KR101159271B1

KR101159271B1 - 정수압력 시도에 의한 동결보존된 생물학적 물질의 융해 후생존력 향상

Info

Publication number: KR101159271B1
Application number: KR1020067004902A
Authority: KR
Inventors: 차바 프리벤스쯔키; 미클로스 몰나르
Original assignee: 크리오-이노베이션 케이에프티.
Priority date: 2003-09-09
Filing date: 2004-09-08
Publication date: 2012-07-05
Also published as: KR20060123090A; ATE462298T1; IL174088A0; EA009409B1; EP1667517A1; WO2005022996A1; BRPI0413721B1; AU2004269999B2; JP4729492B2; JP2007505100A; IL174088A; EA200600511A1; DK1667517T3; EP1667517B1; CA2537938C; NZ546899A; BRPI0413721A; AU2004269999A1; DE602004026323D1; US20110189648A1

Abstract

본 발명은 생물학적 물질에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계; 미리정한 시간 동안 정수압력에서 상기 생물학적 물질을 유지시키는 단계; 정수압력을 해제시키는 단계; 및 적용가능한 프로토콜(protocol)을 사용하여 상기 생물학적 물질을 동결시키는 단계를 포함하여 동결보존된 생물학적 물질의 융해후 생존력을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 동결보존되는 생물학적 물질을 전처리하기 위한 가압 장치 뿐만 아니라, 동결보존되는 생물학적 물질을 전처리하기 위한 가압 장치의 사용에 관한 것으로, 상기 장치는 생물학적 물질을 수용하기 위한 압력 챔버, 상기 압력을 생산하는 수단, 및 상기 챔버 내에서 상기 압력을 유지시키는 수단을 포함한다.

Description

정수압력 시도에 의한 동결보존된 생물학적 물질의 융해 후 생존력 향상{IMPROVING POST-THAW SURVIVAL OF CRYOPRESERVED BIOLOGICAL MATERIAL BY HYDROSTATIC PRESSURE CHALLENGE}

본 발명은 생물학적 물질(bioligical material)에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계; 미리정한 시간동안 상기 생물학적 물질을 정수압력에서 유지시키는 단계; 정수압력을 해제시키는 단계; 및 어떤 적용가능한 프로토콜(protocol)을 사용하여 상기 생물학적 물질을 동결시키는 단계를 포함하여 동결보존된 생물학적 물질의 융해후 생존력을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 동결보존되는 생물학적 물질을 사전처리(pretreatment)하기 위한 가압 장치뿐 아니라, 동결보존되는 생물학적 물질을 사전처리하기 위한 가압 장치의 사용에 관한 것으로, 상기 장치는 생물학적 물질을 수용하기 위한 압력 챔버, 상기 압력을 생산하는 수단, 및 상기 챔버 내에서 상기 압력을 유지시키는 수단을 포함한다.

동결보존 과정은 다양한 분야의 현대 생물학 및 바이오기술에서 다양한 목적을 위해 생물학적 물질을 보존하기 위하여 잘 확립되어 있다.

이러한 방법은 매우 유사한 기본 단계를 따른다.

1. 생물학적 물질을 동결보호제가 함유된 용액으로 처리.

2. 다음 단계는 생물학적 물질을 영하 온도로 동결시키는 것을 포함한다.

3. 상기 준비된 생물학적 물질은 저온, 예컨대 액체질소 내에서 -심지어 매우 오랜 시간 동안- 보존된다.

4. 사용에 앞서 생물학적 물질은 다시 해동된다.

5. 동결보호제가 생물학적 물질로부터 제거된다. 추가적으로, 생물학적 물질은 본래 생존력을 회복하기 위하여 더 많은 단계를 필요로 할 수 있다.

동결보존 과정이 생물학적 물질에 유해할 수 있기 때문에, 상기 개요된 기본 프로토콜을 향상시키기 위한 몇몇 방법들이 시도되었다. 초고속 냉각-가온 비(ultra-rapid cool and warming rates)를 통해서 또는 -80℃까지 냉각시키는 동안 평형 어는점을 점차적으로 낮춤으로써 얼음 형성을 막는 방법들은 모든 분야의 저온생물학에 대해 적절한 해결책을 주지는 못하였다. 동결 후의 생존율을 향상시키려는 시도들이 있었다: 고농축된 동결보호제 수용액은 매우 낮은 온도까지 유리상태로 과냉시켜, 세포 간에 유리상태가 되도록한다(Rall 및 Fahy, 1985). Fahy 등은 유리화를 촉진시키는 추가요소로서 상당히 증가된 정수압력의 사용 가능을 언급하였으나, 또한 생식 생물학(reproductive bilology)에서 약간의 실질적인 중요성이 있음을 고찰했다. 다른 연구는 결정방지단백질(antifreeze protein)(AFPs)의 사용이 비-총괄적으로(non-colligative) 수용액의 어는점을 낮추고, 막 이온 통로를 차단하여, 그로 인해 냉각 동안 어느 정도 보호기능을 수행하는 것으로 보고한다(Baguisi 등, 1997). 동결보호제의 유해효과 및 삼투변화의 유해결과는 상기 기술된 방법들 중 어느 것에서도 무시될 수는 없다.

현재, 이러한 공정들은 다양한 임상적용에서 다양한 정도의 효율을 가지고 있다. 예를 들어, 배아 보존의 경우, 동결보존의 효율은 종(species), 동결방법, 배아의 발달 단계에 따라 0부터 80%까지 변화된다(Ishwar, 1996; Van Wagtendonk-De Leeuw, 1995, 1997; Medeiro, 2002; Reubinoff, 2001; Hammitta, 2003; Archer, 2003; Stachecki, 2002, Leibo and Songsasen, 2002). 또한 현재 주요 관심사가 되고 있는 사람난자의 동결보존 성공률은 그다지 만족스럽지 못하다.

1912년 이래로, 물이 서로 다른 온도에서 정수압력에 놓이면, 상변화를 겪는다는 것이 알려져 왔다(Bridgman, 1911)(도 7). 용액은 그것들에 어떠한 압력을 가하는 경우 심지어 영하에서도 얼지 않고 유지될 수 있다(Bridgeman, 1970). 일찍이 Takahashi 등(2000, 2001)은 이식용 생쥐 간(rat liver)의 영하 보존에서 동결상해(cryoinjuries)를 감소시키기 위해 높은 정수압력(HHP)을 사용하였다. 이러한 방법은 HHP를 사용하여 배지의 어는점을 실질적으로 낮춤으로써, 동결보존에 따른 어떠한 부정 효과없이 영하 온도에서 생물학적 물질을 보존시킨다. 이러한 접근방법은 하기 실시예 2 및 3에서 설명되는 바와 같이, 본 발명자들에 의해 생쥐배아를 보존하는 데 있어 신뢰할 수 없는 것으로 밝혀졌다.

일반적으로 30~50 MPa 범위내 정수압력은 다양한 유기체들의 성장을 억제한다: DNA 복제 개시는 압력에 가장 민감한 세포내 과정들 중 하나이다(Abe 등, 1999). 그 효과는 압축 크기 및 기간에 따라 엄격하게 변화된다(Murakami와 Zimmerman, 1973). 세포막은 주요한 압력손상 부위로 알려져 있다(Palou 등, 1997). 높은 정수압력 처리는 능동수송이나 수동투과성과 같은 막 기능성을 변화시켜, 세포의 물리화학적 균형을 저해할 수 있다(Yager와 Chang, 1983; Aldridge와 Bruner, 1985; Macdonald, 1987; Schuster와 Sleytr, 2002). Routray 등(2002)에 의한 최근 연구는 송사리(Oryzias latipes) 알 및 배아에 실시된 실험에서, 정수압력(5 MPa)이 DMSO의 빨아올림(uptake)을 촉진하였으나, 생존률에서 빠른 손실이 있었음을 보고하였다. 변화된 압력 상태에서 물리적 또는 생화학적 과정은 르 샤틀리에의 원리에 의해 결정된다: 부피 감소를 동반하는 모든 반응은 상당히 빠르게 진행된다(Murakami와 Zimmerman, 1973; Welch 등, 1993; Palou 등, 1997). 압력 적용은 군집된 단백질 형태를 이끌 수 있고, 단백질은 부분적으로 또는 완전히 풀어진 형태를 포함한다. 압력은 단백질간 상호결합의 파괴와 물결합에 따른 공동(cavities)제거의 결합 효과를 발생시켜 단백질의 변성을 일으킬 수 있다(Schmid 등, 1975; Weber와 Drickamer, 1983; Jaenicke, 1991; Gross와 Jaenicke, 1994; Silva 등, 2001).

