EA009409B1 - Способ улучшения выживаемости после размораживания криоконсервированного биологического материала посредством стимуляции гидростатическим сжатием - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу повышения выживаемости после размораживания криоконсервированного биологического материала, включающему приложение к биологическому материалу гидростатического давления, выдерживание биологического материала под гидростатическим давлением в течение предварительно определенного периода времени, сброс гидростатического давления и замораживание биологического материала с использованием любого применимого протокола. Изобретение также относится к применению устройства, повышающего давление, для предварительной обработки биологического материала, который необходимо подвергнуть криоконсервации; устройство содержит камеру высокого давления, в которую помещают биологический материал, средства для создания давления и средства для поддержания давления в камере.

Description

Настоящее изобретение относится к способу повышения выживаемости после размораживания криоконсервированного биологического материала, который включает в себя приложение гидростатического давления (гидростатического сжатия) к указанному биологическому материалу, выдерживание биологического материала под гидростатическим давлением в течение предварительно определенного периода времени, сброс гидростатического давления и замораживание биологического материала с использованием любого применимого протокола. Изобретение также относится к применению устройства, повышающего давление, для предварительной обработки биологического материала, подлежащего криоконсервации, а также к устройству для повышения давления, предназначенному для предварительной обработки биологического материала, подлежащего криоконсервации, причем указанное устройство содержит камеру высокого давления, в которую помещают биологический материал, средства для создания давления и средства для поддержания давления в камере.

Предшествующий уровень техники

Способ криоконсервации широко используется в различных областях современной биологии и биотехнологии для хранения биологического материала для разнообразных целей.

Эти способы включают в себя очень похожие основные этапы.

1. Биологический материал обрабатывают раствором, содержащим криопротектор(ы).

2. Следующая стадия представляет собой охлаждение (замораживание) биологического материала до температуры ниже нуля.

3. Обработанный таким образом биологический материал хранят, в том числе и в течение очень длительных периодов времени, при низкой температуре, например, в жидком азоте.

4. Перед использованием биологический материал снова подогревают.

5. Удаляют криопротектор(ы) из биологического материала. Кроме того, могут потребоваться дополнительные стадии для восстановления исходной жизнеспособности биологического материала.

Было испытано несколько подходов, имевших целью усовершенствование описанного протокола, поскольку процесс криоконсервации повреждает биологический материал. Подходы, направленные на предотвращение образования льда за счет использования очень высоких скоростей охлаждения и нагревания или за счет постепенного снижения равновесной точки замерзания во время охлаждения до -80°С, не дали решения, подходящего для всех областей криобиологии. Предпринимались попытки повысить выживаемость после размораживания за счет витрификации (превращения в стекловидное вещество) высококонцентрированных водных растворов криопротекторов, переохлажденных до очень низких температур, что обеспечивает внутриклеточную витрификацию (Йа11 апб Еайу, 1985). Несмотря на то, что Еайу е! а1. (1984) указали на возможность применения весьма значительного гидростатического давления в качестве дополнительного фактора, который может способствовать витрификации, они считали, что это имеет малое практическое значение для репродуктивной биологии. В других исследованиях описано применение белков, предохраняющих от замерзания (ЛЕР), которые неколлигативно снижают температуру замерзания водных растворов, блокируют ионные каналы в мембранах и за счет этого повышают уровень защиты во время охлаждения (Вадшы е! а1., 1997). В любом из описанных способов не являются пренебрежимо малыми токсические эффекты криопротекторов и вредные последствия изменений осмотического давления.

В настоящее время эти процедуры имеют различный уровень эффективности в различных прикладных задачах. Например, в случае консервации эмбрионов эффективность криоконсервации колеблется от 0 до 80% в зависимости от вида, способа замораживания, стадии развития эмбриона (Нсйгаг, 1996; Уап ХУаЦепбопк-Эе Ьееите, 1995, 1997; Мебейо, 2002; К.еиЬшоГГ, 2001; Нашшйа, 2003; Агсйег, 2003; 81ас11ескг 2002; Ье1Ьо апб 8опда55еп, 2002). Степень успешности криоконсервации яйцеклеток человека, которая в настоящее время является очень популярной проблемой, также далека от удовлетворительной.

С 1912 г. известно, что вода проходит различные фазы, если прикладывать к ней гидростатическое давление при разных температурах (Вйдшап, 1911) (фиг. 7). Если прикладывать к растворам определенные давления, то их можно сохранять в незамороженном состоянии даже при температурах значительно ниже нуля (Впбдетаи, 1970). Высокое гидростатическое давление (ГСД) было использовано ТакайакЫ е! а1. (2000, 2001) для консервирования печени крысы при температурах ниже нуля для последующей трансплантации с целью снижения криоповреждений. В этом подходе ГСД было использовано для значительного снижения температуры замерзания культуральной среды, за счет чего биологический материал сохраняется при температурах ниже нуля без негативного воздействия криоконсервации. Авторами настоящего изобретения этот подход был признан ненадежным при консервации эмбрионов мышей, что показано ниже в примерах 2 и 3.

Гидростатическое давление в диапазоне 30-50 МПа обычно ингибирует рост различных организмов: инициация репликации ДНК является одним из наиболее чувствительных к давлению внутриклеточных процессов (АЬе е! а1., 1999). Воздействие давления имеет различную степень выраженности в зависимости от амплитуды и длительности сжатия (Мигакаш1 апб 21ттегтап, 1973). Указывалось, что основным местом возникновения повреждений, вызванных повышенным давлением, является мембрана клетки (Ра1ои е! а1., 1997). Обработка высоким гидростатическим давлением может нарушить функцио

- 1 009409 нальные свойства мембраны, такие как активный транспорт и пассивная проницаемость, и за счет этого может нарушить физико-химическое равновесие в клетке (Уадет аиб СЫапд, 1983; А1бпбде аиб Вгипег, 1985; Масбопа1б, 1987; 8сйи8!ет апб 81еу!г, 2002). Недавно проведенное исследование Коийау е1 а1. (2002) показало, что гидростатическое давление (5 МПа) ускоряло захват ДМСО в эксперименте, проведенном на яйцеклетках и эмбрионах оризии (Огу/1а5 1айре8), хотя при этом происходило быстрое снижение жизнеспособности. Физические или биохимические процессы в условиях измененного гидростатического давления подчиняются принципу Ле Шателье: все реакции, которые сопровождаются уменьшением объема, заметно ускоряются (Мигакат1 апб 21ттегтап, 1973; \Уе1с11 е1 а1., 1993; Ра1ои е1 а1., 1997). Повышенное давление может привести к изменению конформации белков, включая частично или полностью развернутые конформации. Давление может вызвать денатурацию белков за счет сочетанных эффектов разрыва внутрибелковых взаимодействий и открытия полостей, следствием чего является связывание воды (8сЫт1б е1 а1., 1975; ХУеЬег апб Опскатег. 1983; 1аешске, 1991; Сго55 апб 1аешске, 1994; 8йуа е1 а1., 2001).

В недавно выпущенных статьях указано, что гидростатическое давление повышает продуцирование белков шока (\Уе1с11 е1 а1., 1993; ^етекатр-КатрЫик е1 а1., 2002). Исследования показали, что нестабильность нормального синтеза белков у бактерий, которую вызывает сублетальный холодовой шок, можно преодолеть за счет синтеза так называемых белков холодового шока (С8Р - белки холодового шока, Н8Р - белки теплового шока) (РЫаба!аге е1 а1., 1999). Предполагается, что С8Р и Н8Р имеют много функций, например, являются шаперонами РНК (Огаитаип апб МатаЫе1, 1999) или активаторами транскрипции (ЬаТепа е1 а1., 1991); допускается также, что они играют роль в защите от замораживания (\Уои1ег5 е1 а1., 1999). В дополнительных исследованиях было установлено, что продуцирование С8Р и Н8Р индуцируется не только холодовым шоком, но и другими внешними стрессами. Например, у Е. сой определенный тип С8Р продуцируется при пищевом стрессе (Уатапака е1 а1., 1998). В другом исследовании было показано, что воздействие высокого гидростатического давления провоцирует продуцирование некоторых белков, индуцируемых холодом, и белков теплового шока (^е1сй е1 а1., 1993). В других недавно появившихся статьях указано, что гидростатическое давление повышает продуцирование белков шока (^етекатр-КатрЫик, е1 а1., 2002). Поскольку и холодовой шок, и высокое гидростатическое давление повышают уровни С8Р и Н8Р, были проведены исследования относительно возможности перекрестной защиты. ^етекатр-КатрЫик е1 а1. (2002) обнаружили, что после повышения давления уровень выживания Ьуйепа тоиосу!одеие8, подвергнутой холодовому шоку, был в 100 раз выше, чем у клеток, которые росли при 37°С.

В то время как микробиологи пищевых продуктов изучают указанные процессы с целью убить вредные микроорганизмы (Ви!/ апб Ьибдад, 1986; ^етекатр-КатрЫик е1 а1., 2002; 8рШтЬегдо е1 а1., 2002), задачей настоящего изобретения является повышение выживаемости криоконсервированного биологического материала.

В последние годы большое внимание было уделено изучению роли белков шока в криоконсервации. Ниапд е! а1. (1999) опубликовали данные о том, что значительное снижение концентрации одного из белков шока, Н8Р90, может сопровождаться снижением подвижности сперматозоидов во время охлаждения спермы морских свинок. \Уеп-ке1 е! а1. (2003) сообщили, что содержание Н8Р 90 в сперматозоидах человека значительно снижалось после криоконсервации, что может быть результатом деградации белков.

Обобщая вышесказанное, можно сказать, что Н8Р 90, синтез которого индуцируется высоким гидростатическим давлением, является белком цитозоля, молекулярным шапероном, играющим важную роль в устойчивости к стрессам, фолдинге белков, сигнальной трансдукции и т.п.

Было показано, что он связан со специфической АТФазой, которая важна для активации аутентичных белков организма ш у1уо (Реаг1апб Ртобтотои, 2000).

Связан с подвижностью сперматозоидов.

Активирует синтетазу окиси азота (N08) (Оагаа-Оатбеша е! а1., 1998).

Защищает клетки от активных видов кислорода (К.О8) (Бикиба е! а1., 1996), содержание которых достоверно увеличивается в процессе охлаждения и сильно нарушает подвижность сперматозоидов.

Участвует в метаболизме АТФ (Ртобтотои е! а1., 1997). Уровень АТФ снижается после холодового шока, и после этого не восстанавливается.

После охлаждения спермы свиней содержание Н8Р 90 значительно снижается, совместно со снижением подвижности сперматозоидов. Был сделан вывод о том, что Н8Р 90 может играть ключевую роль в регуляции подвижности сперматозоидов свиней (Ниапд е! а1., 1999).

Гелданамицин, специфический ингибитор Н8Р 90, достоверно снижает подвижность сперматозоидов свиней, причем эффект зависит от дозы и от времени (Ниапд е! а1., 2000).

Уровень Н8Р 90 в сперматозоидах человека значительно снижается после криоконсервации совместно с подвижностью сперматозоидов; снижение не обусловлено утечкой белка, а является результатом его деградации (\Уеп-ке1 САО е! а1., 2003).

