de ese embrión para convertirse en un blastocisto sano.
Por “buen potencial de desarrollo”, se entiende que el embrión es estadísticamente probable que se desarrolle como se desea, es decir, tiene un 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de probabilidad, por ejemplo una probabilidad del 100%, de desarrollarse como se desea. En otras palabras, 55 de 100, 60 de 100, 70 de 100, 80 de 100, 90 de 100, 95 de 100, o 100 de 100 embriones que demuestran las medidas de parámetros celulares utilizadas para llegar a la determinación de un buen potencial de desarrollo, de hecho, continúan desarrollándose como se desea. A la inversa, por “potencial de desarrollo deficiente” se entiende que el embrión no es estadísticamente probable que se desarrolle como se desea, es decir, tiene un 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% o menos probabilidad, por ejemplo 0% de probabilidad, de desarrollarse como se desea. En otras palabras, solo 50 de 100, 40 de 100, 30 de 100, 20 de 100, 10 de 100, o 5 de 100 o menos de los embriones que demuestran las medidas de los parámetros celulares utilizadas para llegar a la determinación de un potencial de desarrollo deficiente continúan, de hecho, desarrollándose como se desea. Como se usa aquí, los embriones “normales” o “sanos” demuestran un buen potencial de desarrollo, mientras que los embriones “anormales” muestran un potencial de desarrollo deficiente.
En algunas realizaciones, la medida de los parámetros celulares se usa directamente para determinar el potencial de desarrollo del embrión. En otras palabras, el valor absoluto de la propia medida es suficiente para determinar el potencial de desarrollo. Ejemplos de esto en las realizaciones descritas aquí que utilizan formación de imágenes de lapso de tiempo para medir parámetros celulares incluyen, sin limitación, los siguientes, cualquiera de los cuales, solos o en combinación, son indicativos de un buen potencial de desarrollo en un embrión humano: (a) una citocinesis 1 que dura alrededor de 0-30 minutos, por ejemplo alrededor de 6-20 minutos, en promedio alrededor de 12-14 minutos; (b) un ciclo celular 1 que dura alrededor de 20-27 horas, por ejemplo alrededor de 25-27 horas; (c) un intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2 que es alrededor de 8-15 horas, por ejemplo alrededor de 9-13 horas, con un valor medio de alrededor de 11 /- 2,1 horas; (d) un intervalo de tiempo, es decir, sincronicidad, entre el inicio de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3 que es alrededor de 0-5 horas, por ejemplo alrededor de 0-3 horas, con un tiempo medio de alrededor de 1 /- 1,6 horas. Los ejemplos descritos aquí de medidas directas, cualquiera de las cuales, solas o en combinación, son indicativas de un potencial de desarrollo deficiente en un embrión humano, incluyen sin limitación: (a) una citocinesis 1 que dura más de alrededor de 30 minutos, por ejemplo alrededor de 32, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 minutos o más; (b) un ciclo celular 1 que dura más de alrededor de 27 horas, por ejemplo 28, 29 o 30 o más horas; (c) un intervalo de tiempo entre la resolución de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2 que dura más de 15 horas, por ejemplo alrededor de 16, 17, 18, 19 o 20 o más horas, o menos de 8 horas, por ejemplo alrededor de 7, 5, 4 o 3 o menos horas; (d) un intervalo de tiempo entre el inicio de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3 que es 6, 7, 8, 9 o 10 o más horas.
En algunas realizaciones, la medida del parámetro celular se emplea comparándola con una medida del parámetro celular de un embrión de referencia o de control, y usando el resultado de esta comparación para proporcionar una determinación del potencial de desarrollo del embrión. Los términos “referencia” y “control”, como se usan aquí, significan un embrión o célula estandarizada que se usará para interpretar las medidas de los parámetros celulares de un embrión dado y asignarle una determinación del potencial de desarrollo. La referencia o control puede ser un embrión que se sabe que tiene un fenotipo deseado, por ejemplo buen potencial de desarrollo, y por lo tanto puede ser un embrión de referencia o control positivo. Alternativamente, el embrión de referencia/control puede ser un embrión que se sabe que no tiene el fenotipo deseado, y por lo tanto puede ser un embrión de referencia/control negativo.
En determinadas realizaciones, la o las medidas de parámetros celulares obtenidas se comparan con la o las medidas de parámetros celulares comparables procedentes de un único embrión de referencia/control para obtener información con respecto al fenotipo del embrión que se está analizando. En aún otras realizaciones, la o las medidas de parámetros celulares obtenidas se comparan con la o las medidas de parámetros celulares comparables procedentes de dos o más embriones de referencia/control diferentes para obtener información más detallada con respecto al fenotipo del embrión ensayado. Por ejemplo, las medidas de parámetros celulares obtenidas del embrión o embriones que se evalúan pueden compararse con un embrión tanto positivo como negativo para obtener información confirmada con respecto a si el embrión tiene el fenotipo de interés.
Por ejemplo, la citocinesis 1 en un embrión humano normal, es decir, con buen potencial de desarrollo, es de alrededor de 0-30 minutos, más generalmente de alrededor de 6-20 minutos, en promedio alrededor de 12-14 minutos, es decir, alrededor de 1,2, 3, 4, o 5 minutos, más generalmente alrededor de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 minutos, en algunos casos 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o hasta alrededor de 30 minutos. Un período de tiempo más largo para completar la citocinesis 1 en el embrión que se está evaluando en comparación con el observado para un embrión de referencia normal es indicativo de un potencial de desarrollo deficiente. Como segundo ejemplo descrito aquí, el ciclo celular 1 en un embrión normal, es decir, desde el momento de la fertilización hasta la finalización de la citocinesis 1, se completa típicamente en alrededor de 20-27 horas, más generalmente en alrededor de 25-27 horas, es decir, alrededor de 15, 16, 17, 18 o 19 horas, más normalmente alrededor de 20, 21, 22, 23 o 24 horas, y más normalmente alrededor de 25, 26 o 27 horas. Un ciclo celular 1 que es más largo en el embrión que se está evaluando en comparación con el observado para un embrión de referencia normal es indicativo de un potencial de desarrollo deficiente. Como tercer ejemplo descrito aquí, la resolución de la citocinesis 1 y el inicio de la citocinesis 2 en embriones humanos normales es de alrededor de 8-15 horas, más a menudo de alrededor de 9-13 horas, con un valor medio de alrededor de 11 /- 2,1 horas; es decir, 6, 7 u 8 horas, más habitualmente alrededor de 9, 10, 11, 12, 13, 14 o hasta alrededor de 15 horas. Un ciclo celular 2 más largo o más corto en el embrión que se está evaluando en comparación con el observado para un embrión de referencia normal es indicativo de un potencial de desarrollo deficiente. Como cuarto ejemplo descrito aquí, el intervalo de tiempo entre el inicio de la citocinesis 2 y el inicio de la citocinesis 3, es decir, la sincronicidad de la segunda y tercera mitosis, en embriones humanos normales es normalmente de alrededor de 0-5 horas, más generalmente de alrededor de 0, 1, 2 o 3 horas, con un tiempo medio de alrededor de 1 /- 1,6 horas; un intervalo más largo entre la finalización de la citocinesis 2 y la citocinesis 3 en el embrión que se evalúa en comparación con el observado en un embrión de referencia normal es indicativo de un potencial de desarrollo deficiente. Finalmente, como un ejemplo descrito aquí de cómo se puede aplicar esta realización cuando se utilizan niveles de expresión génica como parámetros para evaluar el potencial de desarrollo, niveles de expresión más bajos de Cofilina, DIAPH1, ECT2, MYLC2, DG-CR8, Dicer, TARBP2, CPEB1, Simplekina, YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2, BTF3 y/o NELF, es decir, una expresión 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, o 100 veces menor, en embriones de 2 células que se evalúan en comparación con la observada para un embrión de 2 células de referencia normal es indicativa de un potencial de desarrollo deficiente, mientras que una expresión que es igual o mayor que la observada para un embrión de 2 células de referencia normal es indicativa de un buen potencial de desarrollo. Otros ejemplos pueden derivarse de datos empíricos, por ejemplo observando uno o más embriones de células pluripotentes referencia o junto con el embrión/célula pluripotente que se va a evaluar. Puede emplearse cualquier embrión/célula pluripotente de referencia, por ejemplo una muestra de referencia normal con buen potencial de desarrollo, o una muestra de referencia anormal con un potencial de desarrollo deficiente. En algunos casos, se puede emplear más de una muestra de referencia, por ejemplo se pueden utilizar tanto una muestra de referencia normal como una muestra de referencia anormal.
En algunas realizaciones descritas aquí, puede ser deseable utilizar medidas de parámetros celulares a las que se llega mediante microscopía de lapso de tiempo o mediante perfil de expresión, pero no mediante microscopía de lapso de tiempo y perfil de expresión. En otras realizaciones, puede ser deseable utilizar medidas de parámetros celulares a las que se llega mediante microscopía de lapso de tiempo, así como medidas de parámetros celulares a las que se llega mediante perfiles de expresión.
Una medida de un solo parámetro puede ser suficiente para llegar a una determinación del potencial de desarrollo. En algunas realizaciones, puede ser deseable emplear medidas de más de un parámetro, por ejemplo 2 parámetros celulares, 3 parámetros celulares, o 4 o más parámetros celulares.
En determinadas realizaciones, puede ser deseable analizar múltiples parámetros, ya que analizar múltiples parámetros puede proporcionar una mayor sensibilidad y especificidad. Por sensibilidad se entiende la proporción de positivos reales que se identifican correctamente como tales. Esto se puede representar matemáticamente como: (Número de verdaderos positivos)
Sensibilidad =
(Número de verdaderos positivos Número de falsos negativos)
Así, en un método en el que “positivos” son los embriones que tienen un buen potencial de desarrollo, es decir, que se convertirán en blastocistos, y “negativos” son los embriones que tienen un potencial de desarrollo deficiente, es decir, que no se convertirán en blastocistos, una sensibilidad de 100% significa que el ensayo reconoce todos los embriones que se convertirán en blastocistos como tales. En algunas realizaciones, la sensibilidad del ensayo puede ser alrededor de 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o más, por ejemplo 100%. Por especificidad se entiende la proporción de negativos que se identifican correctamente como tales. Esto se puede representar matemáticamente como
(Número de verdaderos positivos)
Especificidad =
(Número de verdaderos negativos Número de falsos positivos)
Así, en un método en el que los positivos son los embriones que tienen buen potencial de desarrollo, es decir, que se convertirán en blastocistos, y los negativos son los embriones que tienen potencial de desarrollo deficiente, es decir, que no se convertirán en blastocistos, una especificidad del 100% significa que el ensayo reconoce todos los embriones que no se convertirán en blastocistos, es decir, se detendrán antes de la etapa de blastocisto, como tales. En algunas realizaciones, la especificidad del ensayo puede ser alrededor de 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o más, por ejemplo 100%.
Como se demuestra en las secciones de ejemplos a continuación y en la figura 7, el uso de tres parámetros proporciona una sensibilidad del 94% y una especificidad del 93% con un punto de corte de 3 veces las desviaciones estándar de la distribución de blastocistos. En otras palabras, los métodos de la invención son capaces de identificar correctamente el número de embriones que se van a convertir en blastocistos el 94% del tiempo (sensibilidad), y el número de embriones que se van a detener antes de la etapa de blastocisto el 93% del tiempo (especificidad). Además, los valores medios especificados y/o los puntos de corte pueden modificarse según el conjunto de datos utilizado para calcular estos valores, así como la aplicación específica.
En algunas realizaciones, la evaluación de un embrión incluye la generación de un informe escrito que incluye la evaluación del experto del embrión en cuestión, por ejemplo una “evaluación del potencial de desarrollo”, una “evaluación de anomalías cromosómicas”, etc. De este modo, un método objeto puede incluir además una etapa de generar o elaborar un informe que proporcione los resultados de dicha evaluación, informe el cual se puede proporcionar en forma de un medio electrónico (por ejemplo, una pantalla electrónica en un monitor de ordenador), o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible).
Un “ informe”, como se describe aquí, es un documento electrónico o tangible que incluye elementos de informe que proporcionan información de interés relacionada con una evaluación a la que se llegó mediante los métodos de la invención. Un informe objeto puede generarse total o parcialmente de forma electrónica. Un informe en cuestión incluye al menos una evaluación del potencial de desarrollo del embrión o célula pluripotente en cuestión, una evaluación de la probabilidad de existencia de anomalías cromosómicas, etc. Un informe en cuestión puede incluir además uno o más de: 1) información sobre la instalación de ensayo; 2) información del proveedor de servicios; 3) datos del sujeto; 4) datos de muestra; 5) una sección de informe de evaluación detallada, que proporciona información relativa a cómo se llegó a la evaluación, por ejemplo a) medidas de parámetros celulares tomadas, b) valores de referencia empleados, si los hubiera; y 6) otras características.
El informe puede incluir información sobre la instalación de ensayos, la cual es relevante para el hospital, clínica o laboratorio en el que se llevó a cabo la recolección de muestras y/o la generación de datos. La recopilación de muestras puede incluir cómo se generó la muestra, por ejemplo cómo se extrajo de un sujeto y/o cómo se cultivó, etc. La generación de datos puede incluir cómo se adquirieron las imágenes o se analizaron los perfiles de expresión génica. Esta información puede incluir uno o más detalles relacionados con, por ejemplo, el nombre y la ubicación de la instalación de ensayo, la identidad del técnico de laboratorio que realizó el ensayo y/o que ingresó los datos de entrada, la fecha y hora en las que se realizó el ensayo y/o se analizó, la ubicación en la que se almacenan la muestra y/o los datos del resultado, el número de lote de los reactivos (por ejemplo, kit, etc.) usados en el ensayo, y similares. Los campos del informe con esta información generalmente se pueden completar con la información proporcionada por el usuario.
El informe puede incluir información sobre el proveedor de servicios, que puede estar ubicado fuera del centro sanitario en el que se encuentra el usuario, o dentro del centro sanitario. Ejemplos de dicha información pueden incluir el nombre y la ubicación del proveedor de servicios, el nombre del revisor, y, cuando sea necesario o deseado, el nombre de la persona que llevó a cabo la preparación de la muestra y/o la generación de datos. Los campos del informe con esta información generalmente se pueden completar con los datos ingresados por el usuario, que se pueden seleccionar entre las selecciones preestablecidas (por ejemplo, usando un menú desplegable). Otra información del proveedor de servicios en el informe puede incluir información de contacto para obtener información técnica sobre el resultado y/o sobre el informe interpretativo.
El informe puede incluir una sección de datos del sujeto, incluyendo el historial médico de los sujetos de los que se extrajeron los ovocitos, la edad del paciente, las características del ciclo de fecundación in vitro (por ejemplo, tasa de fertilización, nivel de hormona estimulante del folículo (FSH) del día 3), y, cuando los ovocitos se recolectan, los parámetros de la cohorte de cigotos/embriones (por ejemplo, el número total de embriones). Estos datos del sujeto pueden integrarse para mejorar la evaluación de los embriones y/o ayudar a determinar el número óptimo de embriones a transferir. El informe también puede incluir datos administrativos del sujeto (es decir, datos que no son esenciales para la evaluación del potencial de desarrollo) tal como información para identificar al sujeto (por ejemplo, nombre, fecha de nacimiento del sujeto (DOB), género, correo y/o dirección de residencia, número de historia clínica (NHC), número de habitación y/o de cama en un centro de atención médica, información del seguro, y similares), el nombre del médico del sujeto u otro profesional de la salud que ordenó la evaluación del potencial de desarrollo, y, si es diferente del médico que ordena, el nombre de un médico del personal que es responsable de la atención del sujeto (por ejemplo, médico de atención primaria).
El informe puede incluir una sección de datos de muestra, que puede proporcionar información sobre la muestra biológica analizada en la evaluación, tal como el tipo de muestra (embrión), cómo se manipuló la muestra (por ejemplo, temperatura de almacenamiento, protocolos preparatorios), y la fecha y hora en que se recogió. Los campos del informe con esta información generalmente se pueden completar con los datos ingresados por el usuario, algunos de los cuales pueden proporcionarse como selecciones preestablecidas (por ejemplo, usando un menú desplegable).
El informe puede incluir una sección de informe de evaluación, que puede incluir información relativa a cómo se llegó a las evaluaciones/determinaciones como se describe aquí. El informe interpretativo puede incluir, por ejemplo, imágenes de lapso de tiempo del embrión que se está evaluando, y opcionalmente resultados de expresión génica. La parte de evaluación del informe también puede incluir opcionalmente una sección de recomendaciones. Por ejemplo, cuando los resultados indican un buen potencial de desarrollo de un embrión, la recomendación puede incluir una recomendación de que se trasplante un número limitado de embriones al útero durante el tratamiento de fertilidad como se recomienda en la técnica.
