CN105821120B - 一种基于巢式复合cold-pcr的t790m突变检测方法 - Google Patents

一种基于巢式复合cold-pcr的t790m突变检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于巢式复合COLD‑PCR联合测序的T790M突变检测方法。该方法以待测样本核酸为模板，利用SEQ ID NO.1~4和SEQ ID NO.5~8所示的引物组进行巢式复合COLD‑PCR联合测序。巢式复合COLD‑PCR包括外反应和内反应，外反应是COLD‑PCR与常规PCR反应的组合反应，内反应是常规PCR反应。该方法具有很好的突变检测灵敏度、检测下限和重复性，而且可无差别扩增野生型与突变型样品且同样具有突变富集效果，还可通过调整外反应的循环数比，根据需要调整突变富集效果和检测灵敏度，具有非常好的应用前景。

Description

一种基于巢式复合COLD-PCR的T790M突变检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域。更具体地，涉及一种基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测方法及其试剂盒。
背景技术
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）已广泛应用于非小细胞肺癌患者的抗肿瘤靶向治疗，其疗效的获得有赖于患者是否存在EGFR基因酪氨酸激酶编码区突变，因此，在靶向治疗前先检测EGFR基因突变状态，对于患者选择与疗效预测具有重要意义。然而所有接受EGFR-TKIs靶向治疗有效的非小细胞肺癌患者最终将出现继发耐药，其中近半数的继发耐药患者会出现EGFR基因二次T790M突变。T790M突变位于EGFR基因20外显子上与EGFR-TKIs耐药相关。当存在T790M突变时，EGFR与ATP的亲和力增强从而相对削弱了其与EGFR-TKIs的亲和力，故而导致耐药。目前，EGFR基因T790M二次突变是第一个被公认的EGFR-TKIs获得性耐药机制。相关研究显示T790M突变不仅存在于EGFR-TKIs治疗后的患者肿瘤细胞中，还可能以微克隆的形式存在于EGFR-TKIs治疗前的肿瘤组织中，EGFR-TKIs治疗使这些克隆被选择性富集。因此，利用高灵敏度的检测方法尽早的检出微量T790M突变对非小细胞肺癌患者EGFR-TKIs治疗的疗效和耐药预测具有重要意义。
目前，临床应用的T790M基因突变检测方法主要包括直接测序法、突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）等。其中直接测序法是突变检测的“金标准”方法，其不仅能检测已知与未知突变，还能明确具体的突变类型，但是灵敏度偏低限制了直接测序法的应用范围，其仅能检出突变片段比例大于20%样品中的突变，由于临床送检的肿瘤组织其肿瘤细胞含量各异，当使用如直接测序法等灵敏度较低的方法进行突变检测时会造成微量T790M突变的漏检。而ARMS法虽然灵敏度较高，但其试剂昂贵、存在非特异性扩增曲线且仅能检测已知突变限制了其应用范围。
综上所述，EGFR基因T790M突变与非小细胞肺癌患者EGFR-TKIs靶向治疗疗效预测和耐药相关，灵敏的检出微量T790M突变对指导非小细胞肺癌靶向治疗具有重要意义。常规PCR联合测序法虽是突变检测的金标准方法，但仅能检出突变片段比例＞20%的突变的低灵敏度限制了其临床应用。另外，COLD-PCR法于2008年被首次报道，其可简单快捷的富集突变片段，与其他方法联用可有效提高突变的检出效率。COLD-PCR可分为全COLD-PCR和快速COLD-PCR，其基本原理为：在野生型、突变型混合样品体系中野生与突变型DNA片段形成的杂合双链较完全匹配的同源双链的Tm值低，另有一些突变可导致其所在DNA片段的Tm值下降；利用此种情况，在相应的PCR反应程序中设定一个较低的临界变性温度（即Tc值）可使仅杂合双链或Tm值降低的纯合突变双链才能有效变性而野生型纯合双链不能有效变性从而选择性的扩增突变片段实现突变富集。其与传统直接测序法的联合应用不仅可有效提高突变检测效率还简便经济，因此具有重要的实用价值。故建立一个高灵敏度的COLD-PCR直接测序体系检测T790M突变具有良好的应用前景。