- 2 009409

При превышении определенного уровня сумма эффектов давления является летальной: хотя необратимые изменения некоторых биомолекул происходят при более высоких давлениях, большинство бактерий и многоклеточных организмов погибают при 300 МПа. Однако тихоходки, которые в активном состоянии погибают между 100 и 200 МПа, могут выдерживать давление до 600 МПа, если они находятся в дегидратированном «измененном» состоянии (8ек1 апй ТоуокЫша, 1998).

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что можно достоверно повысить выживаемость биологического материала посредством приложения к нему повышенного гидростатического давления с последующим выполнением протоколов криоконсервации, соответствующих современному уровню техники. В контексте настоящего изобретения термин «выживаемость» означает, среди прочего, продолжение развития ίη νίίτο и ίη νίνο, более высокую частоту продолжения развития или имплантации и родов (в случае эмбрионов); большую подвижность и/или повышенную способность к оплодотворению после размораживания (в случае сперматозоидов); повышенную способность к оплодотворению, большую частоту развития эмбрионов или их имплантации и большую частоту родов (в случае ооцитов). Следует учесть, что термин «выживаемость» может охватывать другие разнообразные функциональные характеристики в зависимости от типа обработанного биологического материала.

С этой целью была определена переносимость давления некоторыми типами биологических материалов (см. примеры 1, 5 и 6) с последующим исследованием нескольких соответствующих современному уровню техники концепций повышения выживаемости биологического материала, подвергнутого воздействию повышенного давления (см. примеры 2 и 3). Затем авторы настоящего изобретения исследовали эффекты обработки повышенным давлением на различные типы биологических материалов и неожиданно обнаружили являющийся предметом настоящего изобретения способ воздействия повышенным давлением, позволяющий достичь решить задачи настоящего изобретения.

В этой связи следует подчеркнуть, что концепция настоящего изобретения одинаково применима ко многим различным протоколам криоконсервации и что выбор протокола не ограничивает настоящее изобретение. Единственной стадией, которую необходимо включить в усовершенствованные протоколы, является стадия воздействия повышенным гидростатическим давлением, параметры которого могут быть легко оптимизированы специалистом в данной области техники, если он будет следовать указаниям, данным в настоящей заявке.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу повышения выживаемости после размораживания криоконсервированного биологического материала, включающему в себя:

(а) приложение гидростатического давления к биологическому материалу, по выбору, согласно заранее определенному профилю «давление-время»;

(б) выдерживание биологического материала под гидростатическим давлением в течение заранее определенного периода времени;

(в) сброс гидростатического давления;

(г) замораживание биологического материала согласно любому применимому протоколу.

В одной из форм осуществления изобретения давление, используемое в способе согласно настоящему изобретению, лежит в диапазоне от 1 до 250 МПа. В предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения давление предпочтительно лежит в диапазоне от 10 до 100 МПа, более предпочтительно от 20 до 75 МПа и еще более предпочтительно от 30 до 60 МПа.

В другой форме осуществления настоящего изобретения гидростатическое давление, используемое в способе согласно настоящему изобретению, прикладывается к объекту в течение периода времени, лежащего в диапазоне от 1 с до 300 мин. В предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения давление прикладывается предпочтительно на период времени, лежащий в диапазоне от 1 с до 150 мин, более предпочтительно от 1 с до 90 мин и еще предпочтительнее от 1 с до 60 мин.

В других формах осуществления настоящего изобретения способ согласно настоящему изобретению включает в себя постепенное снижение давления в течение периода времени, лежащего в диапазоне от 1 с до 4 ч. В других формах осуществления период времени, в течение которого снижается давление, находится в диапазоне от 10 с до 2 ч, или от 1 мин до 1 ч, или в других случаях от 10 до 30 мин. Снижение давления также может быть мгновенным.

В предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения способ согласно настоящему изобретению используется для обработки биологического материала, выбранного из группы, состоящей из ооцитов, сперматозоидов, зигот, морул, бластоцист, эмбрионов, стволовых клеток, других клеток или тканей позвоночного животного.

Другие предпочтительные формы осуществления настоящего изобретения относятся к способу, в котором указанным позвоночным животным является рыба, птица или млекопитающее, предпочтительно корова, лошадь, коза, овца, свинья, другое сельскохозяйственное животное, домашнее животное, примат, в том числе человек.

Настоящее изобретение также относится к устройству для получения повышенного давления для обработки биологического материала давлением, которое включает в себя камеру высокого давления для помещения в нее биологического материала;

- 3 009409 средства для создания давления в диапазоне от 1 до 250 МПа, предпочтительно от 10 до 100 МПа, более предпочтительно от 20 до 75 МПа и еще предпочтительнее от 30 до 60 МПа и средства для подержания давления в камере в течение периода времени от 1 с до 300 мин, предпочтительно от 1 с до 150 мин, более предпочтительно от 1 с до 90 мин и еще предпочтительнее от 1 с до 60 мин.

В предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к устройству, в котором средства для создания давления представляют собой поршень, а камера высокого давления является цилиндрической камерой, в которой находится этот поршень;

между камерой и поршнем предусмотрены уплотнители, позволяющие развить высокое давление; и для приложения силы к поршню предусмотрены средства, которыми управляют вручную и/или с помощью автоматики.

В другой предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к устройству, в котором средством для приложения силы к поршню является пластинчатый элемент с поверхностью, упирающейся в поршень, и предусмотрены средства для регулирования положения поршня внутри камеры.

В других предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения устройство включает в себя систему для регулирования снижения давления в напорной камере в течение периода времени, лежащего в диапазоне от 1 с до 4 ч.

В других предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения устройство также содержит манометр, который показывает давление в камере.

В другой предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения напорная камера содержит жидкую среду.

В специфических примерах осуществления настоящего изобретения напорная камера имеет стенку толщиной примерно от 10 до 25 мм, предпочтительно толщиной менее 20 мм; камера имеет внутренний диаметр, который предпочтительно меньше 100 мм, более предпочтительно меньше 50 мм, более конкретно примерно равен 20 мм, а высота внутренней полости предпочтительно меньше 250 мм, более предпочтительно меньше 100 мм, в частности примерно равна 200 мм.

В другой предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к устройству, которое используется для обработки биологического материала, выбранного из группы, состоящей из ооцитов, сперматозоидов, зигот, морул, бластоцист, эмбрионов, стволовых клеток, других клеток или тканей позвоночного животного.

Настоящее изобретение также относится к применению устройства высокого давления для компрессии биологического материала.

В предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к применению устройства высокого давления, в котором повышенное давление используется для предварительной обработки биологического материала перед криоконсервацией.

В предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения применение устройства высокого давления может включать в себя любую из процедур криоконсервации согласно настоящему изобретению.

В предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения применение согласно настоящему изобретению предусматривает устройство высокого давления, которое включает в себя камеру высокого давления, подходящую для размещения в ней биологического материала, и средства, обеспечивающие регулируемое давление в диапазоне от 1 до 250 МПа, предпочтительно от 10 до 100 МПа, более предпочтительно от 20 до 75 МПа и еще предпочтительнее от 30 до 60 МПа.

В других предпочтительных формах осуществления настоящего изобретения применение согласно настоящему изобретению предусматривает применение устройства высокого давления, которое включает в себя средства для поддержания давления в течение периода времени в диапазоне от 1 с до 300 мин, предпочтительно от 1 с до 150 мин, более предпочтительно от 1 с до 90 мин и еще предпочтительнее от 1 с до 60 мин.

В предпочтительной форме осуществления настоящего изобретения применение согласно настоящему изобретению включает в себя использование вместе с устройством высокого давления системы управления, регулирующей снижение давления в камере в течение периода времени от 1 с до 4 ч.

В специфических примерах осуществления изобретение также относится к применению устройства высокого давления, при котором в устройстве высокого давления может быть развито высокое гидростатическое давление.

В другой предпочтительной форме осуществления настоящее изобретение относится к применению устройства высокого давления для обработки биологического материала, который выбран из группы, состоящей из ооцитов, сперматозоидов, зигот, морул, бластоцист, эмбрионов, стволовых клеток, других клеток или тканей позвоночного животного.

Изобретение также относится к применению устройства высокого давления согласно настоящему изобретению для компрессии биологического материала.

- 4 009409

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение более подробно описано на примере использования эмбрионов мыши для демонстрации концепции, являющейся предметом изобретения. Тем не менее, очевидно, что описанные процедуры одинаково применимы к любым биологическим материалам, которые обычно криоконсервируют в данной области техники. Эмбрионы мыши были выбраны в качестве объекта детального исследования исключительно по причине легкости их получения и обращения с ними. Кроме того, криоконсервация эмбрионов находится на переднем фронте исследований в области криоконсервации из-за возможности ее применения в промышленности и медицине. Однако в способе согласно настоящему изобретению и, аналогично, в данном описании изобретения термин «эмбрион мыши» может быть использован взаимозаменяемо с термином «биологический материал». В настоящей заявке также представлены экспериментальные данные для 1УЕ-эмбрионов (эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения) коров и сперматозоидов быков, у которых неожиданно была обнаружена повышенная выживаемость после размораживания. Показательным биологическим материалом могут быть, например, эмбрионы различных видов млекопитающих на пред- и постимплантационных стадиях развития, ооциты, сперматозоиды, стволовые клетки, ткани, органы позвоночных животных и человека, или даже весь организм. Позвоночное животное может принадлежать к любому виду, например, быть рыбой, птицей или млекопитающим, предпочтительно коровой, лошадью, козой, овцой, свиньей, другим сельскохозяйственным животным, мелким домашним животным, приматом, в том числе человеком.

Эмбрионы мышей, относящихся к высокоразвитым эукариотическим организмам, более восприимчивы к эффектам гидростатического давления, чем тихоходки и бактерии. Поэтому первая цель состояла в том, чтобы определить основные особенности эмбрионов мыши, обработанных давлением, относящиеся к их морфологии и выживаемости.

Для тщательного исследования способа согласно настоящему изобретению было изготовлено устройство-прототип. Для проведения экспериментов, обсуждающихся в примерах, приведенных ниже, было использовано устройство для создания высокого давления 1, изображенное на фиг. 8.

Устройство для создания высокого давления 1 содержит цилиндрическую камеру высокого давления 2, имеющую два отверстия 3, 4, одно из которых находится наверху, а второе - в дне камеры, манометр 5, который подсоединен к верхнему отверстию 3, и поршень 6, который вставлен через нижнее отверстие 4. Манометром 5 может быть любой подходящий манометр, при условии, что он может измерять давление в диапазоне, представляющем интерес, а именно в диапазоне от 1 до 250 МПа, предпочтительно от 10 до 100 МПа, более предпочтительно от 20 до 75 МПа и еще предпочтительнее от 30 до 60 МПа. Камера высокого давления 2 имеет внутреннюю высоту, примерно равную 60 мм, и ширину, примерно равную 20 мм. Стенка 7 камеры 2 адаптирована к тому, чтобы выдерживать давления до 250 МПа, предпочтительно не мене 75 МПа и еще предпочтительнее до 60 МПа. Стенка 7 камеры 2 предпочтительно изготовлена из материала, устойчивого к коррозии, которым предпочтительно является пластмасса или нержавеющая сталь.