También se apreciará fácilmente que los informes pueden incluir elementos adicionales o elementos modificados. Por ejemplo, cuando es electrónico, el informe puede contener hipervínculos que apuntan a bases de datos internas o externas que proporcionan información más detallada sobre los elementos seleccionados del informe. Por ejemplo, el elemento de datos del paciente del informe puede incluir un hipervínculo a un registro electrónico del paciente, o un sitio para acceder a dicho registro del paciente, registro del paciente el cual se mantiene en una base de datos confidencial. Esta última realización puede ser de interés en un sistema hospitalario o en un entorno clínico. Cuando está en formato electrónico, el informe se graba en un medio físico adecuado, tal como un medio legible por ordenador, por ejemplo en una memoria de ordenador, unidad zip, CD, DVD, etc.
Se apreciará fácilmente que el informe puede incluir todos o algunos de los elementos anteriores, con la condición de que el informe generalmente incluya al menos los elementos suficientes para proporcionar el análisis solicitado por el usuario (por ejemplo, una evaluación del potencial de desarrollo).
Utilidad
Como se discutió anteriormente, los métodos de la invención se pueden usar para evaluar embriones para determinar su potencial de desarrollo. Esta determinación del potencial de desarrollo se puede utilizar para orientar las decisiones y/o acciones clínicas. Por ejemplo, para aumentar las tasas de embarazo, los médicos a menudo transfieren múltiples embriones a las pacientes, lo que puede potencialmente dar como resultado embarazos múltiples que presentan riesgos para la salud tanto de la madre como de los fetos. Utilizando los resultados obtenidos de los métodos de la invención, el potencial de desarrollo de los embriones que se transfieren para convertirse en fetos se determina antes del trasplante, lo que permite al médico decidir cuántos embriones transferir para maximizar las posibilidades de éxito de un embarazo a término minimizando el riesgo.
Las evaluaciones realizadas mediante los siguientes métodos de la invención también pueden resultar útiles para clasificar embriones en un grupo de embriones en función de su potencial de desarrollo. Por ejemplo, en algunos casos, múltiples embriones pueden ser capaces de convertirse en blastocistos, es decir, tendrán un buen potencial de desarrollo. Sin embargo, algunos embriones tendrán más probabilidades de alcanzar la etapa de blastocistos o un blastocisto de mayor calidad que otros, es decir, tendrán un mejor potencial de desarrollo que otros embriones. En tales casos, los métodos de la invención pueden usarse para clasificar los embriones en el grupo. En tales métodos, se miden uno o más parámetros celulares para cada embrión para llegar a una medida de parámetros celulares para cada embrión. Las una o más medidas de los parámetros celulares de cada uno de los embriones se emplean entonces para determinar el potencial de desarrollo de los embriones entre sí. En algunas realizaciones, las medidas de los parámetros celulares de cada uno de los embriones se emplean comparándolos directamente entre sí para determinar el potencial de desarrollo de los embriones. En algunas realizaciones, las medidas de los parámetros celulares de cada uno de los embriones se emplean comparando las medidas de los parámetros celulares con una medida de los parámetros celulares de un embrión de referencia para determinar los potenciales de desarrollo de cada embrión, y comparando entonces los potenciales de desarrollo determinados para cada embrión para determinar el potencial de desarrollo de los embriones entre sí. De esta manera, un médico que evalúa, por ejemplo, múltiples cigotos/embriones, puede escoger solo los embriones de mejor calidad, es decir, aquellos con el mejor potencial de desarrollo, para transferirlos a fin de maximizar las posibilidades de éxito de un embarazo a término y minimizar el riesgo.
Las evaluaciones realizadas siguiendo los métodos descritos aquí también pueden resultar útiles para determinar el potencial de desarrollo de ovocitos que maduran in vitro y de células madre que se cultivan in vitro. La información sobre el potencial de desarrollo de los ovocitos obtenida mediante los métodos de la invención puede orientar la selección de los ovocitos para fertilizar por parte del médico, dando como resultado una mayor probabilidad de éxito en la obtención de blastocistos a partir de estos ovocitos. Del mismo modo, la información sobre el potencial de desarrollo de las células madre puede informar la selección de las células madre por parte del médico para utilizar en los procedimientos, por ejemplo reconstituir o reemplazar un tejido in vivo en un sujeto que lo necesite.
Reactivos, dispositivos y kits
También se describen reactivos, dispositivos y kits de los mismos para practicar uno o más de los métodos descritos anteriormente. Los reactivos, dispositivos y kits de los mismos en cuestión pueden variar mucho. Los reactivos y dispositivos de interés incluyen los mencionados anteriormente con respecto a los métodos de medida de cualquiera de los parámetros celulares antes mencionados, en los que dichos reactivos pueden incluir placas de cultivo, medios de cultivo, microscopios, software formación de imágenes, software de análisis de formación de imágenes, cebadores de ácidos nucleicos, matrices de sondas de ácidos nucleicos, anticuerpos, reactivos del sistema productor de señales, etc., dependiendo del protocolo de medida particular a realizar. Por ejemplo, los reactivos pueden incluir cebadores de PCR que son específicos para uno o más de los genes Cofilina, DIAPH1, ECT2, MYLC2/MYL5, DGCR8, Dicer/DICER1, TARBP2, CPEB1, Simplekina/SYMPK, YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2/IFNGR2, BTF3, y NELF, como se describió anteriormente. Otros ejemplos de reactivos incluyen matrices que comprenden sondas que son específicas para uno o más de los genes de interés, o anticuerpos para las proteínas codificadas por estos genes de interés.
Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión incluirán además instrucciones para practicar los métodos en cuestión. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits en cuestión en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo una hoja u hojas de papel en las que está impresa la información, en el envase del kit, en un prospecto, etc. Aún otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo disquete, CD, etc., en el que se ha grabado la información. Aún otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio eliminado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Formación de imágenes de células automatizada con una matriz de microscopio
Algunos de los métodos descritos anteriormente requieren la capacidad de observar el desarrollo del embrión mediante formación de imágenes de lapso de tiempo. Esto se puede lograr utilizando un sistema compuesto por una matriz de microscopios multicanal en miniatura que puede caber dentro de una incubadora estándar. Esto permite obtener imágenes de múltiples muestras de forma rápida y simultánea sin tener que mover físicamente las placas. Un prototipo ilustrativo, que se muestra en la Fig. 22, consiste en una matriz de microscopios de 3 canales con iluminación de campo oscuro, aunque podrían usarse otros tipos de iluminación. Por “tres canales” se entiende que hay tres microscopios independientes que toman imágenes de tres placas de cultivo distintas simultáneamente. Se utiliza un motor de pasos para ajustar la posición focal para enfocar o adquirir pilas de imágenes 3D. Los LED de luz blanca se utilizan para la iluminación, aunque hemos observado que para los embriones humanos, el uso de LED rojos o infrarrojos cercanos (IR) puede mejorar la relación de contraste entre las membranas celulares y las partes internas de las células. Esta relación de contraste mejorada puede ayudar con el análisis de imágenes tanto manual como automatizado. Además, moverse a la región infrarroja puede reducir la fototoxicidad de las muestras. Las imágenes se capturan con cámaras web de alta resolución y bajo coste, pero se pueden usar otros tipos de cámaras.
Como se muestra en la Fig. 22, cada microscopio del sistema prototipo descrito anteriormente se usa para obtener imágenes de una placa de cultivo que puede contener entre 1 y 30 embriones. El microscopio recoge la luz de un LED de luz blanca conectado a un disipador de calor para ayudar a disipar el calor generado por el LED, que es muy pequeño para tiempos de exposición breves. La luz pasa a través de un parche de campo oscuro convencional para detener la luz directa, a través de una lente condensadora y sobre una muestra etiquetada como “placa de Petri”, que es una placa de cultivo que contiene los embriones que se cultivan y estudian. La placa de cultivo puede tener pocillos que ayuden a mantener el orden de los embriones y mantenerlos inmóviles mientras se lleva la placa hacia y desde la incubadora. Los pocillos se pueden espaciar lo suficientemente cerca para que los embriones puedan compartir la misma gota de medio. Después, la luz dispersa se hace pasar a través de un objetivo de microscopio, después a través de un doblete acromático, y sobre un sensor CMOS. El sensor CMOS actúa como una cámara digital, y está conectado a un ordenador para el análisis y rastreo de imágenes como se describe anteriormente.
Este diseño es fácilmente escalable para proporcionar significativamente más canales y diferentes técnicas de iluminación, y puede modificarse para adaptarse a dispositivos fluídicos para alimentar las muestras. Además, el diseño se puede integrar con un sistema de control de retroalimentación, en el que las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el CO2 (para controlar el pH) y los medios se optimizan en tiempo real en función de la retroalimentación y de los datos de formación de imágenes. Este sistema se utilizó para adquirir videos de lapso de tiempo del desarrollo de embriones humanos, que tiene utilidad para determinar la viabilidad del embrión para procedimientos de fecundación in vitro (FIV). Otras aplicaciones incluyen la terapia con células madre, el cribado de fármacos, y la ingeniería de tejidos.
En una realización del dispositivo, la iluminación la proporciona un diodo emisor de luz blanca (LED) Luxeon montado en un disipador de calor de aluminio y alimentado por un controlador regulado por corriente BuckPuck. La luz del LED se hace pasar a través de una lente colimadora. La luz colimada se hace pasar entonces a través de un tope de parche mecanizado con láser personalizado, como se muestra en la Fig. 22, y se enfoca en un cono hueco de luz usando una lente condensadora asférica. La luz que se transmite directamente a través de la muestra es rechazada por el objetivo, mientras que la luz que es dispersada por la muestra es recogida. En una realización, se utilizan objetivos Olympus con aumento de 20X, aunque se pueden usar aumentos más pequeños para aumentar el campo de visión, o se pueden usar aumentos más grandes para aumentar la resolución. Después, la luz recogida se hace pasar a través de una lente doble acromática (es decir, una lente de tubo) para reducir los efectos de la aberración cromática y esférica. Alternativamente, la luz recogida del objetivo de formación de imágenes puede hacerse pasar a través de otro objetivo, apuntado en la dirección opuesta, que actúa como reemplazo de la lente del tubo. En una configuración, el objetivo de la formación de imágenes puede ser un objetivo de 10X, mientras que el objetivo de lente de tubo puede ser un objetivo de 4X. La imagen resultante es capturada por un sensor CMOS con una resolución de 2 megapíxeles (1600 x 1200 píxeles). También se pueden utilizar diferentes tipos de sensores y resoluciones.
La Fig. 23A muestra una fotografía de la matriz de microscopios multicanal, que tiene 3 microscopios idénticos. Todos los componentes ópticos están montados en tubos de lentes. En el funcionamiento del sistema de matriz, las placas de Petri se cargan en plataformas acrílicas que se montan en etapas de inclinación manual de 2 ejes, que permiten el ajuste del plano de la imagen con respecto al eje óptico. Estas etapas están fijadas a la base del microscopio y no se mueven después de la alineación inicial. Los módulos de iluminación, que consisten en los LED, lentes colimadoras, topes de parches, y lentes condensadoras, están montados en etapas xyz manuales para posicionar y enfocar la luz de iluminación. Los módulos de la formación de imágenes, que consisten en los objetivos, lentes acromáticos y sensores CMOS, también están montados en etapas xyz manuales para posicionar el campo de visión y enfocar los objetivos. Los 3 módulos de la formación de imágenes están conectados a guías lineales y soportados por un solo brazo de palanca, que se acciona mediante un motor de pasos. Esto permite el enfoque controlado por ordenador y la captura automática de pilas de imágenes. Se pueden utilizar otros métodos de enfoque y actuación automáticos.
La matriz de microscopios se colocó dentro de una incubadora estándar, como se muestra en la Fig. 23B. Los sensores de imagen CMOS están conectados a través de una conexión USB a un solo puerto ubicado dentro de la incubadora, que se enruta a un PC externo junto con otras líneas de comunicación y energía. Todos los cables eléctricos salen de la incubadora por el centro de un tapón de caucho sellado con pegamento de silicona.
La matriz de microscopios descrita anteriormente se utilizó para registrar imágenes de lapso de tiempo del desarrollo temprano del embrión humano y el crecimiento documentado desde las etapas de cigoto hasta blastocisto. Cuatro experimentos diferentes monitorizaron un total de 242 embriones. De este grupo, se obtuvieron imágenes de 100 hasta el día 5 o 6; los otros fueron retirados de las estaciones de formación de imágenes en diversos puntos de tiempo para el análisis de expresión génica. En la Fig. 24 se muestra una captura de pantalla del software de captura de imágenes y los embriones fotografiados. Las imágenes se capturaron cada 5 minutos con apenas 1 segundo de exposición a poca luz por imagen. La cantidad total de luz recibida por las muestras fue equivalente a 24 minutos de exposición continua, similar al nivel total experimentado en una clínica de FIV durante la manipulación. Se puede reducir la duración de 1 segundo de exposición a la luz por imagen. Antes de trabajar con los embriones humanos, realizamos extensos experimentos de control con embriones de preimplantación de ratón para asegurarnos de que tanto la tasa de formación de blastocistos como los patrones de expresión génica no se vieran afectados por el procedimiento de formación de imágenes.
Las Figs. 25 y 26 muestran imágenes seleccionadas de las secuencias de lapso de tiempo. Se muestran imágenes para el día 1, día 2,5, día 4 y día 5,5. Para la secuencia mostrada en la Fig. 25, 3 de los 9 embriones se desarrollaron en blastocistos, y para la secuencia mostrada en la Fig. 26, 5 de los 12 embriones se desarrollaron en blastocistos. Se siguió a los embriones individuales a lo largo del tiempo, a pesar de que sus posiciones en el campo fotográfico cambiaron a medida que los embriones experimentaron un cambio de medio el día 3. El uso de medios secuenciales es necesario para cumplir con los requisitos específicos de la etapa de los embriones en desarrollo. Durante el cambio de medio, los embriones se retiraron de la estación de formación de imágenes durante unos minutos y se transfirieron a nuevas placas de Petri. Con el fin de rastrear la identidad de cada embrión durante el cambio de medio, se grabó en video la transferencia de muestras de una placa a otra para verificar que los embriones no estuvieran mezclados. Este procedimiento también se utilizó durante la recogida de muestras para el análisis de expresión génica. El problema de rastrear la identidad de los embriones se puede mitigar utilizando pocillos para ayudar a organizar los embriones en un orden particular.
Placa de Petri con micropocillos
Al transferir las placas de Petri entre diferentes estaciones, los embriones a veces pueden moverse, lo que dificulta así rastrear la identidad del embrión. Esto plantea un desafío cuando la formación de imágenes de lapso de tiempo se realiza en una estación, y los embriones se mueven posteriormente a una segunda estación para la selección y transferencia de embriones. Un método consiste en cultivar embriones en placas de Petri individuales. Sin embargo, esto requiere que cada embrión tenga su propia gota de medio. En un procedimiento típico de FIV, generalmente es deseable cultivar todos los embriones de un paciente en la misma placa de Petri y en la misma gota de medio. Para abordar este problema, hemos diseñado una placa de Petri personalizada con micropocillos. Esto evita que los embriones se muevan y mantiene su disposición en la placa de Petri cuando se transfieren hacia y desde la incubadora 0 las estaciones de formación de imágenes. Además, los pocillos son lo suficientemente pequeños y están muy cerca unos de otros de modo que puedan compartir la misma gota de medio y todos puedan visualizarse simultáneamente con el mismo microscopio. La superficie inferior de cada micropocillo tiene un acabado de calidad óptica. La Fig. 27A muestra un dibujo con dimensiones para una realización. En esta versión, hay 25 micropocillos espaciados muy cerca entre sí dentro de un campo de visión de 1,7 x 1,7 mm. La Fig. 27B muestra una vista en 3D de los micropocillos, que están empotrados alrededor de 100 micrones en la superficie de la placa. En la placa se incluyen marcadores fiduciales, que incluyen letras, números, y otras marcas, para ayudar con la identificación.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos normales en la técnica una divulgación y descripción de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni están destinados a representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderal, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es igual o cercana a la atmosférica.
Fuente de muestra
Todos los embriones utilizados en este estudio fueron recolectados durante un período de varios años y fertilizados y criopreservados por múltiples embriólogos. El número medio de embriones por paciente en nuestro estudio fue 3, y se incluyeron todos los grupos de edad encontrados en un centro de FIV de rutina. En particular, todos los embriones utilizados para estos experimentos fueron generados por FIV (a diferencia de ICSI), por lo que los embriones derivaron de espermatozoides que tenían una función relativamente normal (al menos en términos de su capacidad para penetrar el cúmulo, la zona y el oolema, y formar un pronúcleo). Los protocolos de estimulación eran protocolos estándar de lupron largo (cdc.gov/art). La crioconservación de embriones humanos supernumerarios se logró colocándolos en medio de congelación (1,2propanodiol 1,5 M sacarosa 0,2 M) durante 25 minutos a temperatura ambiente (22 2°C). Después, los embriones se congelaron usando un protocolo de congelación lenta (-1°C/min hasta -6,5°C; mantener durante 5 min; sembrar; mantener durante 5 min; -0,5°C/min hasta -80°C; sumergir en nitrógeno líquido). Comité. No se pudo asociar ninguna información de salud protegida con los embriones.
