KR101725861B1 - 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을 증가시키는 방법 - Google Patents
생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을 증가시키는 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101725861B1 KR101725861B1 KR1020147024575A KR20147024575A KR101725861B1 KR 101725861 B1 KR101725861 B1 KR 101725861B1 KR 1020147024575 A KR1020147024575 A KR 1020147024575A KR 20147024575 A KR20147024575 A KR 20147024575A KR 101725861 B1 KR101725861 B1 KR 101725861B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pressure
- minutes
- biological material
- viability
- treatment
- Prior art date
Links
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 230000035899 viability Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 68
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 44
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 42
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 67
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 47
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 36
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 36
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 21
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 20
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 15
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 14
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 12
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 11
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000009931 pascalization Methods 0.000 description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 108010049152 Cold Shock Proteins and Peptides Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 4
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 4
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001109 blastomere Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 2
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 231100000469 sperm hypomotility Toxicity 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N (R)-adrenaline Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182837 (R)-adrenaline Natural products 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 210000003771 C cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011748 CB6F1 mouse Methods 0.000 description 1
- UNPLRYRWJLTVAE-UHFFFAOYSA-N Cloperastine hydrochloride Chemical compound Cl.C1=CC(Cl)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)OCCN1CCCCC1 UNPLRYRWJLTVAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 241000142921 Tardigrada Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 210000004952 blastocoel Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 229960005139 epinephrine Drugs 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 210000002816 gill Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N hypotaurine Chemical compound [NH3+]CCS([O-])=O VVIUBCNYACGLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 210000000947 motile cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000019100 sperm motility Effects 0.000 description 1
- 230000009303 sperm storage Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0289—Pressure processes, i.e. using a designated change in pressure over time
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Table Devices Or Equipment (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및/또는 스트레스 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 상기 생물학적 물질에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계; 미리 정해진 시간 동안 상기 생물학적 물질을 정수압력 하에 유지시키고 단계; 정수압력을 감소시키는 단계; 어떠한 유용한 프로토콜에 따라 원하는 목적으로 상기 물질을 사용하는 단계를 포함하여 상기 물질을 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 생물학적 물질의 사용은 체외수정, 생명기술적 또는 생물공학적 조작의 분야에 적용할 수 있는 어떤 기술 또는 프로토콜에 속한다.
Description
본 발명은 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및/또는 스트레스 내성을 증가시키는 방법에 관한 것이고, 상기 생물학적 물질에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계; 미리 정해진 시간 동안 상기 생물학적 물질을 정수압력 하에 유지시키고 단계; 정수압력을 감소시키는 단계; 및 어떠한 유용한 프로토콜에 따라 원하는 목적으로 상기 물질을 사용하는 단계를 포함하여 상기 생물학적 물질을 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 생물학적 물질의 사용은 체외수정(assisted reproductive techniques), 생명기술적 및/또는 생물공학적 조작의 분야에 적용할 수 있는 어떤 기술 또는 프로토콜에 속한다.
연골세포(chondrocytes), 효모 및 박테리아에서 정수압력의 효과는 증가된 스트레스 내성 및 쇼크 단백질과 관련하여 스트레스 인자로서 연구되었으나, 생식세포(gametes) 및 배아(embryos)에서는 아직 그러하지 못하다.
미생물들이 치명적인 스트레스에 적응하는 생리학적 메카니즘들은 아직 잘 규명되지 않았다. 박테리아 내 통상적인 단백질 합성에서 치명적인 저온 쇼크로 야기된 불안정성은 소위 저온-쇼크 단백질(cold-shock proteins, CSPs)의 합성에 의해 극복되는 것으로 최근 연구들은 기술하고 있다(Phadtare et al., 1999). 이러한 CSPs(저온-쇼크 단백질)는 RNA 샤프론(Graumann and Marahiel, 1999) 또는 전사 활성화인자(LaTena et al., 1991)와 같은 여러 기능을 가지는 것으로 생각된다; 또한 이것들은 동결에 대한 보호 역할을 수행하는 것으로 추측된다(Wouters et al., 1999). 추가적인 조사에서는 CSPs의 생산이 단지 저온 쇼크 뿐 아니라, 다른 환경적 스트레스로도 야기됨이 확인되었다. 예컨대 대장균에 있어, 어떤 타입의 CSP는 영양적 스트레스에 의해 생산된다(Yamanaka et al., 1998).
또 다른 실험은 높은 정수압력 처리가 어떠한 저온-야기된 단백질 및 열 쇼크 단백질의 생산을 자극하는 것을 보여주었다(Welch et al., 1993). 저온 쇼크 및 높은 압력 처리 양자가 CSP 레벨을 증가시키기 때문에, 교차-보호의 가능성에 대한 실험이 수행되었다. Wemekamp-Kamphuis 등은 압력 후 저온-쇼크된 리스테리아 모노시토젠 균(Listeria monocytogenes)의 생존 레벨이 37℃에서 성장하는 세포의 생존 레벨보다 100 배나 더 높은 것을 확인하였다.
30 - 50 MPa 범위의 정수압력은 일반적으로 다양한 생물의 성장을 방해한다: DNA 복제 개시는 대부분의 압력민감성 세포내 과정 중 하나이다(Abe et al., 1999). 이러한 효과는 압축의 정도 및 지속시간에 상당히 의존적으로 변화한다(Murakami and Zimmerman, 1973). 세포막은 압력 손상의 주요 부위로서 알려져 있다(Palou et al., 1997). 높은 정수압력 처리는 능동수송 또는 수동투과와 같은 막 기능을 변화시키고, 따라서 세포의 생리-화학적 균형을 교란시킬 수 있다(Yager and Chang, 1983; Aldridge and Bruner, 1985; Macdonald, 1987; Schuster and Sleytr, 2002; Routray et al., 2002). 압력의 적용은 부분적으로 또는 전체적으로 펼쳐진 형태를 포함한, 단백질 구조의 변화를 이끌 수 있다. 압력은 단백질의 변성을 일으킬 수 있다(Schmid et al., 1975; Weber and Drickamer, 1983; Jaenicke, 1991; Gross and Jaenicke, 1994; Silva et al., 2001). 최근 보고서는 정수 압력이 쇼크 단백질의 생산을 증가시키는 것으로 기술하고 있다(Welch et al., 1993; Wemekamp-Kamphuis et al., 2002).
변화된 압력 상태에서 물리적 또는 생화학적 과정은 르 샤틀리에 원리에 지배받는다: 부피 감소를 동반하는 모든 반응은 상당히 빠르게 진행된다(Murakami and Zimmerman, 1973; Welch et al., 1993; Palou et al., 1997). 압력의 누적은 어떠한 수준을 벗어나서는 치명적이다: 매우 높은 압력에서 어떤 생물분자의 비가역적 변화가 일어나는 동안, 300MPa에서 대부분의 박테리아와 다세포생물은 죽게 된다. 완보류(tardigrades)는 비록 활발한 상태에서는 100 - 200 MPa 사이에서 죽지만, 만약 탈수 상태에서는 600 MPa 이상에서 생존할 수 있다(Seki and Toyoshima, 1998). 초기 자료는 압력이 서서히 감소되는 한, 생물학적 시스템은 높은 압력에서 견딜 수 있음을 보여주었다(Johnson et al., 1954). Pribenszky 등(2003, 2004)은 또한 압력을 받은 배아의 점진적인 회복 가능성을 연구하여 압력의 점진적인 감소가 유의적으로 생존력을 향상시키는 것을 발견하였다.
다양한 스트레스 자극에 반응하여, 열 쇼크 유전자는 열쇼크 단백질(heat shock proteins, HSPs)를 발현하도록 유도된다. 앞선 연구는 열쇼크 유전자의 발현은 전사단계 및 전사후 단계 양쪽에서 조절되고, 열쇼크 유전자의 빠른 전사 유도는 특이적 전사 인자인 열쇼크 인자1(heat shock factor 1, HSF1)의 활성화와 관련있음을 밝혀내었다. 더욱이, 전사 유도는 시그널 및 세포-타입에 의존하는 방식으로 세기(intensity) 및 운동력학(kinetics)에 따라 변화한다. Kaarniranta 등(1998)은 정수압력 형태의 기계적 하중이 인간 연골세포-유사 세포들에서 열쇼크 유전자 발현을 증가시키는 것으로 설명하고 있다. 지속적인 HHP(높은 정수압력)에 대한 반응은, HSFl의 활성화 및 유전자의 전사 유도없이, 활성화된 mRNA 및 HSP70 단백질 레벨로 특징되어 진다. HSP70의 증가된 발현은 hsp70 mRNA 분자의 안정화를 통하여 매개된다. 흥미롭게도, 정적 압력과는 대조적으로 순환 정수 하중(cyclic hydrostatic loading)은 열 쇼크 유전자의 유도를 일으키지 못하였다. Kaarniranta 등(1998)의 이러한 발견은 지속적은 높은 정수압력에 대한 노출된 연골세포-유사 세포에서 hsp70 유전자 발현은 전사 유도없이, 전사후 단계에서 조절되는 것을 보여준다. 그들은 hsp70 mRNA 전사후 조절이 어떠한 스트레스 형태에서 매우 중요한 열 쇼크 유전자의 추가 모드를 제공하는 것으로 제시했다.
이전에, 본 발명자들은 치명적인 쇼크, 높은 정수압력(HHP)이 동결된 생쥐 배반포의 융해후 생존력을 유의적으로 향상시키는 것을 발견하였다(Pribenszky et al., 2005a, WO2005/022996). 이와 유사하게 정액 동결보존에서, 미리 압력처리된 소 정액의 융해후 평균 운동성이 사전에 압력처리를 하지 않고 동결된 샘플에 비해 유의적으로 더 우수하였다. 이러한 결과는 동결보존된 소 정액의 융해후 운동성에 있어 사전 압력처리가 유용한 효과가 있음을 명확히 말해준다(Pribenszky et al., 2005b). 나아가 높은 정수압력(HHP)과정 동안 생물학적 배경기술 및 생화학적 변화를 탐구하기 위한 연구들이 이들 보호 효과의 메커니즘을 밝혀낼 것이다. 그러나, 이들 연구들은 높은 정수압력(HHP)의 사전처리 후에 생물학적 물질의 동결보존에 관계되나, 다양한 생물학적 물질에 명확하게 적용할 수 없거나 낮은 효율을 가진다.
