CN105431543B - 用于体外受精技术的基于分子的小鼠胚胎分析的方法和质量控制 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种定量评价体外受精中使用的产品的方法。本发明还公开了一种用于临床辅助生殖技术(ART)的改进的质量控制分析方法。

Description

用于体外受精技术的基于分子的小鼠胚胎分析的方法和质量 控制
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的、名称为“用于体外受精技术的基于分子的小鼠胚胎分析的方法和质量控制”的美国临时专利申请第61/783,557号的优先权，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及评价细胞生物学(例如，体外受精)中使用的产品的方法。本发明还公开了用于临床辅助生殖技术(ART)的质量控制分析方法。
背景技术
体外受精(IVF)实验室在治疗不能生育的夫妻方面发挥重要作用。确保IVF实验室中合适的质量控制(QC)对于任何IVF项目的成功而言都是至关重要的，因为实验室环境可改变所产生的胚胎的质量。最优的培养基和稳定的环境对于人胚胎体外成功发育而言是必需的。胚胎学实验室的最终作用是在女性生殖道之外的环境中保持配子和胚胎的固有生存能力。植入前胚胎发育的动态性是独一无二的，因为胚胎不像体细胞培养物那样，胚胎在形态和功能方面不断且快速地发生变化(Leese 1991；Bavister 1995)。
在发育过程中，植入前胚胎仅在几天的过程中就在母本转录本的基因控制下从新陈代谢静止的未分化的单个细胞快速转变成动态的多细胞胚胎，该动态的多细胞胚胎已发育出了自我平衡机制及其自身功能基因组(Leese 1991；Lane 2001；Gardner etal.2005)。早期胚胎依赖于基于丙酮酸酯的代谢并且仅依赖于线粒体氧化磷酸化作用产生能量；与单细胞生物体相似，所述早期胚胎缺乏很多用于pH和渗透控制的关键调节作用。在8细胞期至16细胞期(取决于物种)进行压缩之后，代谢控制变成高度糖酵解代谢。同时，随着胚胎生理学变得更加类似于体细胞，在其他细胞机制的功能复杂性方面也存在显著的转变。该显著的转变是早期胚胎及其在植入前发育的后期阶段的后续发育过程中自我平衡调节的最初的天然特性，这种最初的天然特性在实验室中产生很大的挑战。维持有利的体外环境对于最大化生存能力以及促进不断发育而言是必需的。
相对于生殖道中遭遇的“正常”条件，培养物的发育过程中胚胎周围的环境的扰动导致胚胎生存能力降低以及发育受损。如下文所讨论的，本领域需要用于测试在人IVF中使用的物质的胚胎毒性以及生长促进因素和抑制因素的客观、灵敏且可重复的方法和分析。
发明内容
在本领域中，通常难以使用形态作为标志物来评价次优环境对胚胎和其他细胞的影响。例如，在一些情况下，发育成看起来形态正常的囊胚的胚胎事实上可能不完全正常或健康。例如，这种看起来形态正常的囊胚可在细胞水平上受到损伤。损伤的囊胚的植入能力和产生成功的足月妊娠的能力可能降低。在收集和培养过程中胚胎所暴露的环境可显著改变胚胎的发育可能性和细胞调节作用。小鼠胚胎分析方法(MEA)是检查不涉及人类物质的培养基和环境的适用性的金标准。用于执行MEA的基本技术和规程在体外受精和胚胎转移： 基本技术指南(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer:A Manual of BasicTechniques，Don P.Wolf,编辑，1988,第57-75页)中列举，该参考文献的全部内容通过引用并入本文。简言之，分析方法涉及用孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)使雌性小鼠超数排卵。在注射hCG时将所述雌性小鼠与雄性小鼠放在一起，并在注射hCG之后24小时杀死所述雌性小鼠以获得单细胞胚胎或在注射hCG之后36小时杀死所述雌性小鼠以获得两细胞胚胎。如果单细胞胚胎具有两个极体可见物，选择使用单细胞胚胎，如果两细胞胚胎看起来形态正常，那么选择使用两细胞胚胎。
MEA用于生殖培养基，实验室器具或待与配子和/或胚胎接触的任何设备的毒性和功能性的测试。需要关于这类测试的信息作为II类辅助生殖设备的特定控制的基本原理是这种测试是在辅助生殖设备中用于配子和/或胚胎的物质的潜在毒性的良好的替代指示。FDA已认可了MEA是目前用于胚胎毒性的最合适的测试。简言之，使用单细胞分析和两细胞分析，并且除了单细胞胚胎相对于两细胞胚胎较早地从小鼠输卵管中冲刷出去之外，单细胞分析和两细胞分析是等同的。无论使用单细胞MEA还是两细胞MEA，生物分析应当尽可能代表所述设备用于人IVF的相应步骤，所述步骤例如，胚胎的获取、维持、培养、转移(再定位)以及冷冻保存。通常，在培养96个小时之后评价胚胎形态并确定囊胚的形成。如果多于80％的受精卵已达到囊胚阶段，那么所测试的培养基、实验室器具或其他仪器被认为适于临床应用。
除了检测胚胎毒性之外，MEA能够检测次优原材料、培养基和与IVF和ART有关的接触物质。然而，该分析中还有很多通常被忽视的局限性。例如，所述分析可仅检测严重且苛刻的胚胎毒性条件。MEA无法在发育的非常早的阶段检测或区别生长促进因素或生长抑制因素。
本文描述的实施方式通常涉及提供用作例如体外受精(IVF)环境和/或辅助生殖技术(ART)的质量控制的基于分子的小鼠胚胎分析(mMEA)的系统和方法，并且更加具体而言，本文描述的实施方式涉及用于评价从单细胞期或两细胞期至囊胚期的胚胎发育的改进的分析方法。
通过本发明的描述，结合其他方面，基于下文的描述和权利要求书，本发明的优势变得清楚和明显，本发明的优势由下面部分中所描述的附图来支持。
一方面，本发明提供评价用于人IVF或ART的产品的质量控制方法。所述方法包括提供转基因胚胎(至少单细胞)以及体外培养胚胎持续特定时间段。所述方法还包括评估从单细胞期或两细胞期至囊胚期和超过囊胚期的胚胎发育。所测试的项目的可接受性或失效基于胚胎发育的定量和定性分析来确定。任选地，单细胞胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎发育/多能性调节子的调节区域的至少一个荧光蛋白转基因。
转基因可包括编码所选择的荧光蛋白的报告基因，所述荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)，红色荧光蛋白，蓝绿色荧光蛋白，桔色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
另一方面，所述质量控制方法和分析方法被设计为评估在IVF环境和/或ART中使用的测试项目。所述测试项目可包括配子和胚胎培养基，配子和胚胎处理/加工培养基(包括洗涤和分离培养基)，运输培养基，用于剥离卵母细胞的酶，精子分离梯度，冷冻/玻璃化培养基，解冻/加温培养基，吸管和胚胎处理设备，在人体外受精过程中使用的实验室器具，所述实验室器具包括但不限于：培养皿，离心管，冷冻保存和低温贮存设备以及体外ART相关步骤所涉及的任何溶液、试剂或设备。
另一方面，评估胚胎发育通过分析与胚胎的发育阶段相关的一般胚胎形态和/或荧光位置/数量/品质来完成。优选地，所述胚胎来源于哺乳动物，并且可包括鼠胚胎、猪胚胎、马胚胎、牛胚胎、绵羊胚胎、兔胚胎和非人类灵长类动物胚胎。
再一方面，可操作地连接的胚胎多能性调节子可包括但不限于：Oct-4,Sox2，Nanog，CDX2和Rex1以及它们的上游介导物和下游效应子，所述上游介导物和下游效应子在确保正常胚胎发育方面发挥作用。
胚胎发育可在任何或全部阶段进行评价，所述阶段包括1-细胞期和2-细胞期，4-细胞期，8-细胞期，桑葚胚期，囊胚期和原肠胚形成期。
本发明还提供在临床ART中使用的评估在处理和保存人配子以及产生、培养和保存人胚胎的过程中使用的产品的质量控制分析方法或试剂盒。所述分析方法有利地包括从转基因哺乳动物中收获的转基因单细胞胚胎，其中，所述胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎多能性标志物的调节区域的至少一个报告基因；以及用于评估ART产物和IVF培养条件的指示。所述指示可包括在一些培养条件下孵育转基因单细胞胚胎以及基于来自单细胞期和两细胞期至囊胚形成期和原肠胚形成期的形态评估胚胎发育。
任选地，报告基因编码荧光蛋白，所述荧光蛋白例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝绿色荧光蛋白、桔色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
另一方面，所述分析方法包括至少一个转基因胚胎，其中，所述转基因包括至少一个胚胎多能性调节子和/或其调节区域(例如，上游介导物和/或下游效应子)，其中，所述多能性调节子在确保正常胚胎发育方面发挥作用。测试项目/生长条件可基于胚胎生长、发育和品质进行评估，所述胚胎生长、发育和品质基于对胚胎形态的评价和/或荧光定量/定性评价。用于最优胚胎生长和发育的可接受的阈值基于独特的设定标准，所述标准取决于测试项目和在正常/对照条件下的预期的发育。在测试项目不符合相对于正常对照已确立的接受标准的事件中，所述测试项目可被认为是次优的或胚胎毒性的(即，不可接受的)。