然而，目前COLD-PCR法还有以下几个问题还亟待解决：（1）COLD-PCR的原理决定了其对特定杂合或突变模板的选择性扩增，同时野生型模板的扩增受到抑制，其对野生型样品的扩增效率低下；然而在临床样品检测时，样品的突变状态是未知的，临床要求不但能灵敏的检出低浓度突变也能正常检出野生型样品；同时，T790M突变所在的20外显子还存在插入突变等其他类型突变，有效检测T790M突变的同时也能正常检出其他突变类型也是基本需求之一；所以如何能保证T790M突变的有效富集又不影响野生型或其他突变型样品的成功检测和检出，是研究的一大重点和难点。（2）检测灵敏度和准确度是一对矛盾，对一个方法而言在不同的应用情况下其对灵敏度和准确度要求是不一样的。那么COLD-PCR对突变的富集程度是否可控，以满足不同的应用情况？也即COLD-PCR的灵敏度是否可以人为调整以适应不同的应用需求？是研究的另一大重点和难点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有T790M基因突变检测方法的缺陷和不足，建立一种高灵敏度且突变富集效果可控的COLD-PCR直接测序T790M突变检测体系，其不仅可提高样品的T790M突变检出率还不影响野生型样品和其他类型突变样品的检测和检出。
本发明的目的是提供一种基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测方法。
本发明另一目的是提供一种依据上述方法构建的基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一组基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测引物组，所述引物组包括外引物对和内引物对；所述外引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ IDNO.1~2所示；所述内引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.3~4所示。
优选地，上述外引物对的Tc值为89.7℃。
进一步地，所述引物组还包括外测序引物对和内测序引物对；所述外测序引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.5~6所示，所述内测序引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.7~8所示。
一种基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测方法，是以待测样本核酸为模板，利用上述引物组进行巢式复合COLD-PCR联合测序；所述巢式复合COLD-PCR包括外反应和内反应，所述外反应是利用上述外引物对进行COLD-PCR与常规PCR反应条件的组合反应，所述内反应是利用上述内引物对进行常规PCR反应。
具体优选地，所述外反应程序如下：
预变性：94℃ 3min；
第一循环阶段：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共5个循环；
第二循环阶段：89.7℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共B个循环；
第三循环阶段：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共C个循环；
后延伸：72℃ 7min。
其中，B和C循环数比分别为10：35、15：30、20：25、25：20或总循环数为45内的任意B和C不为0的循环数比。
更优选地，所述B和C循环数比为25：20。
优选地，所述内反应程序如下：
预变性：94℃ 3min；
循环阶段：94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 45s，共40个循环；
后延伸：72℃ 7min。
另外，优选地，所述外反应的体系如下：
Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）10ul、前向引物（10pM/ul）1ul、后向引物（10pM/ul）1ul、纯水 7ul、样品基因组DNA1ul。
优选地，所述内反应的体系如下：
Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）10ul、前向引物（10pM/ul）1ul、后向引物（10pM/ul）1ul、纯水 7ul、外反应产物1ul。
另外，包含有上述引物组的基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
进一步优选地，所述试剂盒还包含有野生型对照品、T790M突变型对照品、外PCR反应液、内PCR反应液、SAP酶混合物、测序反应液。
更优选地，野生型对照品、T790M突变型对照品为：以人肺癌细胞株MSTO-211H的基因组DNA作为野生型对照品，以人肺癌细胞株NCI-H1975的基因组DNA作为T790M突变型对照品。
优选地，巢式COLD-PCR内、外反应体系同上。
优选地，SAP酶混合物为：SAP酶1ul，EcoR I核酸外切酶1ul，去离子水3ul。
优选地，测序反应液为：Bigdye3.1 1ul，测序引物（10pM/ul）1ul，去离子水2ul。