단기간 동안 정액을 저장하기 위한 정액의 냉각과정 또는 약 0℃ 저장방법은 잘 정립되어 있다[Hackett, et al., 1982; Pinto, 1999; O'Shea et al., 1964]. 최적화된 정액 처리(희석)와 최적화된 온도에서 정액 보관을 통하여 정액은 채집 후 1-2일 내에 용인될 정도의 번식능력 결과(그러나 신선한 정액 수정에 비해 명확히 감소된 임신비율)로 수정될 수 있다[Gill et al., 1970; Goodman and, Cain, 1993; Harrop, 1954; ljaz and Ducharme, 1995; Katila et al., 1997]. 이러한 방법은 매우 유사한 기본 단계를 따른다:
1. 정액 채집.
2. 체온에서 정액 희석.
3. 희석된 정액의 최적화된 원심분리. 정액을 재희석하여 최적화된 정액 농도로 조정.
4. 실온 또는 4-5℃ 또는 샘플의 어는점 정도의 온도에서 (재)희석된 정액을 유지.
5. 정액의 수정.
정자가 저장기간 동안 생존력 감소를 경험하는 것처럼, 배아 또는 난모세포의 생존 능력 또한 일단 이들의 생리학적 모계 환경으로부터 분리되면 감소된다(체외배양의 예로서, 활성화, 배아이식, 바이옵시(biopsy), 체내성숙, ICSI, 클로닝 또는 어떤 타입의 생물공학적 과정). 이러한 이유로 통상적인 저장을 포함하는 어떠한 공정 전 또는 후에 생식세포 또는 배아의 생존 능력을 향상시키고, 대부분의 복잡한 생물공학적 공정에 관한 한 수정 또는 이식은 과학적으로나 경제적으로 매우 중요하다.
유사하게, 예컨대 박테리아와 같은 미생물의 보존 동안(예컨대, 동결건조), 미생물이 생존력은 크게 손상된다. 개선된 생존력을 동반하는 어떠한 공정의 효율을 증가시키는 것은 막대한 과학적, 경제적 의미를 낳는다.
상술한 것처럼 명확히, 당업계에서는 생물공학 프로토콜에 폭넓게 사용되는 생물학적 물질의 생존력을 향상시키기 위한 계속적인 요구가 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 정수압력을 가하는 것에 의해 생물학적 물질의 생존력이 상당히 증가되고, 그리고 본 방법의 적용에 의해 많은 상태의 생물공학 프로토콜이 더 효율적으로 이루어질 수 있음을 발견하였다.
본 명세서는 이러한 발견에 대한 넓은 범위의 실시예를 보여준다: 배아 이식(embryos transfer) 또는 수정(insemination)에 본 방법을 적용한 후 임신율과 출산율이 향상되었다; 난모세포에 본 방법을 적용하는 경우, 이들의 스트레스 내성이 크게 증가되었고, 결과적으로 분열율과 배반포 형성율을 높였다; 정액에 본 방법을 적용한 다음, 종래 희석 및 저장의 상태를 따르면, 정자의 운동성이 상당히 더 오랜 시간 보존되었다.
또한 생물학적 물질 저장 또는 조작 단계에서 배지의 어는점 이하에서는 온도를 가하는 것을 피하더라도 실질적인 개선이 있었다. 이러한 발견은 본 발명 그리고 이와 유사한 높은 정수압력(HHP) 방법을 사용하는 경우에 상당한 실질적 효과가 있음을 암시한다.
본 발명의 문맥에서 우리는 본 발명의 개념이 인공수정 및 기타 공정에 이용되는 다른 생명기술/생물공학적 프로토콜이나 공정에도 동등하게 적용될 수 있음을 강조한다. 그리고, 이러한 선택은 본 발명에 대하여 제한되지 않는다. 향상된 프로토콜에 포함되는 유일한 필수 단계는 정수압력을 가하는 단계이다; 이러한 파라미터는 본 발명의 상세한 설명의 가르침을 따를 때 당업자에 의해 용이하게 최적화될 수 있다.
정액 동결은 돼지(및 말까지도) 정자의 융해후 낮은 생존력을 제공하기 때문에, 이러한 종의 대부분의 일반적 교배 방법은 신선한, 희석된, 희석되고 식혀진, 또는 희석되고 냉장된 정액을 가지고 수정하는 것이다. 높은 정수압력(HHP) 사전처리에 의해, 정액은 주어진 온도에서 상당히 더 효과적으로 보존될 수 있고, 또한, 높은 품질에서 저장 시간이 상당히 증가된다.
유사하게, 체외 및 체내 배아 생산, 배아의 체외 배양, 교배, 분열 및 생명기술적/생물공학적 공정 사용, 배아 이식, 난모세포 성숙, ICSI 또는 난모세포 또는 정자에서, 생명기술적/생물공학적 공정은 이들의 생존력을 상당히 감소시킨다. 상술한 특징의 추론으로, 높은 정수압력(HHP) 사전처리에 의해 생식세포와 배아는 증가된 생존력으로 어떠한 종류의 인공수정 기술분야 또는 생명기술적/생물공학적 공정으로도 진입할 수 있다.
본 발명은 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을 증가시키는 방법을 제공하는 데 목적이 있다.
(a) 상기 생물학적 물질에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계;
(b) 미리 정해진 시간 동안 상기 생존가능한 생물학적 물질을 정수압력 하에 유지시키는 단계;
(c) 정수압력을 감소시키는 단계;
(d) 사용은 동결보존을 포함하지 않고, 상기 정수압력의 적용이 상기 생물학적 물질의 잡종3배체화(allotriploidization)를 발생시키지 않는 것을 전제로, 어떤 유용한 프로토콜에 따라 원하는 목적으로 상기 물질을 사용하는 단계를 포함하여 상기 물질을 사용하여 생물학적 물질의 생존력 및/또는 스트레스 내성을 향상시키는 방법.
본 발명에 따른 방법에서 사용된 압력은 1 - 200 MPa, 바람직하게는 10 - 100 MPa이고, 더욱 바람직하게는 20 - 70 MPa이고, 가장 바람직하게는 30 - 60 MPa이다.
본 발명에 따른 방법에서 사용된 정수압력은 '순간'(instantaneous)부터 300분 사이의 시간 동안, 바람직하게는 0.001초 ~ 600분 사이 시간동안 가해지고, 더욱 바람직하게는 1초 ~ 300분 사이 시간동안 가해지고, 더더욱 바람직하게는 20초 ~ 90분 사이 시간동안, 가장 바람직하게는 30초 ~ 60분 사이 시간동안 가해진다.
본 발명에 따른 방법에서 압력 감소 시간은 10초 ~ 20시간, 또는 1분 ~ 1시간, 다른 케이스에서는 10분 ~ 30분간이다. 또한, 압력 감소는 순간적일 수 있다.
본 발명은 미리 정해진 압력 프로파일에 따라 압력이 가해지고, 유지되고, 감소될 수 있다.
본 발명은 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을 유의적으로 증가시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 생물학적 물질의 생존력 및/또는 스트레스 내성을 향상시키는 방법에 관계되고,
(a) 상기 생물학적 물질에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계;
(b) 미리 정해진 시간 동안 상기 생물학적 물질을 정수압력 하에 유지시키는 단계;
(c) 정수압력을 감소시키는 단계;
(d) 사용이 동결보존을 포함하지 않은 것을 전제로, 어떤 유용한 프로토콜에 따라 원하는 목적으로 상기 생물학적 물질을 사용하는 단계를 포함하여 상기 생물학적 물질을 사용하는 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용된 압력은 1 - 200 MPa의 범위이다. 바람직한 구체예에서, 압력은 바람직하게는 10 - 100 MPa이고, 더욱 바람직하게는 20 - 70 MPa이고, 가장 바람직하게는 30 - 60 MPa이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용된 정수압력은 '순간'(instantaneous)부터 300분 사이의 시간 동안 가해진다. 바람직한 구체예에서, 압력은 바람직하게는 0.001초 ~ 600분 사이 시간동안 가해지고, 더욱 바람직하게는 1초 ~ 300분 사이 시간동안 가해지고, 더더욱 바람직하게는 20초 ~ 90분 사이 시간동안, 가장 바람직하게는 30초 ~ 60분 사이 시간동안 가해진다.
다른 구체예에서, 압력 감소 시간은 10초 ~ 20시간, 또는 1분 ~ 1시간, 다른 케이스에서는 10분 ~ 30분간이다. 압력 감소는 순간적일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 미리 정해진 압력 프로파일에 따라 압력이 가해지고, 유지되고, 감소되는 방법에 관련된다.
또 따른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 미리 정해진 온도 프로파일에 따라 압력 압력이 가해지고, 유지되고, 감소되는 방법에 관련된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법은 척추 동물의 난모세포(oocytes), 정자(sperm), 접합체(zygotes), 상실배(morulas), 배반포(blastocysts), 배아(embryos), 줄기세포(stem cells)에서 선택된 생식세포(gametes) 및 배아(embryos)와 관련되어 사용된다.
바람직한 구체예는 상기 척추동물이 어류, 조류 또는 포유류, 바람직하게는 소, 말, 염소, 양, 돼지, 다른 가축, 애완동물, 사람을 포함하는 영장류인 방법과 관련된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 생물학적 물질은 미생물 배양균인 방법에 관련된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 미생물 배양균는 박테리아 배양균이다.