本发明的又一方面，本发明描述了具有提高的灵敏度的用于临床人ART/IVF的质量控制的胚胎分析方法。所述分析方法可包括转基因单细胞胚胎。所述胚胎可包括可操作地连接至与胚胎发育有关的至少一个基因的至少一个报告基因。优选地，所述胚胎在最优和次优胚胎条件下差异表达转基因/报告基因。另一方面，培养条件是胚胎毒性的。本发明还提供测试项目，例如，胚胎培养基，配子处理培养基，用于剥离卵母细胞的酶，精子分离梯度，冷冻培养基，解冻培养基，吸管和胚胎处理设备，或在人体外受精过程中使用的实验室器具，所述实验室器具包括但不限于：培养皿，离心管，冷冻保存和低温贮存设备。
本文公开的本发明还包括使用对胚胎发育至囊胚阶段进行分析提高胚胎分析方法的灵敏度的方法。所述方法包括提供转基因胚胎，所述转基因胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎多能性标志物的调节区域的至少一个报告基因；在使用测试项目的培养条件下孵育转基因胚胎；以及在形态上评估胚胎发育和/或通过从单细胞期至囊胚期和/或原肠胚形成期的上述胚胎标志物的表达评估胚胎发育。
任选地，提高胚胎分析方法的灵敏度的方法还包括评估在囊胚期和超过囊胚期(原肠胚形成期)的胚胎标志物的表达。所述评估可包括测定报告基因的荧光。所述分析方法可检测培养基和/或培养物质中的胚胎毒性。一方面，所述分析方法检测培养基的功能性和在临床体外受精环境中使用的物质的适用性。
本发明公开了包括可操作地连接至至少一个胚胎多能性调节子的调节区域的至少一个转基因的改良的转基因胚胎。所述胚胎多能性调节子包括这些调节子的基因以及在确保正常胚胎发育中发挥作用的它们的上游介导物和下游效应子。有利地，所述转基因是报告基因。所述报告基因可以是荧光或发光蛋白，例如，绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，蓝绿色荧光蛋白，桔色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
附图说明
专利文件或申请文件包括至少一个彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本根据请求并在支付了所需的费用的条件下由专利局提供。
图1是在最优和次优IVF生长条件下从2-细胞期孵育至囊胚期的小鼠胚胎的彩色照片。所述小鼠胚胎包含连接至荧光标记的OCT4胚胎多能性调节子。
图2表示在最优或次优生长条件下OCT-4的表达。图2A是在最优生长条件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。图2B是在次优生长条件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。胚胎生长至囊胚期，随后由DAPI(蓝色，核染色)和抗-OCT-3/4抗体(红色)染色。所述胚胎通过荧光显微镜显像。
图3表示在最优或次优生长条件下SOX2的表达。图3A是在最优生长条件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。图3B是在次优生长条件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。图3C是在次优生长条件下孵育的小鼠胚胎的彩色照片。胚胎生长至囊胚期，由DAPI(蓝色)和抗-SOX2抗体(绿色)染色，随后在荧光显微镜下拍摄照片。
具体实施方式
在阅读了本发明说明书之后，如何以各种不同的可选的实施方式和可选的应用方法实施本发明对于本领域技术人员而言变得明显。然而，本发明的所有各种不同的实施方式不会在本文中一一描述。应当理解的是，本文提供的实施方式仅仅是以举例说明的方式呈现，并不对本发明构成限定。因此，对各种不同的可选的实施方式的详细描述不应当被解释为对本发明的范围的限定，如下面所举例说明的。
在公开和描述本发明之前，应当理解的是，下文描述的各个方面不限于特定的组合物，制备这些组合物的方法或其应用，当然这些组合物、方法或其应用可发生改变。还应当理解的是，本文使用的术语的目的仅在于描述特定的方面，但无意限定本发明。
仅为了便于读者阅读，将对本发明的详细描述分为各个不同的部分并且任何部分中所公开的内容可与另一部分所公开的内容合并。除非另有说明，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
在该说明书和后附的权利要求书中，参考所定义的具有如下含义的多个术语。
本文使用的术语的目的仅在于描述特定实施方式，但无意限定本发明。除非另有明确规定，本文使用的单数形式的冠词“a”，“an”和“the”还意在包括复数形式。
“任选的”或“任选地”是指后续描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且所描述的内容包括发生所述事件或情况的实例和不发生所述事件或情况的实例。
术语“包含”是指组合物和方法包括所记载的元素但不排除其他元素。当将“基本由……构成”用于限定组合物和方法时，其是指排除对组合产生任何实质影响的其他元素。例如，基本由本文所限定的元素构成的组合物可不排除对要求保护的本发明的基本特征和新特征不产生实质性影响的其他元素。“由……构成”是指排除多于痕量的其他成分和所记载的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方式在本发明的范围内。
本文使用的术语“调节区域”包括目标基因的合适的表达所需的所述目标基因的所有元件和/或序列。已知的调节元件包括启动子、增强子、沉默子、绝缘子，等等。调节区域可包括在3’未翻译区域内的或编码序列中的转录起始位点的上游区域(5’未翻译区域)，转录起始位点的下游区域，内含子内的区域，3’未翻译区域中的区域，或者编码序列内的区域。例如，调节区域可仅仅包括指导转基因的表达的生存能力标志物基因的最少必需元素。在其他方面，调节区域可包括生存能力标志物基因的较大部分或基本全部生存能力标志物基因，包括部分或全部编码区域。调节区域还可包括上游介导物和/或下游效应子。
本文使用的术语“生存能力标志物”是指其表达或缺失表明发育的至少一个阶段的胚胎的生存能力的任何基因。生存能力标志物包括胚胎发育标志物和多能性标志物。总体而言，这些标志物包括与胚胎干细胞相关的转录基因。本文使用的多能干细胞标志物在可预计的水平上表达并在可预计的胚胎发育时间定位。生存能力标志物可在胚胎发育的某一阶段表达。在发育过程中的某一时间的表达可说明胚胎正在正常发育，表达的缺乏可说明异常发育。可选地，生存能力标志物可以是在胚胎发育的某一阶段不正常表达的基因，并且该基因在这一时间的表达说明异常发育。
本文使用的术语“报告基因”包括能够可操作地连接至生存能力标志物的调节区域的并且可被显像或以其他方式被评估以确定其表达的任何基因。在优选的实施方式中，所述报告基因是荧光蛋白或发光蛋白。在一些实施方式中，报告基因可以是或可包括，例如，被抗体识别的表位标记(例如，HIS,FLAG,HA)。
本文使用的产品的“可接受性”由囊胚的存活、发育和/或报告基因表达的比例来确定，所述比例基本等于或高于在对照或标准中所观察到的比例(例如，高于80％发育的囊胚)。类似地，本文使用的“失效”由低于在对照或标准中所观察到的比例来确定。
本文使用的“对照条件”是已知的提供最优胚胎生长和/或发育的条件。“测试条件”是使用待测试其对胚胎生长和发育的影响的IVF产品的条件。
本文使用的“最优”条件是指促进健康的、不受约束的胚胎发育的条件。相反，“次优”条件是使得一些细胞生长但是这种生长比预期在最优培养条件下观察到的生长更慢并且更不强健的培养条件。本文使用的“胚胎毒性”是指诱导异常发育或胚胎死亡的培养条件。
本文使用的“辅助生殖技术”或ART包括所有不孕不育治疗，其中，雌性配子(卵子或卵母细胞)和雄性配子(精子)均被处理。体外受精(IVF)是用于帮助不能生育的夫妻怀孕的若干种辅助生殖技术中的一种。IVF是指从雌性卵巢中取出卵子并且在实验室规程中通过精子使该卵子受精的过程。受精卵(胚胎)可冷冻保存以后使用或转移至子宫。
本文使用的“囊胚”是指由可形成胎盘的带有围绕的壁的细胞球(滋养外胚层或TE)，可形成羊膜囊的填充有液体的腔室(囊胚腔)以及称为内细胞团(ICM)的内部细胞簇构成的早期胚胎发育中的结构，胎儿从所述内部细胞簇中形成。涉及本发明的其他术语在下文中更加详细地定义和描述。
总体而言，本文公开了涉及评价一些培养条件或参数对生物细胞的培养和发育的影响的方法，系统和试剂盒。例如，一些实施方式涉及用于评价体外受精或ART的培养条件的质量控制方法。例如，从诸如小鼠之类的报告转基因动物中收获的受精胚胎用于检测可能的有害的或次优培养条件或参数。有效地，转基因胚胎提供更加灵敏的且功能上相关的定性质量控制(QC)分析方法，例如，用于测试临床体外受精和ART实验室中使用的设备以及对临床体外受精和ART实验室中使用的设备进行合格鉴定。