优选地，利用该试剂盒进行检测的方法为：先利用已提取好的组织样品基因组DNA做巢式复合COLD-PCR（先进行外反应，再进行内反应），PCR产物电泳鉴定，PCR产物SAP酶纯化，测序反应，测序产物纯化上机，序列比对与结果分析；所述巢式复合COLD-PCR外反应和内反应的程序同上。
本发明研究发现利用单纯的COLD-PCR条件扩增突变样品时可获得较好的扩增效果，而扩增野生型样品时则扩增效率低下，其产物量只能刚好满足甚至不能满足后续测序反应对模板量的要求。常规PCR能无差别有效扩增突变和野生型片段，其扩增过程不对原始的突变型与野生型片段比例造成影响。本研究在快速COLD-PCR反应条件中COLD-PCR循环步骤后增加了一个常规PCR循环阶段用以在保证有效的突变富集效率前提下增加野生和突变型片段的绝对数量，但琼脂糖电泳鉴定扩增产物发现野生型样品仍不能保证均可见清晰的目的条带，同时COLD-PCR循环条件还导致了一些非特异性扩增条带的出现从而影响了目的条带的有效扩增。在此基础上本研究最终采取了巢式PCR设计，另增设了一个内PCR扩增环节，通过特异性的内PCR扩增引物实现了对含非特异性扩增片段的外PCR产物中目的片段的特异性扩增，电泳鉴定内PCR扩增产物结果显示所有野生、突变型样品均可见单一、清晰目的条带，测序结果显示所有野生、突变型样品均可成功测序并获得良好的测序峰图而突变样品同样获得了有效的突变富集。在利用本发明建立的巢式复合COLD-PCR联合测序与常规PCR联合测序平行检测150例临床样品的实验中，两法均成功检测了所有样品，并同样检出了20Ins突变，而且本发明的巢式复合COLD-PCR联合测序法T790M突变阳性检出率达到了6%（与高灵敏度的ARMS法接近），显著高于常规PCR联合测序法（1.33%）。以上结果显示本研究建立的T790M突变巢式复合COLD-PCR联合测序检测法在实现T790M突变有效富集的前提下，还可正常检测野生型样品和其他突变。
本发明检测的150例临床样品中，在穿刺和肿瘤组织含量＜50%的样品中，因样本基因组DNA得率较低或肿瘤组织基因组DNA含量较低，常规PCR联合测序法T790M突变检测阳性率较本发明巢式复合COLD-PCR联合测序法低，表明在此类样品中应用巢式复合COLD-PCR联合测序法检测T790M突变可减少微量T790M突变的漏检；即在穿刺和肿瘤组织含量＜50%样品中，巢式复合COLD-PCR联合测序法T790M突变阳性检出率较常规PCR联合测序法高，在此类样品中巢式复合COLD-PCR联合测序法具有更好的T790M突变检测效率。故巢式复合COLD-PCR联合测序法较常规PCR联合测序法更适宜于临床组织样品的T790M突变检测。
综上所述，本发明的巢式复合COLD-PCR联合测序法可实现对T790M突变的有效富集，并能正常检出EGFR基因20外显子野生型、T790M突变型和其他突变型样品，适用于临床组织样品的T790M突变检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明构建了一种基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测方法，是以待测样本核酸为模板，利用设计的引物组进行巢式复合COLD-PCR联合测序；所述巢式复合COLD-PCR包括外反应和内反应，所述外反应是利用外引物对进行COLD-PCR与常规PCR反应条件的组合反应，所述内反应是利用内引物对进行常规PCR反应。
上述方法克服了传统COLD-PCR对于野生型样品扩增效率差的问题，具有很好的突变检测灵敏度，而且具有很好的检测下限和重复性，在检测临床样品时比传统常规PCR联合测序具有更好的灵敏度。
同时，上述方法不仅能够检测目的突变型，也能检测其他突变型，对野生型、突变型样品具有同等扩增效能，在灵敏检出微量突变型样品的同时不影响野生型样品的检出，可无差别扩增野生型与突变型样品且同样具有突变富集效果。
另外，上述方法还能够通过调整巢式复合COLD-PCR的外反应中的循环数比，根据需要调整检测灵敏度，实现实验方法的突变富集效果可以根据需求进行控制，具有非常好的应用前景。
附图说明
图1为常规PCR、传统COLD-PCR与本发明巢式复合COLD-PCR产物电泳图
图2为常规PCR与巢式复合COLD-PCR检测T790M突变的检测灵敏度。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 引物设计
依据GENE BANK中EGFR基因的参考序列（NG_007726.2），利用Primer 5.0设计T790M突变扩增、测序引物，由上海Invitrogen公司合成。如表1和表2所示。
表1 PCR及测序引物序列表（1）
表2 PCR及测序引物序列表（2）
实施例2 常规PCR联合测序检测法的建立
