CN113493848A - 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法 - Google Patents

一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113493848A
CN113493848A CN202110836869.XA CN202110836869A CN113493848A CN 113493848 A CN113493848 A CN 113493848A CN 202110836869 A CN202110836869 A CN 202110836869A CN 113493848 A CN113493848 A CN 113493848A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mtb
nano
drug
gyrb
rpsl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110836869.XA
Other languages
English (en)
Inventor
谷红仓
陶春豪
许佩松
王云飞
车仙荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Shengting Medical Laboratory Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Shengting Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Shengting Medical Technology Co ltd filed Critical Hangzhou Shengting Medical Technology Co ltd
Priority to CN202110836869.XA priority Critical patent/CN113493848A/zh
Publication of CN113493848A publication Critical patent/CN113493848A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，结核分枝杆菌插耐药相关基因rpoB、katG、‑15 inhA、pncA、embB、rpsL、gyrA、gyrB的特异性引物；步骤二，得到8对含有特定碱基序列的引物，再混合形成引物池；步骤三，合成barcode引物；步骤四，提取基因组DNA；步骤五，第一轮扩增并纯化；步骤六，第二轮扩增；步骤七，构建测序文库并纯化；步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析；属于分子生物学领域，采用本发明的方法能够得知6种临床常见抗结核药物的耐药突变情况，检测快速、准确、全面。

Description

一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法
技术领域
本发明涉及分子生物学，特别是一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法。
背景技术
耐药结核病（Drug-resistant tuberculosis，DR-TB）是指结核分枝杆菌（MTB）对于抗结核药物耐受而表现出抗结核药物治疗效果降低或者失效。耐药结核病在结核患者中占据了很大一部分比重，耐多药结核病（MDR-TB）与广泛耐药结核病（XDR-TB）已经成为临床亟待解决的难题之一。
对于抗结核药物，临床最常用以及效果最好的主要是一线药物利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素以及二线药物氟喹诺酮类。结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐药性的主要原理为，当某种药物耐药相关的靶基因中的某个碱基位点发生了突变，可导致其所对应的密码子编码的氨基酸发生改变，使结核分枝杆菌对相应的药物产生耐药作用。市场一直在寻找对这6种药物产生耐药相关的基因突变位点的靶基因组合，能够实现快速、准确、全面的检测，本发明解决这样的问题。
市场通常采用探针熔解曲线法、实时荧光定量PCR技术分析突变，但是通常只能检测局限的几种位点突变，且不能报告具体的突变类型。市场需要一种技术能够直接获得MTB耐药相关基因的DNA序列，分析目标基因所有突变情况；本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，本发明检测结核分枝杆菌8种耐药相关基因rpoB、katG、-15 inhA、pncA、embB、rpsL、gyrA、gyrB目标序列，从而得知6种临床常见抗结核药物的耐药突变情况，检测快速、准确、全面。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，包括如下步骤：
步骤一，结核分枝杆菌插耐药相关基因rpoB、katG、-15 inhA、pncA、embB、rpsL、gyrA、gyrB的特异性引物MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R、MTB-katG-F、MTB-katG-R、MTB-inhA-F、MTB-inhA-R、MTB-pncA-F、MTB-pncA-R、MTB-embB-F、MTB-embB-R、MTB-rpsL-F、MTB-rpsL-R、MTB-gyrA-F、MTB-gyrA-R、MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R，扩增产物为445-775 bp；