Чтобы увеличить плотность соединения между внутренней стороной стенки 7 у нижнего отверстия 4 и поршнем 6, последний снабжен круговым герметичным уплотнителем 8, например, кольцевым уплотнителем из тефлона. Такой же или иного рода герметизирующий уплотнитель предпочтительно используется также у верхнего отверстия 3, где установлен манометр 5. Часть стенки 7, окружающей нижнее отверстие, имеет периферический выступ, образующий фланец 9. Камера высокого давления 2 дополнительно оборудована толстой крышкой 10 для удержания и перемещения поршня 6 в камере 2. Крышку 10 можно прикрепить к фланцу 9 с помощью фиксирующих средств, таких как винты 11. Предел прочности на растяжение каждого винта должен иметь достаточно высокое значение, чтобы выдерживать растягивающие силы, обусловленные высоким давлением в камере 2. Камера высокого давления 2 заполнена средой 12, подходящей для создания высокого давления при относительно небольшом сжатии, которое происходит при продвижении поршня внутрь камеры высокого давления 2. Такой средой может быть любой известный тип нетвердой среды 12 (предпочтительно жидкая или гелеобразная среда 12), используемой в области технологии высоких давлений, однако, в контексте настоящего изобретения была использована обычная вода. Чтобы предотвратить нагревание среды 12 при сжатии, стенку 7 камеры высокого давления 2 предпочтительно изготавливают из теплопроводящего материала.

Следует учесть, что описанное устройство для создания высокого давления 1 может быть изготовлено с такими диаметрами, чтобы оно представляло собой портативное устройство для использования усовершенствованного способа криоконсервации согласно настоящему изобретению. Указанные ниже размеры приведены только в качестве примера, и очевидно, что специалист в данной области техники, может легко представить себе примеры осуществления с большими или меньшими размерами. В данном примере камера высокого давления 2 имеет внутреннюю высоту Н₁, равную 60 мм, и внутренний диаметр Ό₁, равный 20 мм, который также соответствует диаметру поршня 6. Высоту Н_р поршня 6 можно выбрать пропорционально Н,, например, в коротком испытательном устройстве она была равна 20 мм. Стенка 7 камеры 2 имеет толщину Ό„, примерно равную 10 мм. Герметичный уплотнитель 8 вокруг поршня 6 имеет высоту Н,. равную 5 мм, и толщину Э,. равную 2 мм. Винты 11, использованные для крепления крышки 10 к фланцу 9, могут иметь диаметр Ό, равный 8 мм. Коммерчески доступные винты 11 такого

- 5 009409 размера могут иметь предел прочности на растяжение, равный 800 МПа, который является достаточным для того, чтобы выдержать давление до 200 МПа. Фактический размер устройства можно выбрать в зависимости от биологического материала, подлежащего обработке, и доступных средств, используемых для помещения биологического материала в устройство.

Во время предварительной обработки эмбрионов мыши перед криоконсервацией эти эмбрионы (помещенные в пластмассовый капилляр с соответствующим раствором для хранения эмбрионов) размещали внутри камеры высокого давления 2 в жидкой среде 12 (последней была обычная вода); поршень 6 вставляли в нижнее отверстие 4, не прикладывая к нему чрезмерных усилий, и прикрепляли крышку 10 к фланцу 9 камеры 2 при помощи винтов 11 так, чтобы она примыкала к поршню 6, который, при несжатом состоянии среды 12, частично выступал из камеры 2. После этого крышку перемещали ближе к нижнему отверстию 4, чтобы сдвинуть поршень 6 внутрь камеры высокого давления 2, закручивая винты (либо вручную, либо с помощью завинчивающего автоматического устройства) с такой скоростью и настолько, чтобы получить необходимые для конкретного проводимого эксперимента параметры давления. Результирующее давление внутри камеры 2 контролировали с помощью манометра 5. По истечении желаемого периода времени производили сброс давления в камере, либо посредством постепенного отвинчивания винтов 11, либо посредством удаления манометра 5 из верхнего отверстия, обеспечивая тем самым квазимгновенное расширение жидкой среды 12.

Средства для помещения эмбрионов в камеру не ограничиваются пластмассовыми капиллярами. В зависимости от конкретной прикладной задачи и биологического материала пробу, подлежащую обработке, можно поместить в различные опорные структуры. Например, эмбрионы или клетки можно поместить на криостатические петли или сетки для электронной микроскопии. В другой форме осуществления изобретения каплю раствора для хранения, в которой находится биологический материал, можно просто покрыть минеральным маслом, выполняющим роль жидкой среды 12. В этом случае можно миниатюризировать все устройство для создания высокого давления, что даст возможность закрепить его под стереомикроскопом для обеспечения легкого выделения биологического материала. В случае макроскопического биологического материала нет необходимости в специальных средствах для размещения, образец можно поместить в камеру, а жидкой средой 12 может быть раствор для хранения. Любые средства для размещения и/или удержания биологического материала в камере, которые обеспечивают воздействие высокого гидростатического давления на биологический материал, входят в объем изобретения.

Устройство для создания высокого давления 1 может быть полностью автоматизировано посредством использования программируемой системы управления. Такая система управления может регулировать следующие входные параметры: скорость увеличения давления, желаемое время пребывания биологического материала под максимальным давлением и скорость сброса давления. Также могут быть использованы средства для регулирования температуры, хотя использования материала с высокой теплопроводностью для изготовления стенки 7 камеры высокого давления 2 может быть достаточно для предотвращения вредных колебаний температуры. Средства для регулирования температуры могут представлять собой единое устройство для повышения давления-замораживания, обеспечивающее одностадийное решение для процесса криоконсервации. В этом случае оба компонента - устройство для создания высокого давления и устройство для замораживания - могут быть автоматизированы и оборудованы средствами для программирования обработки высоким давлением и замораживания согласно требованиям различных биологических материалов.

Также может быть предусмотрено портативное устройство, которое может быть очень сходным с описанной испытательной установкой и которое может обеспечить легкий и простой способ обработки биологического материала; после этой стадии можно использовать легкодоступные технологии консервации биологического материала. Такой подход может помочь практикам в удаленных местах, или его можно использовать в различных проектах, например, для консервации в полевых условиях.

Были проведены тщательно спланированные эксперименты по исследованию переносимости высокого давления различными биологическими материалами. Использованные давления и периоды времени были выбраны так, чтобы перекрыть самый широкий диапазон, который может в дальнейшем быть использован в практических применениях. Например, как показано на фиг. 7, температура фазового перехода воды при повышении давления снижается от 0°С при 0,1 МПа до -21°С при 210 МПа, а при превышении этого уровня давления наблюдается противоположный эффект. Поэтому для использования в способе согласно настоящему изобретению было выбрано давление в диапазоне от 1 до 250 МПа или даже до уровня, при котором среда замерзает при рабочей температуре устройства. Более конкретно, гидростатическое давление, которое может быть приложено к эмбрионам на стадии бластоцисты, равно 1, 5, 10, 15, 20 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 120, 130, 140, 150, 200 или 250 МПа или любому значению между этими промежуточными диапазонами.

Гидростатическое давление может быть приложено к биологическому материалу согласно предварительно заданному профилю «давление-время». Этот профиль может быть определен специалистом в данной области техники в зависимости от материала, подлежащего обработке, при этом давление, прикладываемое к материалу, может постепенно возрастать с течением времени. Профиль, подходящий для данного биологического материала, можно определить эмпирически, и он может быть линейным, сту

- 6 009409 пенчатым или другим стандартным временным профилем.

Сходным образом, для биологических материалов можно выбрать очень разнообразные периоды времени, в течение которых они будут находиться под высоким гидростатическим давлением. Более конкретно, эмбрионы мышей выдерживают под выбранным давлением в течение периода времени в диапазоне от 1 с до 6 ч, более конкретно в течение 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 с, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 70, 80, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 или 360 мин. Время, в течение которого эмбрионы могут выжить под давлением, укорачивается при повышении давления.

Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что время между окончанием предварительной обработки повышенным давлением и началом криоконсервации в специфических формах осуществления изобретения может быть весьма различным. В зависимости от выбранного протокола, состояние биологического материала в этот промежуток времени может изменяться. Этот период может обеспечить физическое восстановление клеток, если он достаточно продолжителен, или, напротив, в клетках могут начаться новые процессы, например, могут происходить синтез и накопление белков шока. В различных условиях эти эффекты могут быть полезными или вредными, поэтому может потребоваться оптимизация протокола посредством проведения дополнительных экспериментов.

Фиг. 1 демонстрирует, что эмбрионы могут переносить значительное давление без видимых изменений морфологии (например, 90 МПа в течение 1 с или 30 МПа в течение 2 ч). Происходило сжатие (уплотнение) эмбрионов в зависимости от величины и длительности приложенного давления. Не ограничивая объем изобретения теорией, авторы изобретения считают, что давление не может быть прямой причиной выдавливания воды из бластоцист. Судя по процитированным источникам, уменьшение размеров эмбрионов было следствием индуцированного давлением синтеза различных белков (белков холодового шока, С8Р), обратимых нарушений структуры белков и метаболических процессов. Сжатые (уплотненные) эмбрионы могут восстановить свою нормальную морфологию через 4-5 ч их культивирования ίη νίίτο и продолжить развитие аналогично контрольным эмбрионам (например, эмбрионы, на которых действовало давление, равное 90 МПа, в течение 30 мин или давление, равное 30 МПа, в течение 3 ч).

Не ограничивая объем изобретения теорией, на основании исследований, проведенных на ΙΥΡэмбрионах коров, можно постулировать, что сжатие (уплотнение) не является критерием оптимальной предварительной обработки повышенным давлением. Сжатие (уплотнение) может быть результатом нарушения проницаемости мембран при повышенном давлении, нарушения диффузии и активного транспорта через клеточные мембраны. Это обратимое изменение морфологии можно считать морфологическим «признаком», который указывает на то, что эмбрионы были обработаны «сублетальным» давлением. Согласно литературе, «сублетальный» шок является воздействием, которое стимулирует продуцирование так называемых «белков шока», которые, предположительно, играют роль в повышении успешности криоконсервации.

Однако в некоторых прикладных задачах для криоконсервации предпочтительно могут быть выбраны сжатые эмбрионы. После повышения давления расширенные бластоцисты сжимаются и остаются в таком виде в течение 3-4 ч, после чего снова расширяются. На основании этого феномена перед процедурой замораживания можно отобрать эмбрионы, обработанные повышенным давлением. Так как морфологические изменения эмбрионов и положительные эффекты предварительной обработки повышенным давлением могут быть результатом нарушения структуры белков, и/или их характеристик, и/или стимуляции продуцирования различных индуцированных давлением белков, обнаружение этих белков может быть признаком того, что к биологическому материалу перед процессом криоконсервации было приложено высокое гидростатическое давление.

Предварительная обработка давлением также в некоторой степени коррелирует с тем временем, в течение которого эмбрионы возвращаются к нормальному развитию после криоконсервации. Наблюдение за этим процессом может выявить природу предварительной обработки, так как приложение высокого гидростатического давления может значительно сократить время, необходимое для регенерации.

Чем больше величина давления, тем меньше время выживания эмбрионов. Воздействие давления, превышающего определенную величину и длительность, вызывает необратимые изменения: эмбрионы распадаются через 2 ч культивирования ίη νίίτο или оказываются уже разрушенными после декомпрессии (например, эмбрионы, обработанные давлением, равным 90 МПа, в течение 2 ч или давлением, равным 30 МПа, в течение 5 ч). Специалист в данной области техники должен уметь определять эти предельные значения давления или предельные длительности воздействия для конкретного используемого биологического материала посредством обычного экспериментирования.