如下文更加详细描述的，所述方法可包括提供具有至少一个细胞的转基因囊胚，在体外或辅助生殖技术(“ART”)培养条件下培养囊胚，以及评估囊胚分化以确定培养条件的可接受性。下文详细描述的质量控制分析方法和执行质量控制分析的方法包括哺乳动物转基因胚胎(至少一个细胞)。在优选的实施方式中，胚胎处于单细胞期或两细胞期。哺乳动物胚胎可获自于牛类、绵羊类、猪类、鼠类、狗类、马类、猴类或人类来源。在一些实施方式中，哺乳动物胚胎是猪类、马类或牛类。更加普遍地，所述胚胎是鼠类衍生的。
本文描述的分子MEA相对于目前用于测试IVF试剂和消耗品的标准MEA可具有许多优势。所述标准MEA基于一个或多于一个发育阶段的胚胎形态的确定。相反，分子MEA可使用发育标志物的分子分析以确定测试产品对胚胎发育的影响。而且，分子MEA可将发育标志物的分子分析与形态分析相结合以确定测试产品对胚胎发育的影响。有益之处包括可获得早期结果，提高灵敏度以及可实现自动操作。当使用小鼠胚胎时，次优培养条件可在48小时这么早的时间表现出来。此外，可观察到具有较小的有害作用，尤其是影响基因表达但不影响形态的作用的IVF试剂。例如由荧光表示的报告基因的表达可被定量或定性确定，包括例如，通过机械方法，使自动化操作得到提高(例如，自动评价)。
为了便于读者理解，在说明书中可使用标题或小标题，这些标题或小标题无意影响本发明的范围。此外，本说明书中使用的一些术语在下文中更加具体地限定。
I.方法
配子和胚胎的培养是任何生殖研究实验室的主要部分，同样，塑料和玻璃器具和其他消耗品，例如，手套、平板、培养基、化学品和油的使用是任何生殖研究实验室的主要部分。在IVF环境中，所有消耗品和材料的质量控制对于保持胚胎培养的最优环境而言至关重要，由此确保正常胚胎生理学和随后的妊娠率。因此，一些实施方式涉及评估IVF消耗品和材料对胚胎的影响或作用(例如，潜在的毒性)的方法。
如本文使用的，IVF消耗品包括但不限于：培养基、培养基补充品、塑料器具、管子、吸管、吸管头，等等，或与人类卵子或胚胎接触的任何材料。塑料和玻璃器具可包括辅助生殖针头、实验室手套、辅助生殖导管和诸如吸管之类的辅助生殖微型工具，或在实验室中用于剥离、显微操作、固定或转移胚胎的其他设备。IVF消耗品进一步包括辅助生殖实验室器具，其包括但不限于：注射器、IVF组织培养皿、IVF组织培养板、吸管头、平皿、平板，以及与配子、胚胎或组织培养基物理接触的其他容器。如本文使用的，IVF消耗品可包括辅助生殖水和意在产生高质量无菌、无热原水的水纯化系统，所述无菌无热原水用于复溶培养基，所述培养基用于抽吸、孵育、转移或存储IVF或其他辅助生殖过程的胚胎，并且所述无菌无热原水用作将会接触胚胎的实验室器具或其他辅助生殖设备的最终漂洗。可被测试的产品的非限定性实例可在21C.F.R.884.6100以及后面的内容中找到，该参考文献的相关部分通过引用并入本文。
一方面，本发明涉及评价用于辅助生殖技术(ART)的产品的方法，所述方法可包括例如，提供包含至少一个细胞的转基因胚胎，其中，所述胚胎包含可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的调节区域的至少一个转基因；体外培养胚胎持续指定时间段；评估转基因在胚胎发育的至少一个阶段的表达；以及基于所述评估确定所述产品的可接受性或失效，其中，所述产品以与其在ART中的预期使用类似的方式在所述方法中使用。在一些实施方式中，所述转基因是报告基因。
一方面，本发明涉及评价用于辅助生殖技术(ART)的产品的方法。所述方法可包括例如，提供转基因胚胎，其中，所述胚胎包含可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的调节区域的至少一个报告基因；体外培养所述胚胎持续指定时间段；评估至少一个报告基因在胚胎发育的至少一个阶段的表达；以及基于所述评估确定所述产品的可接受性或失效，其中，所述产品以与其在ART中的预期使用类似的方式在所述方法中使用。
一方面，本发明涉及评价用于辅助生殖技术(ART)的产品的方法。所述方法可包括例如，提供转基因胚胎，其中，所述胚胎包含可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的调节区域的至少一个报告基因；使用计划用于ART的产品；体外培养所述胚胎持续指定时间段；在指定时间段的至少一部分评估培养的胚胎中的至少一个报告基因的表达；以及基于所述至少一个报告基因的表达评价所述产品的使用对所述胚胎的影响。在一些实施方式中，所述产品以与其在ART中的预期使用类似的方式在所述方法中使用。在一些实施方式中，所述方法进一步包括基于所述评价确定所述产品的可接受性或失效。
在一些实施方式中，所述方法可包括例如，在胚胎发育的至少一个阶段评估胚胎的形态。在一些实施方式中，转基因胚胎作为单细胞胚胎或两细胞胚胎提供。在一些实施方式中，转基因胚胎来自于哺乳动物。在一些实施方式中，所述哺乳动物是鼠类、猪类、马类、牛类、绵羊类、兔类或非人类灵长类动物。在一些实施方式中，所述转基因胚胎来自于大鼠。在优选的实施方式中，所述转基因胚胎来自于小鼠。在一些实施方式中，转基因或至少一个报告基因编码荧光蛋白。在一些实施方式中，评估步骤包括确定荧光蛋白的荧光强度。
所述指定时间段可取决于多种因素，包括，所使用的胚胎的种类，目标转基因的表达模式，测试产品的预期应用，等等。在一些实施方式中，所述指定时间段是一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天或更多天。非限定性的时间段的时间点的实例是24小时，48小时，72小时和96小时。所述时间段还可以实现在一天或多于一天进行一个评估或多于一个评估(例如，在1天至10天的时间段内在一个或多于一个24小时过程中进行一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次)。在一些实施方式中，所述指定时间段由期望的发育阶段确定，所述期望的发育阶段例如，2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚期、囊胚期、原肠胚形成期或超过原肠胚形成期。
在一些实施方式中，评估步骤可包括例如，下列步骤中的一个或多于一个：i.捕获所述胚胎的至少一个图像；ii.基于所述图像确定所述报告基因的表达水平；以及iii.比较所述表达水平和阈值水平和/或对照水平。在一些实施方式中，步骤ii和步骤iii通过电脑执行。在一些实施方式中，评估可包括从视觉上测量光发射和/或强度，或使用设备测量光发射和/或强度。
在一些实施方式中，评估步骤还可包括比较已在对照条件下培养的转基因胚胎中的转基因或至少一个报告基因的表达。
在一些实施方式中，所述至少一个发育阶段可以是例如，1-细胞期，2-细胞期，4-细胞期，8-细胞期，桑葚胚期，囊胚期，和/或原肠胚形成期。
在一些实施方式中，例如，如果转基因或至少一个报告基因的表达足以说明胚胎未受到测试产品的使用的影响的话，那么所述产品可被认为是可接受的。在一些实施方式中，表达的充分性通过与对照比较和/或与正在测试的其他细胞比较来确定。在一些实施方式中，表达的充分性通过与预定的标准比较来确定。在一些实施方式中，如果胚胎的形态是合适的，那么所述产品被认为是可接受的。在一些实施方式中，合适的形态通过与对照比较来确定。在一些实施方式中，合适的形态通过与预定标准比较来确定。在一些实施方式中，可评价形态和表达以确定参数对胚胎发育的影响。例如，如果形态和表达均是阳性的，那么可做出没有消极影响的评价或具有积极影响的评价。如果形态是有利的，但是在一个或多于一个时间点表达不良，那么可做出合适的评价，例如，产生不利或消极影响。
在一些实施方式中，测试条件下胚胎的荧光水平与对照条件下胚胎的荧光水平进行比较以确定测试条件是否可接受。在一些实施方式中，比较表现出某一水平的荧光(例如，0-1或2-3)的胚胎的百分数。在一些实施方式中，测试条件下的胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下的胚胎中所观察到的荧光水平的50％或更高。在一些实施方式中，测试条件下的胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下的胚胎中所观察到的荧光水平的60％或更高。在一些实施方式中，测试条件下的胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下的胚胎中所观察到的荧光水平的70％或更高。在一些实施方式中，测试条件下的胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下的胚胎中所观察到的荧光水平的80％或更高。在一些实施方式中，测试条件下的胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下的胚胎中所观察到的荧光水平的90％或更高。在一些实施方式中，测试条件下的胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下的胚胎中所观察到的荧光水平的100％或更高。应当理解的是，上述这些值范围内的任何子值或子范围考虑用于本文所述的实施方式。