Se validó un gran conjunto de embriones criopreservados, y se hicieron las siguientes observaciones: 1) Los embriones demostraron un tiempo indicativo del desarrollo normal del embrión en términos de puntos de referencia que incluyen: Escisión en 2 células (ocurrió temprano el Día 2), inicio de la degradación del ARN (ocurrió en los Días 1 a 3), escisión en 4 y 8 células (ocurrió al final del Día 2 y Día 3, respectivamente), activación del genoma embrionario (en el Día 3 en la etapa de 8 células), y formación de la mórula y el blastocisto (ocurrió en los Días 4 y 5, respectivamente). 2) Los embriones demostraron una eficiencia para alcanzar la etapa de blastocisto que es típica de los embriones obtenidos en un entorno clínico. Esto probablemente se deba al hecho de que los embriones se criopreservaron en la etapa 2PN y representaron la matriz de embriones encontrados en una clínica de FIV, ya que no se realizó un “triaje” de los que se desarrollarían y no se desarrollarían antes de la criopreservación en la etapa de 1 célula (como es típico de los embriones criopreservados más tarde en el desarrollo en el Día 3 o etapas de blastocisto). De este modo, nuestros datos confirman que estos embriones exhibieron tasas de formación de blastocistos similares en comparación con las observadas en las clínicas típicas de FIV. 3) Estudios anteriores han demostrado que los embriones que se congelan en la etapa 2PN exhiben un potencial similar para el desarrollo, implantación, embarazo clínico y parto en comparación con los embriones recientes. Otros estudios también han mostrado resultados similares para los ovocitos congelados, lo que sugiere que los primeros eventos del desarrollo del embrión humano mantienen una línea de tiempo apropiada después de la criopreservación. 4) Nos enfocamos en parámetros que no dependían del tiempo de fertilización o descongelamiento. El primer parámetro que medimos (duración de la primera citocinesis) es de corta duración (aprox. 10-15 min) y no depende del tiempo de fertilización en este estudio (se puede medir de forma independiente en todos los embriones independientemente del resultado final). Además, todos los parámetros posteriores se miden con respecto a este punto de medida inicial y se comparan entre los embriones que logran convertirse en blastocisto y los que no lo logran. 5) Finalmente, observamos que se sabe que los embriones recientes (no congelados) que son 3PN se desarrollan en el mismo período de tiempo que los embriones normales recientes; comparamos los parámetros en embriones 3PN recientes que obtuvimos de la clínica de FIV de Stanford, y observamos que no eran diferentes de los de nuestros embriones criopreservados o informes publicados.
Plan experimental
En cuatro conjuntos experimentales, rastreamos el desarrollo de 242 embriones en etapa pronuclear (61, 80, 64 y 37, respectivamente). En cada conjunto de experimentos, se descongelaron cigotos humanos el Día 1 y se cultivaron en pequeños grupos en múltiples placas. Cada placa se observó de forma independiente con microscopía de lapso de tiempo bajo iluminación de campo oscuro en distintas estaciones de formación de imágenes. A intervalos de aproximadamente 24 horas, se retiró una placa de embriones del sistema de formación de imágenes, y se recogió como embriones individuales o células individuales (blastómeros) para un análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real de alto rendimiento. Cada placa contenía típicamente una mezcla de embriones que alcanzaron la etapa de desarrollo esperada en el momento de la cosecha (denominados “normales”) y los que se detuvieron o retrasaron en etapas de desarrollo anteriores, o se fragmentaron extensamente (denominados “anormales”). Los embriones se analizaron como embriones intactos individuales o se disociaron en blastómeros individuales seguidos de amplificación de ARN específico de gen. Se obtuvieron imágenes de un subconjunto de embriones (100 de 242) hasta el Día 5 o 6 para monitorizar la formación de blastocistos.
Microscopía y cultivo de embriones humanos
Los embriones humanos se descongelaron retirando los crioviales del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido y colocándolos a temperatura ambiente. Una vez descongelado un vial, se abrió, y los embriones se visualizaron bajo un microscopio de disección. A continuación, se vertió el contenido del vial en el fondo de una placa de cultivo 3003. Los embriones se localizaron en la gota, y se evaluó y registró la supervivencia de cada embrión. A temperatura ambiente, los embriones se transfirieron a una placa de cultivo 3037 que contenía 1,2 propanodiol 1,0 M sacarosa 0,2 M durante 5 minutos, después 1,2 propanodiol 0,5 M sacarosa 0,2 M durante 5 minutos, y 1,2 propanodiol 0,0 M sacarosa 0,2 M durante 5 minutos. Posteriormente, los embriones se cultivaron en el medio Quinn's Advantage Cleavage Medium (CooperSurgical) suplementado 10% de un sustituto de proteína sérica Quinn's Advantage Serum Protein Substitute (SPS; CooperSurgical) entre el Día 1 y 3, y el medio Quinn's Advantage Blastocyst Medium (CooperSurgical) con un 10% de SPS después del Día 3, usando microgotas en aceite. Todos los experimentos utilizaron el mismo tipo de medio de etapa de escisión, excepto dos estaciones durante el primer experimento, que utilizaron un medio Global (LifeGlobal, Guilford, CT). En este pequeño subconjunto (12 embriones), los embriones exhibieron una tasa de formación de blastocistos ligeramente más baja (3 de 12, o 25%), pero la sensibilidad y la especificidad de nuestros parámetros predictivos fueron ambos 100% para este grupo.
Se llevó a cabo la formación de imágenes de lapso de tiempo en múltiples sistemas para acomodar el análisis concurrente de múltiples muestras, así como para validar la consistencia de los datos en diferentes plataformas. Los sistemas consistían en 7 microscopios individuales: (1) dos microscopios Olympus IX-70/71 modificados equipados con platinas calefactadas Tokai Hit, LED Luxeon de luz blanca, y una abertura para iluminación de campo oscuro; (2) dos microscopios Olympus CKX-40/41 modificados equipados con platinas calefactadas, LED Luxeon de luz blanca, e iluminación de contraste de modulación Hoffman (nota: estos sistemas se usaron solo durante el primero de 4 experimentos después de que se decidió que la iluminación de campo oscuro era preferible para medir los parámetros); y (3) un conjunto de microscopios en miniatura de 3 canales construido a medida que cabe dentro de una incubadora estándar, equipado con LED Luxeon de luz blanca y aberturas para iluminación de campo oscuro. No observamos diferencias significativas en el comportamiento de desarrollo, la tasa de formación de blastocistos o los perfiles de expresión génica entre los embriones cultivados en estos diferentes sistemas; de hecho, nuestros parámetros para la predicción de blastocistos fueron consistentes a lo largo de múltiples sistemas y experimentos.
La intensidad de la luz para todos los sistemas fue significativamente más baja que la luz que se usa normalmente en un microscopio de reproducción asistida debido a la baja potencia de los LED (con respecto a una bombilla halógena típica de 100 W) y la alta sensibilidad de los sensores de la cámara. Utilizando un medidor de potencia óptica, determinamos que la potencia de un microscopio de reproducción asistida típico (Olympus IX-71 Hoffman Modulation Contrast) a una longitud de onda de 473 nm oscila de desde apenas 7 a 10 mW dependiendo del aumento, mientras que la potencia de nuestros sistemas de formación de imágenes medida estaba entre 0,2 y 0,3 mW a la misma longitud de onda. Las imágenes se capturaron en un tiempo de exposición de 1 segundo cada 5 minutos durante un máximo de 5 o 6 días, lo que dio como resultado aproximadamente 24 minutos de exposición continua a la luz. A una potencia de 0,3 mW, esto equivale a apenas 1 minuto de exposición bajo un microscopio de reproducción asistida típico.
Para rastrear la identidad de cada embrión durante el experimento de expresión génica y de formación de imágenes correlacionado, instalamos una cámara de vídeo en el estereomicroscopio y registramos el procedimiento de transferencia de muestras durante el cambio de medios y la recolección de muestras. Realizamos experimentos de control con embriones de preimplantación de ratón (n = 56) y un pequeño subconjunto de embriones humanos (n = 22), y no observamos diferencias significativas (p = 0,96) en la tasa de formación de blastocitos entre los embriones de control y los embriones fotografiados.
Análisis de qRT-PCR de alto rendimiento
Para el análisis mediante qRT-PCR de un solo embrión o de un solo blastómero, los embriones se trataron primero con una disolución ácida de Tyrode, para eliminar la zona pelúcida. Para recolectar blastómeros individuales, los embriones se incubaron en medio Quinn's Advantage libre de Ca2+ Mg2+ con HEPES (CooperSurgical) durante 5 a 20 minutos a 37°C con pipeteo riguroso. Las muestras se recogieron directamente en 10 pl de amortiguador de reacción; la reacción posterior de transcripción inversa/preamplificación de una etapa se realizó como se describió anteriormente. La mezcla de cebadores y sondas reunidos de qRT-PCR de ensayo según demanda ABI 20X (Applied Biosystems) se utilizó como cebadores específicos de genes durante las reacciones de transcripción inversa y preamplificación. Las reacciones de qRT-PCR de alto rendimiento se realizaron con FluidigmBiomark 96.96 Dynamic Arrays como se describió anteriormente utilizando las sondas de qRT-PCR de ensayo bajo demanda ABI. Todas las muestras se cargaron en 3 o 4 réplicas técnicas. El análisis de datos de qRT-PCR se realizó con qBasePlus (Biogazelle), Microsoft Excel, y un software personalizado. Ciertos genes se omitieron del análisis de datos debido a una mala calidad de los datos (por ejemplo, curvas de amplificación de PCR deficientes) o una expresión baja o nula constante en los embriones evaluados. Para el análisis de la edad de los blastómeros, el panel de transcritos maternos utilizado incluye DAZL, GDF3, IFITM1, STELLAR, SYCP3, VASA, GDF9, PDCD5, ZAR1 y ZP1, mientras que el panel de genes embrionarios incluye ATF7IP, CCNA1, EIF1AX, EIF4A3, H2AFZ, HSP70.1, JARID1B, LSM3, PABPC1, y SERTAD1. El valor de expresión de cada gen con respecto a los genes de referencia GAPDH y RPLPO, así como con respecto al promedio de genes, se calculó utilizando los métodos geNorm y AACt. GAPDH y RPLPO se seleccionaron como genes de referencia para este estudio empíricamente en base al valor de estabilidad genética y el coeficiente de variación: 1,18 y 46% para GAPDH, y 1,18 y 34% para RPLPO. Estos fueron los más estables entre los 10 genes constitutivos que ensayamos y dentro del intervalo de un conjunto de muestras heterogéneas típico. En segundo lugar, observamos que en blastómeros individuales, como se esperaba, la cantidad de transcritos de RPLPO y GAPDH disminuyó en aproximadamente 1 valor de Ct por división entre la etapa de 1 célula y 8 células, congruente con las expectativas de que cada célula hereda aproximadamente la mitad del conjunto de ARNm con cada división de escisión, en ausencia de nuevos transcritos antes de EGA durante los primeros 3 días del desarrollo humano. En tercer lugar, observamos que el nivel de expresión de estos genes de referencia en blastómeros individuales permaneció estable entre la etapa de 8 células y la de mórula, después de que comenzara la EGA. A nivel del embrión intacto, los valores de Ct tanto de RPLPO como de GAPDH se mantuvieron en gran parte constantes durante todo el desarrollo hasta la etapa de mórula, con un ligero aumento tras la etapa de blastocisto, quizás debido al aumento de los niveles de transcrito en el mayor número de blastómeros presentes. La mayor parte del análisis de expresión génica realizado en este estudio se centró en las etapas de desarrollo antes de la etapa de mórula; sin embargo, cuando el nivel de expresión de los genes de referencia era extremadamente estable.
Rastreo celular automatizado
Nuestro algoritmo de rastreo celular utiliza un marco probabilístico basado en métodos secuenciales de Monte Carlo, que en el campo de la visión por ordenador a menudo se denomina filtro de partículas. El filtro de partículas rastrea la propagación de tres variables principales a lo largo del tiempo: el estado, el control, y la medida. La variable de estado es un modelo de un embrión, y se representa como una colección de elipses. La variable de control es una entrada que transforma la variable de estado, y consiste en nuestro modelo de propagación y división celular. La variable de medida es una observación del estado, y consiste en nuestras imágenes adquiridas por el microscopio de lapso de tiempo. Nuestra estimación del estado actual en cada etapa de tiempo se representa con una distribución de probabilidad a posteriori, que se aproxima mediante un conjunto de muestras ponderadas denominadas partículas. Usamos los términos partículas y modelos de embriones indistintamente, en el que una partícula es una hipótesis de un modelo de embrión en un momento dado. Después de la inicialización, el filtro de partículas aplica repetidamente tres etapas: predicción, medida y actualización.
Predicción; Las células se representan como elipses en el espacio 2D, y cada célula tiene una orientación y un índice de superposición. El índice de superposición especifica la altura relativa de las células. En general, hay dos tipos de comportamiento que queremos predecir: movimiento celular y división celular. Para el movimiento celular, nuestra entrada de control toma una partícula y perturba aleatoriamente cada parámetro para cada célula, incluyendo la posición, la orientación y la longitud de los ejes mayor y menor. La perturbación se muestrea aleatoriamente a partir de una distribución normal con una varianza relativamente pequeña (5% de los valores inicializados). Para la división celular, utilizamos el siguiente enfoque. En un momento dado, para cada partícula, asignamos un 50% de probabilidad de que una de las células se divida. Este valor se escogió empíricamente, y abarca un amplio intervalo de posibles divisiones celulares al tiempo que mantiene una buena cobertura de la configuración actual. Si se predice una división, entonces la célula que se divide se escoge al azar. Cuando se escoge una célula para dividirse, aplicamos una división simétrica a lo largo del eje mayor de la elipse, produciendo dos células hijas de igual tamaño y forma. Después perturbamos aleatoriamente cada valor para las células hijas. Finalmente, seleccionamos aleatoriamente los índices de superposición de las dos células hijas mientras mantenemos su superposición colectiva con respecto al resto de las células.
Después de aplicar la entrada de control, convertimos cada partícula en una imagen simulada. Esto se logra proyectando la forma elíptica de cada célula sobre la imagen simulada usando el índice de superposición. Los valores de píxel correspondientes se establecen en un valor binario de 1 y se dilatan para crear un grosor de membrana comparable a los datos de imagen observados. Dado que los embriones son parcialmente transparentes y se recolecta luz desenfocada, las membranas celulares en la parte inferior del embrión solo son visibles a veces. En consecuencia, las membranas celulares ocluidas se añaden con un 10% de probabilidad. En la práctica, hemos descubierto que estos puntos de membrana ocluidos son cruciales para un modelado de forma preciso, pero es importante hacerlos lo suficientemente dispersos para que no se parezcan a un borde visible.
Medida: Una vez que hemos generado una distribución de modelos hipotéticos, las imágenes simuladas correspondientes se comparan con la imagen del microscopio real. La imagen del microscopio se procesa previamente para crear una imagen binaria de las membranas celulares utilizando un método basado en la curvatura principal, seguido de un umbral. La precisión de la comparación se evalúa usando una distancia de chaflán truncado simétrico, que entonces se usa para asignar un peso, o probabilidad, a cada partícula.
Actualización: Una vez asignados los pesos, las partículas se seleccionan en proporción a estos pesos para crear un nuevo conjunto de partículas para la siguiente iteración. Esto enfoca la distribución de partículas en la región de mayor probabilidad. Las partículas con baja probabilidad se descartan, mientras que las partículas con alta probabilidad se multiplican. El nuevo muestreo de partículas se realiza utilizando el método de baja varianza.
Una vez que se han modelado los embriones, podemos extraer los parámetros de formación de imágenes dinámicos tales como la duración de la citocinesis y el tiempo entre mitosis, como se explica en el texto principal. Nuestro software de rastreo celular se implementó previamente en Matlab, y los tiempos de cálculo oscilaron entre un par de segundos y medio minuto para cada imagen, según la cantidad de partículas. Nuestra versión actual del software está implementada en C, y los tiempos de cálculo oscilan de 1 a 5 segundos, dependiendo del número de partículas.
EJEMPLO 1
Análisis de formación de imágenes para determinar el potencial de desarrollo de los embriones.
