CN107058455B - 猪2细胞胚胎体积的测量方法 - Google Patents

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Abstract

一种猪2细胞胚胎体积的测量方法。猪是重要的经济动物，其生殖调控研究既可以为人类生殖生理和病理过程研究提供参考，又可以为提高猪的繁殖性能提供理论依据，然而,繁殖力低下是目前困扰我国养猪业生产的一个难题。一种猪2细胞胚胎体积的测量方法，通过在显微镜下对猪2细胞胚胎进行拍照并测量，制作回归曲线，得到回归方程，然后通过简单拍照并测量，即可得到较为精确的胚胎体积，有利于进一步研究提高猪胚胎的发育潜能，提升猪生产效率，是一个鉴定高质量胚胎的可靠方法。本发明应用于胚胎工程技术领域。

Description

猪2细胞胚胎体积的测量方法
技术领域：
本发明涉及一种猪2细胞胚胎体积的测量方法。
背景技术：
猪是重要的经济动物，也是生物医学模型动物，其生殖调控研究既可以为人类生殖生理和病理过程研究提供参考，又可以为提高猪的繁殖性能提供理论依据。然而,繁殖力低下是目前困扰我国养猪业生产的一个难题。繁殖力低体现在各个阶段，包括卵减数分裂成熟率低、受精后早期胚胎发育率低、妊娠率及活仔率低等。其中，猪卵成熟和早期胚胎发育过程中的高比率损失已成为一个重要问题，因此，提高猪卵母细胞的发育潜能，对于提升猪生产效率来说，具有重要意义。为了提高人类体外受精(in vitro fertilization, IVF)的成功率，通常移植数枚胚胎，但这样会增加多重受孕的危险。在移植单卵的情况下，为了提高成功率，则需要一个鉴定高量胚胎的可靠方法。以往的评分系统都是以形态学指标为基础的，包括原核形态学，卵裂率，卵裂球数量和形态等，这些指标与胚胎活力有密切关系。胚胎初次卵裂时间也是一个挑选用来移植或冷冻的高质量胚胎的标准。一般认为卵裂球体积越大，发育能力越强。
现有的测量方法是直径估算法（如图1所示），但是该方法对猪2细胞胚胎体积的估算不够准确，此外，同一胚胎在旋转90度后，观察到的体积会有较大变化（如图2所示）。故有必要研发一种新的有效测量猪2细胞胚胎体积的方法，有助于评估猪卵母细胞的发育潜能。
发明内容：
本发明的目的是提供一种猪2细胞胚胎体积的测量方法。
上述的目的通过以下的技术方案实现：
一种猪2细胞胚胎体积的测量方法，其组成包括：猪2细胞，该方法包括如下步骤：
（1）制作回归曲线
A、将2细胞卵裂胚胎染色，将极体置于胚胎12点钟位置，在显微镜下拍照，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX1、左边细胞长度LY1、右边细胞宽度RX1、右边细胞长度RY1；
B、沿卵裂沟方向旋转90度，将极体旋转至胚胎上方，拍摄第2张照片，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX2、左边细胞长度LY2、右边细胞宽度RX2、右边细胞长度RY2；
C、由步骤A、B测量取得的LX1、LX2、LY1、LY2、RX1、RX2、RY1、RY2按照椭圆体计算得出左边细胞和右边细胞的体积；
D、然后用链酶蛋白酶去除透明带，分离2细胞，在显微镜下拍照，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX、左边细胞长度LY、右边细胞宽度RX、右边细胞长度RY；
E、由步骤D测量取得的LX、RX、LY、RY计算得出左边细胞和右边细胞的体积；
F、步骤C计算得出左边细胞和右边细胞的体积认为是估计值，步骤E计算得出左边细胞和右边细胞的体积认为是实际值，按照上述方法测量10枚胚胎，计算取得回归曲线，得到回归方程；
（2）测量猪2细胞胚胎两个细胞的体积，并计算预估体积：
经过步骤A、B的测量并根据回归方程计算，不用去除透明带就可以得出猪2细胞胚胎体积，用于后续活体培养，评估胚胎发育能力。
所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的胚胎染色剂为Hoechst 33342。
所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的步骤A、B、D中，拍照时，连续五次聚焦照片确保取得长度最大值。
所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的步骤D中，当分离2细胞后，若2细胞大小较为接近，去除透明带时为了防止混淆左侧细胞和右侧细胞，用持卵针在左侧细胞稍微用力吸出一个小突起，分离后可以辨认，放入二氧化碳培养箱恢复1小时，每隔20分钟检查和翻动细胞，防止细胞变为扁平，待其变为球体，在显微镜下拍照。
所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的去透明带前，细胞形态认为是接近椭圆体，计算得出左边细胞和右边细胞的体积，公式为：测量体积=（X1+X2）/2×Y1×Y2×1/6×π。
所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的去透明带后，细胞形态认为是球体，计算得出左边细胞和右边细胞的体积，公式为：测量体积=1/6×π×[（X+Y）/2]3。
本发明的有益效果：
1.本发明通过在显微镜下对猪2细胞胚胎进行拍照并测量，制作回归曲线，得到回归方程，然后通过简单拍照并测量，即可得到较为精确的胚胎体积，有利于进一步研究提高猪胚胎的发育潜能，提升猪生产效率，是一个鉴定高质量胚胎的可靠方法。
本发明参照表1：对10枚胚胎进行测量结果如下（附图说明中的附图11中显示）参照表2：对10枚胚胎进行计算，得到如下数据（附图说明中的附图12中显示）：
用去透明带后（实际值）20个数据（左右各十个）对去透明带前（估计值）20个数据进行直线回归（如图8所示），R2=0.9885拟合度好，得到回归方程：Y=1.04X+7.67。其中，Y为去透明带后实际测量值计算得到结果，X为根据去透明带前2细胞卵裂球测量结果计算值。