1、利用PCR外引物对扩增肺癌细胞株NCI-H1975（T790M突变型标准样品）、MSTO-211H（野生型标准样品）基因组DNA样品，2%琼脂糖电泳鉴定PCR产物，随后SAP酶纯化PCR产物，纯化后产物做测序反应，测序反应产物纯化后上机测序，结合标准序列分析样品T790M突变情况以验证引物设计的有效性。
PCR反应体系：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）10ul、上游引物（10pM/ul）1ul、下游引物（10pM/ul）1ul、纯水 7ul、DNA1ul。
常规PCR反应条件：94℃3 min；94℃30s、58℃30s、72℃45s，50个循环；72℃7 min。
PCR产物纯化反应体系及反应条件：SAP酶混合物 5ul，PCR产物5ul；37℃1h，80℃15min。
测序反应体系：Bigdye3.1 1ul，测序引物（10pM/ul）1ul，去离子水2ul，纯化后PCR产物 2ul。
测序反应条件：96℃1 min；96℃10s、50℃5s、60℃4 min，25个循环；12℃恒温。
测序反应产物纯化上机：醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，加10ul高去离子甲酰胺，95℃ 4min后立即放置冰上4min骤冷，然后可上基因测序仪测序。
2、以所设计的外扩增引物扩增T790M野生型、突变型标准样品，电泳鉴定可见清晰、单一441bp目的条带。利用相应测序引物成功对PCR产物进行测序，野生型、突变型样品测序结果分别为野生型和T790M突变，T790M突变常规PCR联合测序检测法已初步建立。
实施例3 Tc值的筛选与验证
（1）采取快速COLD-PCR反应模式，以外引物对扩增野生型PCR产物的Tm值为第一次实验温度基点，向上下两个方向分三次每次各以1℃、0.3℃和0.1℃为单位延伸设定6个实验变性温度梯度，利用Veriti梯度PCR仪分别平行扩增野生型和突变型样品（后两次实验分别以前次实验得到的野生型样品出现清晰目的扩增条带的最低变性温度为新的实验基点温度）。2%琼脂糖凝胶电泳，以最后一次实验的突变型样品出现清晰目的扩增条带的最低变性温度到野生型样品出现清晰目的扩增条带的最低变性温度为Tc值范围，然后选取中间值作为待定Tc值。将相同浓度（20ng/ul）突变型与野生型标准样品基因组DNA按0%、1%、5%、10%、20%、100%比例混合作为实验样品，利用常规PCR条件和COLD-PCR条件分别扩增并测序检测系列混合实验样品，以此验证筛选所得的Tc值是否存在突变富集效应。常规PCR条件：94℃3min；94℃30s、58℃30s、72℃45s，共50个循环；后延伸72℃7min。COLD-PCR反应条件：94℃3min；94℃30s、58℃30s、72℃45s，共5个循环；Tc℃30s、56℃30s、72℃45s，共45个循环；后延伸72℃7min。
反应体系：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）10ul、前向引物（10pM/ul）1ul、后向引物（10pM/ul）1ul、纯水 7ul、样品基因组DNA1ul。
（2）Tc值的筛选实验显示，当变性温度位于89.6~89.7时，野生型样品的目的条带扩增情况明显弱于突变型样品，选择89.7℃作为待确认Tc值。常规PCR联合测序成功检测突变比例为0%~100%的所有实验样品，但仅在突变比例高于5%的实验样品中检出T790M突变。Tc值为89.7℃的COLD-PCR联合测序成功检测突变比例为1%~100%的系列实验样品且在其中均检出T790M突变，但0%的实验样品检测失败，1%、5%实验样品扩增效果不佳。也即当Tc值设定为89.7℃时COLD-PCR具有T790M突变富集效应，确定89.7℃为本实验体系的Tc值。
在此基础上建立了可富集T790M突变的巢式复合COLD-PCR测序检测体系。
实施例4 巢式复合COLD-PCR联合测序法的建立及其灵敏度评估
1、巢式复合COLD-PCR联合测序法包括巢式复合COLD-PCR外反应和内反应与后续测序部分；巢式复合COLD-PCR外反应采取COLD-PCR与常规PCR反应条件的组合反应条件，内反应采取常规PCR反应条件。具体地，外反应和内反应的条件如下：
（1）外反应条件如下：
反应程序：
预变性：94℃ 3min；
第一循环阶段：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共5个循环；
第二循环阶段：89.7℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共B个循环；
第三循环阶段：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共C个循环；
后延伸：72℃ 7min。
其中，不同反应条件设置B与C循环数分别为0：45、10：35、15：30、20：25、25：20、45：0（最终选择25:20作为最终实验反应条件）。