MÉTODOS
Los embriones humanos congelados de 1 célula, también denominados cigotos, se descongelaron y se colocaron en cultivo, y se cultivaron en condiciones tales como las utilizadas en los procedimientos de FIV. Como se describió con más detalle anteriormente, estos embriones parecen ser representativos de la típica población de fecundación in vitro (FIV), ya que se congelaron en la etapa 2PN, y de este modo se criopreservaron indiscriminadamente. Esto contrasta con los embriones típicamente criopreservados en etapas posteriores de desarrollo después de la transferencia de aquellos que se perciben como de la más alta calidad durante los ciclos recientes. Para algunos experimentos, los embriones se colocaron en una placa de cultivo estándar. Para otros experimentos, los embriones se cultivaron en una placa de cultivo personalizada, con micropocillos de calidad óptica.
Los embriones en crecimiento, típicamente entre 1 y 30 por placa, se siguieron individualmente mediante formación de imágenes de lapso de tiempo con un microscopio controlado por ordenador equipado para almacenamiento y análisis de imágenes digitales. En algunos casos, la formación de imágenes de lapso de tiempo se llevó a cabo con microscopios invertidos equipados con platinas calefactadas y cámaras de incubación. En otros casos, la formación de imágenes de lapso de tiempo se realiza con matrices de microscopios en miniatura personalizados que encajan dentro de una incubadora convencional, lo que permitió el cultivo simultáneo de múltiples placas de muestras en la misma incubadora y fue escalable para adaptarse a múltiples canales sin limitaciones en el mínimo intervalo de tiempo entre capturas de imágenes sucesivas. El uso de varios microscopios también eliminó la necesidad de mover la muestra, lo que mejoró la precisión del sistema y la fiabilidad general del sistema. Los sistemas de formación de imágenes utilizaron iluminación de campo oscuro, que proporcionó un contraste de imagen mejorado para la posterior extracción de características y análisis de imágenes, aunque se observó que otra iluminación habría sido suficiente. Los microscopios individuales en la incubadora se aislaron entre sí, proporcionando a cada placa de cultivo su propio entorno controlado. Esto permitió que las placas se transfirieran hacia y desde las estaciones de formación de imágenes sin alterar el entorno de las otras muestras.
Se recopilaron imágenes de lapso de tiempo para el análisis posterior de la morfología celular, incluyendo la medida de al menos uno de los siguientes parámetros celulares: la duración de la primera citocinesis, el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda división celular, y el intervalo de tiempo entre la segunda y la tercera división celular. Las imágenes que se muestran en las figuras se tomaron con un tiempo de exposición de 1 segundo cada 5 minutos durante un máximo de 5 o 6 días. Como se describe con mayor detalle a continuación, la primera citocinesis generalmente ocurre un día después de la fertilización y dura entre alrededor de 14 minutos. La primera y la segunda división celular suelen estar separadas por un promedio de alrededor de 11 horas. Las segundas y terceras división celular suelen estar separadas por un promedio de alrededor de 1 hora. De este modo, la formación de imágenes se prolongó durante un período de tiempo de aproximadamente 36 horas (más o menos varias horas) después de la fertilización.
RESULTADOS
La línea de tiempo de desarrollo de un embrión de preimplantación humano sano en cultivo se documentó durante un período de seis días mediante formación de imágenes de lapso de tiempo (Fig. 2). Se observó que un cigoto humano normal sufre la primera división de escisión al principio del Día 2. Posteriormente, el embrión se escinde en un embrión de 4 y 8 células más tarde en el Día 2 y Día 3 respectivamente, antes de compactarse en una mórula en el Día 4. La primera diferenciación celular morfológicamente evidente se observa en los Días 5 y 6 durante la formación del blastocisto, cuando los blastómeros totipotentes se diferencian en células trofectodermo, que dan lugar a estructuras extraembrionarias como la placenta, o en masa celular interna, que se desarrolla en el feto in vivo y células madre embrionarias pluripotentes in vitro.
A continuación, rastreamos el desarrollo de 242 embriones fertilizados normalmente en cuatro conjuntos de experimentos independientes, y documentamos la distribución de embriones normales y detenidos entre las muestras que se cultivaron hasta el Día 5 o 6. De los 242 embriones, 100 se cultivaron hasta el Día 5 o 6, y se observó que la tasa de formación de blastocistos estaba entre 33% y 53%, similar a la tasa de formación de blastocistos en una clínica de FIV típica (Fig. 3). Los embriones restantes se detuvieron en diferentes etapas de desarrollo, más comúnmente entre la etapa de 2 y 8 células, y se definieron como anormales (Fig. 3). Con el fin de identificar parámetros cuantitativos de formación de imágenes que predicen el éxito en el desarrollo del embrión hasta la etapa de blastocisto, extrajimos y analizamos varios parámetros a partir de los videos de lapso de tiempo, incluyendo el tamaño del blastómero, el grosor de la zona pelúcida, el grado de fragmentación, la duración de los primeros ciclos celulares, los intervalos de tiempo entre las primeras mitosis, y la duración de la primera citocinesis. Durante el análisis de imágenes de video de embriones tanto normales como anormales en el desarrollo, observamos que muchos embriones detenidos experimentaron una citocinesis aberrante durante la primera división celular. Los embriones normales completaron la citocinesis en una estrecha ventana de tiempo de 14,3 /- 6,0 min desde la aparición de los surcos de escisión hasta la separación completa de las células hijas, de forma suave y controlada. Esto se muestra en la Fig. 4 superior. Por el contrario, los embriones anormales comúnmente mostraron uno de dos fenotipos de citocinesis aberrantes. En el fenotipo más leve, la morfología y el mecanismo de la citocinesis parecían normales, pero el tiempo requerido para completar el proceso fue más largo, variando desde unos pocos minutos adicionales hasta una hora (Fig. 4). Ocasionalmente, un embrión que experimentó una citocinesis levemente prolongada todavía se convirtió en un blastocisto. En el fenotipo más severo, la morfología y el mecanismo de la citocinesis se vieron alterados. Por ejemplo, como se muestra en el ejemplo en el panel inferior de la Fig. 4, los embriones formaron un surco de escisión unilateral y experimentaron una serie inusual de eventos de ondulación de la membrana durante varias horas antes de finalmente fragmentarse en componentes más pequeños. También se observaron otras variaciones de dicho comportamiento. Además, los embriones anormales que demuestran estos fenotipos más graves con frecuencia se fragmentaron, lo que proporciona pruebas directas de que la fragmentación del embrión es probablemente un subproducto de una citocinesis aberrante que posteriormente da como resultado un desarrollo embrionario anormal.
El análisis detallado de los nuestros resultados de la formación de imágenes indicó que los embriones normales siguieron un tiempo estricto en la citocinesis y la mitosis durante las primeras divisiones, antes de que comience la activación del genoma embrionario (EGA), lo que sugiere que el potencial de desarrollo de un embrión está predeterminado por los programas maternos heredados. En particular, notamos tres intervalos temporales, o parámetros, en los ciclos celulares del embrión en etapa temprana que estaban estrictamente regulados: (1) duración de la primera citocinesis, (2) intervalo de tiempo entre la primera y la segunda mitosis, y (3) sincronicidad de la segunda y tercera mitosis. La relación entre estos tres intervalos de tiempo y los cambios morfológicos se muestra en la Fig. 5. Para embriones normales, medimos estos parámetros en aproximadamente 14,3 /- 6,0 minutos, 11,1 /- 2,1 horas, y 1,0 /- 1,6 horas, respectivamente (dado aquí como media más/menos desviación estándar).
También llevamos a cabo una formación de imágenes en un conjunto pequeño (n = 10) de embriones recientes (no criopreservados) que eran 3PN (triploides) comenzando en la etapa unicelular. Se ha demostrado que los embriones 3PN siguen la misma línea de tiempo de eventos históricos que los embriones recientes normales durante al menos los tres primeros ciclos celulares. Se obtuvieron imágenes de estos embriones antes de nuestros experimentos principales con el fin de validar los sistemas de formación de imágenes (pero por razones técnicas no se siguieron hasta el blastocisto). De este conjunto de embriones recientes, 3 de los embriones siguieron una línea de tiempo de eventos similar a la de nuestros embriones 2PN criopreservados, oscilando la duración de la citocinesis de 15 a 30 min, oscilando el tiempo entre la primera y la segunda mitosis de 9,6 a 13,8 horas, y oscilando el tiempo entre la segunda y la tercera mitosis de 0,3 a 1,0 horas. Sin embargo, en 7 de los embriones observamos un fenotipo de citocinesis único que se caracterizó por la aparición simultánea de 3 surcos de escisión, una citocinesis ligeramente prolongada, y finalmente la separación en tres células hijas (Fig. 4). Estos embriones tuvieron una duración de citocinesis que oscila de 15 a 70 min (caracterizado como el tiempo entre el inicio de los surcos de escisión hasta la separación completa en 3 células hijas), oscilando el tiempo entre la primera y la segunda mitosis (3 células a 4 células) de 8,7 a 12,7 horas, y oscilando el tiempo entre la segunda y la tercera mitosis (4 células a 5 células) de 0,3 a 2,6 horas. Esta observación, junto con el intervalo diverso de fenotipos de citocinesis mostrados por embriones anormales, sugiere que nuestros embriones criopreservados no se retrasan en el desarrollo por el procedimiento de criopreservación, y se comportan de manera similar a los cigotos recientes que se escinden en 2 blastómeros.
Se pudieron predecir los embriones que alcanzaron el estadio de blastocisto, con sensibilidad y especificidad del 94% y 93% respectivamente, al tener una primera citocinesis de entre 0 y 33 min, un tiempo entre la primera y la segunda mitosis de entre 7,8 y 14,3 horas, y un tiempo entre la segunda y tercera mitosis de entre 0 y 5,8 horas (Fig. 6). Por el contrario, se predijo que los embriones que exhibían valores fuera de una o más de estas ventanas se detendrían. Todos los embriones normales que se desarrollaron con éxito en un blastocisto exhibieron valores similares en los tres parámetros. Por el contrario, los embriones anormales exhibieron una gran cantidad de variabilidad en la cantidad de tiempo que tomaron para completar los intervalos (Fig. 6). Observamos que (1) un período de tiempo más largo de lo normal para completar la primera citocinesis indica un potencial de desarrollo deficiente; (2) un intervalo más largo o más corto de lo normal entre la primera y la segunda división celular indica un potencial de desarrollo deficiente; y (3) un intervalo más largo de lo normal entre la segunda y la tercera división celular indica un potencial de desarrollo deficiente. De este modo, estos parámetros fueron predictivos de la capacidad del embrión para proceder a la formación de blastocistos, y de la calidad de los blastocistos.
Finalmente, notamos que si bien cada parámetro era predictivo de manera autónoma del potencial de desarrollo del embrión, el uso de los tres parámetros proporcionó una sensibilidad y especificidad que excedieron el 90%, con un punto de corte de 3 veces las desviaciones estándar. La curva de característica operativa del receptor (ROC) para estos parámetros se muestra en la Fig. 7. La curva en esta figura muestra la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) frente a la tasa de falsos positivos (1 - especificidad) para diversos cortes de desviación estándar. Para llegar a esta ROC, se utilizaron los siguientes números: Número de verdaderos positivos = 34 (predicho correctamente para alcanzar el blastocisto); número de verdaderos negativos = 54 (predicho correctamente para la detención); número de falsos positivos = 4 (predicho incorrectamente para alcanzar el blastocisto); número de falsos negativos = 2 (predicho incorrectamente para la detención).
DISCUSIÓN
Nuestro análisis indica que los embriones que siguen un tiempo estricto en la mitosis y la citocinesis durante las tres primeras divisiones de escisión son mucho más propensos a desarrollarse en la etapa de blastocisto y formar un blastocisto de alta calidad con una masa celular interna expandida (ICM). Los parámetros morfológicos dinámicos se pueden utilizar para seleccionar los embriones óptimos para la transferencia o crioconservación durante un procedimiento de FIV. Estos parámetros también se pueden utilizar para distinguir entre diferentes calidades de blastocisto, lo que permite una clasificación de los potenciales de desarrollo relativos de los embriones dentro de un grupo. La práctica estándar en las clínicas de FIV es la transferencia en la etapa de 8 células (día 3). Algunas clínicas optan por cultivar embriones hasta la etapa de blastocisto (día 5), ya que la transferencia de blastocisto tiene hasta el doble de tasas de implantación en comparación con la transferencia del día 3. Sin embargo, muchas clínicas evitan el cultivo prolongado debido al mayor riesgo de trastornos epigenéticos. Los parámetros de formación de imágenes predictivos se pueden utilizar para predecir la viabilidad del embrión en la etapa de 4 células (el día 2) y antes de la activación del genoma embrionario. Esto puede permitir la transferencia o crioconservación de embriones un día antes de lo que se suele practicar y antes de que los embriones experimenten cambios significativos en sus programas moleculares. Esto también puede permitir que se seleccionen los embriones más óptimos para PGD u otros tipos de análisis.
EJEMPLO 2 COMPARATIVO
Validación de parámetros de formación de imágenes mediante análisis de expresión génica, y uso de análisis de expresión génica para determinar el potencial de desarrollo.
MÉTODOS
Los embriones humanos congelados de 1 célula, también denominados cigotos, se descongelaron y se colocaron en cultivo, y se cultivaron en condiciones tales como las utilizadas en los procedimientos de FIV. Para algunos experimentos, los embriones se colocaron en una placa de cultivo estándar. Para otros experimentos, los embriones se cultivaron en una placa de cultivo personalizada, con micropocillos de calidad óptica.
Los embriones se extrajeron del sistema de cultivo y de formación de imágenes, y se recogieron como embriones individuales o células individuales (blastómeros) para el análisis de la expresión génica. Cada placa contenía típicamente una mezcla de embriones, algunos alcanzando la etapa de desarrollo esperada en el momento de la cosecha, y otros deteniéndose en etapas tempranas de desarrollo o fragmentándose ampliamente. Los que alcanzaron la etapa de desarrollo esperada en el momento de la recolección se clasificaron como “normales”, mientras que los que se detuvieron se consideraron “anormales”. Por ejemplo, cuando se retiró una placa de embriones de la estación de formación de imágenes al final del Día 2 para la recolección de muestras, cualquier embrión que hubiera alcanzado la etapa de 4 células y más se identificaría como normal, mientras que los que no alcanzaron la etapa de 4 células se etiquetarían como detenidos. Estos embriones detenidos se clasificaron según la etapa de desarrollo en la que se detuvieron, de modo que un embrión con solo 2 blastómeros al final del Día 2 se analizaría como un embrión de 2 células detenido. Se tuvo cuidado de excluir los embriones que morfológicamente parecían estar muertos y porosos en el momento de la recolección de la muestra (por ejemplo, blastómeros degenerados). Para el análisis de la expresión génica, solo se utilizaron los embriones que parecían vivos (tanto para normales como detenidos). Sin embargo, es posible que los embriones que parecían normales durante el momento de la recolección pudieran en última instancia detenerse si se dejaban crecer hasta una etapa posterior. El análisis de expresión génica de los embriones representativos de cada una de estas clases se realizó mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR). En intervalos de aproximadamente 24 horas, se recolectaron embriones de los sistemas de formación de imágenes individuales para análisis de expresión génica mediante qRT-PCR de alto rendimiento con reacciones múltiples de hasta 96 genes ensayados frente a 96 muestras. El análisis de la expresión génica se realizó con el sistema FluidigmBiomark, que puede realizar hasta 9216 reacciones de qRT-PCR simultáneas basadas en el ensayo TaqMan en cantidades de nanolitros.
RESULTADOS
Con el fin de dilucidar los mecanismos moleculares que pueden subyacer a los eventos morfológicos, realizamos un perfil de expresión génica correlacionada. Se analizaron por muestra los niveles de expresión de 96 genes diferentes pertenecientes a diferentes categorías, incluyendo genes constitutivos, marcadores de células germinales, factores maternos, marcadores de la EGA, marcadores de trofoblastos, marcadores de masas celulares internas, marcadores de pluripotencia, reguladores epigenéticos, factores de transcripción, receptores hormonales, y otros (Tabla 1, en la Figura 19). Se ensayaron dos conjuntos de genes ligeramente diferentes pero superpuestos en dos conjuntos experimentales diferentes, que proporcionan un conjunto único de genes de diagnóstico del destino del embrión humano. Los conjuntos de genes únicos se compilaron a partir de datos relacionados con la expresión génica en embriones de organismos modelo o en células madre embrionarias humanas, así como de nuestros propios datos de micromatrices no publicados. El estado de expresión de estos conjuntos de genes en embriones humanos de preimplantación se revela por primera vez en este estudio.