、根据回归曲线，经过步骤A、B的测量图9胚胎，用回归方程：Y=1.04X+7.67计算得出体积。不用去除透明带就可以得出猪2细胞胚胎体积左边269µm3，右边418µm3，用于后续活体培养，评估胚胎发育能力。
本实施例仍然去除透明带分离2细胞，得到图10细胞，实测计算得出实际体积为左边286µm3，为测量估计值的1.06倍，右边433µm3，为测量估计值的0.98倍，以验证本发明可信度。
由以上测试数据可以知道，通过本发明的方法估算的猪2细胞胚胎体积误差值可以控制在10%以内。
附图说明：
附图1是传统的猪2细胞胚胎体积的测量方法：直径估算法示意图。
附图2是同一胚胎旋转90度后照片数据变化示意图。
附图中：A为极体在12点钟位置；图中B为极体旋转90度后的位置。
附图3是去透明带前，猪2细胞胚胎体积的测量示意图。
附图4是同一胚胎旋转90度后极体位置变化3D模拟示意图。
图中：A为极体在12点钟位置；图中B为极体旋转90度后，在胚胎上方。
附图5是去透明带分离2细胞后，细胞示意图。
附图6是去除透明带时为了防止混淆示意图。
附图7是猪2细胞胚胎，细胞分离后体积测量实例图。
附图8是实施例1中的回归曲线示意图。
图中Y为去透明带后实际测量值计算得到结果；图中X为根据去透明带前2细胞卵裂球测量结果计算值。
附图9是实施例1，去透明带前，猪2细胞胚胎体积的测量实例图。
附图10：实施例1，猪2细胞胚胎，细胞分离后体积测量实例图。
附图11是对10枚胚胎进行测量结果的表格图。
附图12是对10枚胚胎进行计算，得到数据表格图。
具体实施方式：
实施例1：
一种猪2细胞胚胎体积的测量方法，其组成包括：猪2细胞，该方法包括如下步骤：
（1）制作回归曲线
A、将2细胞卵裂胚胎染色，将极体置于胚胎12点钟位置，在显微镜下拍照，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX1、左边细胞长度LY1、右边细胞宽度RX1、右边细胞长度RY1；
B、沿卵裂沟方向旋转90度，将极体旋转至胚胎上方，拍摄第2张照片，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX2、左边细胞长度LY2、右边细胞宽度RX2、右边细胞长度RY2；
C、由步骤A、B测量取得的LX1、LX2、LY1、LY2、RX1、RX2、RY1、RY2按照椭圆体计算得出左边细胞和右边细胞的体积；
D、然后用链酶蛋白酶去除透明带，分离2细胞，在显微镜下拍照，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX、左边细胞长度LY、右边细胞宽度RX、右边细胞长度RY；
E、由步骤D测量取得的LX、RX、LY、RY计算得出左边细胞和右边细胞的体积；
F、步骤C计算得出左边细胞和右边细胞的体积认为是估计值，步骤E计算得出左边细胞和右边细胞的体积认为是实际值，按照上述方法测量10枚胚胎，计算取得回归曲线，得到回归方程；
（2）测量猪2细胞胚胎两个细胞的体积，并计算预估体积：
经过步骤A、B的测量并根据回归方程计算，不用去除透明带就可以得出猪2细胞胚胎体积，用于后续活体培养，评估胚胎发育能力。
实施例2：
根据实施例1所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的胚胎染色剂为Hoechst33342。
实施例3：
根据实施例1或2所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的步骤A、B、D中，拍照时，连续五次聚焦照片确保取得长度最大值。
实施例4：
根据实施例1或2或3所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的步骤D中，当分离2细胞后，若2细胞大小较为接近，去除透明带时为了防止混淆左侧细胞和右侧细胞，用持卵针在左侧细胞稍微用力吸出一个小突起，分离后可以辨认，放入二氧化碳培养箱恢复1小时，每隔20分钟检查和翻动细胞，防止细胞变为扁平，待其变为球体，在显微镜下拍照。
实施例5：
根据实施例1或2或3或4所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的去透明带前，细胞形态认为是接近椭圆体，计算得出左边细胞和右边细胞的体积，公式为：测量体积=（X1+X2）/2×Y1×Y2×1/6×π。
实施例6：
根据实施例1或2或3或4或5所述的猪2细胞胚胎体积的测量方法，所述的去透明带后，细胞形态认为是球体，计算得出左边细胞和右边细胞的体积，公式为：测量体积=1/6×π×[（X+Y）/2]3。
实施例7：
由说明书附图2所示，同一胚胎的会导致取得数据不同，胚胎左照片旋转90度得到右照片，故需要拍摄第1张照片后，旋转90度拍摄第2张照片。
实施例8：
根据说明书附图3得出同一胚胎测量得到左边细胞宽度LX1、左边细胞长度LY1、右边细胞宽度RX1、右边细胞长度RY1；沿卵裂沟方向旋转90度，拍摄第2张照片，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX2、左边细胞长度LY2、右边细胞宽度RX2、右边细胞长度RY2。
实施例9：
根据说明书附图6所示2细胞大小较为接近，去除透明带时为了防止混淆左侧细胞和右侧细胞，用持卵针在左侧细胞稍微用力吸出一个小突起如A所示，分离后可以辨认如B所示。
实施例10：
根据说明书附图9得出同一胚胎测量得到左边细胞宽度LX1、左边细胞长度LY1、右边细胞宽度RX1、右边细胞长度RY1；沿卵裂沟方向旋转90度，拍摄第2张照片，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX2、左边细胞长度LY2、右边细胞宽度RX2、右边细胞长度RY2。