反应体系同上。
（2）内反应条件：
预变性：94℃ 3min；
循环阶段：94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 45s，共40~50个循环；
后延伸：72℃ 7min。
反应体系同上。
PCR产物纯化以及测序反应的相关反应体系与反应条件同实施例2。
2、将相同浓度（20ng/ul）突变型与野生型标准样品基因组DNA按0%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、100%比例混合作为实验样品。采用不同巢式复合PCR反应条件和常规PCR反应条件平行扩增此实验样品系列，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定所得扩增产物，并对产物进行测序分析。
另外，利用EGFR基因T790M突变扩增阻滞系统检测试剂盒（厦门艾德，ARMS法）平行检测本实验样品系列。
3、结果
以所设计的巢式PCR扩增引物（内、外引物）结合复合反应条件扩增T790M野生型、突变型标准样品，电泳鉴定可见清晰、单一242bp目的条带。利用相应内测序引物成功对PCR产物进行测序，野生型、突变型样品测序结果分别为野生型和T790M突变，T790M突变巢式复合COLD-PCR联合测序检测法已初步建立。
传统COLD-PCR目的片段扩增效果不佳，产物电泳仅在部分T790M突变比例较高的样品中可见清晰目的扩增条带，且伴随不同程度的非特异性扩增，而在野生型样品以及突变比例低的样品中未见清晰的扩增条带。
常规PCR与不同的巢式复合COLD-PCR均成功扩增突变比例为0%~100%的系列实验样品，电泳可见单一、清晰目的扩增条带，所有PCR产物均成功测序。常规PCR联合测序仅在突变比例等于或高于5%的实验样品中检出T790M突变，0：45的巢式复合COLD-PCR联合测序（即普通巢式PCR联合测序）也仅在突变比例等于或高于5%的实验样品中检出T790M突变，表明此条件下的巢式PCR并不能提高T790M突变检测的灵敏度。而10:35、15:30、20:25、25:20、45:0的巢式复合COLD-PCR联合测序分别在突变比例等于或高于1%、1%、0.5%、0.1%、0.1%的实验样品中检出T790M突变，也即与常规PCR联合测序相比其突变检测灵敏度分别提高了5倍、5倍、10倍、50倍、50倍，同时25:20的巢式复合COLD-PCR较45:0的巢式复合COLD-PCR对野生型样品的扩增效果更佳。故选择25:20的巢式复合COLD-PCR联合测序进行后续实验。
另外，ARMS法可在突变比例等于或高于0.1%的实验样品中检出T790M突变，提示其与本巢式复合COLD-PCR联合测序法具有相似的检测灵敏度。结果如附图1~2所示。
图1中，DNA Marker为天根公司DNA MarkerⅠ。0:45、25:20、45:0的巢式复合COLD-PCR扩增不同T790M突变比例但DNA浓度均为20ng/ul的系列样品。45:0巢式复合COLD-PCR（即巢式复合COLD-PCR）外扩增产物琼脂糖电泳仅在部分T790M突变比例较高的样品中可见清晰目的扩增条带且伴随不同程度的非特异性扩增，而所有样品的内扩增产物均可见单一目的条带，但野生型以及突变比例低的样品其扩增条带弱；25:20巢式复合COLD-PCR外扩增产物琼脂糖电泳可见不同程度非特异性扩增，内扩增产物则均可见单一、清晰目的条带；0:45巢式复合COLD-PCR（即普通巢式PCR）内、外扩增产物电泳均可见单一、清晰目的条带；提示单纯复合COLD-PCR不能对野生型样品进行有效的特异性扩增且对T790M突变型样品也存在不同程度的非特异性扩增，而巢式复合COLD-PCR则可对野生型和突变型样品实现有效的特异性扩增，其中25:20巢式复合COLD-PCR可实现野生型和突变型样品无差别的特异性扩增。
图2中，将相同浓度（20ng/ul）的T790M突变型与野生型标准样品DNA以不同比例稀释为系列样品。循环数比为10:35、15:30、20:25、25:20的不同巢式复合COLD-PCR平行检测该样品系列，随着COLD-PCR循环数的增加，巢式复合COLD-PCR的检测灵敏度由1%提升至0.1%，而常规PCR的检测灵敏度仅为5%。提示巢式复合COLD-PCR在一定范围内可有效提高T790M突变检测的灵敏度且灵敏度的提高程度可控。
综上结果显示，T790M突变巢式复合COLD-PCR联合测序检测法已建立。传统的COLD-PCR对于野生型扩增效率差，而本发明的巢式复合COLD-PCR可无差别扩增野生型与突变型样品且同样具有突变富集效果。而且，本发明的巢式复合COLD-PCR的突变富集效果可控且具有良好的突变检测灵敏度。
实施例5 巢式复合COLD-PCR检测下限和重复性评估