최근 보고서는 정수압력이 쇼크 단백질(shock proteins)의 생산을 높임을 기술하고 있다(Welch 등, 1993; Wemekamp-Kamphuis 등, 2002). 연구보고는 박테리아의 표준단백질 합성에서 치사량에 가까운 저온 쇼크로 야기된 불안정성은 소위 저온-쇼크 단백질(cold-shock proteins)(CSPs, HSPs)의 합성에 의해 극복될 수 있는 것으로 기술하고 있다(Phadtare 등, 1999). CSPs, HSPs는 RNA 샤프론(RNA chaperones)(Graumann과 Marahiel, 1999) 또는 전사(transcription)활성인자 (LaTena등, 1991)와 같이 많은 기능을 가지는 것으로 추측된다. 또한 이것들은 동결에 대하여 보호 작용을 하는 것으로 추측된다(Wouters 등, 1999). 더 많은 연구들에서는 CSPs 및 HSPs 의 생산이 저온 쇼크뿐 아니라, 다른 환경적 스트레스들에 의해서도 야기됨이 밝혀졌다. 예컨대, 대장균에서 CSP타입은 영양적 스트레스에 의해 생산된다(Yamanaka 등, 1998). 또 다른 실험에서는 높은 정수압력 처리가 어떠한 저온-발생 단백질 또는 열쇼크 단백질의 생산을 일으키는 것으로 보였다(Welch 등, 1993). 다른 최근 보고서는 정수압력이 쇼크 단백질의 생산을 야기시키는 것으로 보고하고 있다(Wemekamp-Kamphuis 등, 2002). 저온-쇼크 및 고압력 처리는 모두 CSP 및 HSP 수준을 증가시키기 때문에, 교차-보호 가능성에 대한 실험이 실시되었다. Wemekamp-Kamphuis등(2002)은 저온-쇼크된 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)에 압력을 가한 후의 생존수준이 37℃에서 성장하는 세포보다 100배 더 높다는 사실을 발견하였다.

식품-미생물학자들이 유해 미생물을 죽이기 위해 상기 과정을 연구하는 반면(Butz와 Ludwig, 1986; Wemekamp-Kamphuis 등, 2002; Sphilimbergo등, 2002), 본 발명의 목적은 동결보존된 생물학적 물질의 생존력을 향상시키기 위한 것이다.

최근, 동결보존에서의 쇼크 단백질의 역할에 대한 연구가 주의깊게 이루어져왔다. Huang 등(1999)은 쇼크 단백질, 즉 HSP90의 상당한 감소는 돼지 정자의 냉동과정 동안 정자 운동성 감소와 관련된 것으로 발표했다. Wen-Lei 등(2003)은 사람 정자에서 HPS90가 단백질 퇴화로부터 발생할 수 있는 동결보존 후에 상당히 감소되었음을 보고하였다.

요약하면, 높은 정수압력으로 야기되는 HSP90은:

* 시토졸 단백질(cytosolic protein)이고,

* 스트레스 억제, 단백질 결합, 신호 변환에 필수적 역할을 하는 분자적 샤프론이고,

* 체외에서 진정한 클라이언트 단백질(client protein)의 활성에 필수인 유전적 ATP아제를 가지는 것으로 보였으며(Pearland Prodromou, 2000),

* 정액 운동성과 관련있으며:

* 활성 산화질소 합성효소(activate nitric oxide synthetase) (NOS) (garcia-Gardena 등, 1998)

* 냉각과정 동안 상당히 증가하여 정자 운동성을 크게 손상시키는, 활성산소종(reactive oxygen species)(ROS)을 보호하고(Fukuda 등, 1996),

* ATP 대사와 관련된다(Prodromou 등, 1997). ATP 레벨은 저온쇼크 후 감소되고, 나중에 회복되지 않았다(Watson, 1981)

* HSP90은 돼지정자 냉각후에 정자 운동성의 감퇴와 더불어 상당히 감소되었다. 이는 HSP90이 돼지정자 운동성 조절에 결정적인 역할을 할 수 있다는 결론에 이른다.

* 특이 HSP90 억제자인, 젤다나마이신(Geldanamycin)은 용량-시간 의존 방법에서 돼지정액의 정자 운동성을 상당히 감소시켰다(Huang 등, 2000).

HSP90은 사람정자 동결보존 후, 정자 운동성과 함께 상당히 감소하였다; 감소는 누수에 의한 것이 아니라, 단백질 감성에 기인하였다(Wen-Lei 등, 2003).

축적된 압력 효과는 어느 수준 밖에서는 치명적이다: 고압에서 상당한 생체분자의 비가역적 변화가 발생하는 데, 대부분의 박테리아와 다세포 유기물은 300 MPa 에서 죽는다. 비록 완보류(tardigrade)는 활동상태에서는 100~200 MPa 사이에서 죽지만, 그것들이 탈수된 "툰(tun)" 상태에 있다면 600 MPa까지 생존할 수 있다(Seki와 Toyoshima, 1998).

본 발명자들은 놀랍게도 정수압력을 가한 다음, 종래 동결보존 프로토콜을 시행하면, 생물학적 물질의 생존력이 상당히 향상될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 문맥에 있어서, 생존(survival)이란 용어는 그중에서도 특히 계속적인 체내외 발달의 향상됨, 좀더 높은 부화(hatching) 또는 착상(implanting) 및 출생(birth)율을 의미한다(배아의 경우); 융해후의 좀더 높은 운동성 및/또는 향상된 수정능력을 의미한다(정자의 경우); 향상된 계속적인 체내외 발달, 향상된 수정능력, 좀더 높은 부화(hatching) 또는 착상(implanting) 및 출생(birth)율을 의미한다(난모세포의 경우). "생존"이란 용어는 처리되는 생물학적 물질의 종류에 따라서 서로 다른 기능적 특성을 포함하는 것으로 이해된다.

본 목적을 위해, 특정 종류의 생물학적 물질의 압력 내성력을 확립한 다음(실시예 1, 5 및 6 참조), 가압된 생물학적 물질의 생존력을 향상시키는 목적을 달성하기 위해 몇몇 상태의 기술개념을 연구하였다. 그런다음, 본 발명자는 다른 종류의 생물학적 물질에서 압력처리의 효과를 연구하였는데, 예상외로 압력시도의 본 발명의 방법이 이들 목적을 충족시키는 것을 확인하였다.

본문에서 우리는 본 발명의 개념이 많은 다른 동결보존 프로토콜에 동등하게 적용될 수 있음을 강조하며, 이러한 선택은 본 발명과 관련하여 제한되는 것은 아니다. 향상된 프로토콜에서 포함되는 유일한 필수 단계는 정수압력 시도 단계이다; 본 설명의 가르침에 따를때, 당업자는 손쉽게 파라미터들을 최적화할 수 있다.

[발명의 요약]

본 발명은 (a) 선택적으로 미리정한 압력-시간 프로필에 따라, 상기 생물학적 물질에 정수압력을 가하는 단계;

(b) 미리정한 시간동안 상기 생물학적 물질을 정수압력에서 유지시키는 단계;

(c) 정수압력을 해제시키는 단계;

(d) 어떤 적용가능한 프로토콜을 사용하여 상기 생물학적 물질을 동결시키는 단계를 포함하여, 동결보존된 생물학적 물질의 융해후 생존력을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 압력은 1~250 MPa이다. 바람직한 구체예에서, 상기 압력은 바람직하게는 10~100 MPa, 더욱 바람직하게는 20~75 MPa, 더더욱 바람직하게는 30~60 MPa이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 정수압력은 1초 내지 300분 사이의 시간동안 가해진다. 바람직한 구체예에서, 상기 압력은 바람직하게는 1초 내지 150분간, 더욱 바람직하게는 1초 내지 90분간, 더더욱 바람직하게는 1초 내지 60분간 가해진다.

다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 1초 내지 4시간 동안 점차적인 압력 해제를 포함한다. 다른 구체예에서, 압력 해제시간은 10초 내지 2시간간, 또는 1분 내지 1시간간, 또는 다른 경우에는 10분 내지 30분간이다. 또한 압력 해제는 즉각적으로 이루어질 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 난모세포(oocytes), 정자(sperms), 접합자(zygotes), 상실배(morulas), 배반포(blastocysts), 배아(embryos), 줄기세포(stem cells), 척추동물의 세포 또는 조직(tissue)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 생물학적 물질과 연관되어 사용된다.

다른 바람직한 구체예는 상기 척추동물이 어류, 조류 또는 포유류, 바람직하게는 소, 말, 염소, 양, 돼지, 다른 가축, 애완동물, 사람을 포함하는 영장류인 방법과 관련된다.

또한, 본 발명은 생물학적 물질을 수용하기 위한 압력 챔버;

1~250 MPa, 바람직하게는 10~100 MPa, 더욱 바람직하게는 20~75 MPa, 더더욱 바람직하게는 30~60 MPa의 압력을 생산하는 수단; 및

1초 내지 300분간, 바람직하게는 1초 내지 150분 간, 더 바람직하게는 1초 내지 90분간, 그리고 더더욱 바람직하게는 1초 내지 60분 간의 시간동안 상기 압력을 유지시키는 수단을 포함하는 생물학적 물질의 압력처리를 위한 가압 장치와 관련된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 압력생산 수단이 피스톤이고, 상기 압력 챔버는 상기 피스톤을 수용하는 원통형 챔버이고;

챔버와 피스톤 사이에 고압 밀폐 수단이 제공되며;

수동 및/또는 자동으로 상기 피스톤에 힘을 가하는 수단이 제공되어 있는 가압 장치와 관련된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 피스톤에 힘을 가하는 상기 수단이 상기 피스톤에 접경하는 표면을 가지는 구성과 같은 플레이트이고, 상기 챔버 내의 피스톤 위치를 조정하는 수단이 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 장치는 1초 내지 4시간 간의 시간 동안 상기 압력 챔버의 감압을 제어하는 시스템을 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 장치는 챔버의 압력을 표시하는 압력 게이지를 더 포함한다.