Предполагается, что время выживания эмбрионов, обработанных давлением, можно увеличить путем постепенного снижения давления. Исследования показали, что коэффициент выживаемости эмбрионов, обработанных давлением, резко возрастает, если возвращать их в исходное состояние постепенно. Хотя пребывание в течение 60 мин под давлением, равным 90 МПа, было летальным для всех эмбрионов, 80% эмбрионов выживали при использовании постепенной декомпрессии в течение 120 мин. Время декомпрессии также является признаком настоящего изобретения, и специалист в данной области техники должен определить его для конкретного применения. Более конкретно, декомпрессию эмбрионов мыши, выдержанных под повышенным давлением, производили в течение периода времени в диапазоне от 1 с

- 7 009409 до 4 ч, более конкретно в течение 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 с, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 120, 150, 180, 210 или 240 мин. Аналогично повышению давления, декомпрессию также можно выполнить согласно заранее определенному профилю «давление-время».

Опять-таки не ограничиваясь теорией, можно отметить, что возможным объяснением этой особенности может быть то, что под давлением генерируется значительное количество СО₂ (АЬе апб НопкокЫ, 1995). Гидратация и ионизация СО₂ (образование НСО₃ ^- и Н⁺) ускоряются при повышении давления, поскольку реакция сопровождается уменьшением объема (0,26 мл/моль), которое зависит от величины приложенного давления (Ра1ои е1 а1., 1997; \Уе1с11 е1 а1., 1993). Образующийся внутри клеток диоксид углерода мгновенно растворяется, а затем диссоциирует с образованием НСО3^- и Н⁺, за счет чего также снижается внутриклеточный рН (АЬе апб НопкокЫ, 1995, 1997, 1998, АЬе е1 а1., 1999). Можно предположить, что равновесие, устанавливающееся при повышенном давлении, является летальным для эмбрионов при атмосферном давлении. Можно также выдвинуть гипотезу о том, что мгновенное снижение давления приводит к повышению выделения СО2 в цитоплазме из его гидратированной и ионизированной формы, что приводит к мгновенной гибели эмбрионов. Если декомпрессия происходит в течение определенного времени, то белки плазматической мембраны (Н⁺-АТФаза) (8сйт1б е1 а1., 1975; Рециеих апб С111е8, 1978), обратимо инактивированные повышенным гидростатическим давлением, снова начинают функционировать и (совместно с пассивной диффузией) постепенно сдвигают равновесие к физиологическому состоянию.

Высокое гидростатическое давление (ВГД) ранее было использовано для снижения криоповреждений ИакайакЫ е1 а1. (2000, 2001) при консервации печени крысы при температурах ниже нуля с целью последующей трансплантации. В этом подходе ВГД было использовано для значительного снижения температуры замерзания культуральной среды, за счет чего биологический материал консервировался при температурах ниже нуля без негативных эффектов криоконсервации. Чтобы исследовать этот способ криоконсервации на эмбрионах мышей, были проведены опыты с повышением давления на эмбрионы при 0°С. Выживаемость эмбрионов достоверно снижалась. Если при комнатной температуре (КТ) у эмбрионов, подвергнутых действию давления, равного 30 МПа в течение 45 мин, средняя выживаемость составила 90%, то при 0°С ни один из эмбрионов не выдержал такого воздействия. После 10 или 5 мин пребывания под давлением 60 МПа и 90 МПа соответственно, при 0°С выжило 0% эмбрионов. В противоположность этому, при комнатной температуре выживаемость в обоих случаях была равна примерно 90%. Также на эмбрионы воздействовали повышенным давлением при 0°С, после чего производили постепенную декомпрессию. Применение постепенной декомпрессии при низкой температуре не оказало положительного эффекта на выживаемость эмбрионов. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что этот феномен нельзя использовать, поскольку доказано, что совместное действие давления и низкой температуры является летальным для эмбрионов.

Настоящее изобретение относится к повышению выживаемости после размораживания криоконсервированных бластоцист мыши посредством приложения повышенного гидростатического давления. Выживаемость можно оценить по результатам переноса обработанных давлением эмбрионов после их обработки по любому протоколу криоконсервации и размораживания в культуральную среду и/или их подсадки псевдобеременным реципиентам. Развитие эмбрионов ίη νίίτο, их имплантация, дальнейшее развитие в матке и рождение здоровых детенышей являются явными доказательствами их биологического и генетического потенциала.

Как подробно описано выше, выживаемость криоконсервированных расширенных бластоцист мыши можно повысить посредством обработки их определенным давлением перед процедурой замораживания. К бластоцистам прикладывали давление, равное 60 МПа, на 30 мин, при этом примерно 80-90% эмбрионов оказывались сжатыми, а их выживание не отличалось от выживания необработанных контрольных эмбрионов. Согласно результатам оценки ίη νίίτο, обработка посредством приложения давления резко улучшает развитие эмбрионов ίη νίίτο после замораживания. Исследования ίη νίίτο показали, что воздействие повышенным гидростатическим давлением не только повышает выживаемость обработанных бластоцист, но и сокращает время восстановления, необходимое для возвращения эмбрионов в нативное состояние. В наших иллюстративных исследованиях через 6 ч 98% бластоцист, обработанных давлением, были морфологически (диаметр, структурная целостность и общая морфология) абсолютно идентичными контрольным эмбрионам, и 95% бластоцист продолжали свое развитие через 20 ч, так же, как и в контроле. Эмбрионы, замороженные без обработки давлением, расширялись до первоначальных размеров лишь через 20 ч после размораживания. Доля бластоцист, расширившихся до исходного размера, была значительно меньше по сравнению с бластоцистами, прошедшими обработку давлением (46% против 98%). Кроме того, в этой группе эмбрионы не продолжили свое развитие. Поэтому очевидно, что способ согласно настоящему изобретению пригоден для получения высоко жизнеспособных эмбрионов мыши.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана выживаемость эмбрионов при различных давлениях в диапазоне от 10 до 150 МПа (и при 10 МПа) в течение различного времени (1 с, 5, 15 и 30 мин и далее до 300 мин с 30минутными интервалами) при комнатной температуре. В каждой группе было использовано 14-16 эм

- 8 009409 брионов; каждый эксперимент повторили 3 раза. Выживаемость эмбрионов в полях, обозначенных буквами а и Ъ, не отличается от необработанных контрольных эмбрионов (р <0,05).

На фиг. 2 показана выживаемость эмбрионов, которые находились под давлением 90 МПа в течение 30, 60, 120 мин с последующей декомпрессией в течение 30-180 мин. (При мгновенной декомпрессии выживаемость через 30, 60 и 120 мин составляла 50%, 0%, 0% соответственно). Значения выживаемости, отмеченные на чертеже различными надстрочными индексами, достоверно отличаются друг от друга (р<0,05).

На фиг. 3 а показана выживаемость эмбрионов, находившихся под давлением, равным 30, 60 или 90 МПа, в течение периода от 1 с до 45 мин при комнатной температуре.

На фиг. 3Ъ показана выживаемость эмбрионов, находившихся под давлением, равным 30, 60 или 90 МПа, в течение периода от 1 с до 45 мин при 0°С. В каждой группе было использовано 12-15 эмбрионов; каждый эксперимент повторили 3 раза. Были обнаружены достоверные различия между группами, обработанными давлением при комнатной температуре и при 0°С (р <0,01).

На фиг. 4 показаны средние значения подвижности сперматозоидов (обработанных давлением и контрольных).

На фиг. 5 показана средняя подвижность сперматозоидов быка I после обработки давлением и замораживания-размораживания.

На фиг. 6 показана средняя подвижность сперматозоидов быка II после обработки давлением и замораживания-размораживания.

На фиг. 7 показана температура замерзания воды при различных давлениях.

Фиг. 8 представляет собой схему поперечного сечения возможного устройства для обработки повышенным давлением согласно настоящему изобретению.

Описание примеров осуществления изобретения Материалы и методы для примеров 1-4

Экспериментальные животные и получение эмбрионов.

Мышей СВ6Е1 (СНаг1с5 Ищет, Германия) содержали в стандартных условиях (22±2°С; 12 ч темноты/12 ч света; вода и корм по потребности).

У самок вызывали суперовуляцию посредством внутрибрюшинной инъекции 10 МЕ сывороточного гонадотропина (РМ8С) (81дта, США) с последующей инъекцией 10 МЕ хорионического гонадотропина человека (НСС) (81дта, США) через 46 ч. Через 6 ч после введения НСС самок спаривали с фертильными самцами с образованием моногамных пар. Эмбрионы на стадии одной-двух клеток (день 0 и день 1) получали посредством промывания фаллопиевых труб промывочной средой ЕегйСиб (ЕетйРто Ν.ν., Бельгия). Эмбрионы культивировали при 37°С в термостате с 5% СО₂ при максимальной влажности воздуха. В период между стадиями одной клетки и компактной морулы эмбрионы культивировали в среде С 1.2 (νίΐτίΐίίο, Швеция) под минеральным маслом Ονοίΐ (νίΐτοίίίο, Швеция). Затем эмбрионы переносили и культивировали в среде С 1.2 (νίΐτίΐίίο, Швеция) под минеральным маслом Ονοίΐ до стадии расширенной бластоцисты.

Обработка повышенным давлением.

Бластоцисты помещали в пластиковые капилляры со средой М2 (81дта, США) так, чтобы капилляры не содержали пузырьков воздуха (7-9 эмбрионов/капилляр), после чего капилляры запаивали. Капилляры помещали в камеру высокого давления, заполненную водой в качестве среды, передающей давление. Изготовленное по специальному заказу устройство для создания высокого давления, способное обеспечивать точно регулируемое давление в диапазоне от 1 до 150 МПа, было изготовлено из нержавеющей стали с внутренним диаметром, равным 2 см, и соединено с манометром. Гидростатическое давление создавали посредством продвижения поршня в камеру высокого давления при завинчивании винтов вручную. Желаемое давление достигалось за время от 20 с до 5 мин (от 10 МПа до 150 МПа соответственно); длительность сброса давления была равна 3 секундам. В тех экспериментах, где исследовались эффекты постепенной декомпрессии, время снижения давления лежало в интервале от 30 до 210 мин. Эксперименты проводили при 0°С, камеру высокого давления погружали в холодильную ванну, заполненную средой Βίοοοοί (ЕТ8-8у§ет5, Нью-Йорк, США).

Криоконсервация после предварительной обработки повышенным давлением.

Эмбрионы случайным образом делили на три группы. Бластоцисты группы I криоконсервировали так, как описано ниже, в растворе для витрификации, содержавшем 7М этиленгликоля (ЭГ), по №\\ь11ап аиб Вгет (1998). Эмбрионы группы II обрабатывали давлением, равным 60 МПа, в течение 30 мин, затем замораживали таким же способом. Эмбрионы группы III служили необработанным контролем. После размораживания эмбрионы культивировали ίη νίΐτο в течение 24 ч.

Криоконсервация.