1、将相同浓度（20ng/ul）野生型、混合型（同浓度野生型与突变型样品基因组DNA1:1混合）和突变型样品基因组DNA用去离子水按2倍向下倍比稀释7个梯度至0.16 ng/ul，采用常规PCR条件、COLD-PCR条件和25:20巢式复合COLD-PCR条件平行扩增系列样品，每个样品设置3个平行扩增管。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并对产物进行测序检测。以野生型、混合型和突变型三种样品所有平行管电泳均检出明显目的条带且测序获得正确结果的最低样品稀释浓度为相应方法的检测下限并评估其重复性。
2、结果如表3所示。
表3常规PCR、COLD-PCR和巢式复合COLD-PCR的检测下限和重复性
注：“/”前的“+、-、±”为PCR产物电泳鉴定结果，分别代表可见清晰目的扩增条带、未见目的扩增条带和可见模糊且可疑的目的扩增条带。“/”后的“M、W、-”为PCR产物测序鉴定结果，分别代表测序鉴定为T790M突变、野生型和无测序信号。每个样品设置3个重复管。
结果显示，COLD-PCR扩增浓度为2.5ng/ul及以上混合型和突变型样品时，所有样品及其复管PCR产物电泳大部分可见清晰目的扩增条带，但均存在不同程度的非特异性扩增，同时所有PCR产物均成功测序，测序结果均为突变型。COLD-PCR扩增浓度为5ng/ul及以上野生型样品时，所有样品及其复管PCR产物电泳时目的条带模糊难以辨别且存在各类非特异性扩增，但所有PCR产物均成功测序，测序结果均为野生型。故COLD-PCR联合测序检测野生型和突变型样品时检测下限分别为5ng/ul 和2.5ng/ul，且重复性不佳。
而本发明的25:20巢式复合COLD-PCR与常规PCR扩增浓度为1.25ng/ul及以上野生型、混合型和突变型样品时，所有样品及其复管PCR产物电泳均可见单一、清晰目的扩增条带，且所有PCR产物均成功测序，测序结果与样品标准基因型相符。故两法检测下限均可达1.25ng/ul，且重复性良好。
综上所述，本发明的巢式复合COLD-PCR联合测序具有良好的检测下限和重复性。
实施例6 常规PCR联合测序和巢式复合COLD-PCR联合测序平行检测150例NSCLC组织样品
1、临床样品
收集2013年至2015年广州医科大学附属肿瘤医院非小细胞肺癌患者EGFR-TKI治疗前石蜡切片组织样品150例；性别为男80例，女70例；年龄25~81岁，中位年龄58岁。本研究经广州医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准。
2、基因组DNA提取：依试剂盒说明书提取样品DNA；微量紫外分光光度计测定DNA浓度。
3、分别利用常规PCR联合测序、以及本发明的15:30和25:20的巢式复合COLD-PCR联合测序平行检测150例非小细胞肺癌患者石蜡包埋组织样品T790M突变情况，比较三法对T790M突变以及20外显子其他突变的检出情况。同时分析样品的临床特征与T790M突变率以及检测方法的相关性。
另外，利用ARMS法验证性检测三法检出的所有突变样品和16例随机选取的检测结果为野生型的样品。
统计分析：率的比较用卡方检验，P＜0.05认为有显著性差异，统计分析使用19.0版SPSS。
4、结果
常规PCR联合测序，以及15:30与25:20巢式复合COLD-PCR联合测序均成功检出150例临床样品，其中143（95.33%）例样品检测结果一致，三法T790M突变阳性率分别为1.33%、5.33%和6.00%，20Ins突变率均为2.00%。25:20的巢式复合COLD-PCR联合测序法较常规PCR联合测序法检测T790M突变阳性率显著提高（P=0.032）。在穿刺标本中三种方法T790M突变阳性检出率存在显著性差异（P=0.044），巢式复合COLD-PCR联合测序法显著提高了穿刺标本的T790M突变阳性检出率。
在三法检出的共9例T790M突变阳性样品中，ARMS法检出7例阳性；在三法共同检出的3例20Ins突变样品和16例野生型样品中，ARMS法检测结果均为阴性。结果详见表4和表5。巢式复合COLD-PCR联合测序在检测临床样品检测时比传统常规PCR联合测序具有更好的灵敏度和相同的检测成功率。
表4三种方法检测150例NSCLC样品
注：“—”表示未检测
表5三个方法检测150例NSCLC样品EGFR基因20外显子突变结果与临床特征的关系
实施例7快速COLD-PCR可控突变富集效果的理论测算