El valor de expresión de cada gen con respecto a los genes de referencia GAPDH y RPLPO, así como con respecto al promedio de genes, se calculó utilizando los métodos geNorm (El-Toukhy T, et al. (2009) Hum Reprod) y AACt (Vanneste E, et al. (2009) Nat Med 15:577-83). El valor de estabilidad genética y el coeficiente de variación fueron 1,18 y 46% para GAPDH, y 1,18 y 34% para RPLPO, el más estable entre los 10 genes constitutivos que ensayamos y dentro del intervalo de un conjunto de muestras heterogéneo típico. En blastómeros individuales, como se esperaba, la cantidad de transcritos de RPLPO y GAPDH disminuyó en alrededor de 1 valor de Ct por división entre la etapa de 1 y 8 células, debido al efecto de reducción a la mitad de la división de escisión, así como a la falta de EGA durante los primeros 3 días de desarrollo humano. El nivel de expresión de estos genes de referencia en blastómeros individuales permaneció estable entre la etapa de 8 células y la de mórula. A nivel del embrión completo, los valores de Ct tanto de RPLPO como de GAPDH se mantuvieron en gran parte constantes durante todo el desarrollo hasta la etapa de mórula. El nivel de expresión de RPLPO y GAPDH aumentó significativamente en los blastocistos, muy probablemente debido al mayor número de blastómeros presentes. Estas variaciones no afectaron la validez de RPLPO y GAPDH como genes de referencia. La mayor parte del análisis de expresión génica realizado en este estudio se centró en las etapas de desarrollo antes de la etapa de mórula, cuando el nivel de expresión de los genes de referencia era extremadamente estable.
Expresión diferencial de genes entre embriones normales y anormales. La Fig. 8 muestra el nivel de expresión promedio de 52 genes de 6 embriones anormales de 1 a 2 células y de 5 embriones normales de 1 a 2 células representado en una gráfica de radar en una escala logarítmica. Los embriones detenidos en general mostraron una cantidad reducida de ARNm en comparación con los embriones normales, afectándose más gravemente los genes que facilitaron la citocinesis, el procesamiento del ARN y la biogénesis de miARN. Los genes resaltados con un asterisco indican una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre embriones normales y anormales según lo determinado por la prueba de MannWhitney. Estos 18 genes son Cofilina, DIAPH1, ECT2, MYLC2 , DGCR8, Dicer, TARBP2, CPEB1, Simplekina, YBX2, ZAR1, CTNNB1, DNMT3B, TERT, YY1, IFGR2, BTF3 y NELF. Cada gen pertenece a un grupo como se indica en la Figura, a saber, Citocinesis: Cofilina, DIAPH1, ECT2 y MYCL2; biogénesis de miARN: DGCR8, Dicer y TARBP2; procesamiento del ARN: YBX2; factores maternos: ZAR1; constitutivo: CTNNB1; pluripotencia: DNMT3B, TERT y YY1; receptor: IGFR2; y factor de transcripción: BTF3 y NELF. En la mayoría de los casos, la expresión de estos genes fue mayor en embriones normales de 1 y 2 células que en embriones detenidos de 1 y 2 células.
Curiosamente, ciertas categorías de genes se vieron más afectadas en los embriones anormales que en otros. Por ejemplo, en embriones anormales, la mayoría de los genes constitutivos, receptores hormonales y factores maternos no se alteraron apreciablemente en la expresión génica, mientras que muchos genes involucrados en la citocinesis y la biogénesis de miARN mostraron una expresión significativamente reducida. Además, entre los genes que se vieron afectados, algunos genes mostraron una diferencia mucho mayor entre embriones normales y anormales que otros. Por ejemplo, los genes implicados en la ruta de la biogénesis de miARN, tales como DGCR8, Dicer y TARBP2, mostraron niveles de expresión muy reducidos en embriones anormales. En particular, CPEB1 y Simplekina, dos de los genes más gravemente afectados, pertenecían al mismo mecanismo molecular que regula el almacenamiento y la reactivación del ARNm materno manipulando la longitud de la cola de poli(A) del transcrito (Bettegowda, A. et al. (2007) Front. Biosci. 12:3713-3726). Estos datos sugieren que la anomalía del embrión se correlaciona con defectos en el programa de regulación del ARNm del embrión.
Correlación de la citocinesis con los perfiles de expresión génica. El análisis de la expresión génica se realizó con genes que codificaban componentes clave de la citocinesis. La identidad de cada embrión se rastreó instalando una cámara en el estereomicroscopio, y grabando en video el procedimiento de transferencia de la muestra durante el cambio de medios y la recolección de la muestra. Al evaluar los perfiles de expresión génica de embriones anormales, observamos una fuerte correlación entre la citocinesis aberrante y un nivel más bajo de expresión génica en componentes clave de la citocinesis. Curiosamente, los perfiles de expresión génica de los embriones anormales eran tan diversos y variables como sus fenotipos morfológicos aberrantes.
Se descubrió que la expresión génica de la citocinesis varió entre embriones de 2 células normales y embriones de 2 células anormales (Fig. 9) y entre embriones de 4 células normales y anormales (Fig. 10). Las Figs. 9 y 10 muestran expresiones relativas de genes que se expresan mucho más en embriones humanos normales de dos células (Fig. 9) y embriones normales de 4 células (Fig. 10), correlacionadas con diferentes fenotipos de citocinesis. Como se representa en la Fig. 9, un embrión de 2 células detenido que mostraba una ondulación anormal de la membrana durante la primera citocinesis tenía un nivel de expresión significativamente reducido de todos los genes reguladores de la citocinesis ensayados. Los genes que muestran diferencias en la Fig. 9 son anilina, cofilina, DIAPH1, DIAPH2, DNM2, ECT2, MKLP2, MYCL2 y RhoA. Los niveles de expresión normales se dan en las barras de la derecha, y se puede ver que son más altos en cada gen. En las fotografías sobre los gráficos de la Figura 9, que muestran embriones de dos células anormales, la barra de escala representa 50 pm. La Fig. 10 muestra los resultados de un embrión de 4 células detenido que experimentó una citocinesis aberrante con un surco de citocinesis unilateral y citocinesis extremadamente prolongada durante la primera división mostró una expresión disminuida en los reguladores de citocinesis Anilina y ECT2. La barra de escala en la Fig. 10 también representa 50 pm.
Patrones de expresión génica específicos de la etapa embrionaria. La Fig. 11 muestra cuatro patrones específicos de etapa embrionaria (ESSP) que se identificaron durante el análisis de expresión génica de 141 embriones individuales y blastómeros individuales desarrollados normalmente. Los genes que caen en cada uno de los cuatro ESSP se enumeran en la Tabla 2 (Fig. 20). Las gráficas de la Fig. 11 se crearon agrupando genes basándose en patrones de expresión similares y promediando sus valores de expresión (con respecto a los genes de referencia). El nivel de expresión relativo de un ESSP se calculó promediando los niveles de expresión de genes con un patrón de expresión similar. Los niveles de expresión génica se representan frente a diferentes etapas celulares, es decir, 1c = una célula; M = mórula, B = blastocisto. En la Fig. 11, la expresión relativa de genes en cada uno de los cuatro ESSP se muestra en función del desarrollo, desde 1 célula (1c) hasta mórula y blastocisto. ESSP1 muestra la herencia materna, ESSP2 muestra la activación de la transcripción génica, ESSP3 muestra la activación en etapa tardía, y ESSP4 muestra los transcritos persistentes. Como se indica en ESSP2, el punto de transferencia típico en una clínica de FIV ocurre en el día 3, cuando los embriones están experimentando cambios de desarrollo significativos debido a la activación del genoma embrionario. Los datos de imágenes de lapso de tiempo indican que el potencial de desarrollo de un embrión puede identificarse mediante la etapa de 4 células, lo que permite una transferencia más temprana de los embriones el día 2 y antes de la activación génica. Esta transferencia temprana es útil para mejorar la tasa de éxito de los procedimientos de FIV.
La Tabla 2 (Fig. 20) enumera los genes que pertenecen a cada uno de los cuatro ESSP identificados. Se calculó el nivel de expresión génica relativo de cada gen frente a los genes de referencia (GAPDH y RPLPO) y con respecto al promedio de genes. El patrón de expresión de cada gen frente a la línea de tiempo de desarrollo del embrión siguió uno de los cuatro siguientes ESSP: patrón ESSP (1) Etapa temprana: genes que comienzan con un alto nivel de expresión, se degradan lentamente, y se apagan antes del blastocisto; patrón ESSP (2) Etapa intermedia: genes que se activan después de la etapa de 4 células; patrón ESSP (3) Etapa tardía: genes que se activan en la mórula o el blastocisto; y patrón ESSP (4) Constante: genes que tienen valores de expresión relativamente constantes.
ESSP1 describió el patrón de genes heredados de la madre. Estos transcritos comenzaron con un alto nivel de expresión en la etapa de cigoto, y posteriormente declinaron a medida que los embriones se convirtieron en blastocistos. La vida media de estos transcritos fue aproximadamente 21 horas. Los factores maternos clásicos de otros organismos modelo, tales como GDF9 y ZAR1, así como los genes específicos de células germinales (ovocitos) VASA y DAZL, se incluyeron en esta categoría. ESSP2 incluyó los genes activados embrionarios, que se transcribieron por primera vez en los embriones después de la etapa de 4 células. Algunos genes de esta categoría parecían mostrar dos ondas de activación, la primera y más pequeña en la etapa de 5 a 6 células, y la segunda y más grande en la etapa de 8 células. Los genes de EGA conocidos de otros organismos modelo, tales como EIF1AX31 y JARID1 B32, se incluyeron en esta categoría. ESSP3 estaba compuesto por genes activados tardíamente que no se expresaron hasta la etapa de blastocisto, incluyendo el marcador de trofoblasto GCM1. ESSP4 contenía transcritos persistentes que mantenían una expresión estable con respecto a los genes de referencia durante todo el desarrollo. La vida media de estos genes fue 193 horas, aproximadamente 9 veces más larga que el ESSP1. Esta categoría incluía una mezcla de genes constitutivos, factores de transcripción, reguladores epigenéticos, receptores de hormonas, y otros. Estos 4 patrones de expresión génica se confirmaron en otro conjunto de experimentos utilizando 61 muestras de blastómeros y embriones normales individuales.
Embriones anormales que exhiben un comportamiento mitótico y citocinético aberrante durante las primeras divisiones, se correlacionaron con perfiles de expresión génica altamente erráticos, especialmente en genes involucrados en el manejo del ARN embrionario. De este modo, se pueden combinar estas metodologías para proporcionar métodos que se pueden utilizar para predecir la viabilidad del embrión antes de la implantación. Los resultados sugieren que los embriones anormales comienzan su vida con programas defectuosos en el procesamiento del ARN y en la biogénesis del miARN, lo que provoca una degradación excesiva del ARNm materno. La naturaleza estocástica de tal degradación de ARN no regulada conduce a la destrucción aleatoria de los transcritos, lo que provoca la amplia variedad de fenotipos aberrantes observados en embriones anormales. La disminución del nivel de los miARN causa defectos en la degradación regulada del ARN materno, lo que lleva a una detención del desarrollo en diferentes etapas.
Análisis de blastómeros individuales. Para evaluar cuándo comenzó la diferenciación molecular en embriones de preimplantación humanos, se analizó el nivel de expresión de CDX2 en blastómeros individuales recolectados de 17 embriones en diferentes etapas de desarrollo. La Fig. 12A muestra el nivel de expresión relativo de dos genes, CTBBN1 (barras oscuras) y CDX2 (barras claras) en función de la etapa de desarrollo, desde 2 células hasta blastocisto. Como puede verse, CDX2 se expresó esporádicamente a niveles bajos en algunos blastómeros individuales procedentes de embriones antes de la etapa de 4 células (Fig. 12A). Sin embargo, desde la etapa de 6 células en adelante, cada embrión contenía al menos 1 blastómero que expresaba CDX2 en un nivel significativo. El nivel de expresión del gen constitutivo CTNNB1 también mostrado en la Fig. 12A permaneció constante entre blastómeros del mismo embrión, lo que indica que el patrón de expresión heterogéneo de CDX2 no era un artefacto de qPCR. Los datos de un experimento independiente demuestran observaciones similares. Estos resultados indican que la diferenciación molecular en embriones humanos de preimplantación podría ocurrir tan pronto como inmediatamente después de la etapa de 4 células.
Curiosamente, la inspección de los perfiles de expresión génica en blastómeros individuales reveló embriones que contenían blastómeros con firmas de expresión génica correspondientes a diferentes edades de desarrollo. El perfil de expresión génica de cualquier embrión dado en un momento dado es igual a la suma de la degradación del ARNm materno y EGA. Un blastómero más joven de edad de desarrollo temprana generalmente contiene una gran cantidad de transcritos maternos y una baja cantidad de genes cigóticos, y lo contrario es cierto para un blastómero más viejo en una edad de desarrollo más avanzada. En este experimento, el programa material se definió como los valores de expresión promedio de 10 marcadores ESSP1 (transcritos maternos), y el programa embrionario por los valores de expresión promedio de 10 marcadores ESSP2 (transcritos embrionarios). El panel de transcritos maternos utilizado incluye DAZL, GDF3, IFITM1, STELLAR, SYCP3, VASA, GDF9, PDCD5, ZAR1 y ZP1, mientras que el panel de genes embrionarios incluye ATF7IP, CCNA1, EIF1 AX, EIF4A3, H2AFZ, HSP70.1, JARID1 B, LSM3, PABPC1, y SERTAD1. Entre los 6 blastómeros recolectados con éxito de este embrión particular de 8 células, 3 blastómeros mostraron una firma de expresión génica similar a los blastómeros de una muestra de embrión normal de 3 células, mientras que los otros 3 blastómeros fueron similares a los blastómeros de una muestra de embrión normal de 8 células (Fig. 12B). La explicación más probable de esta observación es la detención de una subpoblación de células dentro del embrión. Este fenotipo de detención parcial también se observó en otro embrión de 9 células y 2 mórulas entre las muestras que analizamos. El hecho de que el nivel de transcritos maternos siguió siendo alto en los blastómeros detenidos, que habían pasado la misma cantidad de tiempo en cultivo que sus células hermanas normales, indica que la degradación del ARN materno no es un proceso espontáneo que simplemente ocurre a través del tiempo, sino que muy probablemente requiere el funcionamiento de mecanismos específicos de degradación del a Rn tales como los microARN (miARN). Estos datos también proporcionan evidencia adicional de que la degradación del ARNm materno es un evento de desarrollo conservado durante la embriogénesis de mamíferos, y es necesaria para el desarrollo normal del embrión (Bettegowda, A., et al. (2008) Reprod. Fertil. Dev. 20:45-53). Además, estos datos sugieren que los blastómeros individuales en un embrión son autónomos y pueden desarrollarse independientemente unos de otros. Además, estos resultados indican que se pueden usar los ensayos de nivel de expresión génica descritos aquí para evaluar un nivel de un ARNm (que es indicativo del nivel de expresión génica) en una célula que se va a evaluar, en el que el ARN es de un gen que se sabe que es parte del programa materno, y la persistencia de tal nivel de expresión en una etapa posterior del desarrollo embrionario se correlaciona con la probabilidad de un resultado anormal, o parte del programa embrionario, en el que la ausencia en el tiempo es indicativa de una probabilidad de un resultado anormal. Los genes del programa materno examinados aquí son ZAR1, PDCD5, NLRP5, H5F1, GDF9 y BNC2. Se conocen y pueden usarse otros genes de efecto materno.
Activación del genoma embrionario. Los presentes métodos se basan, al menos en parte, en los hallazgos de que los embriones anormales, detenidos en el desarrollo, con frecuencia exhiben una citocinesis aberrante y una sincronización mitótica durante las tres primeras divisiones antes de que se produzca la EGA (activación del genoma embrionario). Esto sugiere que el destino del desarrollo embrionario está determinado en gran medida por la herencia materna, un hallazgo en notable acuerdo con un modelo matemático de desarrollo humano previo a la implantación realizado por Hardy et al. en 200134. Además, las anomalías de la citocinesis y la mitosis se correlacionan fuertemente con niveles reducidos de transcritos maternos en genes que regulan la biogénesis de miARN y el enmascaramiento, almacenamiento y reactivación del ARNm materno. Los miARN regulan la traducción al promover la degradación del ARNm en diversos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo y la diferenciación del organismo (Blakaj, A. y Lin, H. (2008) J. Biol. Chem. 283:9505-9508; Stefani, G. y Slack, F. J. (2008) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9:219-230). La creciente evidencia de organismos modelo muestra que los miARN pueden ser los reguladores clave de la degradación de los transcritos maternos en los embriones tempranos (Bettegowda, A., et al. (2008) Reprod. Fertil. Dev. 20:45-53). De este modo, los defectos en la biogénesis de miARN probablemente conducirán a un desarrollo embrionario anormal. Por otro lado, la falta de manejo adecuado de los ARNm maternos también puede conducir a una embriogénesis deficiente. Los ovocitos de mamíferos sintetizan una gran cantidad de transcritos de ARN materno necesarios para apoyar el crecimiento de embriones tempranos antes del parto de la madre. Estos transcritos se reprimen y almacenan durante un período de tiempo prolongado, hasta que se reactivan después de la fertilización. Los defectos en este programa de manejo del a Rn materno probablemente afectarán la cantidad y calidad de los transcritos maternos, y de este modo pondrán en peligro la posibilidad de un desarrollo exitoso.