Эмбрионы в течение 5 мин уравновешивали в растворе, содержавшем 1,5М этиленгликоля (ЭГ) (81дта, США) и 0,25М сахарозы в М2 (81дта, США), с добавлением 10% фетальной сыворотки телят (ФСТ) (81дта, США), затем переносили в раствор для витрификации (7М ЭГ, 0,5М сахарозы в М2 с 10% ПСТ), предварительно помещенный в пластиковые капилляры объемом 0,25 мл (7-9 эмбрионов/капилляр). Затем капилляры запаивали. После воздействия раствора для витрификации в течение 1

- 9 009409 мин капилляр медленно погружали в жидкий азот. Капилляры оттаивали посредством погружения в воду при температуре 30°С на 30 с, после чего эмбрионы извлекали и помещали в регидратирующую среду (0,5М сахарозы в М2 с добавкой 10% ФСТ) на 5 мин. Затем эмбрионы культивировали в среде 6 2.2, как описано выше (Νο\ν51ιαπ апй Вгет, 1998).

Перенос эмбрионов.

Эмбрионы культивировали в среде С 2.2 в течение 2 ч, как описано выше. Затем их в каждой экспериментальной группе разделяли на «погибших» и «выживших» и по отдельности переносили (по 7-12 эмбрионов на животное) в псевдобеременных реципиентов в день 3. В качестве контроля переносили необработанные бластоцисты.

Оценка и статистический анализ.

Качество эмбрионов оценивали сразу же после сброса давления или после оттаивания, а также через 2, 3, 4, 6, 12, 20 и 24 ч. Выживание эмбрионов оценивали по морфологическим признакам: интактность бластомеров, повторное расширение бластоцеля и вылупление из прозрачной зоны были признаками выживания. В качестве контроля были использованы необработанные бластоцисты.

Для оценки ίη νίνο обработанные давлением эмбрионы культивировали в С 2.2 в течение 2 ч, как описано выше. Затем по 7-12 эмбрионов на животное переносили в псевдобеременных реципиентов в день 3. В качестве контролей переносили необработанные бластоцисты. Рождение здоровых детенышей было признаком выживания эмбрионов ίη νίνο.

Выживаемость сравнивали с выживаемостью необработанных контролей с использованием критерия хи-квадрат.

Пример 1. Выживаемость эмбрионов мыши при различных давлениях при комнатной температуре.

В этих экспериментах эмбрионы подвергали воздействию различных гидростатических давлений в диапазоне от 10 до 150 МПа (с шагом по 10 МПа) в течение различных периодов времени в диапазоне от 1 с до 300 мин при комнатной температуре.

При превышении определенных значений давления и времени (фиг. 1) обработка вызывала обратимые морфологические изменения. Расширенные бластоцисты сжимались внутри прозрачной зоны: бластоцель исчезал, размеры бластомеров уменьшались, но их нарушений структурной целостности не обнаруживалось. Через 4-5 ч культивирования ίη νίίτο эти бластоцисты снова расширялись, и в течение 24 ч они вылуплялись из прозрачной зоны (а). Эмбрионы, получившие меньшее воздействие, не обнаруживали морфологических изменений и вылуплялись через 24 ч культивирования ίη νίίτο (Ь), тогда как эмбрионы, получившие большую нагрузку, не расширялись из сжатого состояния и разрушались в пределах 2 ч, или уже были разрушенными после декомпрессии (с) (фиг. 1).

Для оценки ίη νίνο обработанные эмбрионы оценивались как «выжившие» (а и Ь) и «погибшие» (с) через 2 ч культивирования ίη νίίτο после декомпрессии, и их раздельно переносили в реципиентов. После переноса 170 эмбрионов «а» и «Ь» родилось 145 здоровых детенышей (85%), тогда как после переноса 49 эмбрионов «с» не было получено ни одного детеныша (0%).

Не было достоверных различий между частотой вылупления (ίη νίίτο) и рождаемостью (ίη νίνο) в случае контролей, не проходивших обработки давлением, и сжатых и не сжатых эмбрионов «а» и «Ь», обработанных давлением (р <0,05).

Эти результаты показывают, что эмбрионы могут выдерживать значительное давление без изменения выживаемости, хотя чем выше амплитуда давления, тем меньше время выживания эмбрионов (фиг. 1). Эмбрионы, которые не разрушались в течение 2 ч культивирования ίη νίίτο, имели такие же значения выживаемости ίη νίίτο и ίη νίνο, что и необработанные контроли.

Пример 2. Выживаемость эмбрионов мыши при использовании различных профилей декомпрессии.

В этом эксперименте исследовали, можно ли повысить выживаемость эмбрионов, обработанных давлением, посредством постепенной декомпрессии.

Расширенные бластоцисты выдерживали под давлением 90 МПа в течение 30, 60 и 120 мин (при этом выживаемость при комнатной температуре после мгновенной декомпрессии была равна 50, 0 и 0%), после чего давление постепенно снижали (9 ступеней) в течение 30, 60, 90, 120 и 150 мин. Результаты показывают, что можно значительно повысить выживаемость при проведении постепенной декомпрессии, которая имеет оптимальные параметры, зависящие от времени, в течение которого эмбрионы находились под давлением. С увеличением времени, в течение которого эмбрионы находятся под давлением, оптимальное время декомпрессии увеличивается. Максимальная выживаемость, которую можно получить с помощью декомпрессии, снижается с увеличением времени пребывания под давлением (фиг. 2).

После оценки ίη νίίτο 54 «выживших» и 35 «погибших» эмбрионов были перенесены в 9 реципиентов. Из 54 «выживших» эмбрионов 47 имплантировались (87%), а из 35 «погибших» эмбрионов имплантировалось 0 эмбрионов по оценке на 18-й день. Частота имплантации в группе «выживших» эмбрионов не отличалась от частоты имплантации контрольных эмбрионов (р<0,05).

Пример 3. Выживаемость эмбрионов мыши при различных давлениях при низкой температуре.

В этом эксперименте было исследовано влияние температуры на выживаемость эмбрионов, обработанных давлением.

Давление, равное 30, 60 или 90 МПа, прикладывали к эмбрионам на 1 с, 5, 10, 15, 30 и 60 мин при

- 10 009409 низкой температуре (0°С). Если эмбрионы, не обработанные давлением, могут выживать при 0°С в течение достаточно длительного времени без значительного изменения выживаемости, то одновременная обработка давлением, равным 30, 60 или 90 МПа, была летальной для 100% эмбрионов после 45, 10 и 5 мин соответственно. Значительное снижение выживаемости наблюдалось у эмбрионов, обработанных давлением при низкой температуре, по сравнению с группами, обработанными давлением при комнатной температуре (р<0,01%) (фиг. За, 3Ь).

После оценки ίη νίίτο 40 «выживших» и 28 «погибших» эмбрионов были перенесены в 7 реципиентов; из 40 «выживших» эмбрионов имплантировались 34 (85%), а из 28 «погибших» эмбрионов имплантировалось 0 эмбрионов по оценке на 18-й день. Частота имплантации в группе «выживших» эмбрионов не отличалась от частоты имплантации контрольных эмбрионов (р<0,05).

Эмбрионы, выдерживавшиеся при 0°С под давлением 90 МПа в течение 30 мин, также подвергали постепенной декомпрессии. Не выжило ни одного эмбриона при любом использованном времени декомпрессии (30, 60, 90, 120, 150, 180 мин). В каждой группе было от восьми до двенадцати эмбрионов, эксперименты повторяли по 3 раза.

Пример 4. Выживаемость эмбрионов после обработки давлением, замораживания и размораживания.

В настоящем исследовании авторы пытались выяснить, можно ли повысить выживаемость криоконсервированных расширенных бластоцист мыши посредством обработки их повышенным давлением перед выполнением процедуры замораживания. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Выживание замороженных и размороженных эмбрионов, прошедших криоконсервацию после предварительной обработки давлением и без обработки давлением

	η	Признаки выживания через 6 часов	Признаки выживания через 20 часов
		1/з расширения	Полное расширение	% расширения	2/3 расширения	Полное расширение	Вылупление
Группа 1	115	9%	0%ь	17%	10%	19%	0%6
Группа II (обработанная давлением)	95		98% *			3%	95%’
Необработанный контроль	107	-	99%’	-	-	5%	94%’

Цифры с различными индексами достоверно отличаются друг от друга (р <0,01).

Были обнаружены достоверные различия в выживаемости между группами, прошедшими и не прошедшими обработку давлением (р <0,01). Повторное расширение было более быстрым (4-6 ч против 20 ч), а выживаемость была выше (98% против 46%) у эмбрионов, которые перед криоконсервацией проходили обработку давлением (табл. 1). Между контролем и группой, обработанной давлением, не было достоверных различий в отношении выживаемости и частоты вылупления.

Пример 5. Выживание эмбрионов коров после обработки давлением, замораживания и размораживания.

Материалы и методы

Получение ооцитов и их дозревание ίη νίίτο (ΐνΜ).

Если не указано иное, то химические вещества были закуплены в компании ΕΜΒΚ.ΆΡΆ (Бразилиа, Бразилия). Яичники получали с бойни и хранили в физиологическом растворе при 35-37°С. Комплексы «кумулюс-ооцит» (СОС) получали посредством аспирации 2-10 мм фолликулов с помощью шприца на 20 мл с иглой 18 калибра и собирали в центрифужные пробирки на 50 мл. После седиментации в течение 10 мин СОС отсасывали в чашки Петри с культуральной средой ТСМ-199 по Хэнку (С1Ьсо) с добавлением фетальной сыворотки телят (ФСТ), пенициллина, стрептомицина и гепарина (81дша Н3149). После забора СОС три раза промывали средой для дозревания (ЕСМ-199 по Эрлу с добавлением фетальной сыворотки телят (ФСТ), лактатдегидрогеназы (ЬН) (81дша), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), Ь-глутамина, пенициллина и стрептомицина и переносили в 2 мл среды для дозревания (примерно 100 СОС на чашку Петри) с покрытием из минерального масла. Дозревание ооцитов осуществляли при 38°С на воздухе с 5% СО₂ и максимальной влажностью в течение 22 ч.

Подготовка спермы, экстракорпоральное оплодотворение (IV?) и культивирование ίη νίίτο (ΐνθ).

Для экстракорпорального оплодотворения СОС промывали три раза средой для проведения оплодотворения перед переносом группами по 20-25 шт. в чашки Петри, содержавшие по 4 капли объемом по 200 мкл среды для проведения оплодотворения (ТАЬР с добавлением сывороточного альбумина быка (Β8Ά), пенициламина - 81дша Р4875, гипотаурина - 81дша Н1384, эпинефрина - 81дша Е4250 и гепарина 8щша Н3149), покрытых минеральным маслом. Подвижные сперматозоиды получали посредством центрифугирования замороженных и размороженных сперматозоидов (СсгИсе. Куиаба, Бразилия) в ступен

- 11 009409 чатом градиенте плотности перколла (2 мл 45% перколла поверх 2 мл 90% перколла) в течение 20 мин при 700 г при комнатной температуре. Осадок сперматозоидов, собранный со дна 90%-й фракции, промывали в растворе Тироде, забуференном НЕРЕ8, и осаждали посредством центрифугирования при 700 г в течение 5 мин. Сперматозоиды подсчитывали на гемоцитометре и разводили в соответствующем объеме ТЛЬР с получением концентрации 2х10⁶ сперматозоидов/мл; к каждой капле для оплодотворения добавляли аликвоту этой суспензии объемом 200 мкл. Чашки Петри инкубировали в течение 19 ч в увлажненном воздухе, содержавшем 5% СО₂, при 39°С. Предположительные зиготы затем культивировали ίη νίΐτο в каплях 8ОЕ под минеральным маслом в увлажненной атмосфере, содержавшей 5% СО₂, при 39°С.

Обработка давлением.