1、理论上快速COLD-PCR只选择性扩增突变纯合双链，故可富集突变片段至100％达到饱和。同时PCR理论上每个循环可实现对目标片段2倍的扩增，如初始模板数为N0，扩增效率为P，C个循环后，体系中的产物数量N为N＝N0×(1+P)C，而P为100％时，则N＝N0×2C。假设快速COLD-PCR每个循环的突变富集效率和产物扩增效率均为100％(也即只扩增纯合突变片段，不扩增野生型片段)而原始样品中突变片段比例为D％(也即原始样品中突变、野生片段数量分别可计为D和100-D)，则第C个快速COLD-PCR循环时体系中的突变片段数量为D×2C、野生型片段数量仍为100-D。据此可通过以下公式计算在不同快速COLD-PCR循环数下体系中突变片段的比例也即其突变富集效果：第C个循环突变片段比例＝第C个循环突变片段数量/第C个循环总扩增片段数量＝第C个循环突变片段数量/第C个循环野生片段数量+第C个循环突变片段数量＝D×2C/[(100-D)+D×2C]。具体测算结果见表6。其显示伴随COLD-PCR循环数的增加，不同突变比例样品PCR扩增体系中的突变片段比例均逐渐增加直至达到100％饱和，饱和后再增加循环数并不能进一步提高突变片段比例。
2、实施例4的实验结果显示，随着快速COLD-PCR循环数由0增至25，本巢式复合COLD-PCR联合测序检测体系T790M突变富集效果相应增加，其检测灵敏度由5%逐渐提升至0.1%，但进一步增加循环数至45，检测灵敏度仍为0.1%未进一步增加，与理论测算值演变规律一致。提示快速COLD-PCR的突变富集效果在一定范围内通过调节快速COLD-PCR循环数可控。同时，实施例6利用循环数比为15:30和25:30巢式复合COLD-PCR联合测序法，检测150例样品时采取25个快速COLD-PCR循环数的测序体系T790M突变检出率更高，也提示本测序体系其突变富集效果通过调整快速COLD-PCR循环数可控。
表6 快速COLD-PCR理论突变富集效果测算
实施例8 巢式复合COLD-PCR检测试剂盒的组装
1、一种基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测试剂盒，其包含以下成分：
（1）包含有SEQ ID NO.1~4所述的引物组，还包含有SEQ ID NO.7~8所述的测序引物组。
（2）包含有外PCR反应液：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）10ul、外PCR前向引物（10pM/ul）1ul、外PCR后向引物（10pM/ul）1ul、纯水 7ul。
（3）包含有内PCR反应液：Dream Taq Green PCR Master Mix（2X）10ul、内PCR前向引物（10pM/ul）1ul、内PCR后向引物（10pM/ul）1ul、纯水 7ul。
（4）包含有野生型对照品：以人肺癌细胞株MSTO-211H的基因组DNA作为野生型对照品。
（5）包含有T790M突变型对照品：以人肺癌细胞株NCI-H1975的基因组DNA作为T790M突变型对照品。
（6）包含有SAP酶混合物：SAP酶1ul，EcoR I核酸外切酶1ul，去离子水3ul。
（7）包含有测序反应液：Bigdye3.1 1ul，测序引物（10pM/ul）1ul，去离子水2ul。
2、与本试剂盒各成分配套使用的反应条件
（1）巢式复合COLD-PCR反应条件
外反应程序如下：
预变性：94℃ 3min；
第一循环阶段：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共5个循环；
第二循环阶段：89.7℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共B个循环；
第三循环阶段：94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s，共C个循环；
后延伸：72℃ 7min。
其中，B和C循环数比分别为10：35、15：30、20：25、25：20或总循环数为45内的任意B和C不为0的循环数比（优选地，所述B和C循环数比为25：20）。
所述内反应程序如下：
预变性：94℃ 3min；
循环阶段：94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 45s，共40个循环；
后延伸：72℃ 7min。
（2）PCR产物SAP酶纯化反应条件：37℃1h，80℃15min。
（3）测序反应条件：96℃1 min；96℃10s、50℃5s、60℃4 min，25个循环；12℃恒温。
3、该试剂盒检测实验步骤：先利用已提取好的组织样品基因组DNA做巢式复合COLD-PCR（先进行外反应，再进行内反应），再行PCR产物电泳鉴定，当电泳鉴定可见清晰目的条带时行PCR产物SAP酶纯化，其后做测序反应，接着将测序产物纯化上机，最后行序列比对与结果分析。
综上所述，本发明拟建立一种具有可控突变富集效应的巢式复合COLD-PCR结合测序法用于临床样品的T790M突变检测。以肺癌MSTO-211H、NCI-H1975细胞为T790M突变野生型和突变型标准样品，通过引物设计、Tc值筛选以及确认实验确定Tc为89.7℃，利用此Tc建立了可富集T790M突变的巢式复合COLD-PCR测序检测体系。