在一些实施方式中，测试条件下的胚胎的荧光位置与对照条件下的胚胎的荧光位置进行比较以确定测试条件是否是可接受的。在一些实施方式中，比较在某一位置(例如，细胞核或细胞质)中表现出某一荧光水平(例如，FI 0-1或FI 2-3)的胚胎的百分数。在一些实施方式中，测试条件下在给定的胚胎位置中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在给定的胚胎位置中所观察到的荧光水平的50％或更高。在一些实施方式中，测试条件下在给定的胚胎位置中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在给定的胚胎位置中所观察到的荧光水平的60％或更高。在一些实施方式中，测试条件下在给定的胚胎位置中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在给定的胚胎位置中所观察到的荧光水平的70％或更高。在一些实施方式中，测试条件下在给定的胚胎位置中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在给定的胚胎位置中所观察到的荧光水平的80％或更高。在一些实施方式中，测试条件下在给定的胚胎位置中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在给定的胚胎位置中所观察到的荧光水平的90％或更高。在一些实施方式中，测试条件下在给定的胚胎位置中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在给定的胚胎位置中所观察到的荧光水平的100％或更高。应当理解的是，上述这些值范围内的任何子值或子范围考虑用于本文所述的实施方式。
在一些实施方式中，胚胎中存在的标志物或转基因是预计会在胚胎发育过程中的特定时间关闭的基因，例如，在检查胚胎时。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的80％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的70％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的60％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的50％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的40％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的30％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的20％或更低。在一些实施方式中，测试条件下在胚胎中所观察到的可接受的荧光水平是对照条件下在胚胎中所观察到的荧光水平的10％或更低。应当理解的是，上述这些值范围内的任何子值或子范围考虑用于本文所述的实施方式。
在一些实施方式中，至少50％的对照胚胎必须表现出特定水平的荧光(例如，FI0-1或FI 2-3)，从而表明分析方法是成功的。在一些实施方式中，至少60％、70％、80％、90％或100％的对照胚胎必须表现出特定水平的荧光(例如，FI 0-1或FI 2-3)，从而表明分析方法是成功的。应当理解的是，上述这些值范围内的任何子值或子范围考虑用于本文所述的实施方式。
在一些实施方式中，测试条件下胚胎的荧光水平与标准进行比较。在一些实施方式中，标准基于所使用的转基因/标志物，所使用的胚胎种类，被测试的试剂类型，所使用的显微镜或任何其他参数。在一些实施方式中，标准要求测试条件下至少50％的胚胎表现出特定水平的荧光(例如，FI 0-1或FI 2-3)。在一些实施方式中，标准要求测试条件下至少60％的胚胎表现出特定水平的荧光。在一些实施方式中，标准要求测试条件下至少70％的胚胎表现出特定水平的荧光。在一些实施方式中，标准要求测试条件下至少80％的胚胎表现出特定水平的荧光。在一些实施方式中，标准要求测试条件下至少90％的胚胎表现出特定水平的荧光。在一些实施方式中，标准要求测试条件下至少100％的胚胎表现出特定水平的荧光。应当理解的是，上述这些值范围内的任何子值或子范围考虑用于本文所述的实施方式。
在一些实施方式中，产品可以是例如，针头、导管、微型工具、实验室器具、注射器、组织胚胎皿、组织培养板、吸管头、培养皿、平板、水、水纯化系统、培养基、培养基补充品以及与配子、胚胎或组织培养基物理接触的其他容器、设备或试剂中的一种或多于一种。在一些实施方式中，产品可以是例如，配子和胚胎培养基、配子和胚胎处理/加工培养基、运输培养基、剥离卵母细胞的酶、精子分离梯度、冷冻/玻璃化培养基、解冻/加温培养基、吸管和胚胎处理设备、在人ART过程中使用的实验室器具中的一个或多于一个，在人ART过程中使用的实验室器具包括但不限于：培养皿、离心管、冷冻保存和低温贮存设备和涉及ART的任何溶液、试剂或设备。
在一些实施方式中，生存能力标志物可以是与囊胚或胚胎的发育和/或健康有关的任何标志物或基因。而且，例如，所述标志物或基因可以是与Oct-4，Cdx2，Sox2和Nanog中的一个或多于一个相关的任何基因、基因家族或由Oct-4，Cdx2，Sox2和Nanog中的一个或多于一个调节的基因。在一些实施方式中，荧光蛋白是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、桔色荧光蛋白、蓝绿荧光蛋白，等等。
一些实施方式涉及使用发育至囊胚阶段的胚胎提高胚胎分析方法的灵敏度的方法。所述方法可包括例如，提供转基因胚胎，其中，所述转基因胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎多能性标志物的至少一个报告基因；在培养条件下采用测试项目和/或对照孵育转基因胚胎；以及形态上评估从单细胞期至囊胚期和原肠胚形成期的胚胎发育并通过胚胎标志物从单细胞期至囊胚期和原肠胚形成期的表达评估胚胎发育。所述方法可进一步包括评估在囊胚期和超过囊胚期(原肠胚形成期)的胚胎标志物的表达。例如，对表达的评估可通过确定报告基因的荧光或其他光发射来测量。胚胎分析方法可检测培养基和/或培养材料中的胚胎毒性。在另一实施方式中，所述分析方法可检测临床体外受精环境中使用的培养基的功能性和材料的适用性。
用于测试玻璃器具洗涤技术的有效性、清洁手术仪器(抽吸针头)的有效性、转移导管和与人卵子、精子或胚胎接触的任何其他器具的有效性的分析方法同样包括在目前的技术和方法中。
II.转基因胚胎
术语“转基因”是指或属于已并入宿主基因组中或能够在宿主细胞中复制的且能够导致一个或多于一个细胞产物表达的DNA片段。相对于对应的非转化的细胞或动物，示例性的转基因可提供具有新的表现型的宿主细胞或由此发育的动物。“转基因动物”是指非人类动物，通常是哺乳动物，其具有作为染色体外元件存在于其细胞的至少一部分中的或稳定地融入其生殖细胞系DNA的非内源性核酸序列。
转基因技术用于产生转基因哺乳动物，例如，带有连接至目标基因的报告基因的小鼠。分子遗传和遗传工程中的方法通常在最新版本的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,(Sambrook等人)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,编辑)；Animal CellCulture(R.I.Freshney,编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller&Calos,编辑)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols inMolecular Biology,第三版(F.M.Ausubel等人,编辑)；以及Recombinant DNAMethodology(R.Wu编辑,Academic Press)中描述。由此，建立了转基因技术。参见，例如，Methods in Molecular Biology中的Transgenic Mouse:Methods and Protocols(M.Hofker和J.Deursen,编辑，第209卷)(该参考文献的全部内容通过引用并入本文)。