步骤二，在正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，在反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到含有特定碱基序列的引物Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-katG-F、Nano-MTB-katG-R、Nano-MTB-inhA-F、Nano-MTB-inhA-R，Nano-MTB-pncA-F、Nano-MTB-pncA-R，Nano-MTB-embB-F、Nano-MTB-embB-R、Nano-MTB-rpsL-F、Nano-MTB-rpsL-R、Nano-MTB-gyrA-F、Nano-MTB-gyrA-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R；合成这8对含有特定碱基序列的引物，再将这8对引物混合，形成引物池；
步骤三，合成第二轮扩增需要使用的barcode 引物；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，用引物池进行第一轮扩增并纯化；
步骤六，用Barcode引物进行第二轮扩增并给各个样本加上不同的Barcode标签；
步骤七，构建测序文库并纯化；
步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析。
进一步的，步骤一中的引物MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R、MTB-katG-F、MTB-katG-R、MTB-inhA-F、MTB-inhA-R、MTB-pncA-F、MTB-pncA-R、MTB-embB-F、MTB-embB-R、MTB-rpsL-F、MTB-rpsL-R、MTB-gyrA-F、MTB-gyrA-R、MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ01、SEQ02、SEQ03、SEQ04、SEQ05、SEQ06、SEQ07、SEQ08、SEQ09、SEQ10、SEQ11、SEQ12、SEQ13、SEQ14、SEQ15、SEQ16。
进一步的，步骤二中的引物Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-katG-F、Nano-MTB-katG-R、Nano-MTB-inhA-F、Nano-MTB-inhA-R，Nano-MTB-pncA-F、Nano-MTB-pncA-R，Nano-MTB-embB-F、Nano-MTB-embB-R、Nano-MTB-rpsL-F、Nano-MTB-rpsL-R、Nano-MTB-gyrA-F、Nano-MTB-gyrA-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ17、SEQ18、SEQ19、SEQ20、SEQ21、SEQ22、SEQ23、SEQ24、SEQ25、SEQ26、SEQ27、SEQ28、SEQ29、SEQ30、SEQ31、SEQ32。
进一步的，步骤二中， Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-katG-F、Nano-MTB-katG-R、Nano-MTB-inhA-F、Nano-MTB-inhA-R，Nano-MTB-pncA-F、Nano-MTB-pncA-R，Nano-MTB-embB-F、Nano-MTB-embB-R、Nano-MTB-rpsL-F、Nano-MTB-rpsL-R、Nano-MTB-gyrA-F、Nano-MTB-gyrA-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R这8对引物按照浓度比1：1：1.5：2：1：1：0.8：0.8混合形成引物池。
进一步的，步骤五中用引物池进行第一轮扩增的反应总体系包括：2×PCR mix 25μl，引物池 5μl，基因组DNA 50 ng，ddH2O补至50μl；
反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸15s，20个循环；95 ℃变性15s ，62 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
进一步的，步骤六中用Barcode引物进行第二轮扩增的反应总体系包括：2×PCRmix 25μl，Barcode 2μl，第一次扩增纯化后产物21μl，ddH2O补至50μl；
反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
进一步的，步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括：
（1）pooling：将第二次扩增后的纯化产物进行pooling；
（2）末端修复、加A尾：总体系为：pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix 15μl；反应程序为，20 ℃ 反应15 min，65 ℃终止反应 15 min，4 ℃保存；
（3）末端修复进行磁珠纯化；
（4）接头连接的总体系为：末端修复纯化后产物25μl，5×Ligation Buffer 10μl，T4 Rapid DNA Ligase 5μl，Adapter Mix 1μl，ddH2O 9μl；反应程序为，20 ℃ 反应15min，4 ℃保存；
（5）将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库。
进一步的，步骤八中使用Nanopore公司的MinION测序仪，测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9进行纳米测序仪测序。
进一步的，步骤八中使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析的具体步骤包括：
（a） 芯片诱发：配置诱发剂后诱发；
诱发剂为：15μl FLT，500μl FB， 200μl 去酶水；
（b）上机文库点样：配置上机文库后加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序；