Modelo para evaluar la viabilidad embrionaria. La Fig. 13 muestra un modelo para el desarrollo de embriones humanos basado en la formación de imágenes y el análisis molecular correlacionados. Se muestra la línea de tiempo del desarrollo desde el cigoto hasta el blastocisto, incluyendo los breves tiempos críticos para la predicción del desarrollo exitoso hasta blastocisto, y un diagrama del desarrollo del embrión. Los datos moleculares clave, como se muestra en el diagrama, indican que los embriones humanos comienzan su vida con un conjunto distinto de ARN de ovocitos que se heredan de la madre. Este conjunto de ARN se mantiene y empaqueta adecuadamente mediante programas específicos de manejo de ARN en el óvulo. Después de la fertilización, la degradación de un subconjunto de ARN maternos específicos del óvulo (ESSP1; Patrón 1 específico de etapa embrionaria) debe degradarse a medida que comienza la transición del ovocito al embrión. Paralelamente, otros ARN se reparten idealmente por igual en cada blastómero a medida que continúa el desarrollo (ESSP4). La degradación y reparto exitosos de los ARN culmina con la activación del genoma embrionario (EGA) y la transcripción de los genes de ESSP2 de forma autónoma celular. En particular, durante las divisiones de escisión, los blastómeros embrionarios pueden detenerse o progresar de forma independiente. El resultado del desarrollo autónomo celular en el embrión es que los blastómeros individuales pueden detenerse o progresar, y a medida que el embrión de 8 células avanza a la etapa de mórula y más allá, la calidad del blastocisto se verá afectada por el número de células que se detuvieron o progresaron más allá de las 8 células. Los datos de formación de imágenes demuestran que hay períodos críticos de desarrollo que predicen el éxito o el fracaso: primera citocinesis, la segunda división de escisión, y sincronicidad de la segunda y tercera divisiones de escisión. Estos parámetros se pueden medir automáticamente utilizando los algoritmos y el software de rastreo celular descritos anteriormente. Los sistemas y métodos descritos se pueden utilizar para diagnosticar el resultado del embrión con predictores de formación de imágenes claves, y pueden permitir la transferencia de menos embriones en una etapa más temprana del desarrollo (antes de la EGA).
EJEMPLO 3 COMPARATIVO
Formación de imágenes de la maduración del ovocito y del desarrollo posterior del embrión.
RESULTADOS
Una de las principales limitaciones de los procedimientos actuales de FIV es la calidad y disponibilidad de los ovocitos. Por ejemplo, los protocolos actuales de FIV reclutan ovocitos del pequeño grupo cíclico, proporcionando una pequeña cantidad de ovocitos (por ejemplo, 1-20) para la fertilización. Además, alrededor del 20% de los ovocitos recuperados después de la estimulación hormonal durante los procedimientos de FIV se clasifican como inmaduros, y generalmente se descartan debido a un potencial reducido de desarrollo embrionario en las condiciones de cultivo actuales.
Un método para aumentar el conjunto de ovocitos es mediante la maduración in vitro. La Fig. 14 muestra tres etapas de desarrollo durante la maduración in vitro, que incluyen vesícula germinal, metafase I, y metafase II. Las etapas de vesícula germinal y metafase I se clasifican como ovocitos inmaduros, mientras que la metafase II se clasifica como madura debido a la presencia del primer cuerpo polar, que se produce a las 24-48 horas de iniciada la maduración in vitro. La Fig. 15 muestra el desarrollo embrionario de un ovocito que ha madurado in vitro.
Otro método para aumentar el conjunto de ovocitos es reclutar ovocitos del conjunto primario y secundario, proporcionando hasta varios miles de ovocitos. En este procedimiento, se reclutan folículos inactivos del ovario, y se programan in vitro para producir ovocitos con composición cromosómica, estado epigenético, expresión de ARN, y morfología normales. En otros aspectos, los ovocitos pueden derivar de células madre pluripotentes diferenciadas in vitro en células germinales y maduradas en ovocitos humanos.
Como se ilustra en la Fig. 14, el proceso de maduración de un ovocito in vitro está marcado por varios cambios celulares que pueden usarse para definir parámetros celulares para medida y análisis en los métodos descritos aquí. Estos incluyen, por ejemplo, cambios en la morfología de la membrana del ovocito, por ejemplo la velocidad y el grado de separación de la zona pelúcida; cambios en la morfología del núcleo del ovocito, por ejemplo el inicio, finalización y velocidad de degradación de vesículas germinales (GVBD); la velocidad y dirección del movimiento de los gránulos en el citoplasma y el núcleo; y el movimiento y extrusión del primer cuerpo polar.
EJEMPLO 4 COMPARATIVO
Formación de imágenes de la diferenciación de células madre.
RESULTADOS
El análisis de imágenes de lapso de tiempo también se puede utilizar para evaluar la viabilidad, el potencial de desarrollo, y el resultado de otros tipos de células, tales como las células madre, las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), y las células madre embrionarias humanas (hESC). El potencial de desarrollo de las células madre se puede evaluar mediante el análisis de imágenes de lapso de tiempo para medir los cambios en la morfología durante el desarrollo y la diferenciación celulares (Fig. 17). A continuación, las células diferenciadas se pueden analizar y seleccionar para trasplante in vivo u otro uso. Se pueden extraer y analizar varios parámetros de las células madre a partir de datos de imágenes de lapso de tiempo, tales como la duración de la citocinesis, el tiempo entre los eventos de mitosis, el tamaño y la forma de las células, el número de células, el movimiento de las células, los patrones de división, la diferenciación, la división asimétrica (en la que una célula hija mantiene una célula madre mientras que la otra se diferencia), la división simétrica (en la que ambas células hijas permanecen como células madre o ambas se diferencian), y la especificación del destino (que determina con precisión cuándo se diferencia una célula madre).
La fórmula básica de la terapia con células madre es que las células madre indiferenciadas pueden cultivarse in vitro, diferenciarse en tipos de células específicos, y posteriormente trasplantarse a receptores para la regeneración de tejidos y/u órganos lesionados. El análisis de imágenes de lapso de tiempo se puede utilizar como un dispositivo no invasivo de alto rendimiento para identificar células madre que forman una progenie diferenciada no tumorigénica capaz de integrarse en tejidos maduros. Las aplicaciones potenciales incluyen el tratamiento de trastornos neurológicos tales como el Alzheimer y el Parkinson, trastornos del sistema vascular y enfermedades cardíacas, trastornos musculares y esqueléticos tales como artritis, enfermedades autoinmunes y cánceres, así como el descubrimiento de fármacos mediante la evaluación de dianas y terapias novedosas.
En los seres humanos, los tejidos dañados generalmente se reemplazan mediante el reclutamiento y la diferenciación continuos de las células madre en el cuerpo. Sin embargo, la capacidad de regeneración del cuerpo se reduce con el envejecimiento. Un ejemplo de esto es la incontinencia urinaria resultante de la deficiencia del esfínter. Se cree que el envejecimiento es una de las principales causas de la deficiencia del esfínter debido a que el número de fibras musculares y la densidad de los nervios disminuyen con la edad. Para tratar a pacientes con incontinencia, las iPSC pueden derivar de fibroblastos cultivados de tejidos de la pared vaginal para producir células de músculo liso diferenciadas. Estas células diferenciadas pueden entonces trasplantarse in vivo. Antes del trasplante, se puede utilizar el análisis de imágenes de lapso de tiempo para caracterizar las iPSC con respecto a la pluripotencia, diferenciación, metilación y tumorigenicidad. Otras aplicaciones incluyen la formación de imágenes de lapso de tiempo de iPSC que derivan de células de la piel de pacientes con Parkinson y se diferencian en neuronas para trasplante (Fig. 18).
EJEMPLO 5
Validación de parámetros de formación de imágenes mediante análisis automatizado
Como lo demuestran nuestros datos de imágenes de lapso de tiempo, el desarrollo de embriones humanos es un proceso muy variable entre los embriones dentro de una cohorte, y los embriones pueden exhibir una amplia gama de comportamientos durante la división celular. De este modo, la caracterización manual de ciertos eventos del desarrollo, tal como la duración de una citocinesis altamente anormal (Fig. 4), puede estar sujeta a interpretación. Para validar nuestros parámetros de formación de imágenes y la capacidad de predecir sistemáticamente la formación de blastocistos, desarrollamos un algoritmo para el rastreo automatizado de las divisiones celulares hasta la etapa de 4 células. Nuestro algoritmo de rastreo emplea una técnica de estimación de modelos probabilísticos basada en métodos secuenciales de Monte Carlo. Esta técnica funciona generando distribuciones de modelos de embriones hipotéticos, simulando imágenes basadas en un modelo óptico simple, y comparando estas simulaciones con los datos de imagen observados (Fig. 21a).
Los embriones se modelaron como una colección de elipses con posición, orientación e índice de superposición (para representar las alturas relativas de las células). Con estos modelos, se puede extraer la duración de la citocinesis y el tiempo entre mitosis. La citocinesis se define típicamente por la primera aparición del surco de citocinesis (en el que se forman indentaciones bipolares a lo largo del eje de escisión) hasta la separación completa de las células hijas. Simplificamos el problema al aproximar la citocinesis como la duración del alargamiento celular antes de una división celular de 1 a 2 células. Una célula se considera alargada si la diferencia en las longitudes de los ejes supera el 15% (escogido empíricamente). El tiempo entre mitosis es fácil de extraer contando el número de células en cada modelo.
Probamos nuestro algoritmo en un conjunto de 14 embriones humanos (Fig. 21b) y comparamos las medidas automatizadas con el análisis manual de imágenes (Fig. 21c, Fig. 21d). En este conjunto de datos, 8 de los 14 embriones alcanzaron la etapa de blastocisto con buena morfología (Fig. 21e superior). Las medidas automáticas coincidieron estrechamente con las medidas manuales, y se predijo correctamente que los 8 embriones alcanzarían el blastocisto. 2 de los 14 embriones alcanzaron blastocisto con mala morfología (mala calidad de la masa celular interna; Fig. 21e inferior). Para estos embriones, la evaluación manual indicó que 1 alcanzaría el blastocisto y 1 se detendría, mientras que la evaluación automatizada predijo que ambos se detendrían. Finalmente, 4 de los 14 embriones se detuvieron antes de la etapa de blastocisto, y se predijo correctamente que se detendrían por ambos métodos.
Marco de filtro de partículas
El filtro de partículas es una técnica de estimación de modelos basada en la simulación de Monte Carlo. Se utiliza para estimar modelos desconocidos u “ocultos” generando distribuciones de modelos hipotéticos, y comparando estos modelos con datos observados. Su capacidad para adaptarse a dinámicas de movimiento arbitrario e incertidumbres de medida lo convierte en un candidato ideal para rastrear divisiones celulares.
El filtro de partículas rastrea la propagación de tres variables principales a lo largo del tiempo: el estado x, el control u, y la medida z. La variable de estado x es un modelo del embrión que deseamos estimar, y se representa como una colección de elipses (para 2D) o elipsoides (para 3D). La variable de control u es una entrada que transforma la variable de estado, y consiste en nuestro modelo de propagación y división celulares. La variable de medida z es una observación del estado, y consiste en nuestras imágenes adquiridas por el microscopio de lapso de tiempo. Estos parámetros se describen con mayor detalle en las siguientes secciones.
Una estimación del estado actual x en cada etapa de tiempo t se representa con una distribución de probabilidad posterior. Este posterior a menudo se denomina creencia, y se define como la probabilidad condicional del estado actual xt dadas todas las medidas de imágenes pasadas zw y controles pasados u11.
bel (x£) =/>(xt|u1:É,z1:£).
El filtro de partículas se aproxima al posterior con un conjunto de muestras ponderadas, o partículas, denotado como:
Figure imgf000030_0001
en el que M es el número de partículas. Los términos partículas y modelos de embriones se usan indistintamente aquí. De este modo, una sola partícula xt[m] (en la que 1 <= m <= M) es una hipótesis del modelo de embrión en el tiempo t.
Después de la inicialización, el filtro de partículas aplica repetidamente tres etapas. La primera etapa es la predicción, en la que cada partícula se propaga utilizando la entrada de control:
Figure imgf000030_0002
El conjunto de partículas resultante es una aproximación de la probabilidad previa. La segunda etapa es la actualización de la medida, en la que a cada partícula se le asigna un peso de importancia correspondiente a la probabilidad de la medida actual:
w [ml = p ( Z i |x [ ml).
El conjunto de partículas ponderadas es una aproximación del posterior bel(xt).
Un componente clave del filtro de partículas viene en la tercera etapa, en la que el conjunto de partículas se vuelve a muestrear de acuerdo con sus pesos. Esta etapa de nuevo muestreo enfoca la distribución de partículas en la región de mayor probabilidad.
Representación celular
Las células se representan como elipses en el espacio 2D. Cada célula tiene un eje mayor, un eje menor, y una posición bidimensional en coordenadas cartesianas, dada por la ecuación:
(.r - * 0 )2 {y - y0)2 _
^ - 1 *
Cada elipse también tiene una dirección de rumbo 0 (guiñada), que le permite girar en el plano x-y. Dado que las elipses casi siempre se superponen entre sí, también denotamos un índice de superposición h, que especifica el orden de superposición (o la altura relativa de las células). Por lo tanto, los parámetros para cada modelo de embrión en el momento t se dan como:
Figure imgf000030_0003
en la que N es el número de células en ese modelo.
Perturbación y división celulares
La primera etapa del filtro de partículas es la predicción, en la que cada partícula se propaga utilizando la entrada de control. Para nuestra aplicación, hay dos tipos de comportamiento que queremos modelar. El primer tipo de comportamiento incluye el movimiento celular, que incluye traslación, rotación alrededor del ángulo de guiñada, y cambios en la longitud de los ejes mayor y menor. El segundo tipo de comportamiento es la división celular, en la que una célula se divide en dos nuevas células.
Para modelar el movimiento celular, nuestra entrada de control toma una partícula y perturba aleatoriamente cada valor para cada célula: xc¡, y0¡, ai, bi, 0i. La perturbación se muestrea aleatoriamente a partir de una distribución normal con una varianza relativamente pequeña (generalmente se establece en el 5% de los valores inicializados).
Para modelar la división celular, utilizamos el siguiente enfoque. En un momento dado, para cada partícula, asignamos un 50% de probabilidad de que una de las células se dividirá. Este valor se escogió empíricamente, y abarca un amplio intervalo de posibles divisiones celulares al tiempo que se mantiene una buena cobertura de la configuración actual. Si se predice una división, entonces la célula que se divide se escoge al azar. Un modelo más sofisticado podría tener en cuenta factores adicionales tales como el número de células en una partícula y el historial de sus patrones de división, y podría potencialmente crear modelos basados en el comportamiento observado a partir de datos reales.
Cuando se escoge una célula para dividirse, se aplica una división simétrica a lo largo del eje mayor de la elipse, produciendo dos células hijas de igual tamaño y forma. Después, cada valor de las células hijas se perturba aleatoriamente. La perturbación se muestrea nuevamente a partir de una distribución normal pero con una varianza mayor (10% de los valores inicializados) para adaptarse a una gran variabilidad en las nuevas formas celulares. Finalmente, los índices de superposición de las dos células hijas se seleccionan aleatoriamente al tiempo que se mantiene su superposición colectiva con respecto al resto de las células.
Simulación de imágenes
Después de aplicar la entrada de control a cada partícula, la representación de la partícula debe convertirse en una imagen simulada que se pueda comparar con las imágenes reales. La simulación precisa de imágenes puede ser una tarea difícil, y a menudo requiere el uso de técnicas de trazado de rayos y modelos ópticos. En lugar de intentar simular imágenes realistas, el método de la presente invención se centra en simular características que son fácilmente identificables en las imágenes. Específicamente, se simulan imágenes de membranas celulares.
Hay dos observaciones físicas que deben tenerse en cuenta. Primero, aunque el microscopio se enfoca en un solo plano a través del embrión, la profundidad de campo es bastante grande y la luz desenfocada se recolecta de casi todo el embrión. Y en segundo lugar, los embriones son parcialmente transparentes, lo que significa que las membranas de las células en la parte inferior del embrión a veces (pero no siempre) pueden verse a través de las células en la parte superior del embrión.
Con estas observaciones físicas en mente, ahora se describe el modelo de simulación de imágenes. Para cada célula, su forma elíptica correspondiente se proyecta sobre la imagen simulada usando el índice de superposición h. Los valores de píxel correspondientes se establecen en un valor binario de 1 y se dilatan para crear un grosor de membrana comparable a los datos de imagen observados. El índice de superposición h especifica el orden en el que las células se encuentran una encima de la otra. Dado que las membranas celulares ocluidas solo son visibles a veces, si se detectan puntos ocluidos, se colocan en la imagen simulada con baja probabilidad (normalmente alrededor del 10%). En la práctica, aunque estos puntos de membrana ocluidos son necesarios para un modelado de forma preciso, es importante hacerlos lo suficientemente dispersos para que no se parezcan a un borde visible.