또 다른 바람직한 구체예에서 상기 압력 챔버는 액체 충진제(liquid medium)를 포함한다.

특정한 구체예에서 상기 압력 챔버는 약 10~25 mm 두께, 바람직하게는 20 mm 두께 이하의 벽을 가지고, 상기 챔버는 내경이 바람직하게는 100 mm 이하, 보다 바람직하게는 50 mm 이하, 특히 약 20 mm 이고, 내부 높이는 바람직하게는 250 mm, 더욱 바람직하게는 100 mm 이하, 특히 약 200 mm 이다.

또 다른 바람직한 구체예에서 본 발명은 상기 생물학적 물질이 난모세포(oocytes), 정자(sperms), 접합자(zygotes), 상실배(morulas), 배반포(blastocysts), 배아(embryos), 줄기세포(stem cells), 척추동물의 세포 또는 조직(tissue)으로 구성된 그룹에서 선택된 것인 장치와 관련된다.

본 발명은 또한 생물학적 물질의 압착을 위한 압력 장치의 사용과 관련된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 생물학적 물질의 동결보존을 위한 사전처리에 사용되는 가압 장치의 사용과 관련된다.

바람직한 구체예에서, 가압 장치의 사용은 본 발명의 동결보존 방법의 어느 일부에 속할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 사용은 생물학적 물질을 수용하게 적당한 압력 챔버, 및 1~250 MPa, 바람직하게는 10~100 MPa, 더욱 바람직하게는 20~75 MPa, 그리고 더더욱 바람직하게는 30~60 MPa 범위의 제어된 압력을 제공하는 수단을 포함하는 가압 장치의 사용과 관련된다.

다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 사용은 1초 내지 300분간, 바람직하게는 1초 내지 150분간, 더 바람직하게는 1초 내지 90분간, 그리고 더더욱 바람직하게는 1초 내지 60분간의 시간동안 상기 압력을 유지시키는 수단을 포함하는 가압 장치와 관련된다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 사용은 1초 내지 4시간 간의 시간동안 압력 챔버의 감압을 제어하기 위하여 압력 장치와 연계된 제어 시스템을 포함한다.

특정한 구체예에서 본 발명은 상기 정수압력이 가압 장치로 도달될 수 있는 가압 장치의 사용과 관련된다.

또 다른 구체예에서 본 발명은 상기 생물학적 물질이 난모세포(oocytes), 정자(sperms), 접합자(zygotes), 상실배(morulas), 배반포(blastocysts), 배아(embryos), 줄기세포(stem cells), 척추동물의 세포 또는 조직(tissue)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 가압 장치의 사용과 관련된다.

본 발명은 생물학적 물질을 압축하기 위하여 본 발명에 따라 가압 장치를 사용하는 것과 관련된다.

발명 개념을 설명하기 위해 본 발명은 생쥐배아를 사용하는 함으로써 좀더 상세하게 설명된다. 본 공개된 과정은 본 기술분야에서 통상적으로 동결보존되는 모든 종류의 다른 생물학적 물질에 동등하게 적용됨은 명확하다. 용이한 접근성 및 조작성 때문에, 생쥐배아가 상세한 연구 주제로서 선택되었다. 배아의 동결보존은 산업 및 건강보호적 이용가능성에 때문에 동결본존 연구의 선두에 있음은 말할 필요가 없다. 그러나, 본 발명에 따른 방법 및 본 설명에서, 용어 ‘생쥐배아’는 용어 ‘생물학적 물질’과 상호전용되어 사용될 수 있다. 본 명세서에서, 실험 데이터는 또한 소 IVF 배아 및 소 정자에 대해 나타나는 데, 예상외로 향상된 융해후 생존력을 제공한다. 예시적인 생물학적 물질은 예컨데, 각기 다른 포유동물의 배아의 이식 전후기, 난모세포, 정자, 줄기세포, 조직, 척추동물 및 사람의 장기 또는 심지어 인체일 수 있다. 척추동물은 어떠한 종, 예컨데, 어류, 조류 또는 포유류, 바람직하게는 소, 말, 염소, 양, 돼지, 다른 가축, 애완동물, 사람을 포함하는 영장류일 수도 있다.

매우 진화된 진핵 생물로서, 생쥐배아는 완보동물과 박테리아보다는 정수압력의 효과에 더 적당하다. 따라서, 첫째 목적은 압력하에서 형태학 및 생존과 관련한 생쥐배아의 기본 특징을 정립하는 것이다.

본 발명의 방법의 면밀한 연구를 위하여, 원형(prototype) 장치가 제조되었다. 도 8에 도시된, 가압 장치(1)는 하기 실시예에서 논의되는 실험을 실시하기 위하여 사용되었다.

가압 장치(1)는 상단과 하단에 하나씩 2개의 개방구(3,4)를 가지며 상단 개방구(3)에 압력 게이지(5)가 부착되고 피스톤(6)이 하단 개방구(4)를 통하여 삽입된 원통형의 압력 챔버(2)를 포함한다. 압력 게이지(5)는 관심 영역, 즉 1~250 MPa, 바람직하게는 10~100 MPa, 더욱 바람직하게는 20~75 MPa, 그리고 더더욱 바람직하게는 30~60 MPa 범위의 압력측정에 적당한 게이지일 수 있다. 압력 챔버(2)는 약 60 mm의 내부 높이와 약 20 mm의 너비를 가지고 있다. 챔버(2)의 벽(7)은 250 MPa, 바람직하게는 최소 75 MPa, 더욱 바람직하게는 60 MPa 까지 견디도록 설계되었다. 챔버(2)의 벽(7)은 바람직하게는 내식 재료(collosion resistant material), 바람직하게는 플라스틱 또는 스테인레스 강으로 되어있다. 하단 개방구(4)와 피스톤(6)의 벽(7) 안쪽면 간을 꼭 끼이게 하기 위하여, 후단에 예컨대 테프론 링 실링과 같은 원주형 압력 실링(8)이 제공되어 있다. 또한 바람직하게는 다른 형태의 압력 실링(8)이 압력 게이지(5)이 고정된 상단 개방구(3)에 사용되었다. 하단 개방구 둘레의 벽(7) 부분은 플레인지(9)를 형성하는 주변 돌출부를 가진다. 압력 챔버(2)에는 챔버(2)내로 피스톤(6)을 지탱하고 이동시키기 위한 캡(10)이 더 장착되어 있다. 캡(10)은 스크류(11)와 같은 고정수단으로서 플레인지(9)에 부착될 수 있다. 각 스크류의 인장력(tensile strength)는 챔버(2)내 고압에 따른 인장력을 지탱할 만큼 높은 수치를 가져야만 한다. 압력 챔버(2)는 충진제(12)로 채워질 수 있는데, 충진제는 비교적 작은 압축으로 고압을 생산하기에 적당하고, 압력은 압력 챔버(2)내로 피스톤에 힘을 가하는 것으로 만들어진다. 비교적 작은 압축으로 고압을 생산하기에 적당하다. 이와같은 충진제는 고압력 기술분야에서 이미 알려진 종류의 비-고체 충진제(12)(바람직하게는 액체 또는 젤형태의 충진제(12))일 수 있으나, 본 발명의 연구에서는 보통의 물이 사용된다. 압축동안 충진제(12)의 열을 방지하기 위하여 압력 챔버(2)의 벽(7)은 열전도성 재료인 것이 바람직하다.

상기 기술된 가압 장치(1)는 본 발명의 향상된 동결보존 방법을 충족시키기 위해 이동성을 제공할 정도의 직경 구조일 수 있다. 다음 크기는 단지 일예로서 제공되며 당업자는 쉽게 더 크거나 작은 실시예를 설계할 수 있다. 압력 챔버(2)는 60mm의 내부 높이(H_i) 와 20 mm의 내경(D_i)을 가지고, 여기서 내경은 피스톤(6)의 지름과 일치한다. 피스톤(6)의 높이(H_p)는 H_i에 비례하여 선택될 수 있다. 예컨대 짧은 테스트 장치에서는 20 mm이다. 챔버(2)의 벽(7)은 약 10mm의 두께(D_w)를 가진다. 피스톤(6) 주변의 압력 실링(8)은 5mm의 높이(H_s)와 2mm의 두께(D_s)를 가진다. 플레인지(9)에 캡(10)을 고정시키기 위해 사용되는 스크류(11)는 8mm의 지름(D)을 가질 수 있다. 상업적으로 적용가능한 이 크기의 스크류(11)는 800 MPa의 인장강도를 가질 수 있어 200 MPa까지의 압력을 견디기에 충분하다. 장치의 실제 크기는 처리되어질 생물학적 물질과 상기 생물학적 물질을 상기 장치내로 적용시키는 이용가능한 수단에 따라 설계될 수 있다.