上机文库为：加入18.8μl SQB，12.8 μl LB，200 ng DNA文库，然后加入ddH2O补充至47μl；
（c）数据下机后，通过对下机数据进行质控分析：将碱基识别错误率在99 %以下的序列进行过滤，然后将去除接头及Barcode序列后长度在400 bp以下以及800 bp以上的序列进行过滤，最后将合格的序列与结核分枝杆菌基因组序列进行比对；
（d）通过与数据库中的耐药相关基因的常见突变位点的比对分析，可以得到样本中常见耐药突变位点的突变情况。
采用上述技术方案后，本发明的有益之处在于：
本发明设计8种耐药相关基因的目标区域的扩增引物，可以同时检测6种药物，通过序列比对，能对核苷酸突变进行分析，报告具体突变类型以及突变比例，操作简便，具备高通量、敏感、准确全面；这是目前市场上的分子检测手段所不具备的能力；
本发明对多重PCR的引物池浓度比例进行调整，使得最终每个靶基因区域测序都能产生均一性较高的测序数据量；
本发明构建Nanopore扩增子建库测序方法，使PCR得到的扩增子能有效地通过MinION测序仪的纳米孔，从而获得结核分枝杆菌耐药基因数据结果，纳米孔测序仪MinION小巧灵活，可以随时随地实时测序，最快数十分钟即可获得目标序列。最快8小时即可完成从DNA的扩增到数据分析，其他平台的检测如illumina二代测序需要1-2天时间），灵活简便，准确灵敏。
附图说明
图1为本发明DNA扩增与文库构建的流程示意图；
图2为本发明利福平耐药相关突变碱基检出结果示意图（横坐标为不同混样方法对应的Barcode编号，纵坐标为利福平耐药突变序列占总序列（测序获得的未突变序列与突变序列之和）的比例）。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
根据如下的基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法验证本发明的技术效果，包括如下步骤：
步骤一：设计结核分枝杆菌插耐药相关基因rpoB、katG、-15 inhA、pncA、embB、rpsL、gyrA、gyrB目标序列引物，扩增产物为445-775 bp。引物序列信息见表1。
结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚单位的编码基因rpoB基因，是利福平的药物作用靶标。过氧化氢酶还原酶的编码基因katG基因、烯酰基运载蛋白还原酶的编码基因inhA的-15调节区，分别是异烟肼的药物活化位点以及药物作用靶标。吡嗪酰胺酶的编码基因pncA基因，是吡嗪酰胺的药物活化位点。S12核糖体蛋白的编码基因rpsL基因，是链霉素的药物作用靶标。阿拉伯糖基转移酶的编码基因embB基因，是乙胺丁醇的药物作用靶标。DNA旋转酶A、B的编码基因gyrA、gyrB基因，是氟喹诺酮类药物的作用靶标。本发明选取这样的组合在检测结果全面，准确灵敏高上具有协同作用。
表1 结核分枝杆菌耐药相关基因特异性引物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
步骤二，在上述正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，具体见表2。加上特定的序列是为了在使用Barcode引物进行二次扩增时使Barcode引物与这些特定序列结合从而进行PCR扩增，最终得到具有Barcode标签信息的扩增产物，从而在数据分析时能对不同样本进行区分。
表2含特定碱基序列的引物
Figure 992214DEST_PATH_IMAGE002
合成含特定碱基序列的8对引物（100 µM），将8对引物混合形成引物池，引物池的浓度比例为1：1：1.5：2：1：1：0.8：0.8。本实施例中的引物浓度比例并非唯一，一般来说，当PCR反应体系中的引物浓度在0.1-0.5µM时均能达到实验目的。
步骤三，合成Nanopore公司的二轮扩增barcode 引物，共96种（这里只合成了前12种）；具体见表3。
表3 Barcode引物
Figure 904762DEST_PATH_IMAGE004
步骤四，结核分枝杆菌阳性样本耐药相关基因目标序列第一轮扩增与产物纯化；
PCR获得扩增子与文库构建流程见图1
Figure DEST_PATH_IMAGE005
使用混好的引物池对结核样本DNA进行PCR扩增（命名为1、2、3、4）：反应总体系 50μl，其中2×PCR mix（Vazyme）25μl，引物池 5μl，基因组DNA 50 ng，ddH2O补至50μl。反应 程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，20个循环；95 ℃变性15s ，62 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保 存。
Figure 77642DEST_PATH_IMAGE006
在50μl PCR产物加入35μl AMpure XP Beads，吹打混匀后室温静置5 min；置 于磁力架上，待2-5 min液体澄清后弃上清；加入200 μl 新配的80%乙醇，磁力架上静置30 s后弃上清，重复一次；吸干净残留的乙醇，开盖室温晾干约5min，待磁珠干燥即加入23μl ddH2O洗脱DNA；吹打混匀后室温静置3 min，吸取21μl 用于第二次扩增。
步骤五，第二次扩增，给样本加上不同的Barcode标签
Figure 535168DEST_PATH_IMAGE005
用Barcode引物进行PCR扩增：反应总体系50μl，其中2×PCR mix（Vazyme）25μ l，Barcode 2μl，第一次扩增纯化后产物21μl，ddH2O补至50μl。反应程序为：95 ℃ 预变性 5min；95 ℃变性15s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
Figure 411857DEST_PATH_IMAGE006
磁珠纯化方法与实施例2中的方法完全相同。
步骤六：测序文库的构建、纯化：
Figure 437582DEST_PATH_IMAGE005