나아가 본 발명은 상술한 어떠한 방법에 관련되고, 여기서 상기 생물학적 물질의 사용은 체외수정(assisted reproductive techniques), 생명기술적 및/또는 생물공학적 조작의 분야에 적용할 수 있는 어떤 기술 또는 프로토콜에 속한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 프로토콜은 동결건조이다.
또 다른 관점에서, 본 발명의 방법은 생존가능한 생물학적 물질의 스트레스 내성을 향상시키기 위해 적용되는 데, 여기서 증가된 온도에 대응하여 내성은 향상된다.
본 발명은 발명의 개념을 설명하기 위하여 생쥐 배아, 소 정자, 돼지 정자, 돼지 난모세포 및 두 종의 박테리아를 사용하여 더 상세히 설명된다. 본 발명에서 개시되는 공정은 본 기술분야, 좀더 일반적으로는, 생명기술적 또는 생물공학적 공정에 사용될 수 있는 생존가능한 생물학적 물질의 후보인, 모든 포유류, 조류, 또는 어류의 생식세포와 배아, 어떤 종류의 다른 생물학적 물질에 동등하게 적용됨은 명확하다. 용이한 접근성 및 조작성 때문에, 생쥐 배아, 돼지 및 소 정액, 돼지 난모세포 및 두 종의 박테리아가 상세한 연구 주제로서 선택되었다. 또한 용이한 해석 및 추론을 위하여, 간단히 종래 기술 절차가 선택되었다: 배아 이식, 인공 수정, 난모세포의 체외 활성 및 체외 정자 보관. 미생물에 관한 개념 실험의 입증에 관한 한, 높은 정수압력 전처리/처리의 유용한 효과를 나타내기 위하여 박테리아 동결건조가 선택되었다. 이러한 공정은 산업적, 헬스케어 및 연구분야에 기초한 세균학, 종래기술 및 생명기술 또는 생물공학적 공정의 기본 프로토콜이다. 그러나, 본 발명에 따른 방법 그리고 본 발명의 명세서에서 유사하게, 용어 '생쥐 배아' 또는 '소 또는 돼지 정액'은 용어 '생식세포 또는 배아'와 호환되어 사용될 수 있다. 예컨대, 척추동물 및 인간의 배아, 난모세포, 정자의 이식-전 및 이식-후 단계가 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
본 발명의 문맥에 있어서, '생존가능한 생물학적 물질'이라는 표현은 일반적으로 적당한 상태 하에서 생존 능력, 성장, 발아할 수 있는 살아있는 생물의 일부분 또는 이들 생물로부터 유래된 것으로 언급될 수 있다. 생존가능한 생물학적 물질은 세포, 세포 배양체, 조직 샘플, 조직 배양체, 기관 및 이와 유사물일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
미생물에 관련된 용어는 현미경으로 관찰할 수 있는 즉, 눈으로 보기에는 너무 작은 생물체로 언급된다. 미생물은 박테리아, 곰팡이, 고세균(archaea), 진핵생물일 수 있다. 미생물은 종종 단세포 생물로 기술될 수 있다; 그러나, 어떠한 단세포 원생생물은 눈으로도 확인가능하고, 어떠한 다세포 종은 현미경으로 관찰가능하다.
고도로 진화된 진핵 생물로서, 생쥐 배아는 완보류 및 박테리아보다 정수압력 효과에 더 적당하다. 따라서, 첫째 목적은 압력하에서 형태학 및 생존과 관련한 생쥐 배아의 기본 특징을 정립하는 것이다.
생쥐 배아의 압력 내성을 조사하기 위해 주의 깊게 설계된 실험이 수행되었다. 압력 및 시간 스케일의 선택은 나중의 실질적인 임상에 가장 폭넓게 적용가능한 범위로 한정되었다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 압력은 1 ~ 250 MPa 범위에서 선택되었다. 좀더 구체적으로, 팽창된 배반포기 배아에 적용될 수 있는 정수압력은 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150 MPa, 또는 이들 중간 범위 내의 어떤 값이다. 이와 비슷하게, 생쥐 배아를 높은 정수압력 하에서 유지하는 데 광범위한 시간이 선택될 수 있다. 좀더 구체적으로, 생쥐 배아는 선택된 압력하에서 1초 내지 6시간의 시간 동안, 좀더 구체적으로 1초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 120분, 150분, 180분, 210분, 240분, 300분, 360분간 유지된다. 배아가 압력하에서 생존하는 시간은 압력증가에 따라 감소한다.
배아는 실질적인 양의 압력에서 형태학적으로 어떤 외관 변화없이 생존할 수 있다(예컨대, 90MPa 에서 1초 동안 또는 30MPa에서 2시간 동안). 배아는 가해진 압력처리의 크기 및 기간에 따라 응축(compact)된다. 이론적으로 본 발명의 범위를 제한하는 것 없이, 우리는 압력이 배반포로부터 수분을 짜내는 직접적인 요인은 아니라고 생각된다. 인용된 문헌에 근거하여, 배아의 응축(compaction)은 상당한 압력이 다른 단백질의 생산(저온-쇼크 단백질, CSPs), 단백질 구조의 가역적 변화 및 대사과정을 야기시키는 것에 기인한다. 압축된 배아는 체외 배양 4 ~ 5시간 후에 일반 형태를 회복하고, 대조군과 비슷하게 다시 발생(development)을 할 수 있었다(예컨대, 30분 동안 90MPa 또는 3시간 동안 30MPa로 시도된 배아).
위에서 언급된 '치명적 범위'(예컨대, 응축된 배아)의 배아는 나중에 이식 또는 종래기술 또는 생물공학적 공정을 위해 바람직하게 선택될 수 있다. 가압후, 팽창된 배반포는 응축되고 이러한 형태로 3-4시간 유지된 다음 재팽창한다. 이러한 현상에 근거하여, 미리 압력이 처리된 배아가 선택될 수 있다. 배아의 형태학적 변화와 압력 전처리의 유용한 효과는 변화된 단백질 구조 및/또는 외형 및/또는 각기 다른 압력에서 단백질의 향상된 생산으로부터 유래될 수 있기 때문에, 이러한 단백질의 조사는 어떤 추가적 공정에 앞서 생물학적 물질에 적용된 높은 정수압력의 지표가 될 수 있다.
압력의 크기가 높으면 높을수록, 배아의 생존시간은 점점더 단축된다. 어떠한 크기 및 지속시간을 초과하는 압력 임팩트는 비가역 반응을 일으킨다: 배아는 체외배양 2시간 후에 붕괴되거나 응축 후 이미 붕괴되었을 수 있다(예컨대, 90 MPa에서 2시간 또는 30 MPa에서 5시간 동안 적용된 배아). 당업자는 사용된 생물학적 물질에 따라 통상적인 실험에 의해 제한압력 및 제한시간을 결정할 수 있을 것이다.
가압된 배아의 생존율은 점차적인 감압으로 향상될 수 있다. 연구들은 만약 배아들이 점차적으로 회복된다면 가압된 배아의 생존율은 현저히 증가됨을 보였다. 90MPa에서 60분은 모든 배아에 치명적이었으나, 120분 점착적인 감압이 사용되었을 때는 80% 생존했다. 감압시간은 또한 구체적 임상에서 당업자가 결정할 수 있는 본 발명의 특징이다. 좀더 구체적으로, 선택된 압력하에서 유지된 배아는 1초 내지 4시간, 좀더 구체적으로는 1초, 5초, 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 120분, 150분, 180분, 210분 또는 240분의 시간동안 감압되었다. 압력을 가하는 것처럼, 감압 역시 미리 정해진 압력-시간 프로필에 따라 시행될 수 있다.
본 발명에 따른 압력 처리는 원하는 압력 프로파일에 따라 실행될 수 있음은 당업자에게 이해될 수 있다. 따라서, 압력이 가해지고, 유지되고, 감압됨에 따른 시간 의존도는 압력 처리 즉, 가압 동안, 최대압력 기간 동안, 감압 동안 모든 시점을 포함하는, 각기 다른 시간-압력 커브에 따라 변화할 수 있다. 주어진 시점에서 압력 레벨은 초과실험없이 본 발명의 가르침에 근거하여 용이하게 실행된 예비 실험에 따라 최적화될 수 있고 셋팅될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 미리 정해진 시간 프로파일에 따라 실시될 수 있다. 용어 '온도 프로파일'은 압력 처리의 진행 동안 측정되거나 셋팅될 수 있는 시간-온도 프로파일로 언급되며, 적용되는 압력과 독립적으로 제어될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 압력처리는 단일 온도에서 실시된다. 그러나, 상당한 생물학적 물질은 압력 처리의 각기 다른 단계 또는 단계의 일부에서 각기 다른 온도의 사용을 지시할 수 있다. 셋팅 온도는 예컨대 실온, 대기온도, 생물학적 물질 본래의 자연상태의 체온, 자연상태의 체온보다 다소 높은 온도 등 그 어떤 온도일 수 있다. 당업자는 대조 실험과 비교하여 압력처리의 효율성을 분석함으로써 주어진 온도 프로파일의 적용을 용이하게 결정할 수 있다.
이론적 제한 없이, 이런 특징의 가능한 설명은 상당한 양의 CO2가 압력하에서 발생된다는 것이다(Abe와 Horikoshi, 1995). 반응이 적용압력의 크기에 의존적으로 부피감소(-0.26ml/mol)를 동반하기 때문에 CO2의 수화 및 이온화(HCO3 -및 H+)가 증가한 압력에 의해 촉진된다(Palou 등 1997, Welch 등 1993). 세포간에 생산된 이산화탄소는 즉시 용해되고, 그런다음 HCO3 - 과 H+ 로 해리됨으로써, 세포내 pH를 감소시킨다(Abe와 Horikoshi, 1995, 1997, 1998, Abe 등 1999). 증가된 압력에서 유지되는 평형은 공기압에 있는 배아에 치명적일 것이다. 또한 즉각적인 압력 감소는 세포질로부터 수화 및 이온화된 형태로부터 CO2의 증가된 감소를 일으켜, 배아의 즉각적인 죽음을 일으킬 것으로 가정된다. 어떠한 감압상태에서, 증가된 정수압력에서 가역적으로 불활성화된 원형질 막 단백질(H+-ATPase)(Schmid 등 1975, Pequeux와 Gilles 1978)은 다시 기능을 시작하고, (수동 확산과 함께) 점차 평형을 생리상태로 이동시킨다.