동결보존될 생쥐배아의 사전처리 동안, (적당한 배아 유지액과 함께 플라스틱 스트로우로 미리 옮겨진)배아는 압력 챔버(2) 내부 액체 충진제(12)(이후 보통 물) 내에 안치된다; 피스톤(6)은 어떤 초과 힘없이 하단 개방구(4)속으로 삽입되고, 캡(10)은 피스톤(6)에 인접한 위치에 있는 스크류(11)를 이용하여 챔버(2)의 플레인지(9)에 부착되고, 피스톤은 충진제(12)를 압축하지 않은 상태에서 챔버(2)로부터 약간 밀려나와 있다. 다음에, 실시되는 특정 실험을 위해 요구되는 압력 상태에 도달할 정도로 스크류(수동 또는 자동)를 죔으로써, 캡은 챔버(2)내로 피스톤을 밀기위하여 하단 개방구(4) 가까이에 당겨진다. 챔버(2)내 발생 압력은 압력 게이지(5)에 표시된다. 원하는 시간이 경과한 후, 스크류(11)를 점차 풀거나, 상단 개방구로부터 압력 게이지(5)를 떼어내어 액체 충진지(12)가 거의 순간적으로 팽창함으로써 압력 감소가 일어난다.

배아를 챔버에 안치시키는 수단은 플라스틱 스트로우에 한정되지는 않는다. 특별 적용 및 생물학적 물질에 따라서, 처리될 샘플은 다른 보관구조물에 놓여질 수 있다. 예컨데, 배아 또는 세포는 크리오루프(cryoloop) 또는 전자현미경 그리드(grid)에 안치될 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 물질을 포함하는 보관액 방울은 단순히 액체 충진제(12)로서 광유(mineral oil)가 덮혀질 수 있다. 이러한 경우, 전체 가압장치는 소형화될 수 있어서, 입체현미경 하에서 용이한 회수가 가능하게 될 수 있다. 극히작은 생물학적 물질의 경우, 특별한 안치수단(placing means)이 필요없이 샘플이 챔버에 안치될 수 있고, 액체 충친제(12) 그 자체가 보관액(holding solution)이 될 수 있다. 고압력이 생물학적 물질에 걸리되록 하는 챔버에서 생물학적 물질을 안치 또는 보관하는 수단은 본 발명의 범주 내에 있다.

가압 장치(1)는 프로그램화된 제어 시스템으로 완전 자동화될 수 있다. 이와 같은 제어 시스템은 입력 파라미터로서 다음과 같은 압력획득율, 최고압에서 원하는 시간, 압력해제율 포함할 수 있다. 비록 압력 챔버(2)의 벽(7)의 소재로서 매우 열전도가 높은 재료가 유해 온도변화를 충분히 방지할 수 있으나, 온도 제어수단 또한 사용될 수 있다. 온도 제어수단은 동결보존과정의 원스텝 해결책을 제공하는 통합된 가압-동결 장치에 맞게 계획될 수 있다. 그러한 계획에서, 가압 구성요소 및 동결 구성요소는 모두 자동화되고, 각기 다른 생물학적 물질의 요구조건에 따른 압력처리 및 동결을 프로그래밍하는 수단과 맞춰질 수 있다.

또한 상기 기술된 테스트 유닛과 매우 비슷한 이동가능한 장치가 설계되어 생물학적 물질을 쉽고 단순하게 처리하는 방법을 제공하며, 그런다음 이 단계후 상기 생물학적 물질을 보존하기 위해 적용가능한 기술이 행해질 수 있다. 이러한 방법은 원거리에 있는 업종관계자를 돕거나, 야생동물 보존과 같은 다른 프로젝트에 사용될 수 있다.

각기 다른 생물학적 물질의 압력 내성을 조사하기 위해 주의깊게 설계된 실험이 수행되었다. 압력 및 시간 스케일의 선택은 나중의 실질적인 임상에 가장 폭넓게 적용가능한 범위로 한정되었다. 예를들어 도 7에 보이는 것처럼, 물의 상변화 온도는 0℃ 0.1 MPa 부터 -21℃ 210 MPa까지 감소하였으며, 상기 압력 수준 위에서는 반대적인 효과가 관찰되었다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 압력은 1~250 MPa 범위 또는 상기 장치의 작동 온도에서 충진제가 동결되는 점까지로 선택되었다. 좀더 구체적으로, 팽창된 배반포기 배아에 적용될 수 있는 정수압력은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200 또는 250 MPa, 또는 이러한 중간 범위 내의 어떤 값이다.

정수압력은 미리정한 압력-시간 프로필에 따라 상기 생물학적 물질에 가해질 수 있다. 처리될 생물학적 물질에 따라서 상기 물질에 가해지는 압력은 시간에 걸쳐 점차 증가될 수 있음은 당업자 수준에서 이해될 수 있다. 주어진 생물학적 물질에 적용되는 프로필은 경험칙적으로 결정될 수 있으며, 그것은 선형, 계단형 또는 다른 일반적으로 사용되는 시간 프로필일 수 있다.

비슷하게, 생물학적 물질을 높은 정수압력 하에서 유지하는 데 광범위한 시간이 선택될 수 있다. 좀더 구체적으로, 생쥐배아는 선택된 압력하에서 1초 내지 6시간의 시간 동안, 좀더 구체적으로 1초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 120분, 150분, 180분, 210분, 240분, 300분, 360분간 유지된다. 배아가 압력하에서 생존하는 시간은 압력증가에 따라 감소한다.

압력 전처리의 끝과 동결보존의 시작 사이의 시간은 각 구체예에서 상당히 다를 수 있음은 당업자에게 인식될 수 있다. 주어진 프로토콜에 따라, 생물학적 물질의 상태는 이런 시간 구조에서 변할 수 있다. 이러한 기간이 충분히 길다면, 세포의 물리적인 회복이 있을 수 있으나, 반대로, 세포 과정이 시작될 수 있다, 즉, 쇼크 단백질의 합성 및 축적이 발생할 수 있다. 서로 다른 환경에서 이러한 효과는 이익이 되거나 손해가 될 수 있다; 따라서 실험법에 따른 관점에서 프로토콜의 최적화가 필요하다.

도 1은 배아가 실질적인 양의 압력에서 형태학적으로 어떤 외관 변화없이 생존할 수 있음을 보여준다(예컨데, 90MPa 에서 1초 동안 또는 30MPa에서 2시간 동안). 배아는 가해진 압력처리의 크기 및 기간에 따라 응축(compact)되었다. 이론적으로 본 발명의 범위를 제한하는 것 없이, 우리는 압력이 배반포로부터 수분을 짜내는 직접적인 요인은 아니라고 생각한다. 인용된 문헌에 근거하여, 배아의 응축(compaction)은 상당한 압력이 다른 단백질을 생산하며(저온-쇼크 단백질, CSPs), 단백질 구조에서 가역적 변화와 대사과정을 야기시킨 결과에 기인한다. 압축된 배아는 체외 배양 4~5시간후에 일반 형태를 회복하고, 대조군과 비슷하게 다시 발달을 할 수 있었다(예컨데, 30분동안 90MPa 또는 3시간동안 30MPa로 시도된 배아).

이론적으로 본 발명의 범위를 제한하는 것 없이, IVF 소 배아 연구로부터 압축(compaction)은 최적인 사전 압력처리에 대한 척도가 아닌 것으로 생각된다. 응축은 압력으로 변경된 막 투과성, 세포막을 통한 변경된 확산 및 능동 수송의 결과때문일 수 있다. 형태학에서 있어서, 이러한 가역 변화는 배아가 '치사량에 가까운' 충격으로 처리되었다는 형태학적 '신호'로 간주될 수 있다. 문헌에 따라, '치사량에 가까운' 쇼크는 소위 '쇼크 단백질' 생산을 야기시키는 충격이고, 이는 동결보존 성공율을 향상시키는 데 역할을 하는 것으로 생각된다.

그러나, 어떠한 임상에서는 응축된 배아가 동결보존을 위해 바람직하게 선택될 수 있다. 가압후, 팽창된 배반포는 응축되고, 3~4일 동안 이런 상태로 유지된 다음, 재팽창한다. 이러한 현상에 근거하여, 동결과정 전에 압력 처리된 배아가 선택될 수 있다. 배아의 형택학적 변화 및 사전 압력처리의 유익한 효과는 변경된 단백질 구조 및/또는 특징 및/또는 향상된 압력-야기된 단백질의 생산으로부터 생기기 때문에, 이러한 단백질의 조사는 동결보존 과정전 생물학적 물질에 가해진 높은 정수압력을 표시할 수 있다.