pooling：将第二次扩增后的纯化产物按照每个样本100 ng进行pooling， pooling后总体积不超过50 μl，不足50 μl的用ddH2O补充至50 μl。
Figure 769862DEST_PATH_IMAGE006
末端修复、加A尾：总体系为65μl，pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix （Vazyme）15μl。反应程序为，20 ℃ 反应15 min，65 ℃终止反应 15 min，4 ℃保存。
Figure 296658DEST_PATH_IMAGE007
末端修复纯化，在65μl PCR产物加入52μl AMpure XP Beads，之后纯化方式与 实施例2 中的纯化方法相同，最后洗脱DNA时用27μl ddH2O洗脱，取25μl用于接头连接。
Figure 293433DEST_PATH_IMAGE008
接头连接：总体系为50μl，末端修复纯化后产物25μl，5×Ligation Buffer （NEB）10μl，T4 Rapid DNA Ligase（NEB）5μl，Adapter Mix（Nanopore）1μl，ddH2O 9μl。反应 程序为，20 ℃ 反应15 min，4 ℃保存。
Figure 349114DEST_PATH_IMAGE009
接头连接产物纯化：在50 μl 接头连接产物中加入35μl AMpure XP Beads，吹 打混匀后室温静置5 min；置于磁力架上，待2-5 min液体澄清后弃上清；加入200μl SFB （Nanopore），磁力架上静置30 s后弃上清，重复一次；吸干净残留的乙醇，开盖室温晾干约 5min，待磁珠干燥即加入15μl ddH2O洗脱DNA；吹打混匀后室温静置3 min，吸取13μl 即得 到终文库。
步骤七：
使用Nanopore公司的MinION测序仪测序（测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9）
Figure 431339DEST_PATH_IMAGE005
芯片诱发：
诱发剂的配制：取一个1.5 ml EP管，加入15μl FLT，500μl FB，然后加入200μl 的去酶水，吹打混匀。
诱发：将已质检完毕的芯片插入到上机机器中，打开加诱发试剂的孔，用1000 μl的移液枪，吸取450 μl的诱发剂，加入诱发剂前先调小一点量程，使枪尖带有小液珠，插入孔中，调小量程使液体缓缓进入芯片，直到不能调小量程为止。诱发剂加入完毕后，关闭孔洞静置5min。接着打开孔洞，按照上一步方法继续加入200 μl的诱发剂。
Figure 371613DEST_PATH_IMAGE006
上机文库点样：
上机文库的配置：取一个EP管，加入18.8μl SQB，12.8μl LB，200 ng DNA文库，然后加入ddH2O补充至47μl，吹打混匀。
加样：打开加样孔，用100μl的移液枪，吸取47μl的上机文库，加样时，枪尖悬空在加样孔上方，缓慢按动移液枪，确保上机文库一滴一滴地加入。加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序。每个样本数据量达到200K即可停止测序。
Figure 957315DEST_PATH_IMAGE007
数据下机后，过滤接头序列等无效数据：将碱基识别错误率在99 %以下的序列 进行过滤，然后将去除接头及Barcode序列后长度在400 bp以下以及800 bp以上的序列进 行过滤。最后将合格的序列与结核分枝杆菌基因组序列进行比对，通过与数据库中的耐药 相关基因的常见突变位点的比对分析，可以得到样本中常见耐药突变位点的突变情况。
实验一：
对4例结核阳性样本使用本发明进行了结核耐药基因突变检测（编号1，2，3，4），有一例样本未检测到耐药基因相关突变，三例样本检测到了耐药基因相关突变，结果见表5。（注：第3列916A>G即embB基因的916位碱基由A突变成了G，第4列甲硫氨酸306缬氨酸即前述突变导致embB基因的第306位密码子所编码的氨基酸由甲硫氨酸变成了缬氨酸）。另外，在实施例中，未检测到氟喹诺酮类药物耐药相关的gyrB基因的突变，是因为gyrB基因的突变频率较低，但该基因也会产生耐药相关突变如苏氨酸511天冬酰胺、脯氨酸592丝氨酸。
表5 4例样本结核耐药基因突变鉴定结果
Figure 449477DEST_PATH_IMAGE010
实验二，耐药突变株的检测限实验：
将1例利福平敏感（编号1）和1例利福平耐药（编号2，丝氨酸450亮氨酸）的结核分枝杆菌病DNA按照表6所述方法混合后使用本发明进行检测。结果如图2所示。
表6 两例样本按不同比例混合（使用7个Barcode标签对不同混合方式加以区分）
Figure 18998DEST_PATH_IMAGE011
结果分析：由表6和图2可知：本发明检出的导致利福平耐药的rpoB基因450位密码子突变序列占比与实验中混样比例能够保持良好的符合关系。说明当某个耐药位点的突变频率在10%以上时，本发明对于结核分枝杆菌耐药株的检测具有准确的报告结果。
实验三，检测灵敏性实验：
将已知拷贝数（10000 CFU/ml）的利福平耐药（丝氨酸450亮氨酸）结核DNA进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的结核DNA（1000 CFU/ml、100 CFU/ml、10 CFU/ml、1CFU/ml）。然后用本发明所述方法进行耐药检测，耐药突变鉴定结果如表7所示。
表7 本发明灵敏性验证结果
Figure 72885DEST_PATH_IMAGE012
结果分析：表7表明本发明的检测限可低至100 CFU/ml，能达到常规的分子检测方法的普遍检测限（100 CFU/ml）。
实验四，检测准确性实验：
选取8例结核分枝杆菌DNA，其中7例为已知耐药突变，1例为无耐药相关突变。具体见表8。
表8 本发明准确性验证结果
Figure 781602DEST_PATH_IMAGE013
实验结果分析：
由表8可知：用本发明对这8例样本进行结核分枝杆菌耐药检测结果与已知耐药突变情况达到100%的一致性，说明了本发明对于结核耐药突变检测极高的准确性。