주의 깊게 선택된 압력 파라미터에 따른 처리 후에, 배아는 체외에서 배양된 다음, 가임신 대리모에 이식된다. 압력처리된 배아로부터 태어난 새끼의 수는 압력처리없이 태어난 것보다 더 높았다.
배아의 처리와 유사하게, 돼지 난모세포 또한 이들의 압력-내성을 실험하기 위하여 가압되었다. 그런다음, 주의 깊게 선택된 파라미터로 난모세포들은 전처리되고, 최적화된 값보다 10배나 더 큰 전기 임펄스로 스트레스를 받고, 배반포기가 될 때가지 분열과 추가 발생이 조사되었다. 체외에서 활성화되어 분열 및 발생된 난모세포의 수는 압력처리한 것이 처리 안한 것보다 더 높았다.
배아의 처리와 유사하게, 소 및 돼지 정액 또한 정자의 압력-내성을 실험하기 위하여 가압되었다. 그런다음, 주의 깊게 선택된 파라미터로 정액은 전처리되고, 각기 다른 온도에서 유지되었다. 정액 채집 후에 각기 다른 시점에서 운동성이 있는 정자의 수는 압력처리한 것이 처리 안한 것보다 높았다. 압력 처리된 돼지 정액의 수정은 시설에서 일상적으로 달성되는 것보다 더 높은 한배속 새끼 수를 제공했다.
배아의 처리와 유사하게, 대장균과 락토바실러스 플랜타럼샘플(Lactobacillus plantarumsamples)균이 동결건조 후에 박테리아의 생존력이 증가될 수 있는지를 확인하기 위하여 가압되었다. 동결건조 후 선택된 압력/시간 파라미터에서 생존한 박테리아의 수는 압력처리한 것이 처리 안한 것보다 더 높았다.
본 발명의 설명은 모델 시스템으로서 생쥐 배반포, 돼지 난모세포, 돼지 및 소의 정자 및 두 종류의 박테리아 종을 사용한 정수압력의 시도에서 생물학적 물질의 생존 능력이 향상되는 것을 보여준다. 이것은 가압된 배아를 이식하고, 배양 배지에 이들을 처리하거나/또는 가임신 수여자에게 이식, 또는 체외 활성; 또는 처리된 정액과 수정 또는 동결건조 후 생존한 박테리아의 수를 세는 것 등으로 평가될 수 있다.
체외 발생, 이식 및 추가적인 자궁내 발생 및 분열 및 추가적인 발생은 배아와 난모세포 생존능력의 명확한 증거이다. 이와 유사하게, 정액의 체외 저장 및 수정에서, (체외에서)운동성 있는 정자의 더 높은 숫자 및 높은 임신율은 상기 방법의 가능성을 뒷받침한다.
가압은 본 발명에 따른 프로토콜에 적용할 수 있는 어떤 유용한 가압 장치를 이용하여 실시될 수 있다. 이러한 도구는 제한되지는 않으나 예컨대 WO2005/022996에 기술된 장치 또는 본 명세서에 기재된 장치일 수 있다.
본 발명은 하기 기술된 실험적 실시예를 통하여 잘 설명될 수 있으나, 본 발명의 범주가 하기 실시예에 기술된 특이적 구체예로 결코 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 실온에서 서로 다른 압력에서 생쥐 배아의 생존력, 이식 및 출산율에 대한 압력 처리의 효과
배아 생산 및 배양
1-세포기 생쥐 배아는 6-8 주령되고 과잉배란된 늙고 약한 CB6F1 생쥐로부터 채집되었고, G 1.2 및 G 2.2 배양액(Vitrolife, Goteborg)에서 37℃, 5% CO2, 최대 습도로 팽창된 배반포기까지 배양되었다.
가압
배반포는 M2(Sigma St. Louis, MO)와 함께 플라스틱 스트로우(7-9 배아/스트로우)로 옮겨졌다. 압력 충진제(pressure medium)로서 M2가 채워진 스트로우는 150 MPa 이상까지 압력을 발생하고 정밀하게 측정할 수 있는 특별이 주문제작된 압력챔버 속에 안치되었다. 원하는 정도의 압력 도달 시간은 20초 내지 5분 소요되었다(각기 10 MPa 내지 150 MPa); 압력 해제 기간은 2~4초이었다.
이식
생체내 평가를 위해, 30분간 600 bar로 가해진 배아는 상기 방법에 따라 2시간 동안 G 2.2에서 배양되었다. 그런 다음, 이것들은 3일차에 각각 가임신 수여자(pseudopregnant recpients)에 이식되었다(동물 당 7~12 배아). 처리하지 않은 배반포는 대조구로서 이식되었다.
평가 및 통계학적 분석
체외배양에서 계속된 24시간 동안의 400 배 확대된 배아의 형태학적 외관 변화와 이식된 배아의 출생율로부터 결론이 내어졌다. 현미경관찰로 형태 변화되지 않은 난할구(blastomeres), 할강(blastocoel)의 재팽창과 투명대(zona pellucida)로부터 부화는 체외 생존의 신호였다. 임신 암컷의 18일차 절개에서 태아 수 또는 건강한 새끼의 출생은 배아가 체외에서 생존했다는 증거였다. 생존율은 카이 제곱 테스트(chi-square test)로 대조구와 비교되었다.
본 실험에서, 배아는 실온에서, 1초 내지 300 분까지 다양한 시간 동안, 10부터 150 Mpa(10Mpa씩 증가)까지 각기 다른 정수압에 노출되었다.
어떤 압력 및 시간을 초과한 처리는 가역적인 형택학적 변화를 일으켰다. 팽창된 배반포는 투명대 내에서 응축되었다: 할강은 사라지고, 할구 크기는 작아졌으나 구조적 형태는 변화가 없었다. 생체외 배양 4~5시간 후, 배반포가 재팽창하였고, 24시간에 투명대로부터 부화되었다(a). 보다 작은 충격을 받은 배아는 아무런 형택학적 변화를 보이지 않았고, 체외 배양 24시간 내에 부화하였고(b), 보다 큰 충격을 받은 배아는 응축된 상태로부터 재팽창하지 않았으며 2시간 내에 붕괴되었거나, 감압후에 이미 붕괴되었다(c).
생체내 평가를 위해, 시도된 배아는 감압후 2시간의 체외 배양 후 '생존'(a와 b) 및 '사망'(c)으로 판단되었고, 각각 수여자에게 이식되었다. 29개의 압력처리된 배아가 가임신 대리모에 이식되어 이중 28 마리가 태어났다. 이러한 비율은 압력처리하지 않은 배아에서 달성되는 것보다 매우 높다. 종래 기술 데이터 상태(약 85%)를 능가하는 이러한 유의적 향상은 사전 압력처리의 확고한 효과를 보여준다. 최적화된 압력 및 시간 파라미터가 적용될 때, 생물학적 물질의 생존력 향상은 기준치가 높고 이미 산업적으로 만족스러울 지라도 여전히 중요할 수 있다. 그러나, 본 기술 분야에서, 모든 백분율 포인트가 경제적인 중요도에 추가될 수 있다.
실시예 2: 실온에서 각가 다른 압력에서 소 정자의 생존, 정자 운동성의 감소를 막기 위한 압력 처리 효과
소 정액은 일반적으로 냉동되어 보관되지만, 본 발명의 방법의 특징은 산업적으로 중요한 시스템에서 추가적으로 실시되었다.
13마리 소의 정자는 안드로메드 희석제(AndroMed extender)(MiniTub, Tiefenbach, 독일)로 8 x 10 /mL의 정자 농도로 희석되었다. 희석된 정자는 25℃에서 0.25 mL 스트로우에 삽입되었다. 스트로우들은 처리 그룹과 비처리 그룹으로 나뉘었다. 처리 그룹은 컴퓨터로 제어되는 9개의 각기 다른 프로파일을 가진 압력기(Cryo-Innovation, Budapest, Hungary)로 가압되었다. 전체/전진 운동성을 테스트하기 위하여 컴퓨터원용 정자 분석기(CASA apparatus)로 SpermVision 버젼 3.0(Minitub, Tiefenbach, 독일)이 사용되었다.
600 bar 범위대 이하의 압력처리는 정자 생존에 부정적인 영향을 주지는 않았다. 실온에서 정자 저장 8시간 후 처리/비처리 샘플의 운동성이 다시 분석되었다: 압력처리된 샘플에서 운동성이 있는 세포의 비율이 더 높았다.
실시예 3: 실온에서 각기 다른 압력에서 돼지 정자의 생존력, 정자 운동성의 감소를 막기 위한 압력 처리 효과
본 발명에 따른 방법의 적용가능성을 조사하기 위해, 산업표준인 실온 저장상태에서 돼지 정자의 생존력이 실험되었다.
정액 채집
정액는 일주일에 2번씩 수퇘지로부터 채집되었다. 필터링된 정액-풍부 분획은 장갑낀-손 기술(gloved-hand technique)을 이용하여 250 ml 격리된 진공병으로 채집된 다음, 정자가 평가되었다(Hancock and Hovell, 1959). 70% 운동성을 지닌 정자 이상의 정액의 정자-풍부한 분획이 사용되었다.