또한 압력 사전처리는 배아가 동결보존후 정상적인 발달과정을 회복하는 시간과 어느 정도 관계있다. 이러한 과정에 대한 관찰은 높은 정수압력 사용이 재생(regeneration)에 걸리는 시간을 단축시키는 것과 같은, 사전처리의 특성을 나타낸다.

압력의 크기가 높을수록, 배아는 더 적은 시간 생존한다. 어떠한 크기 및 기간을 초과하는 압력 충격은 비가역적 변화를 일으킨다: 배아는 체외배양 2시간 후 쇠약해지거나 또는 압축후에 이미 쇠약해졌다(예컨데, 2시간동안 90MPa 또는 5시간동안 30MPa로 시도된 배아). 당업자는 사용되는 구체적 생물학적 물질에 따라 일상 실험에서 제한된 압력 및 제한된 시간을 결정할 수 있을 것이다.

가압된 배아의 생존율은 점차적인 감압으로 향상될 수 있다. 연구는 만약 그것들이 점차적으로 회복된다면 가압된 배아의 생존율은 현저히 증가함을 보였다. 90MPa에서 60분은 모든 배아에 치명적이었으나, 120분 점착적인 감압이 사용되었을 때는 80% 생존했다. 감압시간은 또한 구체적 임상에서 당업자가 결정할 수 있는 본 발명의 특징이다. 좀더 구체적으로, 선택된 압력하에서 유지된 배아는 1초 내지 4시간, 좀더 구체적으로는 1초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 120분, 150분, 180분, 210분 또는 240분의 시간동안 감압되었다. 압력을 가하는 것처럼, 감압 역시 미리정한 압력-시간 프로필에 따라 시행될 수 있다.

다시, 이론적 제한 없이, 이런 특징의 가능한 설명은 상당한 양의 CO₂가 압력하에서 발생된다는 것이다(Abe와 Horikoshi, 1995). 반응이 적용압력의 크기에 의존적으로 부피감소(#0.26ml/mol)를 동반하기 때문에 CO₂의 수화 및 이온화(HCO₃ ^- 및 H⁺)가 증가한 압력에 의해 촉진된다(Palou 등 1997, Welch 등 1993). 세포간에 생산된 이산화탄소는 즉시 용해되고, 그런다음 HCO₃ ^- 과 H⁺ 로 해리됨으로써, 세포내 pH를 감소시킨다(Abe와 Horikoshi, 1995, 1997, 1998, Abe 등 1999)). 증가된 압력에서 유지되는 평형은 공기압에 있는 배아에 치명적일 것이다. 또한 즉각적인 압력 감소는 세포질로부터 수화 및 이온화된 형태로부터 CO₂의 증가된 감소를 일으켜, 배아의 즉각적인 죽음을 일으킬 것으로 가정된다. 어떠한 감압 상태에서, 증가된 정수압력에서 가역적으로 불활성화된 원형질 막 단백질(H⁺-ATPase)(Schmid 등 1975, Pequeux와 Gilles 1978)은 다시 기능을 시작하고, (수동 확산과 함께) 점차 평형을 생리상태로 이동시킨다.

일찍이 높은 정수압력(HHP)은 Takahashi 등(2000, 2001)에 의해 이식용 생쥐 간(rat liver)의 영하 보존에서 동결상해(cryoinjuries)를 감소시키기 위해 사용되었다. 이러한 방법은 HHP를 사용하여 배지의 어는점을 실질적으로 낮춤으로써, 동결보존에 따른 어떠한 부정 효과없이 영하 온도에서 생물학적 물질을 보존시킨다. 생쥐배아의 경우 동결보존 방법을 연구하기 위해, 0℃에서 배아에 압력을 가하는 연구가 설계되었다. 배아 생존율은 상당히 감소하였다. 실온에서 배아는 45분동안 30MPa 에서 90% 평균생존율을 가지는 반면, 0℃에서 같은 충격으로는 어떤한 배아도 생존하지 못하였다. 0℃에서 10분 또는 5분후, 60MPa 및 90MPa 각각에서 0%의 배아가 생존하였다. 반대로, 실온에서 양 케이스에서 생존율은 약 90%였다. 낮은 온도에서 점차적인 감압 적용은 배아생존에 유익한 효과를 주지 못했다. 이러한 발견에 근거하여, 압력 및 낮은 온도는 함께 배아에 치명적으로 드러났기 때문에, 이러한 현상의 이용은 이러한 형태에서는 적용할 수 없다.

본 발명은 정수압력 시도로써 동결보존된 생쥐 배반포의 융해후 생존력의 향상에 관한 것이다. 이것은 배아에 압력을 가한 다음, 동결보존 프로토콜로 처리하고, 융해한 다음, 배지로 및/또는 가임신 수여자(pseudopregnant recipients)로 이식하는 것으로 평가될 수 있다. 체외 발달, 이식 및 자궁 발달 및 건강한 새끼의 출산은 이들의 생물학적 및 유전적 잠재력의 명백한 증거이다.

상기에서 설명한 것처럼, 동결보존된 팽창된 생쥐 배반포의 생존율은 동결과정 전에 어떤 압력처리에 의해 향상될 수 있었다. 30분동안 60 MPa의 압력충격이 배반포에 가해지고, 여기서 배아의 약 80% ~90%가 응축되었고, 생존율은 처리되지 않은 대조군과 차이가 없었다. 체외 평가에 따라, 적용된 압력처리는 동결후의 배아의 체외발달을 크게 향상시킨다. 체외연구는 정수압력 시도가 처리된 배반포의 생존율을 향상시킬 뿐만 아니라, 배아가 자연 상태로 회복되는 데 필요한 회복시간을 향상시킴을 보였다. 우리의 예시적 실험에서, 압력처리된 배반포의 98%가 6시간 후 대조군의 배아와 형태학적(지름, 구조적 완전성, 및 일반적 형태)으로 정확히 동일하고, 배반포의 95%가 대조군과 같이 20시간 이내에 완전히 부화했다. 압력처리없이 동결된 배아는 융해후 단지 20시간에서 재팽창하였다. 재팽창된 배반포율은 압력처리된 것에 비해 상당히 열등하였다(46% 대 98%). 게다가, 이 그룹에서는 어떤 배아도 부화되지 못했다. 따라서, 본 발명에 따른 방법이 많은 생존 생쥐배아를 얻는데 적합하다.

도 1은 실온에서 각기 다른 시간 동안(1초, 5분, 15분, 30분에서 300분까지 30분 간격으로) 10MPa ~ 150MPa(10MPa씩)까지 각기 다른 압력에서의 배아 생존율을 보인다. 각 그룹별로 14~16 배아가 사용되었다; 각 실험은 3회 반복되었다. 'a' 및 'b'로 표시된 배아의 생존율은 처리되지 않은 대조군과 차이가 없었다(p<0.05).

도 2는 30, 60, 120분간 90MPa로 가압되고, 30~180분간 감압된 배아의 생존율을 보인다(30, 60, 120분에서 즉각적인 감압 생존율은 각각 50%, 0%, 0%였다). 서로 다른 윗첨자로 표시된 생존율은 서로 다른 것과 유의적인 차이가 있었다(p<0.05).

도 3a은 실온에서 1초 내지 45분 동안 30, 60 및 90MPa로 가압된 배아의 생존율을 보인다.

도 3b는 0℃에서 1초 내지 45분 동안 30, 60 및 90MPa로 가압된 배아의 생존 율을 보인다. 각 그룹별로 12~15 배아가 사용되었다; 각 실험은 3회 반복되었다. 실온 및 0℃에서 가압된 배아 간에 유의적인 차이가 있었다(p<0.01).

도 4는 정자 운동성의 평균값을 보인다(압력처리된 것과 대조군).

도 5는 가압하고 동결-융해한 소I 정자의 평균 운동성을 보인다.

도 6은 가압하고 동결-융해후 소II 정자의 평균 운동성을 보인다.

도 7은 각기 다른 압력에서 물의 어는점을 보인다.

도 8은 본 발명에 따른 적용가능한 가압 장치의 도식적인 절단면도이다.

실시예 1 내지 4에 대한 재료 및 방법

실험 동물 및 배아 생산

CB6F1(Charles River, 독일)생쥐들은 표준 상태(22±2℃; 12시간 어둡게/ 12시간 밝게; 물과 먹이는 무제한 제공) 하에서 사육되었다.

암컷들에게 PMSG(Sigma, 미국) 10 IU를 복강내 주사하고, 46시간 후 hCG(Sigma, 미국) 10 IU를 복강내 주사하여 과배란시켰다. hCG 투여 6시간 후, 암컷들을 번식능력이 있는 수컷들과 자웅한쌍씩 어울리게 하였다. 퍼티컬트(FertiCult) 수세액(FertiPro N.V, 벨기에)로 난관(oviduct)을 수세하여 1 내지 2세포기 배아를 획득하였다. 5% CO₂ 및 최대 습도에서 37℃로 유지되는 상태에서 배아들을 배양하였다. 1세포기와 응축상실기(compact morula stage) 사이인 배아를 광유, 즉 오보일(Ovoil)(Vitrolife, 스웨덴) 하에서 G 1.2 배양액(Vitrolife, 스웨덴)에서 배양하였다. 그리고 나서, 팽창된 배반포기(blastocyst stage)까지 오보일 (Ovoil) 하에서 G 2.2(Vitrolife, 스웨덴)으로 옮겨 배양시켰다.