Preprocesamiento de imágenes
Ahora se describirá la variable de medida z. Un objetivo del método de la presente invención es extraer imágenes binarias de las membranas celulares de las imágenes del microscopio para compararlas con las imágenes simuladas. Estas membranas exhiben alta curvatura y alto contraste, pero no se extraen fácilmente usando técnicas de umbralización basadas en la intensidad o el color. Por consiguiente, se emplea un detector basado en la curvatura principal. Este método utiliza el operador de Hesse:
Figure imgf000031_0001
en el que Ixx, Ixy e Iyy son derivadas parciales de segundo orden evaluadas en la ubicación del píxel s y escala gaussiana o. Los valores propios de la matriz hessiana 2x2 proporcionan información sobre las curvaturas principales, mientras que el signo de los valores propios distingue los “valles” de las “crestas” 43. Para detectar picos o crestas brillantes, la curvatura principal en cada píxel se calcula como
Figure imgf000031_0002
en la que X2 es el valor propio mínimo. Para detectar membranas de grosor variable, se aplica el operador de Hesse en un intervalo de escalas (es decir, omin <= o <= omax) y se extrae la curvatura máxima en este intervalo. Finalmente, la imagen de Hesse se establece como umbral para crear una imagen binaria de las membranas celulares extraídas. El nivel umbral generalmente se establece en el doble de la desviación estándar de los valores de píxeles en el hessiano.
Pesos de partículas
Como se describe en la sección titulada “Marco del filtro de partículas”, la segunda etapa principal del filtro de partículas es la actualización de la medida, en la que a las partículas se les asigna un peso de importancia correspondiente a la probabilidad de la medida actual dado un modelo en particular. En nuestro caso, el peso de importancia se determina comparando la imagen de microscopio preprocesada discutida anteriormente con la imagen simulada también discutida anteriormente.
Este problema se ha investigado anteriormente, en el que los pesos de los filtros de partículas se calcularon comparando imágenes simuladas con imágenes reales utilizando información mutua normalizada. Este enfoque es similar a la idea de la coincidencia de la cuadrícula de ocupación, que busca ubicaciones de píxeles que estén ambas ocupadas (valor 1) o ambas vacías (valor 0). Estos métodos pueden tener problemas cuando las imágenes simuladas y reales tienen una forma similar pero están ligeramente desalineadas. En cambio, el método que se describe utiliza una función de probabilidad basada en la distancia del chaflán, que mide el valor promedio de las distancias más cercanas de un conjunto de puntos a otro. Se definen dos conjuntos de puntos A (en el conjunto de números reales de tamaño m) y B (en el conjunto de números reales de tamaño n), correspondientes a los píxeles distintos de cero en la imagen simulada y en la imagen real, respectivamente. La distancia del chaflán hacia adelante desde el conjunto de puntos A a B se da como:
Figure imgf000032_0001
La distancia del chaflán hacia atrás se define de manera similar. El presente método emplea una distancia de chaflán simétrica, que proporciona una medida de cuán bien la imagen simulada coincide con la imagen real, así como cuán bien la imagen real coincide con la imagen simulada:
Figure imgf000032_0002
En la práctica, las medidas de distancia individuales se truncan para reducir la influencia del ruido. Para reducir el tiempo de cálculo, las distancias se determinan buscando la ubicación de los píxeles en las transformaciones de distancia de las imágenes.
La distancia del chaflán se utiliza como una medida de probabilidad de nuestra medida de datos dado el modelo estimado. Es decir, en el tiempo t, para una medida de imagen dada zt y un modelo de partículas xt[m], el peso de importancia de las partículas se da como:
Figure imgf000032_0003
La constante X se establece típicamente en 1, y se puede variar para controlar la “planaridad” de la distribución de probabilidad.
Re-muestreo de partículas y asignación dinámica
La tercera etapa principal del filtro de partículas es el re-muestreo, en el que las partículas se seleccionan en proporción a su peso para crear un nuevo conjunto de partículas. Las partículas con baja probabilidad se descartan, mientras que las partículas con alta probabilidad se multiplican. Ha habido mucho trabajo previo en el desarrollo de algoritmos eficientes para re-muestreo. El presente método utiliza el enfoque de baja varianza.
Un aspecto importante en los filtros de partículas es la elección del número de partículas. La elección más simple es usar un valor fijo, digamos M = 1000. Después, para cada etapa de tiempo, el conjunto de M partículas se transforma en otro conjunto del mismo tamaño. En el contexto de la solicitud, puede haber períodos de tiempo relativamente largos durante los cuales las células están inactivas o simplemente cambian ligeramente de tamaño y posición. Se aprovecha esta observación para reducir la carga de procesamiento asignando dinámicamente el número de partículas de acuerdo con la cantidad de actividad celular. Es decir, cuando las células están activas y dividiéndose, aumentamos el número de partículas, y cuando las células están inactivas, reducimos el número de partículas.
Para medir el grado de actividad celular, se calcula la suma de las diferencias cuadradas (SSD) en las intensidades de píxeles entre la nueva imagen (adquirida por el microscopio) y la imagen anterior. Para reducir el ruido, las imágenes se suavizan primero con un filtro gaussiano, y el valor SSD se suaviza con el tiempo con una media móvil causal. A continuación, el número de partículas se ajusta dinámicamente en proporción a este valor y se trunca para permanecer dentro de los límites 100<M<1000. La Fig. 30 es una gráfica que muestra cómo podría asignarse el número de partículas para un embrión que se divide desde la etapa de 1 célula a la de 4 células. Cabe señalar que este método simplemente proporciona una medida de la cantidad de “actividad” en la imagen, pero no distingue entre la división celular y el movimiento del embrión (traslación y/o rotación), debido a que no se realizó un registro de imagen previo. En esta situación (determinar el número de partículas), esto es aceptable ya que el número de partículas debería aumentar en cualquier caso. En la práctica, también ajustamos el número de partículas en función del número de células en el modelo de embrión más probable. Es decir, se generan más partículas cuando se cree que hay más células presentes en las imágenes.
Limitaciones del rastreo bidimensional
El algoritmo de rastreo celular 2D descrito anteriormente es útil para determinar el número de células en el embrión, así como sus formas 2D. Sin embargo, está limitado por el hecho de que no existe una representación física subyacente. Esto puede ser importante o no para rastrear automáticamente las divisiones celulares con el fin de evaluar la viabilidad del embrión. Por ejemplo, ciertos parámetros, tales como la duración de la citocinesis y el tiempo entre divisiones celulares, pueden medirse utilizando el algoritmo de rastreo celular 2D. En la siguiente sección ampliamos nuestro modelo 2d a 3D. Para hacer frente a las oclusiones y las ambigüedades de profundidad que surgen de la estimación de formas 3D a partir de imágenes 2D, se aplican restricciones geométricas y restricciones sobre la conservación del volumen celular.
Representación celular y rastreo tridimensional
Esta sección describe un algoritmo para el rastreo 3D de la división celular. Muchas de las etapas del algoritmo 2D se trasladan a este algoritmo, con algunas excepciones clave. Hay una nueva representación celular para uso en 3D. Las células ahora se representan como elipsoides en el espacio 3D, dadas por la ecuación:
Figure imgf000033_0001
Cada elipsoide también tiene una dirección de rumbo 0, un cabeceo y, y un balanceo a. De este modo, la representación de cada modelo de embrión en el tiempo t se da como:
Figure imgf000033_0002
Un efecto importante de este modelo revisado es que puede haber ambigüedades asociadas con inferir formas 3D a partir de imágenes 2D. Por ejemplo, una célula de forma esférica tendría un aspecto similar a una célula con un eje mayor más largo y una rotación de cabeceo más grande. Esto no es una preocupación importante, ya que como se mostrará más adelante, la distribución de partículas mantendrá estas múltiples hipótesis hasta que haya suficiente información disponible para hacer una distinción (por ejemplo, de un evento como la división celular).
Los elipsoides se consideran rígidos; es decir, la deformación no se modela explícitamente. Sin embargo, permitimos una pequeña cantidad de superposición entre elipsoides vecinos, y en estas regiones de superposición asumimos que las células están aplanadas entre sí. Esta es una consideración importante, ya que se observa comúnmente en los embriones, y la explicamos en las siguientes secciones.
Perturbación y división celulares
Nuestro modelo de división y perturbación celulares en 3D es similar al modelo en la Sección 4, “Perturbación y división celulares”, con algunas excepciones clave. La estimación de la forma 3D se puede utilizar para reforzar la conservación del volumen. Esto evita que las células crezcan arbitrariamente grandes, particularmente en la dirección z. La conservación del volumen se aplica en dos situaciones. Primero, para la perturbación celular, se varían los ejes a y b, y c se calcula de manera que se conserve el volumen para esa célula individual. En segundo lugar, para la división celular, se aplica la siguiente restricción:
4 4
—TTClpbpC-p = 'z rT í{{íd ib<J jC ¿1 "h f l - d j C ( j 3 )■
o o
en la que el subíndice p denota una célula madre, y los subíndices d1 y d2 denotan las dos células hijas. En la práctica, permitimos una ligera violación de estas restricciones al permitir que el volumen total del embrión fluctúe entre más/menos el 5% del volumen original. Esto se utiliza para compensar posibles inexactitudes en la estimación del volumen inicial.
Cuando se escoge una célula para dividirse en 3D, su división se modela de la siguiente manera. Primero, para la célula individual escogida, se aplica una división a lo largo del eje largo de la elipse, que podría ser a, b o c, según la configuración. Las células hijas se inicializan para que tengan el mismo tamaño y estén espaciadas uniformemente, teniendo en cuenta la rotación de la célula madre. Después, sus parámetros se alteran para cubrir un amplio intervalo de configuraciones posibles, nuevamente utilizando una distribución normal con una varianza establecida en el 10% de los valores inicializados.
Restricciones geométricas
Los problemas de oclusión y ambigüedad de profundidad se mitigan parcialmente mediante la conservación del volumen. Sin embargo, también se necesitan restricciones con respecto a las relaciones espaciales de los elipsoides vecinos. La primera restricción es que se prohíbe que las células se superpongan en más del 20% en el radio. Para las células que se superponen en una cantidad aceptable, se asume que se han aplanado entre sí. El modelo de partículas que se describe representa este fenómeno al ignorar los puntos dentro de los elipsoides que se cruzan durante la simulación de imágenes. Esto fue motivado empíricamente y se correlaciona bien con el comportamiento observado físicamente.
Se impone una segunda restricción que mantiene las células muy próximas. Esta restricción está directamente relacionada con el comportamiento físico de los embriones humanos, en los que las células están restringidas por una membrana denominada la zona pelúcida. La zona se modela como un caparazón esférico y se usa para imponer condiciones de contorno. El radio de la zona se establece en un 30% más grande que el radio del embrión de 1 célula.
Estas restricciones se aplican de la siguiente manera. Para cada partícula en un momento dado, se aplica una entrada de control aleatoria para generar una nueva partícula, como se discutió anteriormente. Si se ha violado alguna de las restricciones físicas, la nueva partícula se descarta y se aplica un nuevo control aleatorio. Si no se genera una nueva partícula satisfactoria después de un cierto número de intentos, entonces esa partícula se descarta.
Simulación de imágenes
La ventaja de la iluminación de campo oscuro, utilizada en los ejemplos, es que las membranas celulares dispersan la luz más que el interior de la célula. Este efecto es más pronunciado en lugares en los que las membranas celulares son paralelas al eje óptico (eje z). En consecuencia, para simular imágenes se buscan estas ubicaciones en nuestros modelos 3D, que no necesariamente se ubican en los ecuadores de los elipsoides debido a su rotación. Después se siguen las mismas reglas con respecto a los bordes visibles y ocluidos, como se discutió anteriormente.
Ejemplo de rastreo celular en 2D
Este ejemplo se refiere a la microscopía celular automatizada, y utiliza el algoritmo descrito anteriormente para el rastreo 2D de las divisiones celulares. Este modelo está diseñado para rastrear el número de células en la imagen, así como los contornos 2D de las membranas celulares. La primera etapa es la adquisición de imágenes, que motiva las secciones posteriores, tales como la simulación de imágenes y el preprocesamiento de imágenes. Las secuencias de imágenes de lapso de tiempo para este ejemplo se adquirieron con un microscopio invertido Olympus IX-50 personalizado, con un objetivo de 10X. El microscopio se modifica para iluminación de campo oscuro, en el que un cono hueco de luz se enfoca en la muestra colocando una abertura circular entre la fuente de luz y la lente condensadora. La lente del objetivo recoge la luz que es dispersada por la muestra y rechaza la luz transmitida directamente, produciendo una imagen brillante sobre un fondo oscuro. Una ventaja de la iluminación de campo oscuro es que las membranas celulares tienden a dispersar la luz más que el interior de la célula, mejorando así su contraste. El microscopio está equipado con una platina calentada y una cámara de incubación personalizada para permitir el cultivo de los embriones durante un período de hasta 5 o 6 días. Las imágenes se capturaron a intervalos de 5 minutos por una cámara digital Olympus SLR montada en el puerto lateral de la IX-50.
La formación de imágenes de los embriones comenzó cuando eran cigotos o huevos fertilizados con una forma apenas esférica. Para inicializar el conjunto de partículas, el hessiano umbralizado se calcula como se describe en la Sección 6, “Preprocesamiento de imágenes”, y se le ajusta un círculo usando mínimos cuadrados. Después, todas las partículas se inicializan como círculos con orientaciones aleatorias muestreadas a partir de una distribución uniforme.
La Fig. 31 muestra los resultados del algoritmo 2D para rastrear divisiones celulares desde la etapa de 1 célula a la de 4 células. Los resultados muestran que el algoritmo extrae con éxito las membranas celulares, incluso para las células hacia la parte inferior que están parcialmente ocluidas. Cabe señalar que en la mayoría de las aplicaciones de filtros de partículas, el mejor modelo “único” a menudo se representa como una suma ponderada de los parámetros de estado de la distribución de partículas. Sin embargo, para los resultados presentados aquí, se muestra la partícula con la mayor probabilidad.
Ejemplo de rastreo celular en 3D
La Fig. 32 muestra dos aplicaciones exitosas del algoritmo 3D descrito anteriormente para el rastreo desde la etapa de 1 célula a la de 4 células. La Fig. 33 es un diagrama que muestra un ejemplo de cómo se distribuyen las partículas durante una división de 1 célula a 2 células (correspondiente al primer ejemplo mostrado en la Fig. 32). Esta gráfica muestra la ubicación 3D de los centros de cada célula. A medida que la célula comienza a dividirse, las predicciones muestran una ambigüedad en cuanto a qué célula hija se colocará encima de la otra, pero esto se resuelve en un par de fotogramas.
Extracción de parámetros predictivos
Una vez modelados los embriones utilizando los métodos descritos anteriormente, se pueden extraer ciertos parámetros de los modelos. Normalmente, se utiliza el modelo mejor o más probable. Estos parámetros incluyen, por ejemplo, la duración de la primera citocinesis, el tiempo entre la primera y la segunda división celular, y el tiempo entre la segunda y la tercera división celular. La duración de la citocinesis se puede aproximar midiendo cuánto tiempo se alarga un modelo de célula antes de dividirse en dos células. El alargamiento se puede medir observando la relación entre los ejes mayor y menor de la elipse. Otros parámetros que se pueden extraer de los modelos incluyen el tiempo entre la fertilización y la primera división celular, las formas y simetrías de las células y los procesos de división, los ángulos de división, fragmentación, etc. Los parámetros se pueden extraer utilizando el algoritmo de rastreo celular 2D o el algoritmo de rastreo celular 3D.
La citocinesis se define por la primera aparición del surco de citocinesis hasta la separación completa de las células hijas. Dado que nuestros modelos de embriones están compuestos por elipses indeformables, identificar el aspecto del surco de citocinesis es una tarea desafiante. Un método sería permitir que las elipses se deformen, pero esto da como resultado un problema de rastreo más complejo. Otro método sería buscar cambios en la curvatura en la imagen microscópica preprocesada; sin embargo, esto frustra el propósito de intentar medir nuestros parámetros predictivos directamente de los modelos de embriones. De este modo, simplificamos el problema al aproximar la duración de la primera citocinesis como la duración del alargamiento celular antes de una división de 1 célula a 2 células. El alargamiento se cuantifica calculando la relación entre el eje mayor a y el eje menor b de la elipse. Una célula se considera alargada si:
Figure imgf000035_0001
Este valor del 15% se escogió empíricamente y funciona bien para este conjunto de datos en particular; sin embargo, se pueden utilizar otros valores. Una vez que un modelo de embrión se ha dividido en 2 células, podemos extraer la duración aproximada de la primera citocinesis calculando la duración del alargamiento para el modelo de 1 célula.