一方面，转基因哺乳动物包括连接至目标生存能力标志物基因的调节区域的报告基因。报告基因包括例如荧光蛋白或发光蛋白，例如荧光素酶，绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。荧光蛋白可包括但不限于：蓝色/UV蛋白，例如，TagBFP,mTagBFP2,azurite,EBFP2,mKalama1,Sirius,sapphire,和T-sapphire。荧光蛋白还可包括蓝绿蛋白，例如，ECFP,cerulean,SCFP3A,mTurquoise,mTurquoise2,单体Midoriishi-Cyan,TagCFP,和mTFP1。在优选的实施方式中，荧光蛋白是绿色蛋白，例如，EGFP,Emerald,Superfolder GFP,单体Azami Green,TagGFP2,mUKG,mWasabi,或Clover。同样考虑将黄色荧光蛋白用作报告基因，所述黄色荧光蛋白包括EYFP,Citrine,Venus,SYFP2,ZsYellow1,和TagYFP。用作报告基因的桔色蛋白可包括单体Kusabira-Orange,mKOk,mKO2,mOrange,和mOrange2。红色蛋白例如，HcRed1,mRaspberry,mCherry,mStrawberry,mTangerine,tdTomato,TagRFP,mApple,mRuby,和mRuby2。远红光蛋白包括但不限于：mPlum,HcRed-Tandem,mKate2,mNeptune,和NirFP。转基因小鼠的胚胎在目标标志物表达的同时在相同位置上表达报告蛋白。
在一些实施方式中，转基因动物包括可操作地连接至胚胎生存能力标志物的调节区域的多于一个转基因。在一些实施方式中，转基因动物包括可操作地连接至不同的胚胎生存能力标志物的调节区域的2个、3个、4个或更多个转基因。例如，转基因动物可包括多个荧光报告基因，每个荧光报告基因连接至不同的生存能力标志物，这样，多个荧光蛋白在胚胎中表达。报告基因的表达可随胚胎的发育而发生改变。在优选的实施方式中，在胚胎中表达的所有报告基因可通过相同的方法(例如，荧光显微检查)来分析。不受理论的限制，相同胚胎中多个基因的分析被认为可导致灵敏度增加。
在一些方面，配子可获自于雄性和雌性动物(分别为精子和卵母细胞)并且卵母细胞可使用类似于IVF规程的方法体外受精。在一些方面，雄性和雌性动物可进行交配并且在期望的时间点从雌性动物中收获得到的胚胎。在优选的实施方式中，所述雌性是野生型(即，不带有转基因)，所述雄性是转基因的。不受理论的限制，早期胚胎中来自母本转录本的转基因的表达将会产生转基因的不期望的背景表达。在一些实施方式中，雌性是转基因的，雄性是野生型。在一些实施方式中，雄性和雌性均含有转基因。在一些实施方式中，雌性和雄性动物携带一个转基因或多于一个不同的转基因。本领域技术人员会理解的是，不同的生存能力标志物在发育过程中的不同时间表达，并且因此，来自母本转录本的表达不是所有生存能力标志物的重要考虑因素。
如本文使用的，生存能力标志物包括胚胎发育标志物和多能性标志物以及由这些标志物调节的基因家族和/或基因。总体而言，这些标志物包括与胚胎干细胞相关的转录基因。本文使用的多能性干细胞标志物在可预期的水平上进行表达并在胚胎发育的可预期的时间定位。多能性干细胞(PS)-特异性标志物包括但不限于：八聚体转录因子(即，Oct-4)家族；由Oct-4调节的基因；Sox基因家族，例如，Sox1，Sox2，Sox3，Sox15和Sox18；Klf基因家族，例如，Klf4和Klf5；Nanog基因家族，例如，NANOG，以及它们的调节区域。其他生存能力标志物包括但不限于：TGF-β超家族及其受体，即，Activ RIB/ALK-4,GDF-3和Lefty，cryptic蛋白家族，即，Cripto-1，整联蛋白家族，即，整联蛋白α6(CD49f)和整联蛋白β1(CD29)，Podocalyxin家族，即，PODX-1，FGF家族，即，FGF4和FGF5，叉头框(Forkhead box)转录因子家族，即，FoxD3，T-box家族转录因子，即，TBX3和TBX5，发育多能性相关分子家族，即，Dppa2，Dppa3/Stella，Dppa4和Dppa5/ESG1，LRR家族，即，5T4，钙黏蛋白家族，即，E-钙黏蛋白，跨膜蛋白的连接蛋白家族，即，连接蛋白-43和连接蛋白-45，“其他”类别的F-box家族，即，FBOXO15，趋化因子/趋化因子受体家族，即，CCR4和CXCR4，ATP结合盒转运子，即，ABCG2。涉及OCT-4和/或SOX2-介导的干性维持的其他公知的标志物是Utf1,TERT,Zscan4,CD9,CD15/Lewis X,CD25,CD30/TNFRSF8,CD90/Thy1,碱性磷酸酶/ALPL,αHCG,HCG,DNMT3B,GBX2,GCNF/NR6A1,Gi24/Dies1/VISTA,LIN-28A,LIN-28B,LIN-41,c-Myc,Rex-1/ZFP42,sFRP-2,Smad2,Smad2/3,SPARC,STAT3,SUZ12,TOBX2,TEX19/19.1,THAP11,和TROP-2。本领域技术人员应当理解的是，目前已知的或待发现的任何生存能力标志物包括在本发明中。
本发明还考虑到的且公开的是一种改良的转基因胚胎，所述转基因胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎多能性标志物的至少一个转基因。所述胚胎多能性标志物及其上游介导物和下游效应子在确保正常胚胎发育方面发挥作用。在优选的实施方式中，转基因是报告基因。在优选的实施方式中，报告基因是荧光蛋白或发光蛋白，选自：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝绿荧光蛋白、桔色荧光蛋白、黄色荧光蛋白。
III.胚胎发育分析
在临床ART中使用的特定产品的适用性基于胚胎生长、发育和/或质量来评估。胚胎发育的定性评分可基于标志物表达的定量/定性评价，例如，通过评价光发射或强度或荧光或者诸如颜色之类的任何其他可视指示剂。在一些实施方式中，胚胎形态的评价还可与表达分析一同进行和使用。
在一些实施方式中，可包括一个或多于一个对照，用于比较目的。对于对照和测试产品而言，可体外培养几乎相同数目的单细胞或两细胞胚胎。例如，在一种非限定性方式中，30个胚胎可分配于十个液滴之间，每个液滴在分开的孔中培养。在一些方面，对照和测试产品可分别具有大约30个胚胎，这30个胚胎在十个液滴和孔之间分配。还可测试和运行任何其他合适的数目。
胚胎发育的定性分析可通过视觉上测量或评价颜色、光强度或荧光分析发育中的胚胎来完成，例如，经由可包括UV光的光学显微镜使荧光蛋白表达显像。所述测量或评价还可包括或可考虑囊胚内的颜色、光线或荧光的位置。如参考实施例和附图更加详细地看到的，最优和次优培养条件可基于荧光位置(细胞核定位和细胞质定位，等等)和荧光强度来评价或确定。
如本领域技术人员易于理解的，最优胚胎生长的可接受阈值可基于单独的设定标准(例如，培养条件)，发育标志物，转基因/报告体基因和测试项目。囊胚分化可通过共聚焦显微镜来评估。在优选的实施方式中，培养条件的可接受性基于经由荧光显微镜的胚胎发育定性分析。在特别优选的实施方式中，胚胎发育通过胚胎观察器(例如，延时系统(Time-lapse system),Unisense Fertilitech A/S)观察，其中，根据需要获取正在发育的胚胎的图片，例如，大约每10分钟获取正在发育的胚胎的图片，并且可产生延时录像以跟踪胚胎发育的所有阶段。如附图中所举例说明的(参考实施例更加详细地描述)，胚胎发育可通过评价荧光或其他光学或指示剂的位置和数量/强度，根据年代(特定培养时间段所达到的阶段)和胚胎质量，从形态和功能上来确定。测试细胞中单个标志物的表达可根据表达模式提供未分化或分化的表现型的证据。发育/分化之后，下调的基因的表达和/或上调的基因的表达的缺失可表明胚胎发育的阶段。
胚胎发育和质量可定性和/或定量评价。在一些实施方式中，例如通过显微镜下囊胚的显像执行荧光(和形态)的定性评价。表达的定性分析(例如，通过荧光)可包括例如测试样本和任选地对照样本的荧光强度的主观分级(例如，没有荧光，低强度，中等强度，高强度)。在一种非限定性的实施方式中，使用0-3的分数，其中，0-1的级别意味着几乎没有或没有发光或表达，2-3意味着中等至高等表达或发光。例如，可基于一组样本彼此的相对表达进行分级。例如，5个、10个、20个或30个孔的相对分级，其中，根据分数对每个孔进行分类。在一些实施方式中，分数在0至3之间。在一些方面，2或更高的分数可意味着发育正常。在一些方面，2或更高的分数结合MEA中合适的发育可意味着发育正常或可接受。相反，0-1的分数可意味着测试产品或参数是不可接受的，即使评价了可视形态(例如，使用MEA看起来是可接受的)。这种低分数可有助于避免假阳性，否则，如果本领域技术人员单独使用MEA，会产生假阳性。例如，如上所述，可确定可接受的限度。
在优选的实施方式中，胚胎发育可定量或半定量评价。非限定性的实例包括通过连接至显微镜的电脑评价荧光强度或光强度，基于胚胎照片评价强度，使用光度计或荧光光度计测量光强度，或任何其他确定荧光强度的方法。在一些实施方式中，自动确定荧光强度。在一些实施方式中，照相机或其他存在于显微镜上的设备检测荧光信号并将所述信号传输至能够确定荧光强度和/或将荧光强度和来自其他胚胎(例如，在对照条件下生长的胚胎)的强度进行比较的软件程序。
在一些实施方式中，单独地测量每种条件(例如，测试条件和对照条件)下生长的每个胚胎的荧光强度和/或荧光位置。在一些实施方式中，多个胚胎在限定的区域内生长，例如，培养基的单个液滴中，并且，一同评价或测量区域中的所有胚胎的荧光强度。如上所述，评价或定量/定性测量可基于与其他测试样品(包括对照，如果存在的话)的比较评价。