가압

M2(Sigma, 미국)와 함께, 배반포를 기포가 없는 플라스틱 스트로우(7-9 배아/스트로우)로 옮긴 다음, 스트로우를 열밀봉하였다. 스트로우를 압력 충진제(pressure medium)인 물이 채워진 압력챔버 속에 안치시켰다. 주문제작된 가압 장치는 1 내지 150 MPa 범위내에서 정밀하게 제어된 압력을 제공할 수 있으며, 2 Cm 내경을 가지는 스테인레스 강 재질로 되어 있고, 압력 게이지와 연결되어 있다. 정수압은 스크류 수동조작을 통하여 피스톤을 압력 챔버로 밀어냄으로써 발생된다. 원하는 정도의 압력 도달 시간은 20초 내지 5분 소요된다(각기 10 MPa 내지 150 MPa); 압력 해제 기간은 3초이었다. 단계적인 감압 효과를 조사하는 실험에서, 해제 시간은 30-120 분 사이였다. 0℃에서 실시된 실험에서, 압력 챔버는 바이오-쿨(FTS-Sytems, 뉴욕, 미국)의 냉각조에서 냉각되었다.

사전 가압이 된 동결보존

배아들을 무작위적으로 3개의 그룹으로 배분하였다. 그룹I 의 배반포들은 하기 설명되는 것과 같이, Nowshari 및 Brem(1998)에 따라 7M 에틸렌 글리콜(EG)을 포함하는 유리화 용액(vitrification solution)내에서 동결보존되었다. 그룹II의 배아들은 30분 동안 60 MPa 압력으로 처리된 다음, 동일한 방법으로 동결되었다. 그룹III은 비처리된 대조군으로 사용되었다. 융해후, 배아들은 24시간동안 생체외에서 배양되었다.

동결보존

배아들은 M2(Sigma, 미국)에서 1.5M 에틸렌 글리콜(EG)(Sigma, 미국) 및 0.25M 자당(sucrose)을 포함하는 용액에서 5분간 평형되었고, 10% 소태아혈청(Fetal Calf Serum)(FCS)(Sigma, 미국), 0.25ml 플라스틱 스트로우(7-9 배아/스트로우)에 미리 옮겨진 유리화 용액(7M EG, 0.5M 자당 10% FCS)으로 운반되었다. 최종적으로, 스트로우들은 열밀봉되었다. 유리화 용액에 1분 노출시킨 후, 스트로우는 천천히 액체질소 속으로 담가졌다. 스트로우들은 30℃ 물에서 30초동안 융해된 다음, 배아들은 회복되어 5분동안 원상배지(rehydration medium)(0.5M 자당 10% FCS)에 놓여졌다. 그런 다음 배아는 상술한 것처럼 G2.2 배지에서 배양되었다(Nowshari와 Brem, 1998).

배아 이식

배아는 상기와 같이 2시간 동안 G 2.2에서 배양되었다. 그리고 나서, 이것들은 각기 실험 그룹에서 ‘사망’ 과 ‘생존’으로 분리되었고, 3일차에 각각 가임신 수여자(pseudopregnant recpients)에 이식되었다(동물 당 7~12 배아). 처리하지 않은 배반포는 대조구로서 이식되었다.

평가 및 통계적 분석

압력 해제후 또는 융해후와 2, 3, 4, 6, 12, 20 및 24 시간후에 배아 품질이 조사되었다. 배아 생존은 형태학적 외관을 기준으로 평가되었다: 할구의 무손상, 할강의 재팽창 및 투명대(zona pellucida)로부터 부화(hatching)는 생존의 신호였다. 처리되지 않은 배반포는 대조군으로 이용되었다.

체내 평가를 위해, 상기와 같이 압력처리된 배아를 G2.2 에서 2시간 동안 배 양하였다. 그런 다음, 동물 당 7~12 배아를 3일차의 가임신 수여자로 이식시켰다. 압력처리되지 않은 배반포들은 대조군으로서 이식되었다. 건강한 새끼의 출생은 배아의 생체내 생존의 증거였다.

생존율은 카이스퀘어 테스트로서 대조군과 비교되었다.

실시예 1. 실온에서 각기 다른 압력에서의 생쥐배아의 생존

본 실험에서, 배아를 실온에서, 1초 내지 300 분까지 다양한 시간 동안, 10부터 150 Mpa(10Mpa씩 증가)까지 각기 다른 정수압에 노출시켰다.

어떤 압력 및 시간을 초과한 처리(도 1)는 가역적인 형택학적 변화를 일으켰다. 팽창된 배반포는 투명대 내에서 응축되었다: 할강은 사라지고, 할구 크기는 작아졌으나 구조적 형태는 변화가 없었다. 생체외 배양 4~5시간 후, 배반포가 재팽창하였고, 24시간에 투명대로부터 부화되었다. 보다 작은 충격을 받은 배아는 아무런 형택학적 변화를 보이지 않았고, 체외 배양 24시간 내에 부화하였고(b), 보다 큰 충격을 받은 배아는 응축된 상태로부터 재팽창하지 않았으며 2시간 내에 쇠약해졌거나, 감압후 이미 쇠약해졌다(c)(도 1).

생체내 평가를 위해, 시도된 배아는 감압후 체외 배양 2시간 후 ‘생존’(a와 b) 및 ‘사망’(c) 으로 판단되었고, 각기 수여자에게 이식되었다. 170개의 이식된 ‘a’와 ‘b’ 배아 중에서 145개의 건강한 새끼가 태어났으나(85%), 49개의 ‘ c’에서는 한 개도 태어나지 않았다(0%).

압력을 받지 않은 대조군, 응축되거나 응축되지 않은 가압된 a 및 b 배아의 부화율(체외) 및 출생율(체내) 간에는 어떠한 유의적 차이가 없었다.

이러한 결과는 비록 압력 크기가 높을수록 배아 생존율이 감소할지라도, 배아는 상당양의 압력에서 생존율에서 어떠한 변화없이 생존할 수 있음을 보이고 있다(도 1). 체외 배양 2시간내에 쇠약해지지 않은 배아는 처리되지 않은 대조군과 체내외 생존율에서 동일하였다.

실시예 2. 각기 다른 감압 프로필 후 생쥐배아의 생존

본 실험에서, 우리는 압력이 가해진 배아의 생존율이 점차적인 감압에 의해 향상될 수 있는지를 조사하였다.

팽창된 배반포는 30, 60, 90 분 동안 90Mpa에서 유지되었고, (여기서 실온에서 즉각적인 감압에서의 생존율은 각각 50%, 0%, 0%였다) 그런 다음, 압력은 30, 60, 90, 120, 150 분 동안 9단계로 점차적으로 해제되었다. 결과는 생존율이 점차적인 감압에 의해 유의적으로 향상될 수 있음을 보이는데, 점차적인 감압은 배아가 압력에 놓여진 시간에 따라 최적 범위를 가진다. 배아가 압력에 놓여진 시간이 길수록 최적 시간은 증가한다. 감압으로 이룰 수 있는 최대 생존율은 가압시간이 증가함에 따라 감소된다(도 2).

체외 평가에서 54개의 생존배아 및 35개의 사망배아가 9개의 수여자에게 이식되었다. 18일차에 54개의 생존 배아 중 47개가 착상되었으나(87%), 35개의 사망 배아 중에서 아무것도 착상되지 못했다. 생존 그룹의 착상율은 대조군과 차이가 없었다(p<0.05).

실시예 3. 저온에서 각기 다른 압력에서의 생쥐배아의 생존

이 실험에서는, 가압된 배아의 생존에 대한 온도의 역할을 조사하였다.

저온(0℃)에서 1초, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분 동안, 배아에 30, 60, 90 MPa 압력을 가하였다. 압력을 가하지 않은 배아는 생존율에 있어, 0℃에서 어떤 유의적 변화없이 실질적인 시간동안 생존할 수 있는 반면, 30, 60, 90 MPa 의 동시적인 압력 처리는 각각 45, 10, 5 분 후 배아에 100% 치명적이었다. 실온에서 처리된 그룹과 비교하여 저온에서 가압된 배아에서 상당히 감소된 생존율이 관찰되었다(p<0.01%)(도 3a, 3b).

체외 평가에서 40개의 ‘생존’ 배아 와 28개의 ‘사망’ 배아가 7개의 수여자에게 이식되었다. 18일차에 40개의 ‘생존’ 배아 중 34개가 착상되었고(85%), 28개 ‘사망’ 배아 가운데 어떤것도 착상되지 않았다. ‘생존’ 그룹의 착상율은 대조군과 차이가 없었다(p<0.05).