*정액의 준비
종래 기술된 방법(Almlid and Johnson, 1988; Maxwell and Johnson, 1997)에 따라 약간의 변경으로 동결된 정액이 준비되었다. 간단히 요약하면, 정액은 격리된 용기에서 37℃ 벨츠빌 융해액(Beltville Thawing Solution, BTS)희석제를 가지고 1:2로 희석된 다음, 수집 후 1시간 동안 상온(20-23℃)에서 식혀졌다. 식힌 후, 정액은 10 ml 튜브에 넣어져 2400 x g 에서 3분간 상온에서 원심분리되고, 상등액은 버려졌다. 펠렛(pellet)은 락토오즈 및 달걀노른자 희석액으로 상온에서 재현탁되었다. 그런 다음, 글리세롤 희석액(2차 희석제) 및 이퀵스 페이스트(Equex paste)(Minitub, Tiefenbach, 독일)가 정액에 첨가되어 최종 6% 글리세롤 및 0.5% Equex 농도가 되었다. 그런 다음, 0.25 ml 미니스트로우에 정액을 넣고 열밀봉하였다. 농도는 300 x 106 정자/ml가 되었다.
가압
스트로우는 압력 충진재로 물이 채워진, 가압 장치의 압력 챔버 내에 안치되고, 미리정해진 압력-프로토콜이 작동되었다. 주문제작된 가압 장치는 10 ~ 1,000 bar의 범위내에서 정밀하게 제어되는 압력을 제공할 수 있다. 가압 장치는 20 x 220 mm의 내부 직경을 가진 스테인레스 강철로 되어 있고, 압력 게이지와 연결되어 있다. 피스톤이 압력 챔버에서 움직여 정수압력을 발생시켰다. 가압 및 감압의 속도는 200 bar/분이었다.
샘플은 실온에서 각각 40, 80, 또는 120분간 각각 200, 400, 800 bar로 가압되었다. 가압하지 않은 샘플은 대응하는 시간 동안 실온에서 유지되었다.
평가
20분 배양후, 5 ㎕씩 각각 두 방울이 유리 슬라이드들로 이동되고, 22 mm x 22 mm 커버-슬립 각각 두개가 씌워졌다. 샘플들은 37℃ 현미경 스테이지와 위상차 광학렌즈(2OX, Olympus, 일본)가 장착된 현미경(Olympus BX 30)에 삽입되고, 컴퓨터 연동 정액분석기(CASA apparatus)인 SpermVision 버젼 3.0(Minitub, Tiefenbach, 독일)로 각 방울로부터 5-5 필드(fields)가 평가되었다. VSL>10 ㎛/s 및 AOC >10 인 정자가 전진 운동성이 있는 것으로 고려되었다.
결과
혼성 모델(인자들: 시간, 압력, 날짜(랜덤))을 이용하여 운동성 파라미터를 분석한 결과, 압력 인자가 유의적인 것으로 조사되었다(p=0.001, 전체 운동성; p=0.0103, 전진 운동성). 압력 처리의 비교한 결과, 800 bar 압력처리 임팩트가 다른 레벨에 비해 유의적으로 나쁜 것으로 조사되었다(P < 0.001, 전체 운동성; P< 0.05, 전진 운동성)(표 1).
| 40분 | 80분 | 120분 | ||||
| tm | pm | tm | pm | tm | pm | |
| 200 bar | 81(4) | 71.5(6.5) | 91(2) | 61(16) | 82.2(0.5) | 64(16) |
| 400 bar | 87(3) | 73(2) | 87(2) | 52(9) | 80(4) | 63(9) |
| 800 bar | 65.5(6.5) | 48(2) | 78.5(3.5) | 53.5(9.5) | 69.5(3.5) | 52(10) |
| 대기압력 | 88(2) | 70(11) | 88(1) | 61(10) | 80(1) | 68.5(8.5) |
tm: 전체 운동성; pm: 전진 운동성. 각각의 처리 조합은 2번 반복되었다.
다음으로, 압력처리적용이 5시간의 저온 적응시간 후의 정자 운동성율에 어떠한 영향을 미치는지 조사되었다. 혼성 모델이 압력, 시간 및 (5시간의 적응시간 전과 후의 두 가지 레벨 기준으로)조사, 고정인자의 상호 작용, 및 랜덤 요소로 시간 기준으로 재조정되었다. 압력과 조사 인자(examination factors) 만이 유일하게 유의적으로 조사되었다(표 2).
| 40분 | 80분 | 120분 | ||||
| tm | pm | tm | pm | tm | pm | |
| 200 bar | 81(4) | 71.5(6.5) | 91(2) | 61(16) | 82.2(0.5) | 64(16) |
| 400 bar | 87(3) | 73(2) | 87(2) | 52(9) | 80(4) | 63(9) |
| 800 bar | 65.5(6.5) | 48(2) | 78.5(3.5) | 53.5(9.5) | 69.5(3.5) | 52(10) |
| 대기압력 | 88(2) | 70(11) | 88(1) | 61(10) | 80(1) | 68.5(8.5) |
tm: 전체 운동성; pm: 전진 운동성. 40, 80, 120분 각각의 시간 간격동안 각 압력처리의 4, 3, 2의 반복이 있었다.
가압되지 않은(대기압) 샘플의 전체 운동성은 유의적으로 감소된 반면, 200 및 400 bar로 처리된 것의 운동성은 초기 운동성에 비해 5시간의 저온 적응시간 후에도 감소하지 않았다.
실시예 4: 돼지 정자의 수정능력과 관련한 압력 처리 효과
새끼 기형 조사뿐 아니라 압력처리된 정자의 수정 능력을 관찰하기 위하여, 이미 새끼 생산에서 배제된 암퇘지 5마리에 압력처리된 수퇘지 정액으로 인공수정을 하였다.
수퇘지 2마리의 정액은 상용되는 희석제로 체온에서 1:3으로 희석된 다음, 희석된 정액을 주입백(infusion bag)에 채우기 전, 샘플은 30분 안에 실온으로 냉각되었다. 주입백은 자동조절되는 가입장치(Cryo-Innovation Ltd., Budapest, 헝가리)의 압력 챔버내에 안치되어 실온에서 압력 프로그램이 실행되었다.
압력 처리는 300 bar로 90분간 이루어졌다. 처리 후, 정액 샘플은 실온에서 동일한 상용 희석액으로 추가적으로 희석된 다음, 가압 후 1시간 내에 암퇘지 5마리에 수정되었다. 수정과정은 첫수정 후 12시간에 압력처리된 정액으로 반복되었고, 대응하는 시간동안 5℃에서 남겨졌다.
초음파 검사에서 5마리 모두 임신된 것이 확인되었다. 통상의 해산과정에 따라, 58 마리의 건강한 돼지새끼들이 태어났다. 돼지새끼들은 어떠한 결함이나 기형이 없었다.
압력처리는 돼지 정자의 수정능력을 유지시키고, 새끼에 있어 어떠한 결함이나 기형을 일으키지 않는 것으로 결론났다. 농장에서 평균적인 한배 새끼수는 9.8 새끼/암퇘지인 반면, 압력처리된 것은 100% 임신율과 평균 11.6 한배 새끼의 결과를 보인다. 따라서 압력 처리는 평균 한배 새끼수를 증가시키는 것으로 결론났다.
실시예 5: 각기 다른 압력 처리 후에 돼지 난모세포의 생존력(체외활성에 따른 난할)
난모세포의 압력 내성을 확인하기 위하여, 체외에서 성숙된 돼지 난모세포는 각기 다른 압력 처리 조합에 따라 체외 전기-활성에 의해 활성되었다.
600개의 체외성숙되고 노출된 난모세포들은 처리 그룹들(n=15-20 난모세포/그룹)과 대조 그룹으로 구분되었다. 그룹들은 24℃ 및 38.5℃에서 30 - 90 분간 200 - 400 bar 에서 TCM-HEPES 배지의 0.5 ml 인공 스트로우에서 가압되었다(스트로우는 미네랄 오일과 금속볼로 밀봉되었다). 대조구들은 동일 환경에서 유지되었고, 한 대조 그룹은 대응시간 동안 온도가 유지되는 IVM 배지에 남겨졌다. 처리 후, 난모세포는 체외에서 활성되었고, 추가적인 발생(development)을 위해 38.5 ℃로 유지되는 배양배지에 안치되었다. 분열은 활성 후 48 시간 동안 체크되었다. 표 3은 각기 다른 그룹에서 체외 활성후 분열된 난모세포의 백분율을 보여주고 있다.
| P/t(24℃) | 30분 | 60분 | 90분 |
| 200 bar | 71% | 65% | 68% |
| 400 bar | 85% | 86% | 74% |
| 대조 그룹 Ⅰ.: | 65% | ||
| P/t (38.5℃) | 30분 | 60분 | 90분 |
| 200 bar | 91% | 94% | 76% |
| 400 bar | 72% | 75% | 83% |
| 대조 그룹 Ⅱ.: | 90% | ||
| 대조 그룹 Ⅲ.: | 81% |
30 - 90 분간 200 - 400 bar 압력처리는 성숙된 돼지 난모세포에 유해한 영향을 주지 않았다. 또한, 24℃에서 30 - 60분간 400 bar 압력처리와 38.5℃에서 30 - 60 분간 200 bar 압력처리는 대응되는 대조 그룹에 비해 더 높은 분열율을 일으켰다. 또한, 30 - 90 분간 600 - 800 bar 압력처리가 이루어졌다. 이들 그룹에서는 어떠한 난모세포도 생존하지 못했다; 이러한 압력 파라미터는 유해하였다.
실시예 6: 각기 다른 압력 처리 조합 후, 최적보다 10배 강한 전기펄스로 활성화된 체외 성숙된 돼지 난모세포의 생존력
압력처리된 난모세포가 유해한 전기쇼크에 좀더 생존할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 체외 성숙된 돼지 난모세포에 각기 다른 압력 조합으로 처리한 다음 체외에서 10배 전기-활성을 거쳐 활성되었다.