如所述的，如果期望的话，方法可包括基于视觉上评价形态的定性评价，例如，通过小鼠胚胎分析方法(MEA)完成的。这种评价可包括比较从0天单细胞期开始至囊胚期(例如通过96小时培养)的胚胎发育。例如，受精之后一天，本领域技术人员可预期观察到在测试产品上培养的胚胎和对照中的胚胎的分裂。受精之后两天，在进行小鼠分析的情况下，如果测试产品被认为是用于ART可接受的，本领域技术人员可预期观察到在最优条件下在对照和测试产品中的发育的八细胞期。发育至囊胚期的胚胎数目同样在对照和测试产品中进行定量。当进行显微观察时，基于所观察到的存活的囊胚数目以及那些囊胚的定性表观评价ART中使用的测试产品的适用性。
VI.分析方法和试剂盒
同样地，本文描述了用于评估与ART产品有关的胚胎影响或毒性的、灵敏度高于标准MEA分析方法的方法和分析试剂盒。所述方法可包括提供包含转基因胚胎的分析方法，所述转基因胚胎具有可操作地连接至多能性标志物的报告基因的至少调节区域。而且，本文可提供促进或已知引起正常胚胎发育的对照产品。所述对照产品可在ART中具有与预期测试产品的使用相同或类似的用途。
在一些实施方式中，待测试的产品可以是培养基或补充品。如本文使用的，培养基包括但不限于：用于辅助生殖过程的生殖培养基和补充品。培养基包括液体或粉末形式的各种不同的物质，出于制备、维持、转移或储存的目的，所述物质(例如，水，用于处理配子或胚胎的酸溶液，漂洗溶液，试剂，精子分离培养基，或用于覆盖所述培养基的油)与胚胎直接物理接触。本文使用的补充品包括添加至培养基中的提高培养基的特定性质的特定试剂，例如，蛋白质，血清，抗生素，等等。
测试产品的可接受性可通过评价2-细胞期，4-细胞期，8-细胞期，桑葚胚期，囊胚期和/或原肠胚形成期的胚胎发育与对照产品进行比较。更加具体而言，转基因胚胎可通过显微镜进行分析以评价发育的囊胚期的分化。例如，在转基因小鼠胚胎的情况下，胚胎可在受精之后大约48小时和/或96小时被评价。在一些方面，所述方法可包括在48小时进行评估，这可以是发育质量的早期预测。对于其他哺乳动物胚胎而言，从受精至囊胚发育的持续时间段可基于胚胎来源的不同而不同。例如，人类胚胎的囊胚发育通常在第5天发生。胚胎生存能力基于对胚胎表达的定性/定量评价(例如，通过荧光)进行评价或评分而评价，并且如果需要的话，还可与形态评价一同进行。
最优胚胎生长的可接受阈值基于单独设定标准，所述标准取决于培养条件和测试项目。在一些方面，对照基准与各个测试中的测试培养基平行运行。例如，当评估用于IVF环境的新培养基时，相对于对照培养基对培养基进行测试，所述对照培养基已被预先确定为提供胚胎的最优生长条件。新的测试培养基通过相对于对照培养基中的囊胚发育来评价囊胚发育而进行评价。评价可包括定性比较对照培养基中达到囊胚期的培养的胚胎的数目与在测试培养基中达到相同阶段的胚胎数目。可接受的质量控制通常要求测试培养基中至少80％的囊胚得到发育以使产品通过测试。其他生长参数包括在对照培养基和测试培养基中的囊胚期所观察到的细胞数目以及转基因囊胚中的报告基因的荧光强度和位置。如与标准MEA分析方法所比较的，在囊胚可能看起来正常的情况下，本文所公开的分析方法为胚胎发育提供了更高的灵敏度。可操作地连接至多能性/生存能力标志物(和/或其调节区域)的报告基因可通过显微镜观察到并且提供在最优、次优和/或胚胎毒性生长条件下对基因表达的更好的描绘。可接受的限度例如可如上述胚胎发育的分析部分所描述的那样确定。
在一些方面，测试产品的评价不需要和平行运行的对照产品进行比较。在一些方面，标准化的标准用于确定测试产品是否是可接受的。例如，各种不同阶段的测试条件下生长的囊胚的表达(例如，通过荧光分析)可与对应于最优胚胎生长的表达水平进行比较。在一些实施方式中，用户可容易地确定可接受的水平，例如，基于类似条件下的先前实验来确定。在一些实施方式中，分析方法包括被认为可接受的标准。在一些实施方式中，可接受性限度可由管理机构或类似群体设定。可接受的限度例如可如上述胚胎发育的分析部分所描述的那样确定。
本文提供用于临床ART以评估在处理和保存人配子和生产、培养和保存人胚胎的过程中使用的产品的质量控制分析方法。所述分析方法可包括从转基因哺乳动物中收获的转基因单细胞胚胎，其中，所述转基因胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎多能性标志物的至少一个报告基因。多能性调节子可以是生存能力标志物，例如，OCT-4，SOX2，Nanog，CDX2以及它们的上游介导物和下游效应子，所述上游介导物和下游效应子在确保正常胚胎发育方面发挥作用。报告基因可编码蛋白。所述蛋白可包括任何报告蛋白，其包括但不限于：绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝绿荧光蛋白、桔色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。所述分析方法还包括用于评估ART产品和IVF培养条件的指示。这些指示包括涉及ART条件下孵育转基因单细胞胚胎的指示和基于从单细胞期和两细胞期至后期的囊胚形成期和原肠胚形成期的形态和/或基因表达(如通过报告基因表达所确定的)评估胚胎发育的指示。本文使用的孵育描述了在限定的培养基中培养受精的单细胞胚胎或两细胞胚胎持续预定的时间量(例如，大约24小时至96小时)的过程。
一方面，本发明涉及在评价用于辅助生殖技术(ART)的培养基中使用的质量控制分析方法，所述分析方法包括：一个或多于一个转基因胚胎，其中，所述胚胎包括可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的调节区域的至少一个报告基因；对照产品，其中，所述产品产生最优胚胎生长；以及使用所述分析方法评估ART产品和IVF培养条件的指示。在一些实施方式中，对照产品是对照培养基。在一些实施方式中，所述分析方法还包括次优培养基，其中，所述次优培养基产生次优胚胎生长。在一些实施方式中，所述指示包括用于确定在ART中使用的待测试产品的可接受性的标准或指南。
本文还公开了用于临床人ART/IVF的质量控制的分子MEA试剂盒。所述试剂盒包括转基因单细胞胚胎。所述转基因胚胎包括可操作地连接至与胚胎发育相关的至少一个基因的至少调节区域的至少一个报告基因；以及表达转基因/报告基因的胚胎，所述转基因/报告基因在最优和次优培养条件下或胚胎毒性培养条件下差异表达。所述试剂盒还包括ART/IVF消耗品。ART消耗品可包括但不限于：胚胎培养基，配子处理培养基，用于剥离卵母细胞的酶，精子分离梯度，冷冻培养基，解冻培养基，吸管和胚胎处理设备，在人体外受精过程中使用的实验室器具，所述实验室器具包括但不限于：培养皿，离心管，冷冻保存设备和低温贮存设备。
实施例
在下面的实施例部分中，本文进一步详细公开了其他实施方式，这些实施方式无意限定权利要求的范围。
实施例1：多能性调节子的评估
诸如ART中使用的培养基或材料的毒性和无菌性之类的若干因素可影响胚胎的发育。下面的实施例描述了评价最优和次优培养条件下胚胎生存能力的分析方法。本实施例显示了使用荧光显微镜使其中的多能性调节子显像的胚胎。用于评价发育的单细胞期或两细胞期中的胚胎发育的多能性标志物包括例如，SOX2，Oct-4，Nanog以及它们的上游介导物和下游效应子，所述上游介导物和下游效应子在确保正常胚胎发育方面发挥作用。
为了测试培养基，培养基添加物或ART消耗品，收集的转基因胚胎首先在对照培养基(已确定促进最优囊胚发育的培养基)或测试培养基的50μL液滴中孵育。在各个情况下，胚胎用矿物质油覆盖并且在经典细胞培养条件下(空气中含5％CO2的潮湿气氛中)，37℃下孵育。在第一天、第二天和/或第三天，选择胚胎用于分析并转移至待测试的培养基。胚胎被培养直至第5天。通过与对照组比较达到囊胚期的比例，可识别干扰胚胎发育的毒性作用或次优作用。
a.小鼠胚胎中OCT-4的表达
图1是荧光显微镜照片，其显示了早期小鼠胚胎中多能性调节子OCT-4的表达。两细胞胚胎在最优(对照)和次优(测试)条件下进行体外培养。大约48小时之后，用对OCT-4具有特异性的抗体(红色)对胚胎进行染色并通过荧光显微镜进行评估。(OCT-4也称为OCT-3/4)。如图1所显示的，在最优生长条件下孵育的左侧胚胎带有均匀的染色，发育良好。相反，右侧囊胚在次优生长条件下孵育。右侧胚胎的右侧细胞上观察到缺乏OCT-4染色，这说明次优生长条件甚至在胚胎发育的早期导致胚胎发育较慢并且使OCT-4表达降低。
b.小鼠囊胚中OCT-4的表达
图2A和图2B举例说明了囊胚期的OCT-4的表达。胚胎在体外培养96小时，随后用DAPI(蓝色细胞核染色，左侧图像)和抗OCT-4抗体(红色，中央图像)染色并通过荧光显微镜观察。每个图中的右侧图像表示DAPI图像和OCT-4图像的合并图像，染色的覆盖以紫色显示。图2A中，在最优生长条件下，如由均匀OCT-4染色所表明的，观察到正常胚胎发育。相反，在图2B中，胚胎在次优生长条件下孵育。在胚胎中观察到一些侧壁滋养外胚层细胞上的OCT-4染色缺失，如图2B中的箭头所示。在不使用目前所要求保护的技术的条件下，在使用形态评价的常规MEA标准QC规程时次优培养条件是不明显的或无法识别为次优培养条件，因为囊胚看起来是正常的并且以正常速度发育。然而，通过观察图2B中的缓慢生长，清楚地是，囊胚发育比在图2A中所观察到的胚胎发育和囊胚分化在质量上较不均匀并且不那么好。