本体系应用巢式PCR模式，其外扩增采取先快速COLD-PCR后常规PCR的复合模式，其内扩增采用常规PCR模式。在外扩增总循环数为45的情况下通过在10:35至25:20范围内调整外扩增体系中快速COLD-PCR和常规PCR的循环数配比实现了5~50倍的T790M突变富集效果，灵敏度达0.1%与ARMS法相当，且可无差别检出T790M野生型、突变型样品并能检出扩增子上20Ins突变。本体系检测下限达1.25 ng/ul且重复性良好（而普通的COLD-PCR联合测序体系检测野生型和突变型样品的检测下限分别为5ng/ul和2.5ng/ul且重复性不佳）。应用循环数比例为15:30和25:20的巢式复合COLD-PCR联合测序与常规PCR联合测序平行检测150例非小细胞肺癌组织样本，结果符合率为95.33%（143/150）（即143例样品检测结果一致），T790M突变阳性率分别为 5.33%、6.00%和1.33%，25:20的巢式复合COLD-PCR联合测序显著提高了T790M突变的阳性检出率（P=0.032），且三法均一致检出3例20Ins突变。
综上所述，本发明构建的巢式复合COLD-PCR联合测序是一种简单、灵敏、高效的T790M突变检测方法，是一种突变富集效果可控的突变富集方法，可在突变富集效果可控的情况下灵敏的检出T790M突变且能同时正常检出野生型和20Ins型突变样品适用于临床样品的检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学附属肿瘤医院
<120> 一种基于巢式复合COLD-PCR的T790M突变检测方法
<130>
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 外引物对的前向引物
<400> 1
gtccctgtgc taggtctt 18
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 外引物对的反向引物
<400> 2
ccccatggca aactc 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 内引物对的前向引物
<400> 3
atgcgaagcc acact 15
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 内引物对的反向引物
<400> 4
tctcccttcc ctgattac 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 外测序引物对的前向引物
<400> 5
tcatgcgtct tcacctgg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 外测序引物对的反向引物
<400> 6
cagaccgcat gtgaggat 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 内测序引物对的前向引物
<400> 7
ccctccctcc aggaagcc 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 内测序引物对的反向引物
<400> 8
cccttccctg attacctttg c 21

Claims (4)

1.一组基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测引物组，其特征在于，所述引物组包括外引物对和内引物对；所述外引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.1~2所示；所述内引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.3~4所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括外测序引物对和内测序引物对；所述外测序引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.5~6所示，所述内测序引物对的前向引物和后向引物分别如SEQ ID NO.7~8所示。
3.一种基于巢式复合COLD-PCR联合测序法的EGFR基因T790M突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1或权利要求2所述引物组。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含有野生型对照品、T790M突变型对照品、外PCR反应液、内PCR反应液、SAP酶混合物、测序反应液。
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