Claims (1)

1.一种猪2细胞胚胎体积的测量方法，其组成包括：猪2细胞，其特征是：该方法包括如下步骤：
（1）制作回归曲线
A、将2细胞卵裂胚胎染色，将极体置于胚胎12点钟位置，在显微镜下拍照，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX1、左边细胞长度LY1、右边细胞宽度RX1、右边细胞长度RY1；
B、沿卵裂沟方向旋转90度，将极体旋转至胚胎上方，拍摄第2张照片，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX2、左边细胞长度LY2、右边细胞宽度RX2、右边细胞长度RY2；
C、由步骤A、B测量取得的LX1、LX2、LY1、LY2、RX1、RX2、RY1、RY2按照椭圆体计算得出左边细胞和右边细胞的体积；
D、然后用链酶蛋白酶去除透明带，分离2细胞，在显微镜下拍照，用矩形框架校正测量数据边缘然后测量长度，分别得到左边细胞宽度LX、左边细胞长度LY、右边细胞宽度RX、右边细胞长度RY；
E、由步骤D测量取得的LX、RX、LY、RY计算得出左边细胞和右边细胞的体积；所述的去透明带后，细胞形态认为是球体，计算得出左边细胞和右边细胞的体积，公式为：测量体积=1/6×π×[（X+Y）/2]3；
F、步骤C计算得出左边细胞和右边细胞的体积认为是估计值，步骤E计算得出左边细胞和右边细胞的体积认为是实际值，按照上述方法测量10枚胚胎，计算取得回归曲线，得到回归方程；
（2）测量猪2细胞胚胎两个细胞的体积，并计算预估体积：
经过步骤A、B的测量并根据回归方程计算，不用去除透明带就可以得出猪2细胞胚胎体积，用于后续活体培养，评估胚胎发育能力；
所述的胚胎染色剂为Hoechst 33342；
所述的步骤A、B、 D中，拍照时，连续五次聚焦照片确保取得长度最大值；
所述的步骤D 中，当分离2细胞后，若2细胞大小较为接近，去除透明带时为了防止混淆左侧细胞和右侧细胞，用持卵针在左侧细胞稍微用力吸出一个小突起，分离后可以辨认，放入二氧化碳培养箱恢复1小时，每隔20分钟检查和翻动细胞，防止细胞变为扁平，待其变为球体，在显微镜下拍照；
所述的去透明带前，细胞形态认为是接近椭圆体，计算得出左边细胞和右边细胞的体积，公式为：测量体积=（X1+X2）/2×Y1×Y2×1/6×π。
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