本发明设计8种耐药相关基因的目标区域的扩增引物，可以同时检测6种药物，通过序列比对，能对核苷酸突变进行分析，报告具体突变类型以及突变比例，操作简便，具备高通量、敏感、准确全面的优点；目前市场上的分子检测手段不具备这样的能力，具有广大的市场价值。
除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。
序列表
<110> 杭州圣庭医疗科技有限公司
<120> 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法
<141> 2021-07-23
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
aatatgtggc ccgctagcac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acacgttctc gacgctaacc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gatgtgctct atcggggcaa g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtctccgtgg atcagcatgt a 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tggccagata gggttccgac atg 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atgacgaatg cgaccgcgga g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ccatcagtgc atcccggttc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
accgtatatc tctggctgcc 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtgatatacg gcttgctgct ct 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ctagtagtag cgcaggatct cggta 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gccgatcaaa cagaacgtca a 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
tccgcttcaa ctgaacgttg t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ggatcgaaca ggttgacctc 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gatactccag cgcacagaa 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ccgttgtgat cacggtgcaa g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
agacgcatgt acggccgaat g 21
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
aggtcttcac gatacgtcga gaatatgtgg cccgctagca c 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gtccaatcag ttgcagcttc agacacgttc tcgacgctaa cc 42
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
aggtcttcac gatacgtcga ggatgtgctc tatcggggca ag 42
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gtccaatcag ttgcagcttc aggtctccgt ggatcagcat gta 43
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
aggtcttcac gatacgtcga gtggccagat agggttccga catg 44
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
gtccaatcag ttgcagcttc agatgacgaa tgcgaccgcg gag 43
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
aggtcttcac gatacgtcga gccatcagtg catcccggtt c 41
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gtccaatcag ttgcagcttc agaccgtata tctctggctg cc 42
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
aggtcttcac gatacgtcga ggtgatatac ggcttgctgc tct 43
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gtccaatcag ttgcagcttc agctagtagt agcgcaggat ctcggta 47
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
aggtcttcac gatacgtcga ggccgatcaa acagaacgtc aa 42