300 - 600개의 체외성숙된 난모세포들(매일)은 처리 그룹들(n= 15-20 난모세포/그룹)과 대조 그룹으로 구분되었다. 난구세포(cumulus cells)를 가진 그룹들은 24℃에서 30 - 120 분간 200 - 800 bar 에서 TCM-HEPES 배지의 0.5 ml 인공 스트로우에서 가압되었다(스트로우는 미네랄 오일과 금속볼로 밀봉되었다). 대조구들은 동일 환경에서 유지되었고, 한 대조 그룹은 대응시간 동안 온도가 유지되는 IVM 배지에 남겨졌다. 처리 후, 난모세포는 와동(vortexing)으로 벗겨진 다음, 최적보다 10배 강한 전기 펄스로 체외에서 활성되었고, 추가적인 발생(development)을 위해 38.5 ℃로 유지되는 배양배지에 안치되었다. 분열은 활성 후 48 시간 동안 체크되었고, 배반포 형성은 6일째 조사되었다. 실험은 3번 반복되었다.
| P/t | 30분 | 60분 | 120분 |
| 200 bar | 42% | 54% | 26% |
| 400 bar | 35% | 35% | 29% |
| 600 bar | 0% | 0% | 0% |
| 800 bar | 0% | 0% | |
| 대조 그룹 Ⅰ.(24℃) | 20% | ||
| 대조 그룹 Ⅱ.(온도유지) | 10% | ||
| 배반포 형성 | |||
| P/t | 30분 | 60분 | 120분 |
| 200 bar | 47% | 44% | 32% |
| 400 bar | 29% | 35% | 28% |
| 600 bar | 0% | 0% | 0% |
| 800 bar | 0% | 0% | |
| 대조 그룹 Ⅰ.(24℃) | 28% | ||
| 대조 그룹 Ⅱ.(온도유지) | 21% |
30 - 60분간 200 - 400 bar 압력처리는 무처리 또는 600 또는 800 bar로 처리된 것들에 비해 유의적으로 더 많은 수의 생존 난모세포를 수득하였다. 30 또는 60분간 200 bar 압력 처리는 대조구나 다른 그룹에 비해 유의적으로 더 우수한 분열율과 배반포율을 제공하는 것으로 입증되었다.
실시예 7: 각기 다른 압력 처리 조합에 이은 동결건조 후 박테리아의 생존력
실험을 위하여 두가지 미생물 즉, 대장균(Escherichia coli.)과 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)이 사용되었다. 세포수는 각각 TGE(Tripton Glucose Extract) 영양 배지(MERCK사) 및 MRS 한천배지(agar)(MERCK사)에서 결정되었다. 세포수는 처리 그룹 준비 전, 압력 처리 후, 동결건조에 따른 37℃ 배양 96시간 후에 각각 결정되었다(c.f.u.). 압력 처리는 다음 표에 따른 동일 시간에서 9대의 가압 장치로 실행되었다:
샘플은 멸균된 0.5 ml 인공 스트로우에 채워지고, 멸균된 쇠볼로 밀봉되었다. 동결건조는 에드워드 동결건조 장치에서 이루어졌다. 실험은 2회 반복되었다. 결과는 다음 표들에 나타나 있다.
| 생존 세포수/0.4 ml | |||
| 처리 그룹 번호 | 동결건조 전 | 동결건조 후 Ⅰ. | 동결건조 후 Ⅱ. |
| 1 | 1.30 x 107 | 2.29 x 106 | 2.56 x 106 |
| 2 | 7.80 x 106 | 3.02 x 106 | 2.54 x 106 |
| 3 | 8.80 x 106 | 2.01 x 106 | 2.05 x 106 |
| 4 | 5.70 x 106 | 4.25 x 106 | 4.19 x 106 |
| 5 | 6.38 x 106 | 1.99 x 106 | 2.10 x 106 |
| 6 | 1.26 x 107 | 4.34 x 106 | 4.13 x 106 |
| 7 | 7.50 x 106 | 3.12 x 106 | 3.59 x 106 |
| 8 | 8.70 x 106 | 2.71 x 106 | 3.88 x 106 |
| 9 | 8.30 x 106 | 3.36 x 106 | 4.83 x 106 |
| 대조구 | 1.05 x 107 | 2.56 x 106 | 4.08 x 106 |
| 생존 세포수/0.4 ml | |||
| 처리 그룹 번호 | 동결건조 전 | 동결건조 후 Ⅰ. | 동결건조 후 Ⅱ. |
| 1 | 6.10 x 108 | 1.55 x 107 | 1.65 x 107 |
| 2 | 3.20 x 108 | 2.56 x 108 | 2.90 x 108 |
| 3 | 4.80 x 108 | 9.30 x 107 | 9.0 x 107 |
| 4 | 3.90 x 108 | 1.36 x 108 | 1.00 x 108 |
| 5 | 5.90 x 108 | 2.14 x 108 | 1.80 x 108 |
| 6 | 5.95 x 108 | 2.27 x 108 | 1.70 x 108 |
| 7 | 6.10 x 108 | 7.50 x 107 | 9.50 x 107 |
| 8 | 6.60 x 108 | 1.65 x 108 | 7.80 x 107 |
| 9 | 6.20 x 108 | 1.52 x 107 | 1.21 x 107 |
| 대조구 | 5.10 x 108 | 2.50 x 107 | 7.7 x 107 |
굵은 숫자로 표시된 처리 그룹은 대조 그룹과 비교하여 유의적으로 더 높은 세포 생존력을 나타낸다. 처리 그룹들 사이에서, 그룹 2 및 그룹 4가 우수한 것으로 입증되었다. 동결건조 전 높은 특이적 정수압력 처리는 동결건조 후에 유의적으로 세포 생존을 향상시키는 것으로 나타났다.
실시예 8: 압력 처리의 유무에 따른 배아-바이옵시 또는 교배 후 소 배아의 생존
난모세포 수집 및 체외 성숙(IVM)
(도축장의 난소로부터 적출된) COCs는 FCS, LH (Sigma사), FSH (Sigma사), L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신(streptomycin)으로 영양공급되고, 미네랄 오일로 커버된 TCM- 199 Earl's에서, 38℃ 5.1% CO2 및 최대 습도에서 22시간 동안 성숙되었다.
정자 준비, 체외수정(IVF) and 체외배양(FVC)
수정배지는 미네랄 오일로 커버된 BSA, 페니실라민(penicilamin), 히포타우린(hipotaurin), 에피네프린(epinephrine) 및 헤파린으로 보충된 TALP이다.
운동성이 있는 정자는 동결-융해된 정자를 퍼어콜 불연속적 밀도 기울기(Percoll discontinuous density gradient)(2 ml 45% Percoll - 2 ml 90% Percoll)에서 실온 700g 에서 20분간 원심분리하여 획득되었다. 재현탁후 정자는 수정 방울에 첨가되었다. 플레이트는 5% CO2, 39℃ 습한 공기에서 19시간 동안 배양되었다. 접합체 추정물질은 5% CC2, 39℃ 습한 공기에서 미네랄 오일 속 SOF 방울에서 체외 배양되었다.
가압
팽창된 배반포는 배아 유지 배지와 함께 거품없이 0.25 ml 플라스틱 스트로우 속으로 주입된 다음(7-9배아/스트로우), 스트로우는 PVC로 밀봉되었다.
스트로우는 가압장치에 안치되었다(Cryo-Innovation Ltd., Budapest, 헝가리). 배아는 실온에서 다양한 시간 동안(15, 30, 45, 50, 60, 90, 100 분) 60 ~ 90 MPa 까지(10 MPa 씩증가) 각기 다른 정수압력에 노출되었다.
결과
수정된 배아 또는 바이옵스 후 배아의 생존율은 특이적으로 선택된 압력 처리된 것이 처리 안한 것보다 유의적으로 더 높았다.
실시예 9: 압력 처리 유무에 따른 유전자 도입 후 소 배아의 생존력
본 실험에서, 소 배아는 변화된 압력 조건하에서 이들의 행동이 생쥐 배아와 유사한지 확인하기 위하여 정수압력에 노출되었다. 정수압력을 시도한 후, 샘플은 유전자 도입되었다.
체외 배양 및 도입후, 샘플의 생존력은 사전에 압력이 처리되지 않은 샘플과 비교하여 향상되었다.
실시예 10: 압력 처리 유무에 따른 ICSI 및 배아 바이옵시 후 인간 배아의 생존력
본 실험에서, 소 배아는 변화된 압력 조건하에서 이들의 행동이 생쥐 배아와 유사한지 확인하기 위하여 정수압력에 노출되었다. 정수압력을 시도한 후, 샘플은 ICSI 또는 바이옵시되었다.
체외 배양 및 도입후, 샘플의 생존력은 사전에 압력이 처리되지 않은 샘플과 비교하여 향상되었다.
실시예 11: 압력 처리후 체외 저장 및 성숙에 따른 난모세포(인간, 소, 염소, 돼지)의 생존력
본 실험의 목적은 난모세포들이 만약 사전에 정수압력이 처리된 경우 얼마나 높은 효율로 (체외 저장/성숙을 포함하는) 어떤 과정을 잘 견딜 수 있는지를 조사하는 것이다.
난모세포는 정수압력으로 처리되고 샘플은 감압 후 체외에서 유지되었다. 난모세포의 체외 또는 체내 생존은 사전에 압력처리하지 않은 샘플과 비교하여 향상되었다.
실시예 12: 가압처리 후, 체외 저장에서 배아 줄기세포의 생존력
본 실험의 목적은 사전 압력 처리에 의해 배아 줄기세포의 생존력이 향상되는지를 조사하는 것이다. 생쥐 배아 줄기세포에 정수압력이 처리되고, 샘플은 저장되고 감압 후 유지되었다. 이들 세포의 체외 또는 체내 생존은 사전에 압력처리하지 않은 샘플에 비교하여 향상되었다.