Расширенные бластоцисты помещали в пластиковые капилляры (7-9 эмбрионов/капилляр), содержавшие среду для хранения эмбрионов (Етсаге Ηο1άίη§, Етсаге, Новая Зеландия) без пузырьков воздуха, затем капилляры герметизировали ПВХ. Капилляры помещали в камеру высокого давления, заполненную водой в качестве среды для передачи давления. Эмбрионы подвергали воздействию различных гидростатических давлений в диапазоне от 60 до 90 МПа (с шагом 10 МПа) в течение различного времени (15, 30, 45, 50, 60, 90, 100 мин) при комнатной температуре, как описано выше.

Криоконсервация с предварительной обработкой давлением.

Эмбрионы случайным образом делили на три группы. Бластоцисты группы I криоконсервировали так, как указано ниже, в растворе для замораживания, содержащем 1,5М этиленгликоля (ЭГ). Эмбрионы группы II обрабатывали давлением, равным 80 МПа, в течение 50 мин, затем замораживали таким же способом. Промежуток времени между обработкой давлением и началом замораживания составлял 4-5 мин. Группа III служила в качестве необработанного контроля. После размораживания эмбрионы культивировали ίη νίΐτο в течение 24 ч.

Криоконсервация.

Бластоцисты уравновешивали в течение 8 мин в растворе для замораживания, содержавшем 1,5М этиленгликоля (Етсаге, Новая Зеландия), предварительно поместив их в пластиковые капилляры объемом 0,25 мл (7-9 эмбрионов на капилляр). Капилляры герметизировали ПВХ. Капилляры помещали в программируемый морозильный аппарат (В1о-соо1, ЕТ8-§уй1ет5, США, Нью-Йорк), предварительно охлажденный до -5,2°С. Через 3 мин начиналась кристаллизация. Еще через 10 мин капилляры начинали охлаждать со скоростью -0,5°С/мин до -32°С, после чего их погружали в жидкий азот. Капилляры размораживали посредством осторожного встряхивания на воздухе в течение 10 с, после чего их помещали в воду при 35°С до тех пор, пока лед в капиллярах не таял. Бластоцисты извлекали из капилляров, три раза промывали в 8ОЕ, помещали в 8ОЕ под минеральное масло и возвращали в инкубатор на 24 ч.

Оценка и статистический анализ.

Качество эмбрионов оценивали сразу же после сброса давления или после размораживания, а также через 2, 3, 4, 6, 12 и 24 ч. Выживание эмбрионов оценивали по морфологическим признакам и продолжению развития ίη νίΐτο: интактность бластомеров, повторное расширение бластоцеля и вылупление из прозрачной зоны были признаками выживания. В качестве контроля были использованы необработанные бластоцисты.

Выживаемость сравнивали с выживаемостью контролей с использованием критерия хи-квадрат. Значение вероятности р <0,05 было принято за статистически достоверное.

Результаты

Выживание и продолжение развития эмбрионов после обработки различными давлениями.

В первой серии экспериментов на эмбрионы воздействовали различными значениями гидростатического давления в течение различного времени. Результаты суммированы в табл. 2, приведенной ниже:

Таблица 2

Выживание замороженных и размороженных эмбрионов коров, прошедших криоконсервацию после предварительной обработки давлением или без предварительной обработки давлением

Давление	Время	л (число эмбрионов, оставшихся сжатыми после декомпрессии/число несжатых эмбрионов)	Продолжение развития через 6 часов	Продолжение развития через 24 часа (вылупление)
			141	ΙΙί-ΐν	Ι-ΙΙ	ιιι-ιν
80 МПа	45 мин	8 (5/3)	8	-	8(4)	-
60 МПа	60 мин	8 (3/5)	8	-	8(5)	-
90 МПа	45 мин	7 (7/0)	4	3	4(1)	3
90 МПа	30 мин	7 (3/4)	6	1	6(6)	1
Контроль	8	7	1	6(2)	2

Σ-Π: полностью расширившиеся или расширившиеся на 2/3 от первоначального размера эмбрионы первого или второго класса;

Ш-ΣΥ: эмбрионы третьего класса или мертвые эмбрионы.

- 12 009409

Продолжение развития ίη νίίτο бластоцист, витрифицированных после предварительной обработки повышенным давлением и без предварительной обработки.

Во второй серии опытов мы исследовали, можно ли улучшить развитие ίη νίίτο прошедших криоконсервацию расширенных ίη νίίτο зрелых/оплодотворенных/культивируемых бластоцист коров посредством обработки повышенным давлением перед выполнением процедуры замораживания. В каждой экспериментальной группе было использовано по 8-12 эмбрионов, эксперименты повторили 6 раз. Результаты представлены в табл. 3.

Были обнаружены достоверные различия в выживаемости ίη νίίτο между группами, обработанными давлением и не обработанными давлением (р <0,01). Повторное расширение происходило быстрее (1-2 ч против 4-6 ч), а выживаемость была выше (81% против 41%) у тех эмбрионов, которые перед криоконсервацией прошли обработку давлением (табл. 3). Не было достоверных различий между контрольной группой и группой, обработанной давлением, в отношении выживаемости и вылупления.

Таблица 3 Продолжение развития ίη νίίτο после размораживания 1УМБС-бластоцист коров, замороженных после предварительной обработки давлением или без предварительной обработки давлением

		1	ас	4 часа	12 часов	24 часа
	N	Ι+ΙΙ	IV	Ι+ΙΙ	IV	Вылупление	Ι+1Ι	IV	Вылупление	Ι+ΙΙ	IV
Замороженные после предварительной обработки	59	88%	12%	81%	19%	12%	81%	19%	17%	81%	19%
Необработанные	61	46%	54%	41%	59%	0%	41%	59%	0%	41%	59%

Ι-ΙΙ: полностью расширившиеся или расширившиеся на 2/3 эмбрионы первого или второго класса; IV: погибшие эмбрионы.

Выводы

Полученные результаты показали, что проведение перед замораживанием обработки давлением может повысить скорость развития ίη νίίτο, выживаемость и частоту вылупления 1'УМБС-эмбрионов коров (ЖМЕС = дозревание ооцитов ίη νίίτο, оплодотворение ίη νίίτο, культивирование эмбрионов ίη νίίτο). Также это исследование представило доказательства того, что обработка давлением может в значительной степени способствовать успеху криоконсервации. Очевидно, что способы, представленные в вышеизложенных экспериментах, легко адаптируются к широкому диапазону биологических материалов, в частности к эмбрионам различного происхождения, например, эмбрионам лошадей, коз, свиней или приматов, включая эмбрионы человека.

Пример 6. Выживание сперматозоидов после обработки давлением, замораживания и оттаивания.

В первой части данного исследования было описано, как повышенное гидростатическое давление (ННР) влияет на долю подвижных клеток в свежей сперме быков. Во второй части эксперимента было выбрано 4 пары параметров на основании графика зависимости подвижности сперматозоидов от давления и времени, после чего сравнили подвижность после размораживания сперматозоидов замороженной спермы быков, прошедшей предварительную обработку при выбранных параметрах «давление-время», с подвижностью сперматозоидов, которые были заморожены без предварительной обработки.

Пробы спермы были получены из Центра искусственного осеменения Клессхайма, Австрия. Пробы разбавляли до концентрации сперматозоидов, равной 8х10⁷ мл, разбавителем АпйгоМей (МштТиЬ, Германия), как описано в инструкции. Разбавленную сперму помещали в капилляры объемом 0,25 мл и хранили при комнатной температуре. Перед обработкой давлением капилляр со спермой разрезали на две части. Одну половину запаивали и затем обрабатывали давлением при специфических параметрах давление/время, другую использовали для сравнения с подвижностью сперматозоидов после обработки. Эксперименты с различными параметрами давления/времени повторяли по семь раз, прогрессивную подвижность оценивали индивидуально путем исследований с помощью светового микроскопа, которые проводили два разных лаборанта. Группы, прошедшие обработку, получали обработку давлением при следующих параметрах: 10 МПа в течение 30, 60, 90 и 120 мин; 30 МПа в течение 30, 60, 90, 120 и 510 мин; 50 МПа в течение 30, 60 и 90 мин; 70 МПа в течение 30, 60 и 90 мин; 90 МПа в течение 30, 60, 90, 120 и 510 мин. Устройство для повышения давления было изготовлено по специальному заказу из нержавеющей стали, оно содержало камеру высокого давления с водой в качестве среды для передачи давления и утвержденный соответствующей организацией манометр. Время достижения желаемого значения давления составляло от 1 до 5 мин, сброс давления осуществляли за 2-3 с.

Средняя подвижность сперматозоидов в контрольных пробах варьировала между 75 и 90%, тогда как средняя подвижность сперматозоидов в пробах, обработанных давлением, варьировала от 55 (90 МПа/120 мин) до 84 (10 МПа/30 мин) процентов. В группах, обработанных при 30 МПа/510 мин и 90 МПа/510 мин, подвижность была значительно снижена по сравнению с другим группами, обработанны

- 13 009409 ми давлением (27 и 33% соответственно; р <0,05). См. фиг. 4.

Во второй части исследования пробы спермы были получены от двух быков (одна проба - от быка с известной плохой замораживаемостью спермы). Пробы разбавили, как описано выше, затем разделили на четыре группы для обработки. Группы, подлежащие обработке, разделили на две части: одну половину запаивали в капилляре и перед замораживанием подвергали воздействию повышенного давления с параметрами: I - 90 МПа/30 мин; II - 90 МПа/90 мин; III - 30 МПа/30 мин; IV -30 МПа/90 мин, вторую половину замораживали без предварительной обработки по такому же протоколу замораживания (уравновешивание при 5°С в течение 60 мин, затем 10 мин при -110°С перед погружением в жидкий азот). Размораживание производили в водяной бане с температурой 35°С в течение 30 с. Каждую группу также исследовали на начальную подвижность сперматозоидов после обработки давлением и без обработки. Каждый эксперимент повторили восемь раз.

Средняя начальная подвижность сперматозоидов у обоих быков находилась в интервале от 65 до 80%, тогда как после обработки давлением она снижалась до 45-75%. Средняя подвижность сперматозоидов после размораживания у обоих быков была значительно выше после предварительной обработки давлением (р <0,001) (бык I: 2-3% без обработки давлением против 17-33% после обработки - фиг. 5; бык II: 0% без обработки давлением против 21-35% после предварительной обработки давлением - фиг. 6). Среди исследованных параметров сочетание 30 МПа/90 мин оказалось значительно лучшим (33 и 35%; р<0,05).

Настоящее исследование явно подтверждает положительный эффект предварительной обработки давлением на подвижность сперматозоидов быков, прошедших криоконсервацию в нашем эксперименте, после их размораживания. Исследование обеспечило дополнительные доказательства того, что обработка давлением может в значительной степени способствовать успеху криоконсервации. Очевидно, что способы, представленные в вышеизложенных экспериментах, легко адаптируются к широкому диапазону биологических материалов, в частности к сперме различного происхождения, например, к сперме лошадей, коз, свиней или приматов, включая сперму человека.

Промышленная применимость.