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gtccaatcag ttgcagcttc agtccgcttc aactgaacgt tgt 43
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
aggtcttcac gatacgtcga gggatcgaac aggttgacct c 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
gtccaatcag ttgcagcttc aggatactcc agcgcacaga a 41
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
aggtcttcac gatacgtcga gccgttgtga tcacggtgca ag 42
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
gtccaatcag ttgcagcttc agagacgcat gtacggccga atg 43
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
aagaaagttg tcggtgtctt tgtg 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
tcgattccgt ttgtagtcgt ctgt 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
gagtcttgtg tcccagttac cagg 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ttcggattct atcgtgtttc ccta 24
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
cttgtccagg gtttgtgtaa cctt 24
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
ttctcgcaaa ggcagaaagt agtc 24
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
gtgttaccgt gggaatgaat cctt 24
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
ttcagggaac aaaccaagtt acgt 24
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
aactaggcac agcgagtctt ggtt 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
aagcgttgaa acctttgtcc tctc 24
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
gtttcatcta tcggagggaa tgga 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
caggtagaaa gaagcagaat cgga 24

Claims (9)

1.一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，结核分枝杆菌插耐药相关基因rpoB、katG、-15 inhA、pncA、embB、rpsL、gyrA、gyrB的特异性引物MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R、MTB-katG-F、MTB-katG-R、MTB-inhA-F、MTB-inhA-R、MTB-pncA-F、MTB-pncA-R、MTB-embB-F、MTB-embB-R、MTB-rpsL-F、MTB-rpsL-R、MTB-gyrA-F、MTB-gyrA-R、MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R，扩增产物为445-775 bp；
步骤二，在正向引物的5’端加上AGGTCTTCACGATACGTCGAG碱基序列，在反向引物的5’端加上GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG碱基序列，得到含有特定碱基序列的引物Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-katG-F、Nano-MTB-katG-R、Nano-MTB-inhA-F、Nano-MTB-inhA-R，Nano-MTB-pncA-F、Nano-MTB-pncA-R，Nano-MTB-embB-F、Nano-MTB-embB-R、Nano-MTB-rpsL-F、Nano-MTB-rpsL-R、Nano-MTB-gyrA-F、Nano-MTB-gyrA-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R；合成这8对含有特定碱基序列的引物，再将这8对引物混合，形成引物池；
步骤三，合成第二轮扩增需要使用的barcode 引物；
步骤四，提取基因组DNA；
步骤五，用引物池进行第一轮扩增并纯化；
步骤六，用Barcode引物进行第二轮扩增并给各个样本加上不同的Barcode标签；
步骤七，构建测序文库并纯化；