0℃에서 30분동안 90MPa 하에서 유지된 배아 역시 점차적으로 감압되었다. 어떠한 배아도 우리가 사용한 회복 시간(30, 60, 90, 120, 150, 180분)에서 생존하지 못했다. 8 내지 12 배아가 각 그룹에서 사용되었고, 실험은 3회 반복되었다.

실시예 4. 압력처리, 동결 및 융해 후 생쥐배아의 생존

본 연구에서 우리는 동결건조된 팽창된 생쥐 배반포의 생존율이 동결 과정전 압력처리로 향상될 수 있는지를 조사하였다. 그 결과는 표 1에 나타난다.

사전 압력처리와 함께/없이 동결보존되고 동결-융해된 배아의 생존

	수	6시간후 생존 신호		20시간후 생존 신호
		1/2팽창됨	완전 팽창됨	1/2 팽창됨	2/3 팽창됨	완전 팽창됨	부화됨
그룹I	115	9%	0% ^b	17%	10%	19%	0% ^b
그룹II	95	-	98% ^a	-	-	3%	95% ^a
그룹III	107	-	99% ^a	-	-	3%	94% ^a

서로 다른 위첨자는 서로 유의적 차이가 있다(P<0.01).

압력을 가한 그룹과 압력을 가하지 않은 그룹간에 생존율에 있어서 유의적인 차이가 관찰되었다(p<0.01). 동결보존전에 압력처리를 받은 배아에 있어서 재팽창이 더 빨랐으며(4-6시간 대 20시간), 생존율이 더 높았다(98% 대 46%)(표 1). 생존율 및 부화율에 있어서 대조군과 압력처리된 그룹간에 유의적인 차이가 없었다.

실시예 5. 압력처리, 동결 및 융해 후 소 배아의 생존

재료 및 방법

난모세포 수집 및 체외성숙( IVM )

화학제는 별도 표시가 없는한 EMBRAPA(브라질리아, 브라질)로부터 구입하였다. 난소는 도살장으로부터 수집되어 35-37 도시 생리수에서 보관되었다. 난구-난모세포 복합체(Cumulus- oocyte complex)는 18G 바늘이 달린 20ml 시린지를 사용하여 2~10mm 난포(follicles)을 흡입하여 얻어지고, 50ml 원심분리 튜브에 수집되었다. 10분 침전 후, COCs 는 소태아혈청(FCS), 페니실린, 스트렙토마이신(streptomycin) 및 헤파린(Sigma H3149)이 보충된 TCM-199 Hank’s(Gibco)가 담겨진 배양접시로 옮겨졌다. 수집된 COCs 가 성숙 배지(FCS, LH(Sigma), FSH(Sigma), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 TCM-199 Earl’s)에서 3회 세척된 후, 2ml 성숙 배지(대략 배양접시 당 100 COCs)로 옮겨지고, 광유로 덮혔다. 난모세포는 22시간 동안 5% CO₂ 및 최대 습도하에서 38 ℃에서 성숙되었다.

정자 준비, 최외수정 ( IVF ) 및 최외 배양( IVC )

IVF를 위해, COCs 는 수정배지에서 3회 세척된 다음 200㎕ 수정 배지(BSA, 페니실라민-Sigma P4875, 히포타우린-Sigma H1384, 에피네프린-Sigma E4250 및 헤파린-Sigma H3149 가 보충된 TALP) 4 방울이 담긴 배양접시로 옮겨지고 광유로 덮혀졌다. 운동성이 있는 정자는 동결-융해된 정자(Genetic, Cuiaba, 브라질)를 불연속적 농도구배의 퍼콜(Percoll)(2ml 45% 퍼콜부터2ml 90% 퍼콜에 걸쳐)에서 실온 700g에서 20분간 원심분리하여 얻어졌다. 90% 부분 아래쪽에서 수집된 정자 펠렛은 HEPES-완충된 Tyrode’s 에서 세척되고 700g에서 5분간 원심분리하여 펠렛화된다. 정자는 혈구계산기(hemocytometer)로 계산되고 적당량의 TALP로 2×10⁶ 정자/ml가 되도록 희석된다; 이 현탁액의 200㎕ 분취량이 각각의 수정 방울(fertilization drop)에 첨가된다. 플레이트는 5% CO₂ 습도있는 39℃에서 19시간 동안 배양되었다. 그런 다음, 추정되는 접합자는 39℃, 5% CO₂에 습한 상태에서 광유 하에 SOF 방울에서 체외 배양되었다.

가압

배아 보관배지(Emcare Holding, Emcare, 뉴질랜드)와 함께, 배반포들을 기포가 없는 0.25ml 플라스틱 스트로우(7~9 배아/스트로우)로 옮긴 다음, 스트로우들을 PVC로 밀봉하였다. 스트로우를 압력 충진제(pressure medium)로서 물이 채워진 압력챔버 속에 안치시켰다. 상술한 것처럼, 배아를 실온에서 다양한 시간 동안(15, 30, 45, 50, 60, 90, 100분), 60부터 90 Mpa(10Mpa씩 증가)까지 각기 다른 정수압에 노출시켰다.

사전 가압이 된 동결보존

배아들을 무작위적으로 3개의 그룹으로 배분하였다. 그룹I 의 배반포들은 하기 설명되는 것과 같이, 1.5M 에틸렌 글리콜(EG)을 포함하는 동결 용액내에서 동결보존되었다. 그룹II의 배아들은 50분 동안 80 MPa 압력으로 처리된 다음, 동일한 방법으로 동결되었다. 동결시작과 압력처리간의 시간간격은 4 내지 5분이었다. 그룹III은 비처리된 대조군으로 사용되었다. 융해후, 배아들은 24시간동안 체외 배양되었다.

동결보존

배반포는 0.25ml 플라스틱 스트로우(7~9 배아/스트로우)에 미리 옮겨진 1.5M 에틸렌 글리콜(Emcare, 뉴질랜드)을 포함하는 동결 용액에서 8분간 평형되었다. 스트로우를 -5.2℃로 미리 냉각된 자동 동결기(Bio-cool, FTS-Sytems, 뉴욕, 미국)에 안치시켰다. 3분후, 식빙(seeding)이 야기되었다. 10분 후, 스트로우는 -0.5℃/분 속도로 -32℃까지 냉각된 다음, 액체질소에 담겨졌다. 스트로우는 10초간 공기 중에서 천천히 흔들 다음, 스트로우의 얼음이 녹을때까지 35℃ 물에 넣음으로써 해동되었다. 배반포는 스트로우로부터 회수되었고, SOF에서 3회 세척되었고, 광유 하의 SOF로 옮겨져, 24시간 동안 인큐베이터에서 회복되었다.

평가 및 통계적 분석

압력 해제후 또는 융해후와 2, 3, 4, 6, 12 및 24 시간후에 배아 품질을 조사하였다. 배아 생존은 형태학적 외관과 계속된 체외 발달을 기준으로 평가되었다: 배반포의 손상없음, 할강의 재팽창, 및 투명대로부터 부화는 생존 표시였다. 처리되지 않은 배반포는 대조군으로 사용되었다.

생존율은 카이스퀘어 테스트로서 대조군과 비교되었다. P<0.05 의 확률치는 통계적으로 유의적인 것으로 취급되었다.

결과

다양한 압력 처리후 배아의 생존 및 계속적 발달

첫번째 실험에서, 다양한 시간동안 배아를 각기 다른 정수압에 노출시켰다. 그 결과를 하기 표 2에 요약하였다.

사전 압력처리와 함께/없이 동결보존된 다음 동결-융해된 소 배아의 생존

압력	시간	수 (감압후 응축된것/비~)	6시간 계속된 발달		24시간 계속된 발달 (부화됨)
			I-II	III-IV	I-II	III-IV
80MPa	45분	8(5/3)	8	-	8(4)	-
80MPa	60분	8(3/5)	8	-	8(5)	-
80MPa	45분	7(7/0)	4	3	4(1)	3
80MPa	30분	7(3/4)	6	1	6(6)	1
대조군		8	7	1	6(2)	2

I- II: 완전히 또는 2/3 재팽창된 1급 또는 2급 배아; III-IV; 3급 또는 사망 배아

사전 압력처리와 함께 및 없이 유리화된 배반포의 계속된 체외 발달

두번째 연구에서, 우리는 체외에서 성숙되고/수정되고/배양된 팽창된 소 배반포로서 동결보존된 배반포의 계속된 체외 발달이 동결과정 전에 압력 처리함으로써 향상될 수 있는지를 조사하였다. 8~12 배아가 각 실험 그룹에 사용되었고, 실험은 6회 반복되었다. 그 결과를 표 3에서 나타내었다.

압력을 가한 그룹과 압력을 가하지 않은 그룹간에 체외 생존율에서 유의적인 차이가 관찰되었다(p<0.01). 동결보존전에 압력처리된 배아에 있어서 재팽창이 더 빨랐으며(1~2시간 대 4~6시간), 생존율이 더 높았다(81% 대 41%)(표 3). 생존율 및 부화율에 있어서 대조군과 압력처리된 그룹간에 유의적인 차이가 없었다.