Результаты, представленные в приведенных выше примерах, показывают, что обработка давлением, проведенная перед криоконсервацией, заметно повышает скорость развития эмбрионов ίη νίΐτο, выживаемость и частоту вылупления эмбрионов. Соответственно, может быть достигнута основная цель этих усилий: получение большего количества потомков. Кроме того, представленные данные по эмбрионам быков и сперме быков показывают широкую применимость концепции криоконсервации биологических материалов согласно настоящему изобретению. Применение способов согласно настоящему изобретению может быть полезным для повышения успешности криоконсервации эмбрионов и манипуляций с эмбрионами, включая другие виды млекопитающих и не исключая человека, а также для работы с ооцитами, эмбриональными стволовыми клетками, тканями и т. п. Представленный способ также открывает широкие возможности для других областей техники, где может найти применение криоконсервация биологического материала.

Ссылки

ЛЬе, Е., апб НопкокЫ, К. (1995). Нубгойайс ргеккиге ргото1ек 1ке аабШсабоп оГ ναοιιοία ίη 8асскаготусек сегеуыае (Гидростатическое давление способствует закислению вакуолей Засскаготусек сегеуыае). ЕЕМ8 М1сгоЬ1о1 Ьей 130, 307-312.

АЬе, Е., апб НопкокЫ, К. (1997). Vасиο1а^ аабШсайоп ίη Засскаготусек сегеуыае тбисеб Ьу е1еуа1еб кубгойайс ргеккиге 18 1гап81еп1 апб 18 теб1а1еб Ьу νасиο1а^ Н+-АТРаке (Закисление вакуолей Засскаготусек сегеч181ае, вызванное повышенным гидростатическим давлением, является временным и опосредованным вакуолярной Н⁺-АТФазой). Ех1геторкбе8 1, 89-93.

АЬе, Е., апб Нопкоккг К. (1998). Апа1у818 оГ ш1гасе11и1аг рН т 1ке уеай Засскаготусек сеге^'Ыае ипбег е1еуа1еб кубго81абс ргеккиге: а йибу ш Ьаго-(р1ехо-) рку81о1оду (Анализ внутриклеточного рН в дрожжах Засскаготусек сегетыае при повышенном гидростатическом давлении: баро-(пьезо-)физиологическое исследование). ЕхйеторШек 2, 223-228.

АЬе, Е., Ка1о, С, апб НопкокЫ, К. (1999). Рге88иге-гедц1а1еб те1аЬо118т т ткгоогдашктк (Регулируемый давлением метаболизм у микроорганизмов). Тгепбк М1сгоЫо1 7, 447-453.

А1бг1бде, В.Е., Вгипег, Ь.Г (1985). Ргеккиге еГГесй оп тескашктк оГ скагде йапкрой асгокк Ьбауег тетЬгапек (Воздействие давления на механизм переноса зарядов через двухслойные мембраны). ВюсЫт Вюркук Ас1а 817, 343-354.

Агскег, I., Ооок, Э.А., Ебдаг, Э.Н. (2003). В1ак(осу8( Гогтайоп апб се11 питЬегк т китап Ггохеп1ка\\'еб етЬгуок Го11о\утд ех1епбеб сиНиге (Образование бластоцист и количество клеток в замороженныхразмороженных эмбрионах после длительного культивирования). Нитап Вергобис11оп (ОхГогб, Епд1апб) 18, 1669-1673.

Вади181, А., Агач, А., СгокЬу, Т.Е., Воске, ГЕ., апб Во1апб, М.Р. (1997). Нуро1кегтк 81огаде оГ ккеер етЬгуок χνίΐΐι апиГгеехе рго1еш8: беνе1οртепΐ т νίΐτο апб ш νίνο (Гипотермическое хранение эмбрионов овец с белками, предохраняющими от замерзания). Ткеподепо1оду 48, 1017-1024.

Впбдтап, Р.^. (1911). \Уа1ег т 1ке кдшб апб Гйе 8окб Гогтк ипбег ргеккиге (Вода под давлением в

- 14 009409 жидкой и пяти твердых формах). Ртосеебтдк оГ б1е Лтепсаи Асабету оГ Айк апб 8с1епсе 47, 441-558. Впбдетап, Р.Е. (1970). Тке ркукюк оГ Ыдк ргеккиге (Физика высокого давления). Ыете Уогк: Эоуег. Βηϊζ Р., Биб\у|д Н. (1986). Ргеккиге шасбуабоп оГ тютоотдаЫктк а! тобега!е !етрега!игек (Инактивация микроорганизмов давлением при умеренных температурах). Ркукюа В+С 139-140, 875-877.

Раку, О.М., МасРатаие, Ό.Ρ.. Апде11, С.А. апб Мегутап, Н.Т. (1984). УбтШсабоп ак ап арргоаск !о стуортекегуабоп (Витрификация как подход к криоконсервации). СтуоЫо1оду 21, 407-426.

Рикиба, А., Окауа, Т., Оба, Н., Тапака, Т., ТоуокиЫ, 8. апб ИсЫба, К. Ох1бабуе кбекк гекропке ш поп шбисеб аси!е пербтоФхкйу: епкапсеб ехргеккюп оГ кеа! ккоск рго!еш 90 (Реакция на оксидативный стресс при индуцированной железом острой нефротоксичности: повышенная экспрессия белка теплового шока 90). Вюскет Вюркук Век Соттип 1996; 219:76-81.

Оагаа-Оагбепа, О., Рап, В., 8как, V., 8оггепбпо, В., Стпо, О., Рараре!горои1ок. Оупат1с асбуабоп оГ епбо111еНа1 пНпс ох1бе куп!каке Ьу Н8Р90 (Динамическая активация эндотелиальной синтазы окиси азота белком теплового шока 90). Иа1иге 1998; 392: 821-4.

О^аитаии, Р.Б., Магак1е1 М.А. (1999). Со1б ккоск рто!етк СкрВ апб СкрС аге та)ог к!абопату-ркакешбисеб рто!етк ш ВасШик киЬббк (Белки холодового шока СкрВ и СкрС являются основными индуцируемыми белками стационарной фазы у ВасШик киЬббк). Агск МюгоЬю1 171, 135-138.

Отокк, М., 1аеЫске, В. (1994). Рго!ешк ипбег ргеккиге. Тке б1ГЫепсе оГ к1дк кубток1абс ргеккиге оп кбисЫте, Гипсбоп апб аккетЬ1у оГ рто!етк апб рго!еш сотр1ехек (Белки под давлением. Влияние высокого гидростатического давления на структуру, функцию и сборку белков и белковых комплексов). Еиг 1 Вюскет 221, 617-630.

Ниапд, 8.Υ., Кио, У.Н., Бее, У.С., Ткои, Н.Б., Бее, У.Р., Скапд, Н.Б. е! а1. 8иЬк!апба1 бесгеаке оГ кеа!ккоск рто!ет 90 ргесебек !ке бесНпе оГ крегт тобШу бийпд сообпд оГ Ьоаг крегта^оа (Значительное снижение содержания белка теплового шока 90 предшествуют снижению подвижности сперматозоидов во время охлаждения сперматозоидов хряков). Ткейодепо1оду 1999; 51:1007-16.

Ниапд, 8.Υ., Кио, ΥΉ., Ткои, Н.Б., Бее, XV.С., Кшд, Υ.Τ., Ниапд, Н.С. е! а1. Тке бесбпе оГ ротсше крегт тоб1бу Ьу де1бапатусш, а кресбгс б1ЫЬПог оГ кеа! ккоск рто!еш 90 (Н8Р 90) (Снижение подвижности сперматозоидов свиней гелданамицином, специфическим ингибитором белка теплового шока 90). Ткейодепо1оду 2000; 53:1117-84.

1ккуаг, А.К., Метоп, М.А. (1996). ЕтЬгуо бапкГег т ккеер апб доа!к: а гег1е\у (Перенос эмбрионов овцам и козам: обзор). 8та11 Вцттап! Векеагск 19, 35-43.

ЫеЫске, В. (1991). Рго!еш к!аЫ1ку апб то1еси1аг абар!абоп !о ех1гете сопббюпк (Стабильность белков и молекулярная адаптация к экстремальным условиям). Еиг 1 Вюскет 202, 715-728.

БаТепа, А., Вгапб1, А., Ра1сош, М., 8ршто, В., Роп, С.Б., Оиа1ега, СО. (1991). 1бепбйсабоп оГ а со1бккоск !^аиκс^^рί^опа1 епкапсег оГ !ке ЕкскейсЫа сок та)ог со1б ккоск депе епсобшд пис1еоббе рто!еш Н-Ы8 (Идентификация стимулятора транскрипции основного гена холодового шока ЕкскейсЫа сок, кодирующего нуклеотидный белок Н-Ы8). Ргос Иаб Асаб 8а И8А 88, 10907-10911.

БеШо, 8.Р. апб 8опдкакеп, N. (2002). Стуортекегуабоп оГ дате!к апб етЬгуок оГ поп-ботекбс креаек (Криоконсервация гамет и эмбрионов неодомашненных животных). Ткейодепо1оду 57. 303-326.

Масбопа1б, А.О. (1987). Тке го1е оГ тетЬтапе Пшбку т сотр1ех ргосеккек ипбег Ыдк ргеккиге (Роль текучести мембраны в комплексных процессах под высоким давлением). 1п: Зоппакск, Н/ν., Магци1к, В.Е., Ζ^тте^тап. А.М., еббогк. Сиггеп! Реткресбуек ш Н1дк Ргеккиге Вю1оду. Бопбоп: Асабетю Ргекк рр. 207-223.

Мебебо, С.М.О., Роге11, Р., Окуепа, А.Т.И., апб Вобпдиек, 2002. ББ. Сиггеп! 8!а!ик ОГ 8регт Сгуоргекегуабоп: Vку 1кп'! I! Ве!!ег? (Современное состояние криоконсервации спермы: Почему это лучше?) Ткейодепо1оду 57:327-344.

Мигакатт Т.Н., Ζ^тте^тап, А.М. (1973). ΌΝΛ куп!кек1к ш Те!гакутепа: а ргеккиге к!ибу (Синтез ДНК в Тебакутепа: исследование влияния давления). Су!оЫок 7,171-181.

№уккап, М.А., Вгет, О. (1998). ЕГГес! оГ сгуорго1ес1ап1к апб !кеб сопсеп!габоп оп рок1-1ка\у киту1уа1 апб беуе1ортеп! оГ ехрапбеб тоике Ь1ак!осук!к Ггс^еп Ьу а к1тр1е ^ар^б-Г^ееζ^пд ргосебиге (Влияние криопротекторов и их концентрации на выживание и развитие после размораживания расширенных бластоцист мыши, замороженных посредством простой процедуры быстрого замораживания). Ткеподепо1оду 50, 1001-1013.

Ра1ои, Е., ^ореζ-Ма1о, А., ВатЬока-Сапоуак, Ο.ν., Vе1б-Скаиек, 1., апб 8уапкоп, В.О. (1997). Ктебс апа1ук1к оГ Ζудокасска^отусек Ьабб тасбуабоп Ьу Ыдк кубгок!абс ргеккиге (Анализ кинетики инактивации Ζудокасска^отусек ЬаШ1 высоким гидростатическим давлением). БеЬепкт.^1кк. и. Тескпо1. 30,703-708.

Реаг1, Б.Н. апб Ргобготои, С. 81гис1иге апб т у1уо Гипсбоп оГ Нкр 90 (Структура и функция Нкр 90 ш У1уо). Сигг. Орт 8!гис! Вю1 2000; 10:46-51.