步骤八，使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中的引物MTB-rpoB-F、MTB-rpoB-R、MTB-katG-F、MTB-katG-R、MTB-inhA-F、MTB-inhA-R、MTB-pncA-F、MTB-pncA-R、MTB-embB-F、MTB-embB-R、MTB-rpsL-F、MTB-rpsL-R、MTB-gyrA-F、MTB-gyrA-R、MTB-gyrB-F、MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ01、SEQ02、SEQ03、SEQ04、SEQ05、SEQ06、SEQ07、SEQ08、SEQ09、SEQ10、SEQ11、SEQ12、SEQ13、SEQ14、SEQ15、SEQ16。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，所述步骤二中的引物Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-katG-F、Nano-MTB-katG-R、Nano-MTB-inhA-F、Nano-MTB-inhA-R，Nano-MTB-pncA-F、Nano-MTB-pncA-R，Nano-MTB-embB-F、Nano-MTB-embB-R、Nano-MTB-rpsL-F、Nano-MTB-rpsL-R、Nano-MTB-gyrA-F、Nano-MTB-gyrA-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R的序列分别是：SEQ17、SEQ18、SEQ19、SEQ20、SEQ21、SEQ22、SEQ23、SEQ24、SEQ25、SEQ26、SEQ27、SEQ28、SEQ29、SEQ30、SEQ31、SEQ32。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤二中，所述Nano-MTB-rpoB-F、Nano-MTB-rpoB-R、Nano-MTB-katG-F、Nano-MTB-katG-R、Nano-MTB-inhA-F、Nano-MTB-inhA-R，Nano-MTB-pncA-F、Nano-MTB-pncA-R，Nano-MTB-embB-F、Nano-MTB-embB-R、Nano-MTB-rpsL-F、Nano-MTB-rpsL-R、Nano-MTB-gyrA-F、Nano-MTB-gyrA-R、Nano-MTB-gyrB-F、Nano-MTB-gyrB-R这8对引物按照浓度比1：1：1.5：2：1：1：0.8：0.8混合形成引物池。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤五中用引物池进行第一轮扩增的反应总体系包括：2×PCR mix 25 μl，引物池 5 μl，基因组DNA 50 ng，ddH2O补至50 μl；
反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，20个循环；95 ℃变性15s ，62 ℃退火60s，72 ℃延伸15s，20个循环；循环结束后72 ℃延伸5min，4 ℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
6.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤六中用Barcode引物进行第二轮扩增的反应总体系包括：2×PCR mix 25μl，Barcode 2μl，第一次扩增纯化后产物21μl，ddH2O补至50μl；
反应程序为：95 ℃ 预变性5min；95 ℃变性15s ，62 ℃退火15s，72 ℃延伸30 s，12个循环；循环结束后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；
纯化采用磁珠纯化。
7.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括：
（1）pooling：将第二次扩增后的纯化产物进行pooling；
（2）末端修复、加A尾：总体系为：pooling完的DNA溶液50μl，末端修复mix 15μl；反应程序为，20 ℃ 反应15 min，65 ℃终止反应 15 min，4 ℃保存；
（3）末端修复进行磁珠纯化；
（4）接头连接的总体系为：末端修复纯化后产物25μl，5×Ligation Buffer 10μl，T4Rapid DNA Ligase 5μl，Adapter Mix 1μl，ddH2O 9μl；反应程序为，20 ℃ 反应15 min，4℃保存；
（5）将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库。
8.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤八中使用Nanopore公司的MinION测序仪，测序试剂盒：SQK-LSK109，测序芯片：R9进行纳米测序仪测序。
9.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法，其特征在于，步骤八中使用纳米测序仪测序，对数据进行质控分析后，进行数据分析的具体步骤包括：
（a） 芯片诱发：配置诱发剂后诱发；
所述诱发剂为：15μl FLT，500μl FB，200μl 去酶水；
（b）上机文库点样：配置上机文库后加样，加样完毕后，盖上加样孔的盖子，关闭诱发试剂孔，插上数据线，与上机电脑相连接，设置上机程序后开始测序；
所述上机文库为：加入18.8μl SQB，12.8μl LB，200 ng DNA文库，然后加入ddH2O补充至47μl；
（c）数据下机后，通过对下机数据进行质控分析：将碱基识别错误率在99 %以下的序列进行过滤，然后将去除接头及Barcode序列后长度在400 bp以下以及800 bp以上的序列进行过滤，最后将合格的序列与结核分枝杆菌基因组序列进行比对；
（d）通过与数据库中的耐药相关基因的常见突变位点的比对分析，可以得到样本中常见耐药突变位点的突变情况。