사전 압력처리와 함께 및 없이 동결되고, 융해후 IVMFC 소 배반포의 계속적인 체외 발달

		1시간		4시간		12시간			24시간
	수	I+II	IV	I+II	IV	부화됨	I+II	IV	부화됨	I+II	IV
전처리후 동결	59	88%	12%	81%	19%	12%	81%	19%	17%	81%	19%
비처리된	61	46%	54%	41%	59%	0%	41%	59%	0%	41%	59%

I-II: 완전히 또는 2/3 재팽창된 1급 또는 2급 배아; IV; 사망 배아

결론

우리 결과는 동결에 앞서 압력 처리는 IVMFC(난모세포의 체외성숙, 체외수정, 배아의 체외배양) 소 배아의 체외 발달 속도, 생존율 및 부화율을 향상시킬 수 있음을 보였다. 나아가 이번 연구는 압력 충격이 동결보존 성공율을 크게 증대시킬 수 있다는 증거를 제공한다. 상기 실험에서 보여진 방법은 전영역의 생물학적 물질, 특히 예를들어 인간 배아를 포함하는, 말, 염소, 돼지 또는 영장류와 같은 다양한 종의 배아에 쉽게 적용가능한 것으로 인식된다.

실시예 6. 압력 처리, 동결 및 융해 후 정자의 생존

본 연구의 첫부분에서, 우리는 HHP가 신선한 소 정액의 운동성이 있는 세포 비에 어떠한 영향을 미치는지 기술하고자 한다. 둘째 부분에서는, 도시된 압력-시간-정자 운동성 차트로부터 4개의 파라미터-쌍을 선택하였고, 선택된 압력-시간 파라미터로 사전처리된 동결된 소-정액과 사전처리없이 동결된 것을 비교하였다.

정액 샘플은 오스트리아에 있는 Artificial Insemination Centre of Klessheim 에서 얻었다. 샘플을 규정에 기술된 것처럼 AndroMed 희석제(MiniTub, 독일)로 정자 농도 8×10⁷/ml로 희석하였다. 희석된 정자를 0.25 ml 스트로우에 옮겨 실온에서 보관하였다. 압력 처리 전에 정액 샘플이 담긴 스트로우를 2부분으로 잘랐다. 한 부분은 열밀봉된 다음, 비(specific) 압력/시간 파라미터로 가압되었고, 다른 부분은 압력후 운동성과 비교하는데 사용되었다. 각 압력/시간 파라미터에서의 실험은 7회 반복되고, 별도의 두 보조자(seperate assistants)가 광학 현미경을 이용하여 향상적인 운동성을 조사하였다. 처리 그룹은 다음 파라미터로 시도되었다: 30, 60, 90 및 120분 동안 10 MPa; 30, 60, 90, 120 및 510분 동안 30 MPa; 30, 60 및 90분 동안 50 MPa; 30, 60 및 90분 동안 70 MPa; 30, 60, 90, 120 및 510분 동안 90 MPa. 가압장치는 스테인레스 강으로 주문제작되었고, 압력 충진제로서 물을 포함하는 압력 챔버, 및 당국에서 승인된 압력 게이지를 포함한다. 원하는 정도의 압력에 도달 시간은 1 내지 5분 사이였고, 감압은 2 내지 3초 걸렸다.

대조군 샘플의 평균 운동성은 75 내지 90% 범위였고, 반면에 가압된 샘플의 평균 운동성은 55(90 MPa/ 120분) 내지 84%(10 MPa/ 30분)였다. 30 MPa/510분 그룹 90 MPa/510분 그룹은 다른 가압된 그룹과 비교하여 유의적으로 감소된 운동성을 가졌다(각각 27%와 33%,; p<0.05). 도 4 참조.

두번째 시험에서, 정액 샘플은 2마리 소로부터 얻어졌다(하나는 매우 나쁜 동결능력의 이력을 가짐). 샘플은 상기와 같이 희석된 다음, 4 처리그룹으로 분할되었다. 처리 그룹들은 나누어졌다: 즉, 한쪽은 열밀봉되어 동결되지 전에 그룹I은 90MPa/30분, 그룹 II는 90MPa/90분, 그룹 III은 30MPa/30분, 그룹 IV는 30MPa/90분으로 가압되었고, 다른 한쪽은 사전처리없이 동일한 동결 프로토콜(5℃에서 60분 평형, 그런다음 액체질소에 넣기 전에 -110℃에서 10분)을 사용하여 동결되었다. 융해는 30초동안 35℃ 수조에서 실시되었다. 각 그룹은 또한 가압처리된 또는 가압처리않된 초기 운동성이 테스트되었다. 각 시험은 8번 반복되었다.

양쪽의 소의 초기 평균 운동성은 65~80% 사이였으나, 가압 이후 45~75%로 감소하였다. 양쪽의 소의 융해후 평균 운동성은 사전 압력처리없이 동결된 것에 비해, 사전 압력처리된 것이 유의적으로 우수하였다(p<0.001)(소I: 2~3% 가압없음 대 17~33% 가압있음- 도 5; 소II: 0% 가압없음 대 21~35% 사전 가압처리- 도 6). 이용된 파라미터 중에서, 30MPa/90분이 유의적으로 우수함이 증명되었다(33 및 35%; p<0.05).

본 연구는 우리 실험에서 동결보존된 소 정액의 융해후 운동성에 사전 압력처리가 유효함을 명확히 기술하고 있다. 이번 연구는 또한 압력 충격이 동결보존 성공율을 증대시킨다는 증거를 제공한다. 상기 실험에서 보여진 방법은 전 영역의 다른 생물학적 물질, 특히 다른 종의 정자, 예컨데, 인간을 포함한 말, 염소, 돼지에 용이하게 적용가능 한 것으로 이해된다.

상기 실시예에 나타난 결과는 동결보존에 앞서 적용된 압력처리가 배아의 체외 발달 속도, 생존율 및 부화율을 명확히 향상시킬 수 있음을 보인다. 그 결과, 모든 이와 같은 최상의 목적은 달성될 수 있다: 더 많은 새끼 발생. 도한, 소 배아 및 소 정자에서 나타나는 데이터는 생물학적 물질을 동결보존하기 위한 본 발명의 광범위한 이용가능성을 보인다. 본 발명에 따른 방법의 이용은 난모세포, 배아 줄기 세포, 조직 및 유사체에 대한 적용뿐 아니라 인간을 제외한 포유류를 포함하는 모든 종류의 배아-동결보존 및 배아-촉진에서 성공율을 향상시키는 데 유용하다. 또한 본 방법은 생물학적 물질의 동결보존이 적용될 수 있는 다른 분야에 광범위한 적용가능성을 열고 있다.

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Claims

(a) 생존가능한 생물학적 물질에 정수압력을 가하거나, 미리정한 압력-시간 프로필에 따라 정수압력을 가하는 단계;

(b) 미리정한 시간동안 상기 생존가능한 생물학적 물질을 정수압력에서 유지시키는 단계;

(c) 정수압력을 해제시키는 단계;

(d) 적용가능한 동결 프로토콜을 사용하여 상기 생존가능한 생물학적 물질을 동결시키는 단계를 포함하는, 동결보존된 생존가능한 생물학적 물질의 융해후 생존력을 향상시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 정수압력은 1 ~ 200 MPa 범위인 방법.
제1항에 있어서, 상기 정수압력은 10 ~ 100 MPa 범위인 방법.
제1항에 있어서, 상기 정수압력은 20 ~ 75 MPa 범위인 방법.
제1항에 있어서, 상기 정수압력은 30 ~ 60 MPa 범위인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 1초 내지 300분 동안 가해지는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 1초 내지 150분동안 가해지는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 1초 내지 90분 동안 가해지는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 1초 내지 60분 동안 가해지는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압력은 1초 내지 4시간 사이에서 점차적으로 해제되거나 또는 즉시 해제되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 압력은 1초 내지 4시간 사이에서 점차적으로 해제되거나 또는 즉시 해제되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 압력은 1초 내지 4시간 사이에서 점차적으로 해제되거나 또는 즉시 해제되는 방법.
제8항에 있어서, 상기 압력은 1초 내지 4시간 사이에서 점차적으로 해제되거나 또는 즉시 해제되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 압력은 1초 내지 4시간 사이에서 점차적으로 해제되거나 또는 즉시 해제되는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생존가능한 생물학적 물질은 난모세포(oocytes), 정자(sperms), 접합자(zygotes), 상실배(morulas), 배반포(blastocysts), 배아(embryos), 줄기세포(stem cells), 척추동물의 세포 또는 조직(tissue)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 척추동물은 어류, 조류 또는 포유류인 방법.
제16항에 있어서, 상기 포유류는 소, 말, 염소, 양, 돼지, 애완동물, 사람을 포함하는 영장류로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
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