본 실험에서 나타난 결과는 어떤 타입의 인공수정 또는 생물공학적 기술 전에 앞선 압력 처리가 생식세포 및 배아 (및 줄기 세포)의 생존력(스트레스 내성)을 증가시키는 것이 보여준다. 또한, 생쥐 배아, 소 및 돼지 정자, 돼지 난모세포 및 박테리아에서의 본 실험의 데이터는 본 발명의 개념의 광범위하게 적용될 수 있음을 나타낸다. 본 발명에 따른 방법은 인간을 제외한 다른 포유동물 종을 포함하는, 모든 종류의 인공수정 또는 생물공학적 기술, 배아-조작에서 성공율을 향상시키는 데 유용하게 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 생식세포 및 배아 조작이 적용될 수 있는 다른 분야에 대한 넓은 가능성을 열어준다.
정액 동결은 돼지(및 말까지도) 정자의 융해후 낮은 생존력을 제공하기 때문에, 이러한 종의 대부분의 일반적인 교배 방법은 신선한, 희석된, 희석되고 식혀진, 또는 희석되고 냉장한 정액으로 수정하는 것이다. 높은 정수압력(HHP) 사전처리에 의해 정액은 주어진 온도에서 상당히 더 효과적으로 보존될 수 있고, 또한, 높은 품질에서 저장 시간이 상당히 증가된다.
유사하게, 체외 및 체내 배아 생산, 배아의 체외 배양, 교배, 분열 및 생명기술적/생물공학적 공정 사용, 배아 도입, 난모세포 성숙, ICSI 또는 난모세포 또는 정자에서 생명기술적/생물공학적 공정은 이들의 생존력을 상당히 감소시킨다. 상술한 특징의 추론으로, 높은 정수압력(HHP) 사전처리에 의해 생식세포와 배아는 증가된 생존 능력으로 어떠한 종류의 인공수정 기술분야 또는 생명기술적/생물공학적 공정으로도 진입할 수 있다.[Cl]
참고문헌
[116] Abe, F., and Horikoshi, K. (1995). Hydrostatic pressure promotes the acidification of vacuoles in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett 130, 307-312.
[117] Abe, F., and Horikoshi, K. (1997). Vacuolar acidification in Saccharomyces cerevisiae induced by elevated hydrostatic pressure is transient and is mediated by vacuolar H+-ATPase. Extremophiles 1, 89-93.
[118] Abe, F., and Horikoshi, K. (1998). Analysis of intracellular pH in the yeast Saccharomyces cerevisiae under elevated hydrostatic pressure: a study in baro- (piezo-) physiology. Extremophiles 2, 223-228.
[119] Abe, F., Kato, C, and Horikoshi, K. (1999). Pressure-regulated metabolism in microorganisms. Trends Microbiol 7, 447-453.
[120] Aldridge, B.E., Bruner, LJ. (1985). Pressure effects on mechanisms of charge transport across bilayer membranes. Biochim Biophys Acta 817, 343-354.
[121] Almlid T., and Johnson L.A., 1988. Effects of glycerol concentration, equilibration time and temperature of glycerol addition on post-thaw viability of boar spermatozoa frozen in straws. J. Anim. Sci. 66:2899-2905.
[122] Gill HP, Kaufman CF, Foote RH, Kirk RW. (1970) Artificral insemination of beagle bitches with freshly collected, liquid stored, and frozen-stored semen. Am J Vet Res 1970;31:1807-1813.
[123] Goodman MF, Cain Jt.(1993) Retrospective evaluation of artificial insemination with chilled extended semen in the dog. J Reprod Fertil 1993;47:554. abstr.
[124] Graumann, P.L., Marahiel M. A. (1999). Cold shock proteins CspB and CspC are major stationary-phase-induced proteins in Bacillus subtilis. Arch Microbiol 171, 135-138.
[125] Gross M., and Jaenicke R., 1994. Proteins under pressure. The influence of high hydrostatic pressure on structure, function and assembly of proteins and protein complexes. Eur. J. Biochem. 221:617-630.
[126] Hackett, A J; Wolynetz, M S (1982): Reproductive performance of totally confined sheep bred with semen extended in a lactose-egg yolk-glycerol buffer and stored at 5 degrees C Canadian Journal Of Comparative Medicine. Revue Canadienne De Medecine Comparee, Volume 46, Issue 3, July 1982, Pages 327-333
[127] Hancock J.L., and Hovell G.L.R., 1959. The collection of boar semen. Vet. Res.71:664-669.
[128] Harrop AE. (1954) Artificial insemination of a bitch with preserved semen Br Vet J.1954; 110:424-425.
[129] Jaenicke, R. (1991). Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions. Eur J Biochem 202, 715-728.
[130] Johnson F.H., Eyring H., Polissar M.J., 1954. The Cinetic Basis of Molecular Biology. Wiley, New York.
[131] Kaarniranta K., EIo M., Sironen R., Lammi M.J., Goldring M.B., Eriksson J.E.,Sistonen L., and Helminen H.J., 1998. Hsp70 accumulation in chondrocytic cells exposed to high continuous hydrostatic pressure coincides with mRNA stabilization rather than transcriptional activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2319-2324.
[132] Katila T, Combes GB, Varner DD, Blanchard TL (1997) Comparison of three containers used for the tranSPOrt of cooled stallion semen. Theriogenology 1997;48: 1085-1 092.
[133] LaTena A., Brandi A., Falconi M., Spurio R., Pon C.L., and Gualerzi CO., 1991. Identification of a cold-shock transcriptional enhancer of the Escherichia coli major cold shock gene encoding nucleotide protein H-NS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10907-10911.
[134] ljaz A, Ducharme R.(1995) Effect of various extenders and taunne on survival of stallion sperm cooled to 5' C Theriogenology 1995, 44: 1039-1050.
[135] Macdonald, A.G. (1987). The role of membrane fluidity in complex processes under high pressure. In: Jonnasch, H. W., Marquis, R.E., Zimmerman, A.M., editors. Current Perspectives in High Pressure Biology. London: Academic Press pp. 207-223.
[136] Maxwell W.M.C., and Johnson L.A., 1997. Membrane status of boar spermatozoa after cooling or cryopreservation. Theriogenology 48:209-219.
[137] Murakami, T.H., Zimmerman, A.M. (1973). DNA syntheseis in Tetrahymena: a pressure study. Cytobios 7, 171-181.
[138] O'SHEA, T; WALES, R G (1964): EFFECTS OF POTASSIUM ON RAM SPERMATOZOA DURING CHILLING TO AND STORAGE AT 5 DEGREES C. Journal Of Reproduction And Fertility, Volume 53, August 1964, Pages 121-132.
[139] Palou, E., Lopez-Malo, A., Barbosa-Canovas, G. V., Welti-Chanes, J., and Swanson, B. G. (1997). Kinetic analysis of Zygosaccharomyces bailii inactivation by high hydrostatic pressure. Lebensm.-Wiss. U. Technol. 30, 703-708.
[140] Pequeux, A., and Gilles, R. (1978). Effects of high hydrostatic pressures on the activity of the membrane ATPases of some organs implicated in hydromineral regulation. Comp Biochem Physiol B Biochem MoI Biol 59, 207-212.
[141] Phadtare, S., Alasina, J., Inouye, M. (1999). Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr Opin Microbiol 2, 175-180.
[142] Pinto, C R; Paccamonti, D L; Eilts, B E (1999) Fertility in bitches artificially inseminated with extended, chilled semen. Theriogenology, Volume 52, Issue 4, September 1999, Pages 609-616;
[143] Pribenszky C, Molnar M., Cseh S., Solti L., 2005a. Improving post-thaw survival of cryopreserved mouse blastocysts by hydrostatic pressure challenge. Anim. Reprod. Sci. 87. 143-150.
[144] Pribenszky C, Molnar M., Solti L., Dengg J., Lederer J., 2005b. The effect of high hydrostatic pressure on the motility of fresh and frozen-thawed bull semen (pilot study). Reproduction in domestic animals 40. 338.
[145] Pribenszky Cs., Molnar M., Cseh S., and Solti L., 2003. Viability of embryos after exposing to high hydrostatic pressure. Theriogenology 59, 329 (Abstract).
[146] Pribenszky Cs., Molnar M., Cseh S., and Solti L., 2004. Survival of mouse blastocysts after low temperature preservation under high pressure. Acta Vet. Hung. 52, 479-487.
*[147] Routray R., Suzuki T., Strussmann C.A., Takai R., 2002. Factors effecting the uptake of DMSO by the eggs and embryos of medaka, Oryzias latipes. Theriogenology 58:1483-1496.
[148] Schmid, G., L?demann, H. D., and Jaenicke, R. (1975) High pressure effects on the activity of glycolytic enzymes. Biophys Chem 3, 90-98.
[149] Schuster, B., Sleytr, U.B. (2002). The effect of hydrostatic pressure on S- layer-supported lipid membranes. Biochim Biophys Acta 1563, 29-34.
[150] Silva, J.L., Foguel, D., Royer, CA. (2001). Pressure provides new insights into protein folding, dynamics and structure. Trends Biochem Sci 26, 612-618.
[151] Weber, G., Drickamer, H.G. (1983). The effect of high pressure upon proteins and other biomolecules. Q Rev Biophys 16, 89-112.
[152] Welch, T.J., Farewell, A., Neidhardt, F.C., Bartlett, D.H. (1993). Stress response of Escherichia coli to elevated hydrostatic pressure. J Bacteriol 175, 7170-7177.
[153] Wemekamp-Kamphuis, H.H., Karatzas, A.K., Wouters, J.A., Abee, T. (2002). Enhanced levels of cold shock proteins in Listeria monocytogenes LO28 upon exposure to low temperature and high hydrostatic pressure. Appl Environ Microbiol 68, 456-63.
[154] Wouters, J.A., Jeynov, B., Rombouts, F.M., de Vos, W.M., Kuipers, O.P., Abee, T. (1999). Analysis of the role of 7 kDa cold-shock proteins of Lactobacillus lactis MG1363 in cryoprotection. Microbiology 145, 3185-3194.
[155] Yager, P., Chang, E.L. (1983). Destabilization of a lipid non-bilayer phase by high pressure. Biochim Biophys Acta 731, 491-494.