c.小鼠囊胚中Sox2的表达
图3A、图3B和图3C表示在最优或次优条件下生长的胚胎中的Sox2的表达模式。图3A至图3C是对照小鼠胚胎的荧光显微照片。胚胎在体外被孵育至囊胚期，固定，并用DAPI(蓝色)和抗-Sox2抗体(绿色)染色，并通过显微镜进行观察。培养96个小时之后，图3A的左侧图像显示胚胎的DAPI染色。图3A的中央图像表示Sox2生存能力标志物的染色模式，并且右侧图像是合并的图像。胚胎中所观察到的染色模式是均匀的并且证实最优条件下的正常的、健康的囊胚发育。注意均匀染色以及轮廓分明的囊胚分化。
回到图3B，观察了在次优生长条件下孵育的囊胚。96个小时之后，胚胎被固定并且用DAPI(蓝色)和抗-Sox2抗体(绿色)染色，并且通过显微镜观察以评价生长。图片看上去显示了正常生长和发育，虽然是在次优培养条件下。
图3C显示了用DAPI(蓝色)和抗-Sox2抗体(绿色)染色的在次优胚胎条件下不良生长的两个胚胎。
胚胎中所观察到的染色模式是均匀的并且证实了最优条件下的正常、健康的囊胚发育。滋养外胚层均匀染色，但内细胞团没有均匀染色。
实施例2：分子小鼠胚胎分析
含有连接至多能性标志物的报告基因的转基因小鼠用于在最优和次优条件下执行基于分子的小鼠胚胎分析(mMEA)。使用在POU蛋白结构域第5类转录因子1(Pou5fl，也称为Oct-4)启动子和远端增强子的控制下表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转基因雄性小鼠(B6；CBA-Tg(Pou5f1-EGFP)2Mnn/J；Jackson Laboratory)。
转基因雄性小鼠与超数排卵的野生型(B6D2F1)雌性小鼠交配。收集单细胞胚胎并且分组培养，所述分组为每20μL培养基液滴3至4个胚胎，或每10μL培养基液滴单个胚胎，这取决于所执行的实验。胚胎在最优或次优条件下培养96小时。荧光显示Oct-4-EGFP转基因的表达。
a.胚胎发育过程中形态发育和Oct-4表达的比较
在最优和次优条件下在每20μL培养基液滴3至4个胚胎的组中培养单细胞胚胎。胚胎发育在培养48小时之后使用光学(立体镜)显微镜和UV(带有UV光线的倒置显微镜)显微镜评价以检查胚胎形态，确定发育阶段并评估作为GFP荧光强度的函数的Oct-4表达水平。通过这两种方法评价相同的胚胎。
b.荧光模式/强度与胚胎发育的关系-多胚胎分析
收集单细胞胚胎并在最优或次优条件下在每20μL培养基液滴3至4个胚胎的组中培养单细胞胚胎。各组胚胎的盲法评价由两个评估员在48小时进行：一个评估员通过光学显微镜(立体镜)确定胚胎组的形态，另一评估员确定胚胎组的荧光强度。每个胚胎组的另一评价在96小时进行以确定囊胚发育。
就次优条件而言，在48小时对两种方法的比较表明基于形态的分析方法确定了63.3％的胚胎发育至8-细胞期或超过8-细胞期，相反，基于荧光的分析确定了仅33.3％的胚胎具有期望的荧光强度(中等至高强度)。在确定生长条件是次优的方面，分子MEA在早期比标准MEA更加灵敏。由光学显微镜和荧光显微镜确定的囊胚发育没有区别。对于单个胚胎而言，观察到在OCT-4(荧光)的早期表达和发育至胚胎发育的后期之间有良好的关联。
实施例3：用于评价在存在不同品质的油条件下的囊胚发育的分子小鼠胚胎分析
含有CDX2-GFP的转基因小鼠胚胎用于执行在存在不同品质的油((1)好油，(2)5％劣质油，(3)7.5％劣质油，(4)10％劣质油，和(5)15％劣质油)的条件下的基于分子的小鼠胚胎分析(mMEA)。测试了用于上述所列的油品质中的每一个的十八个胚胎。使用立体显微镜在48小时和96小时评估胚胎以在形态上评价囊胚发育，并且还在48小时和96小时使用荧光显微镜评估胚胎以评价GFP表达。使用常规MEA规程，96小时评分为80％或高于80％的任何胚胎(扩增的囊胚和孵化中的囊胚)通过测试，这样，可认为测试的参数是可达到的。如下所示，单独的形态分析不像分子表达方法那么灵敏并且可能会对7.5％劣质油产生一个假阳性。
a.48小时发育和Cdx-2表达的形态评估
相同胚胎的Cdx-2表达/荧光强度也在48小时进行评估。胚胎在相对主观的0-3荧光分数上进行分级，其中，0表示没有荧光，1表示低荧光，2表示中等荧光，3表示高荧光。
b.96小时发育和Cdx-2表达的形态评估
“好油”，“5％劣质油”和“7.5％劣质油”均符合使用MEA或形态分析的80％阈值，被认为是可接受的。10％和15％劣质油没有达到80％阈值。特别是96小时对囊胚荧光强度的评估无法区分最优条件和次优条件之间的发育差别。胚胎在0-3的相对主观的荧光分数上进行分级，其中，0表示没有荧光，1表示低荧光，2表示中等荧光，3表示高荧光。
e.结果的讨论/总结
下表1和下表2显示了仅使用形态评价会导致7.5％劣质油*的假阳性。相反，分子MEA早在48小时就识别了次优发育。如表2中的数据所举例说明的，仅使用形态，7.5％的劣质油已得分在80％截止值之上，而Cdx-2的发育表达说明那些胚胎受到7.5％劣质油的不良影响。这说明根据本文描述的分子MEA提供的一些实施方式的灵敏度相对于仅仅视觉形态的分析得到提高。
表1
48小时早期分裂发育的百分数％
表2
96小时囊胚期发育的百分数％
实施例4：分子小鼠胚胎分析案例研究
a.次优培养基成分的确定
含有连接至多能性标志物的报告基因的转基因小鼠胚胎在含有不同品质的人血清白蛋白(HSA)的20μL培养基液滴中孵育。胚胎被矿物质油覆盖并且在经典细胞培养条件(空气中含5％CO2的潮湿气氛)下在37℃下孵育。从形态上评估胚胎并且在培养48小时和96小时之后评估胚胎中的GFP的表达。
在48小时，通过标准MEA和分子MEA评价胚胎。结果在表3中显示。所有HSA样品给出与标准MEA(上半部分表)类似的结果，其中，95.3％至97.7％的胚胎在各条件下发育至8-细胞期或超过8-细胞期。分子MEA(下半部分表)识别出两个HSA样品(HSA-A和HSA-D)，这两个HSA样品表现出更多的没有荧光至低荧光的胚胎。
表3
在96小时评价胚胎以确定各个阶段的胚胎百分数。结果在表4中显示。HSA-B,HSA-C和HSA-F允许高于85％的胚胎发育至扩增的囊胚期和超过扩增的囊胚期，这超过了可允许的IVF培养基的要求。HSA-D允许83.7％的胚胎发育至扩增的囊胚期和超过扩增的囊胚期，这勉强通过了可允许的IVF培养基的要求。HSA-A仅允许72.7％的胚胎发育至扩增的囊胚期和超过扩增的囊胚期，这不满足可允许的IVF培养基的要求。与标准MEA相比，分子MEA在更早的阶段(48小时)识别了次优培养条件。
表4
本领域技术人员应当理解的是，在不背离本发明公开的内容的实质的条件下，可对本发明做出多种和各种不同的改良。因此，应当清楚地理解的是，本文公开的各种形式仅仅是举例说明，无意限定本发明公开的范围。

Claims (12)

1.一种用于评估人体外受精或人辅助生殖技术(ART)中使用的消耗品对胚胎发育的作用的质量控制方法，所述方法包括：
提供包括至少一个细胞的转基因非人类胚胎，其中，所述转基因非人类胚胎包括至少一个可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的转基因；其中，所述生存能力标志物选自：OCT-4和CDX2；
采用所述消耗品体外培养所述胚胎持续特定时间段；
在至少一个发育阶段评估转基因在转基因胚胎中的表达；以及
基于所述转基因表达的评估确定所述消耗品是否对胚胎的发育有害，其中，当所述转基因相对于对照在不同水平和/或不同位置表达时，所述消耗品对发育有害。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述转基因包括编码荧光蛋白的报告基因，所述荧光蛋白选自：绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，蓝绿色荧光蛋白，桔色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述消耗品选自：配子和胚胎培养基，配子和胚胎处理/加工培养基，运输培养基，用于剥离卵母细胞的酶，精子分离梯度，冷冻/玻璃化培养基，解冻/温热培养基，吸管和胚胎处理设备，在人体外受精过程中使用的实验室器具。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述胚胎评估通过评价与胚胎的发育阶段相关的胚胎形态以及荧光位置、荧光数量和/或荧光品质来完成。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述胚胎是鼠类胚胎、猪类胚胎、马类胚胎、牛类胚胎、绵羊类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述可操作地连接的胚胎生存能力标志物是OCT-4。
7.如权利要求1所述的方法，其中，胚胎发育在1-细胞期、2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期、桑葚胚期、囊胚期和/或原肠胚期进行评估。