En principio, medir el tiempo entre eventos de mitosis es sencillo. Por ejemplo, el tiempo entre la primera y la segunda mitosis se puede medir como el tiempo entre el modelo de 2 células y el modelo de 3 células. Sin embargo, en algunos casos, los embriones pueden exhibir un comportamiento inusual y aleatorio. Esto incluye, por ejemplo, un embrión que pasa de 1 célula a 2 células, de 2 células a una aparente de 3 o 4 células, y después vuelve a 2 células. El algoritmo descrito es capaz de rastrear este tipo de comportamiento, pero plantea un desafío para determinar el intervalo de tiempo entre eventos de mitosis.
Una forma de lidiar con este comportamiento es la siguiente: en lugar de medir el tiempo entre un modelo de 2 y 3 células (para encontrar el tiempo entre la primera y la segunda mitosis), esto se puede aproximar simplemente contando el número de fotogramas de imagen en los que es más probable un modelo de 2 células. Esto funciona bien en algunos casos, pero no siempre es representativo del tiempo real entre eventos de mitosis. También se pueden hacer frente a estos eventos imponiendo una restricción a los modelos en función del número de células. Es decir, al escoger el modelo mejor o más probable de la distribución en cada iteración, se puede requerir que el número de células en el modelo permanezca siempre igual o aumente, pero nunca disminuya. Después de aplicar esta restricción, es sencillo calcular el tiempo entre eventos de mitosis. Esta restricción también es útil para filtrar los resultados de rastreo que pueden mostrar pequeñas cantidades de fluctuación, lo que ocasionalmente puede ocurrir cuando un modelo alterna entre un modelo de 1 célula y de 2 células, por ejemplo.
Método para extraer parámetros predictivos
La Fig. 35 muestra un diagrama de flujo que resume los métodos descritos anteriormente. El diagrama de flujo muestra cómo se puede analizar un solo embrión (aunque esto se puede aplicar a varios embriones u otros tipos de células y células madre). En la primera etapa, se adquiere una imagen de un embrión con un microscopio de lapso de tiempo (“medida”). Esta imagen se puede guardar en un archivo y volver a abrir en un momento posterior. La imagen generalmente se procesa previamente para mejorar ciertas características, aunque esto no es necesario. Se predicen modelos de posibles configuraciones de embriones, y se simulan imágenes a partir de estos modelos (“predicción”). La imagen simulada podría incluir imágenes de membranas celulares, como se describió anteriormente, o imágenes que representen con mayor precisión las imágenes del microscopio antes del preprocesamiento. Después, los modelos se comparan con la imagen del microscopio preprocesada (“comparación”). Con esta comparación, se mantienen las mejores predicciones, mientras que se descartan las malas. El conjunto de predicciones resultante se utiliza entonces para mejorar las predicciones para la siguiente imagen. Después de realizar este proceso para múltiples imágenes secuenciales, es posible medir parámetros morfológicos directamente desde el mejor modelo o modelos, tales como, por ejemplo, la duración de la citocinesis y el tiempo entre eventos de mitosis. Estos parámetros se pueden utilizar para evaluar la viabilidad del embrión, como se discutió anteriormente.
EJEMPLO 7
Análisis automatizado de la actividad celular
Los métodos descritos anteriormente requieren la capacidad de rastrear el desarrollo celular mediante microscopía. Para los embriones, es deseable rastrear varios embriones, que se cultivan juntos en la misma placa. Los métodos analíticos utilizados aquí también requieren que se tomen imágenes periódicamente (por ejemplo, cada 1-30 minutos durante 1-5 días para los embriones; se pueden usar diferentes intervalos de tiempo para otros tipos de células, tales como las células madre). Por lo tanto, se diseñó un método de formación de imágenes para realizar un rastreo automático del desarrollo del embrión.
En la microscopía de lapso de tiempo, las células se cultivan en condiciones controladas y se obtienen imágenes durante un período prolongado de tiempo para monitorizar procesos tales como la motilidad (movimiento dentro del ambiente), la proliferación (crecimiento y división), y los cambios en la morfología (tamaño y forma). Debido a la duración de los experimentos y la gran cantidad de datos de imágenes generados, extraer parámetros tales como la duración y el tiempo entre las divisiones celulares puede ser una tarea tediosa. Esto es particularmente cierto para aplicaciones de alto rendimiento en las que se obtienen imágenes de varias muestras simultáneamente. De este modo, existe la necesidad de un software de análisis de imágenes que pueda extraer la información deseada automáticamente.
Una forma de evaluar la viabilidad del embrión es medir la cantidad de “actividad celular” en las imágenes. Esto se puede lograr simplemente tomando pares secuenciales de imágenes y comparando sus valores de píxeles. Más específicamente, para medir la cantidad de actividad celular para cada nueva imagen, se calcula la suma de las diferencias al cuadrado (SSD) en las intensidades de píxeles entre la nueva imagen, denotada como I', y la imagen anterior, denotada como I', sobre todos los píxeles superpuestos i:
Figure imgf000036_0001
Para reducir el ruido, las imágenes se pueden suavizar primero con un filtro gaussiano. La Fig. 28 muestra una gráfica de la actividad celular desde el día 1 hasta el día 3 para un solo embrión. Como se muestra, hay picos agudos correspondientes a la división de 1 célula a 2 células, la división de 2 células a 4 células, y la división de 4 células a 8 células en un embrión humano. Las anchuras de los picos son representativas de las duraciones de las divisiones celulares.
Una de las limitaciones de este enfoque es que la métrica de SSD solo mide la cantidad de actividad en la imagen, y eventos como el movimiento del embrión (tal como el desplazamiento o la rotación) pueden parecer bastante similares a la división celular. Una solución a este problema es realizar un registro de imágenes antes de calcular la SSD. El registro de imágenes es el procedimiento de encontrar una relación geométrica entre dos imágenes para alinearlas en el mismo sistema de coordenadas, y se puede lograr utilizando una variedad de técnicas diferentes. Por ejemplo, se puede utilizar una variación de la rutina no lineal iterativa de Levenberg-Marquardt, que registra imágenes minimizando la SSD en intensidades de píxeles superpuestas. El algoritmo de LM transforma la ubicación de los píxeles utilizando una matriz de homografía de 3x3:
Figure imgf000036_0002
en la que las ubicaciones de los píxeles de destino x' e y' se normalizan como:
X
x = — y = — y .
Ü iV r
Así:
j = fW + h íV + h 2
/id r +- hry + /i#
Figure imgf000036_0003
La matriz de homografía se puede aplicar a una variedad de transformaciones de imágenes, y una opción razonable en esta aplicación serían las transformaciones de cuerpo rígido (euclidianas). Esto alinearía las imágenes de los embriones en traslación y rotación en el plano (a lo largo del eje de la cámara). Sin embargo, es posible generalizar ligeramente y usar una transformación afín, que permite sesgar la imagen. Esta generalización puede ser deseable o no, dependiendo de la señal que se intenta medir. Las ecuaciones de movimiento se convierten así:
x — hoT - f h iy 4- /í2
y h¿x - h i i j + /?.$
El algoritmo de LM primero calcula las derivadas parciales de e con respecto a los parámetros de movimiento desconocidos hk usando la regla de la cadena:
de s r óx' s r 5yf
Sh¡ Sx'Óhk 6yf Shk
Para los parámetros de movimiento afines, estas derivadas parciales se convierten en:
Se 5T_
SflQ '5xr
Se 61’
6ht V6xr’
Figure imgf000037_0001
Se s r
Sh3 X Syr'
6e_ _ 6T_
S ^ _ S T _
Sfa &yr
A continuación, utilizando estas derivadas parciales, el algoritmo de LM calcula la matriz hessiana aproximada A (en el conjunto de números reales de tamaño 6x6) y el vector gradiente ponderado b (en el conjunto de números reales de tamaño 6x1) sumando la contribución de cada píxel:
Figure imgf000037_0002
óe.i
bh £ Shk
Finalmente, los parámetros de movimiento se pueden actualizar añadiendo el movimiento incremental:
A H = (A A I)-Jb,
en el que la constante X regula el tamaño de la etapa de la actualización de movimiento, e I es la matriz de identidad. En cada iteración del algoritmo, la primera imagen se deforma de acuerdo con la estimación de movimiento actualizada y se compara con la segunda imagen calculando la SSD de intensidades de píxeles en áreas de superposición. La presente solicitud asume que el movimiento del embrión entre imágenes consecutivas es muy pequeño, y por lo tanto solo se lleva a cabo un número fijo y pequeño de iteraciones. La Fig. 28B muestra una gráfica de la actividad celular sin (28A) y con (28B) registros de imágenes realizados para cada par de imágenes. Dado que la función de error de la rutina de Levenberg-Marquardt es la SSD, simplemente se traza el error residual para cada registro. La Fig. 29 compara gráficas de actividad celular para el desarrollo embrionario normal y anormal. En el día 3, el punto en el que un embriólogo normalmente evaluaría la morfología, los embriones se ven similares, y ambos podrían considerarse potencialmente viables. Sin embargo, sus gráficas de actividad celular son drásticamente diferentes, ya que uno de los embriones sufre una serie típica de divisiones celulares mientras que el otro se divide de un embrión de 1 célula en múltiples células y fragmentos. Como era de esperar, el embrión que tiene una gráfica de actividad normal finalmente alcanza el blastocisto en el día 5,5.
Se pueden utilizar otros tipos de registro de imágenes antes de calcular la SSD en intensidades de píxeles. Esto incluye, por ejemplo, correlación cruzada, correlación cruzada normalizada, correlación de fase cruzada, información mutua, detección y rastreo de características, transformación de características invariantes de escala (SIFT), flujo óptico, y descenso de gradiente. El preprocesamiento de imágenes puede ser deseable o no antes del registro, tal como la mejora de características o contraste.
Modelo para evaluar la viabilidad embrionaria
La Fig. 13 muestra un modelo para el desarrollo de embriones humanos basado en la formación de imágenes y el análisis molecular correlacionados. Se muestra la línea de tiempo del desarrollo desde el cigoto hasta el blastocisto, incluyendo los breves tiempos críticos para la predicción del desarrollo exitoso del blastocisto, y un diagrama del desarrollo del embrión. Los datos moleculares clave, como se muestra en el diagrama, indican que los embriones humanos comienzan su vida con un conjunto distinto de ARN de ovocitos que se heredan de la madre. Este conjunto de ARN se mantiene y empaqueta adecuadamente mediante programas específicos de manejo de ARN en el óvulo. Después de la fertilización, la degradación de un subconjunto de ARN maternos específicos del óvulo (ESSP1; Patrón 1 Específico de Etapa Embrionaria) debe degradarse a medida que comienza la transición del ovocito al embrión. Paralelamente, otros ARN se reparten idealmente por igual en cada blastómero a medida que continúa el desarrollo (ESSP4). La degradación y reparto exitosos de los ARN culmina con la activación del genoma embrionario (EGA) y la transcripción de los genes de ESSP2 de forma autónoma celular. En particular, durante las divisiones de escisión, los blastómeros embrionarios pueden detenerse o progresar de forma independiente. El resultado del desarrollo autónomo celular en el embrión es que los blastómeros individuales pueden detenerse o progresar, y, a medida que el embrión de 8 células progresa a la etapa de mórula y más allá, la calidad del blastocisto se verá afectada por el número de células que se detuvieron o progresaron más allá de las 8 células.
Los datos de formación de imágenes demuestran que hay períodos críticos de desarrollo que predicen el éxito o el fracaso: primera citocinesis, la segunda división de escisión, y sincronicidad de la segunda y tercera divisiones de escisión. Estos parámetros se pueden medir automáticamente utilizando los algoritmos y el software de rastreo celular descritos anteriormente. Los sistemas y métodos descritos se pueden utilizar para diagnosticar el resultado del embrión con predictores claves de la formación de imágenes, y pueden permitir la transferencia de menos embriones en una etapa más temprana del desarrollo (antes de la EGA).
Comparación del análisis de imágenes automatizado frente a manual
La Fig. 34 muestra una comparación del análisis de imágenes automatizado con el análisis de imágenes manual para un conjunto de 14 embriones. Los embriones 1 a 10 (como se marcan en las gráficas) alcanzaron la etapa de blastocisto con morfología variable. Los embriones 11 a 14 se detuvieron y no alcanzaron el blastocisto. La Fig. 34A muestra la comparación para medir la duración de la primera citocinesis, y la Fig. 34B muestra la comparación para medir el tiempo entre la 1a y la 2a mitosis. Como se muestra, los dos métodos muestran una buena concordancia en general. Se esperan pequeñas cantidades de discrepancia para la duración de la primera citocinesis, ya que pueden atribuirse al hecho de que nuestro análisis automatizado hace una aproximación midiendo el alargamiento, como se discutió anteriormente. En unos pocos casos, existe un mayor desacuerdo entre el análisis automático y manual tanto para la duración de la citocinesis como para el tiempo entre la 1a y la 2a mitosis. Esto ocurre para algunos de los embriones anormales, y es causado por un comportamiento inusual que es difícil de caracterizar manualmente y rastrear automáticamente. Para este grupo de embriones, y utilizando solo los dos primeros criterios (duración de la primera citocinesis y tiempo entre la 1a y la 2a mitosis), el algoritmo automatizado tiene cero falsos positivos. Esto sería extremadamente importante en un procedimiento de FIV en el que se deben evitar los falsos positivos. El análisis manual de imágenes tuvo un falso negativo (embrión 9), mientras que el algoritmo automatizado tuvo dos falsos negativos (embriones 9 y 10). Sin embargo, aunque los embriones 9 y 10 técnicamente alcanzaron la etapa de blastocisto, mostraron una morfología deficiente en comparación con otros blastocistos, y serían candidatos menos óptimos para la transferencia. Para el análisis manual de imágenes, el embrión 14 sería un falso positivo basado en estos dos criterios, y el tercer parámetro de duración entre la segunda y la tercera mitosis es necesario para dar un verdadero negativo. Sin embargo, el algoritmo automatizado realiza la predicción correcta utilizando solo los dos primeros criterios. Estos resultados indican que nuestro algoritmo automatizado puede predecir con éxito blastocisto frente a no blastocisto, así como diferenciar entre diferentes calidades de blastocisto. De este modo, para situaciones en las que se determina que varios embriones tienen un buen potencial de desarrollo, es posible calcular una clasificación de sus cualidades relativas, con el fin de seleccionar los primeros 1 o 2 embriones para la transferencia durante los procedimientos de FIV.
Todos los ejemplos y el lenguaje condicional enumerados aquí están destinados principalmente a ayudar al lector a comprender los principios de la invención y los conceptos aportados por los inventores para promover la técnica, y deben interpretarse sin limitación a los ejemplos y condiciones citados específicamente.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar el potencial de desarrollo de un embrión humano, que comprende medir el siguiente parámetro celular:
el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda mitosis;
y emplear dicha medida del parámetro celular para proporcionar una determinación del potencial de desarrollo de dicho embrión;
en el que dicho potencial de desarrollo es la habilidad o capacidad para desarrollarse como un blastocisto.
2. El método según la reivindicación 1, que comprende medir tanto el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda mitosis como la sincronicidad de la segunda y tercera mitosis.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el método mide el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda mitosis, y es normal el intervalo de tiempo entre la primera y la segunda mitosis de 11,1 /- 2,1 horas.
4. El método de la reivindicación 2, en el que es normal una sincronicidad de la segunda y tercera mitosis de alrededor de 0-5 horas, por ejemplo 1,0 /- 1,6 horas.
5. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que dichos parámetros se miden mediante formación de imágenes de lapso de tiempo.
6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que dichos embriones humanos se han preparado recientemente a partir de ovocitos por fecundación in vitro.
7. El método de las reivindicaciones 1-5, en el que dichos embriones humanos se han congelado previamente.
8. El método de la reivindicación 5, en el que la formación de imágenes de lapso de tiempo se realiza con un microscopio controlado por ordenador equipado para almacenamiento y análisis digitales.
9. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la formación de imágenes de lapso de tiempo emplea iluminación de campo claro, iluminación de campo oscuro, contraste de fase, contraste de modulación de Hoffman, contraste de interferencia diferencial.
10. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el intervalo entre imágenes está entre 1 y 30 minutos.
11. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de determinar una clasificación de los potenciales de desarrollo relativos de los embriones dentro de un grupo.
12. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la formación de imágenes de lapso de tiempo se realiza con un microscopio controlado por ordenador que está equipado para el almacenamiento y análisis de imágenes digitales y el análisis de imágenes automatizado para predecir si es probable que el embrión se convierta en un blastocisto y determinar la calidad de un blastocisto.
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