[156] Yamanaka, K., Fang, L., Inouye, M. (1998). The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation. MoI Microbiol 27, 247-255.
Claims (15)
- (a) 생존가능한 생물학적 물질에 정수압력(hydrostatic pressure)을 가하는 단계;
(b) 미리 정해진 시간 동안 상기 생존가능한 생물학적 물질을 정수압력 하에 유지시키는 단계;
(c) 정수압력을 감소시키는 단계;
(d) 상기 생물학적 물질을 동결보존하지 않고, 사용하는 단계를 포함하며,
상기 생물학적 물질은 포유 동물의 난모세포인 것인,
생물학적 물질의 생존력 및/또는 스트레스 내성을 향상시키는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 정수압력은 1 - 200 MPa인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정수압력은 10 - 100 MPa인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정수압력은 20 - 75 MPa인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정수압력은 30 - 60 MPa인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 0.001초부터 600분 사이 시간동안 가해지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 1초 ~ 300분 사이 시간동안 가해지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 10초 ~ 150분 사이 시간동안 가해지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 20 ~ 90분 사이 시간동안 가해지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정수압력은 30초 ~ 60분 사이 시간동안 가해지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압력은 순간적 감압과 6시간 사이의 어느 한시간에 걸쳐 점차적으로 감소되는 것인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 물질의 사용은 체외수정인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HUP0501079 | 2005-11-22 | ||
| HU0501079A HU0501079D0 (en) | 2005-11-22 | 2005-11-22 | Increasing the viability and stress tolerance of viable biological material, including gametes and embryos |
| PCT/IB2006/054358 WO2007060608A2 (en) | 2005-11-22 | 2006-11-21 | Increasing the viability and stress tolerance of viable biological material |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020087015269A Division KR20080092345A (ko) | 2005-11-22 | 2006-11-21 | 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을증가시키는 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140116227A KR20140116227A (ko) | 2014-10-01 |
| KR101725861B1 true KR101725861B1 (ko) | 2017-04-11 |
Family
ID=89986410
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020087015269A KR20080092345A (ko) | 2005-11-22 | 2006-11-21 | 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을증가시키는 방법 |
| KR1020147024575A KR101725861B1 (ko) | 2005-11-22 | 2006-11-21 | 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을 증가시키는 방법 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020087015269A KR20080092345A (ko) | 2005-11-22 | 2006-11-21 | 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을증가시키는 방법 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8278031B2 (ko) |
| EP (2) | EP1981336B1 (ko) |
| JP (1) | JP5259414B2 (ko) |
| KR (2) | KR20080092345A (ko) |
| CN (1) | CN101312646A (ko) |
| AU (1) | AU2006318124B2 (ko) |
| BR (1) | BRPI0618978A2 (ko) |
| CA (1) | CA2630480C (ko) |
| DK (1) | DK1981336T3 (ko) |
| EA (1) | EA022779B1 (ko) |
| ES (1) | ES2500142T3 (ko) |
| HR (1) | HRP20140827T1 (ko) |
| HU (1) | HU0501079D0 (ko) |
| IL (1) | IL191565A (ko) |
| PL (1) | PL1981336T3 (ko) |
| SI (1) | SI1981336T1 (ko) |
| WO (1) | WO2007060608A2 (ko) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010022269A (ja) * | 2008-07-18 | 2010-02-04 | Soka Univ | 細胞の保存方法及びその装置 |
| DE102009025268B4 (de) * | 2009-06-17 | 2012-12-06 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verfahren und Vorrichtung zur Konservierung von Tiefsee-Organismen |
| TWI618422B (zh) | 2015-07-07 | 2018-03-11 | 財團法人資訊工業策進會 | 基地台、使用者終端機以及確定共用頻譜之使用之方法 |
| JP6823074B2 (ja) | 2015-12-07 | 2021-01-27 | クーパーサージカル・インコーポレイテッドＣｏｏｐｅｒＳｕｒｇｉｃａｌ， Ｉｎｃ． | 低温検体キャリヤおよび関連する方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070087321A1 (en) | 2003-09-09 | 2007-04-19 | Csaba Pribenszky | Post-thaw survival of chryopreserved biological material by hydrostatic pressure challenge |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0413721B1 (pt) * | 2003-09-09 | 2017-11-14 | Applied Cell Technology Korlátolt Felelösségu Társaság | Post-defrosting increased surface of biological material criopreserved by hydrostatic pressure stimulus |
-
2005
- 2005-11-22 HU HU0501079A patent/HU0501079D0/hu unknown
-
2006
- 2006-11-21 EA EA200801418A patent/EA022779B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-11-21 US US12/094,582 patent/US8278031B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 CN CNA2006800434396A patent/CN101312646A/zh active Pending
- 2006-11-21 KR KR1020087015269A patent/KR20080092345A/ko active Search and Examination
- 2006-11-21 ES ES06821517.7T patent/ES2500142T3/es active Active
- 2006-11-21 WO PCT/IB2006/054358 patent/WO2007060608A2/en active Application Filing
- 2006-11-21 JP JP2008541878A patent/JP5259414B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 CA CA2630480A patent/CA2630480C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-11-21 AU AU2006318124A patent/AU2006318124B2/en not_active Ceased
- 2006-11-21 EP EP06821517.7A patent/EP1981336B1/en active Active
- 2006-11-21 PL PL06821517T patent/PL1981336T3/pl unknown
- 2006-11-21 BR BRPI0618978-4A patent/BRPI0618978A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-11-21 EP EP14171466.7A patent/EP2792240A1/en not_active Withdrawn
- 2006-11-21 DK DK06821517.7T patent/DK1981336T3/da active
- 2006-11-21 KR KR1020147024575A patent/KR101725861B1/ko active IP Right Grant
- 2006-11-21 SI SI200631821T patent/SI1981336T1/sl unknown
-
2008
- 2008-05-20 IL IL191565A patent/IL191565A/en not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-09-02 HR HRP20140827TT patent/HRP20140827T1/hr unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070087321A1 (en) | 2003-09-09 | 2007-04-19 | Csaba Pribenszky | Post-thaw survival of chryopreserved biological material by hydrostatic pressure challenge |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Animal Reproduction Science Vol. 87, Pages 143-150(2005.6.).* |
| Teriogenology, Vol. 57, Page 506(2000).* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090017440A1 (en) | 2009-01-15 |
| WO2007060608A3 (en) | 2007-09-07 |
| KR20080092345A (ko) | 2008-10-15 |
| BRPI0618978A2 (pt) | 2011-09-20 |
| SI1981336T1 (sl) | 2014-11-28 |
| CA2630480C (en) | 2014-04-01 |
| CA2630480A1 (en) | 2007-05-31 |
| JP5259414B2 (ja) | 2013-08-07 |
| AU2006318124A1 (en) | 2007-05-31 |
| PL1981336T3 (pl) | 2015-02-27 |
| EP2792240A1 (en) | 2014-10-22 |
| EP1981336A2 (en) | 2008-10-22 |
| ES2500142T3 (es) | 2014-09-30 |
| US8278031B2 (en) | 2012-10-02 |
| EA022779B1 (ru) | 2016-03-31 |
| HU0501079D0 (en) | 2006-01-30 |
| IL191565A (en) | 2013-04-30 |
| AU2006318124B2 (en) | 2013-02-07 |
| KR20140116227A (ko) | 2014-10-01 |
| CN101312646A (zh) | 2008-11-26 |
| EA200801418A1 (ru) | 2008-12-30 |
| EP1981336B1 (en) | 2014-06-11 |
| DK1981336T3 (da) | 2014-09-15 |
| WO2007060608A2 (en) | 2007-05-31 |
| JP2009516523A (ja) | 2009-04-23 |
| HRP20140827T1 (hr) | 2014-11-21 |
| IL191565A0 (en) | 2008-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8415093B2 (en) | Post-thaw survival of cryopreserved biological material by hydrostatic pressure challenge | |
| US7879539B2 (en) | Improving the post-thaw survival of mammalian blastocyt or sperm by applying hydrostatic pressure prior to cryopreservation | |
| Pribenszky et al. | Stress for stress tolerance? A fundamentally new approach in mammalian embryology | |
| Pribenszky et al. | Improving post-thaw survival of cryopreserved mouse blastocysts by hydrostatic pressure challenge | |
| KR101725861B1 (ko) | 생존가능한 생물학적 물질의 생존력 및 스트레스 내성을 증가시키는 방법 | |
| Correia et al. | Antifreeze proteins for low-temperature preservation in reproductive medicine: a systematic review over the last three decades | |
| Aljaser | Cryopreservation methods and frontiers in the art of freezing life in animal models | |
| Febretrisiana et al. | Nuclear maturation rate of sheep oocytes in vitro: effect of storage duration and ovary temperature. | |
| Makarevich et al. | Possibilities of cattle ovarian tissue conservation: a mini-review. | |
| Mrowiec et al. | Using rapid I method for vitrification of bovine oocytes | |
| US20140093864A1 (en) | Increasing the viability and stress tolerance of viable biological material | |
| US20140329222A1 (en) | Increasing the viability and stress tolerance of viable biological material | |
| Class et al. | Patent application title: INCREASING THE VIABILITY AND STRESS TOLERANCE OF VIABLE BIOLOGICAL MATERIAL Inventors: Csaba Pribenszky (Budapest, HU) Miklos Molnar (Budapest, HU) Andras Horvath (Ullo, HU) Assignees: APPLIED CELL TECHNOLOGY KFT. | |
| Paim et al. | Vitrification of Rattus norvegicus immature cumulus-oocyte complexes using hyaluronic acid | |
| El-Sayed et al. | The Effeciency of Cryotop in Vitrification of In Vitro Produced Egyptian Buffalo (Bubalus Bubalis) Embryos |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| AMND | Amendment | ||
| B701 | Decision to grant | ||
| GRNT | Written decision to grant |