8.一种确定在人体外受精(IVF)或人辅助生殖技术(ART)中使用的消耗品的适用性的质量控制方法，所述方法包括：
提供包含至少与一个细胞的多个转基因非人类胚胎，其中，所述转基因非人类胚胎包括至少一个可操作地连接至至少一个胚胎生存能力标志物的转基因，其中，所述转基因包括报告基因；并且，其中，所述生存能力标志物选自：OCT-4和CDX2；
采用所述消耗品体外培养所述转基因胚胎的第一亚组持续特定时间段以提供测试胚胎；
在对照条件下体外培养所述转基因胚胎的第二亚组持续特定时间段以提供对照胚胎；
评估转基因在所述测试胚胎和所述对照胚胎中的表达并且比较所述表达；以及
基于所述比较确定在人IVF或人ART中使用的消耗品的适用性，其中，如果至少80％的测试胚胎表现出转基因表达类似于对照胚胎，那么所述消耗品是合适的。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述胚胎生存能力标志物是OCT-4。
10.如权利要求8所述的方法，其中，所述报告基因编码荧光蛋白。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述消耗品是培养基、吸管、胚胎处理设备和实验室器具。
12.如权利要求8所述的方法，其中，所述转基因表达在囊胚期进行评估。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10667499B2 (en) 2013-03-14 2020-06-02 FUJIFILM Irvine Scientific, Inc. Method and quality control molecular based mouse embryo assay for use with in vitro fertilization technology
CN107058455B (zh) * 2016-08-10 2021-09-17 黑龙江省农业科学院畜牧研究所 猪2细胞胚胎体积的测量方法
WO2018044789A1 (en) * 2016-08-29 2018-03-08 Progena, Inc. Autologous somatic stem cell therapy, method of controllable preparation of therapeutic composition and procedure of adaptive treatment of ivf patient
WO2020031185A2 (en) * 2018-08-06 2020-02-13 Carmel Diagnostics Ltd. Cellular tissue analysis method and device
CN108986901B (zh) * 2018-09-14 2022-11-29 钟影 Ivf质量控制方法、终端设备及系统
CN110850070B (zh) * 2019-11-22 2021-06-01 北京大学 一种基于荧光标记转基因动物模型评价化学物质生殖发育毒性的方法
CN113355386B (zh) * 2021-06-02 2022-05-17 福建省妇幼保健院 一种应用三原核受精卵检测体外受精环境质量的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1847595A1 (en) * 2006-04-20 2007-10-24 Northern Sydney and Central Coast Area Health Service Methods of assessing embryo viability
WO2011025736A1 (en) * 2009-08-22 2011-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging and evaluating embryos, oocytes, and stem cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2430653A1 (en) * 2000-11-27 2002-08-08 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University In Jerusalem Transfection of human embryonic stem cells
US9086403B2 (en) * 2004-06-03 2015-07-21 The Johns Hopkins University Methods of screening for cell proliferation or neoplastic disorders
WO2006040763A2 (en) * 2004-10-12 2006-04-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Isolated primate embryonic cells and methods of generating and using same
PL2535403T3 (pl) * 2005-12-08 2019-10-31 Univ Louisville Res Found Inc Bardzo małe komórki macierzyste typu embrionalnego (VSEL) oraz sposoby ich izolowania i zastosowania
CN101603025B (zh) * 2008-06-13 2011-05-04 北京瑞途之星科技有限公司 胚胎干细胞样多能性细胞及其制备方法
CN102333861A (zh) * 2008-09-30 2012-01-25 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 用于分离非常小的胚胎样(vsel)干细胞的方法
CN102382796B (zh) * 2010-08-31 2014-08-27 中国科学院上海生命科学研究院 调控胚胎干细胞及早期胚胎的胚层分化的方法和试剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1847595A1 (en) * 2006-04-20 2007-10-24 Northern Sydney and Central Coast Area Health Service Methods of assessing embryo viability
WO2011025736A1 (en) * 2009-08-22 2011-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging and evaluating embryos, oocytes, and stem cells

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Comparative Analysis of Development-Related Gene Expression in Mouse Preimplantation Embryos With Different Developmental Potential;XIANGPING LI等;《MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT》;20050712;第72卷;第152–160页
Long-term human pluripotent stem cell self-renewal on synthetic polymer surfaces;David A. Brafman等;《Biomaterials》;20100915;第31卷;第9137-9138页右栏第5-6段和图1
Miguel Angel Ramı＇rez等.Effect of Stem Cell Activation, Culture Media of Manipulated Embryos, and Site of Embryo Transfer in the Production of F0 Embryonic Stem Cell Mice.《BIOLOGY OF REPRODUCTION》.2009,第80卷第1216–1222页.
Quantitative Analysis of Gene Expression in Preimplantation Mouse Embryos Using Green Fluorescent Protein Reporter;Serguei Yu Medvedev等;《Biology of Reproduction》;20021231;第67卷(第1期);第282-286页

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