Рециеих, А., апб ОШек, В. (1978). ЕГГес!к оГ Ыдк кубток!абс ргеккигек оп !ке асбуйу оГ !ке тетЬтапе АТРакек оГ коте огдапк 1трбса!еб т кубгот1пега1 теди1абоп (Воздействие высокого гидростатического давления на активность мембранных АТФаз некоторых органов, участвующих в регуляции гидроминерального обмена). Сотр Вюскет Ркукю1 В Вюскет Мо1 Вю1 59, 207-212.

РкабЫге, 8., А1акта, 1., 1поиуе, М. (1999). Со1б-ккоск гекропке апб со1б-ккоск рго!ешк (Реакция на хо

- 15 009409 лодовой шок и белки холодового шока). Сигг Θρίη М1сгоЬю1 2,175-180.

Ргобготои, С, Кое, 8.М., 0'Впап, К., ЬабЬигу, ТЕ.. Р1рег, Р.ХУ.атб Реаг1, ЬН. 1бепРГ1са1гоп апб к(гисЦгга1 с11агас1еп/абоп оГ (Не АТР/АЭР-Ьтбтд кйе ίη (Не Н8Р90 то1еси1аг сРарегопе (Идентификация и определение структуры АТФ/АДФ-связывающего сайта молекулярного шаперона Н8Р90). Се11 1997; 90:6575.

Ка11, У.Р., апб РаРу, 6.М. (1985). 1се-Ггее сгуоргекегуаРоп оГ тоике етЬгуок а! -196°С Ьу мйпПсабоп (Криоконсервация эмбрионов мыши без образования льда при -196°С посредством витрификации). Νι1иге 313, 573-575.

КеиЬ1поГГ, В.Е., Рега, М.Р., Уа_)1а, 6., апб Тгоипкоп, Α.Ο. (2001). ЕГГесбме сгуоргекегуаРоп оГ Ритап етЬгуошс к(ет се11к Ьу (Ре ореп ри11еб к(га\м мРпПсабоп те(Роб (Эффективная криоконсервация эмбриональных стволовых клеток человека по методу витрификации в открытом капилляре). Нитап КергобисРоп 16,2187-2194.

КоиРау, Р., Зи/икк Т., 8Рикктапп, С.А.апб Така1, К. (2002). Еас(огк аГГесРпд (Ре ир(аке оГ ЭМ80 Ьу (Ре еддк апб етЬгуок оГ тебака, ΟΐΎζίηκ 1аРрек (Факторы, влияющие на захват ДМСО яйцеклетками и эмбрионами оризии, ΟΐΎζίηκ 1аРрек). ТРеРодепо1оду 58.1483-1496.

8сРтгб, 6., Ьибетапп, Н. Ό., апб .Таешске, К. (1975) Нщ1г ргеккиге еГГес(к оп (Ре асруру оГ §1усо1уРс еηζутек (Влияние высокого давления на активность гликолитических ферментов). ВюрРук СРет 3,90-98.

8сРик!ег, В., 81еуР, и.В. (2002). ТРе еГГес( оГ РубгоЧаРс ргеккиге оп 8-1ауег-кирройеб Ир1б тетЬгапек (Влияние гидростатического давления на липидные мембраны с опорным 8-слоем). ВюсРгт ВюрРук Ас(а 1563, 29-34.

8ек1, К., ТоуокРгта, М. (1998). Ргекегутд (агбщгабек ипбег ргеккиге (Консервация тихоходок под давлением). ЫаШге 395, 853-854.

811уа, ТЬ., Родие1, Ό., Коуег, С.А. (2001). Ргеккиге ргомгбек пете йгк1д1г(к Рг(о рго(е1п Го1бтд, бупатюк апб кРисШге (Давление обеспечивает новые представления о фолдинге белка, его динамике и структуре). Тгепбк ВюсРет 8а 26,612-618.

8р1РтЬегдо, 8., Е1маккоге, Ν., ВеРиссо, А. (2002). М1сгоЫа1 тасРуаРоп Ьу РгдР-ргеккиге (Инактивация микробов высоким давлением). ТРе Гоигпа1 оГ 8ирегсРРса1 Р1шбк 22, 55-63.

8(ас1гескг И, СоРеп, к, 8сРгтте1, Т., УШабкеп, 8.М. (2002). Ре(а1 беме1ортеп( оГ тоике оосу(ек апб ζудоΐек сгуоргекегуеб т а попсопуепРопа1 Ρ^ζί^ тебшт (Развитие плодов из ооцитов и зигот мыши, криоконсервированных в нестандартной среде для замораживания). СгуоЬю1о§у 44, 5-13.

ТакаРакРг, Т., КакРа, А., ТакаРакРг, Υ., 8акато(о, 1., Υокоуата, К., Рири, Т., ΥатаκР^ηа, 8., Татак1, Т., Τакаζатеа, Υ., Мша!киЬак1, К. (2000). РипсРопа1 1п(едгРу оГ 1Ре га! Рмег айег киШего ргекегуаРоп ипбег РгдР ргеккиге (Функциональная целостность печени крысы после консервации при температурах ниже нуля при высоком давлении). Тгапкр1ап1аРоп Ргосеебтдк 32, 1634-1636.

ТакаРакРг, Т., КакРа, А., ТакаРакРг, Υ., Υокоуата, К., 8акато!о, I., ΥатаκР^ηа, 8. (2001). РгекегуаРоп оГ га! 11уегк Ьу кирегсооРпд ипбег РгдР ргеккиге (Консервация печени крысы посредством суперохлаждения под высоким давлением). Тгапкр1а!аРоп Ргосеебшдк 3,916-919.

Уап УаДепбопк-Эе Ьееите, А.М., Эеп Оаак, ТН., Кгшр, Т.А., Ка11, У.Р. (1995). Сотрапкоп оГ 1Ре еГРсасу оГ сопмеп(юпа1 к1оте Ρ^ζί^ апб гар1б сгуоргекегуаРоп те(Робк Гог Ромиге етЬгуок (Сравнение эффективности методов стандартного медленного замораживания и быстрой криоконсервации эмбрионов коров). СгуоЬю1оду 32, 157-167.

Уап УаДепбопк-Эе Ьееите, А.М., Эеп Наак, ТН.6., апб Ка11, У.Р. 1997. Р1е1б Ггба1к (о сотраге ргедпапсу га(ек оГ Ромиге етЬгуо сгуоргекегуаРоп те(Робк: уйггГ1саРоп апб опе-к(ер бйиРоп уегкик к1оте Ρ^ζί^ апб (Ргее-к(ер бйиРоп (Полевые эксперименты по сравнению частот наступления беременностей при различных методах криоконсервации эмбрионов коров: витрификация и одностадийное разведение против медленного замораживания и трехстадийного разведения). ТРеподепо1оду 48, 1071-1084.

Уа(коп, Р.Р. ТРе еГГес( оГ со1б кРоск оп крегт се11 тетЬгапек (Воздействие холодового шока на мембраны клеток спермы). 1п: Моглк, 6.Т апб С1агке, А. ебк. ЕГГес(к оГ 1оте (етрегаЦгге оп Ью1оДса1 тетЬгапек. Ьопбоп: Асабетгс Ргекк; 1981, р. 189-218.

УеЬег, 6., ОРскатег, Н.6. (1983). ТРе еГГес( оГ РгдР ргеккиге ироп рго(еигк апб о1Рег Ьюто1еси1ек (Влияние высокого давления на белки и другие биомолекулы). О Кем ВюрРук 16, 89-112.

Уе1сР, Т.Т, Рагетее11, А., №1бРагб!, Р.С., ВагРеР, Э.Н. (1993). 8Рекк гекропке оГ ЕксРеРсРга соР (о е1ема(еб РубгоЧаРс ргеккиге (Стрессорная реакция ЕксРеРсРга соР на повышенное гидростатическое давление). ί Вас(епо1 175,7170-7177.

Уетекатр-КатрРшк, Н.Н., Кага1хак, А.К., ХУоШегк, ТА., АЬее, Т. (2002). ЕпРапсеб 1еме1к оГ со1б кРоск рго(еигк ш ЫЧеРа топосмЮдепек Ь028 ироп ехрокиге (о 1оте (етрегаЦгге апб РгдР Рубгок1аРс ргеккиге (Повышенные уровни белков холодового шока в ЫЧеРа топосу(одепек Ь028 под действием низкой температуры и высокого гидростатического давления). Арр1 Епу1гоп М1сгоЬю1 68,456-63.

Уеп-Ье1, С, Υί-Хш, У., Σιγ-ΟΟιτ^ X. апб 2Репд, Ь. (2003). СгуоргекегуаРоп-тбисеб бесгеаке ш Реа(кРоск рго(ейг 90 ш Ритап кρе^та(оζоа апб Рк тесРапгкт (Вызванное криоконсервацией снижение белка теплового шока 90 в сперматозоидах человека и его механизм). Ак1ап .Тоита1 0Г Апбго1оду 5. 43-46.

Уои!егк, ТА., •купом, В., КотЬоиР, Р.М., бе Уок, У.М., Кшрегк, 0.Р., АЬее, Т. (1999). Апа1укгк оГ 1Ре

- 16 009409 го1е оГ 7 кЭа со1б-кйоск ргсЛеюк оГ Ьас!оЬасШик 1асйк М61363 ш сгуорго!есйоп (Анализ роли белков холодового шока массой 7 кДа Ьас!оЬасШик 1асйк М61363 в криопротекции). МюгоЬю1оду 145, 3185-3194.

Уадег, Р., Сйапд, Е.Ь. (1983). Оек1аЫ1|/а1юп оГ а Нр1б поп-Ьйауег рйаке Ьу Ιιίβΐι ргеккиге (Дестабилизация липидной не бислойной фазы высоким давлением). ВюсЫт Вюрйук Ас!а 731,491-494.

Уатапака, К., Еапд, Ь., 1поиуе, М. (1998). Тке СкрА ГатПу т ЕксйейсЫа сой: ти1йр1е депе бирйсайоп Гог к!гекк абар!айоп (Скра-семейство в ЕксйейсЫа сой: множественная дупликация генов для адаптации к стрессу). Мо1 МюгоЬю1 27,247-255.

Claims (6)

1. Способ повышения выживаемости после размораживания криоконсервированного жизнеспособного биологического материала, включающий в себя стадии:

(а) приложения гидростатического давления к жизнеспособному биологическому материалу;

(б) выдерживания жизнеспособного биологического материала под гидростатическим давлением;

(в) сброса гидростатического давления;

(г) замораживания жизнеспособного биологического материала.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидростатическое давление находится в диапазоне от 1 до 200 МПа, предпочтительно от 10 до 100 МПа, более предпочтительно от 20 до 75 МПа и наиболее предпочтительно от 30 до 60 МПа.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гидростатическое давление прикладывают на период времени от 1 с до 300 мин, предпочтительно от 1 с до 150 мин, более предпочтительно от 1 с до 90 мин и наиболее предпочтительно от 1 с до 60 мин.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что давление сбрасывают постепенно в течение периода времени от 1 с до 4 ч или мгновенно.

5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что жизнеспособный биологический материал выбран из группы, состоящей из ооцитов, сперматозоидов, зигот, морул, бластоцист, стволовых клеток, других клеток или тканей позвоночного животного.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что позвоночное животное является рыбой, птицей или млекопитающим, предпочтительно коровой, лошадью, козой, овцой, свиньей, другим сельскохозяйственным животным, домашним животным, приматом, включая человека.