CN202110836869.XA 2021-07-23 2021-07-23 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法 Pending CN113493848A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110836869.XA CN113493848A (zh) 2021-07-23 2021-07-23 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110836869.XA CN113493848A (zh) 2021-07-23 2021-07-23 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113493848A true CN113493848A (zh) 2021-10-12

Family

ID=77996449

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110836869.XA Pending CN113493848A (zh) 2021-07-23 2021-07-23 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113493848A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113470747A (zh) * 2021-06-29 2021-10-01 首都医科大学附属北京胸科医院 结核杆菌耐药性分析结果的获取方法及装置
CN116875718A (zh) * 2023-09-07 2023-10-13 南京诺因生物科技有限公司 结核分枝杆菌耐药突变位点测序文库的构建方法及试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450877A (zh) * 2014-07-03 2015-03-25 北京圣谷同创科技发展有限公司 利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测
CN104531865A (zh) * 2014-12-24 2015-04-22 博奥生物集团有限公司 一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用
CN106811530A (zh) * 2017-02-27 2017-06-09 苏州百源基因技术有限公司 基于hrm技术检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒及引物
CN111172303A (zh) * 2019-12-31 2020-05-19 广州金域医学检验集团股份有限公司 一种结核杆菌耐药性检测试剂盒及结核杆菌耐药性检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450877A (zh) * 2014-07-03 2015-03-25 北京圣谷同创科技发展有限公司 利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物四个结核耐药基因检测
CN104531865A (zh) * 2014-12-24 2015-04-22 博奥生物集团有限公司 一种检测结核分枝杆菌耐药基因的试剂盒及其应用
CN106811530A (zh) * 2017-02-27 2017-06-09 苏州百源基因技术有限公司 基于hrm技术检测结核分枝杆菌耐药性的试剂盒及引物
CN111172303A (zh) * 2019-12-31 2020-05-19 广州金域医学检验集团股份有限公司 一种结核杆菌耐药性检测试剂盒及结核杆菌耐药性检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUSTIN O’GRADY: "基于纳米孔靶向测序的结核病耐药型快速检测方法", 《腾讯视频》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113470747A (zh) * 2021-06-29 2021-10-01 首都医科大学附属北京胸科医院 结核杆菌耐药性分析结果的获取方法及装置
CN113470747B (zh) * 2021-06-29 2024-04-26 首都医科大学附属北京胸科医院 结核杆菌耐药性分析结果的获取方法及装置
CN116875718A (zh) * 2023-09-07 2023-10-13 南京诺因生物科技有限公司 结核分枝杆菌耐药突变位点测序文库的构建方法及试剂盒
CN116875718B (zh) * 2023-09-07 2023-12-01 南京诺因生物科技有限公司 结核分枝杆菌耐药突变位点测序文库的构建方法及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106676182B (zh) 一种低频率基因融合的检测方法及装置
CN113493848A (zh) 一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法
CN108070658B (zh) 检测msi的非诊断方法
WO2018186930A1 (en) Method and kit for constructing nucleic acid library
CN108949757B (zh) 基于二代测序平台检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒和方法
CN111690748B (zh) 使用高通量测序检测微卫星不稳定的探针组、试剂盒及微卫星不稳定的检测方法
CN111206100A (zh) 一种检测egfr基因t790m位点突变的试剂盒和方法
CN113337576A (zh) 文库制备方法、试剂盒及测序方法
CN110846408A (zh) 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用
CN112195238B (zh) 一种扩增pkd1基因的引物组及试剂盒
CN113416769B (zh) 基于二代测序技术检测无对照样本的微卫星不稳定的方法、组合物和用途
CN116463408A (zh) 一种abo基因扩增引物、扩增体系、扩增方法、测序文库构建方法及测序方法
CN112592968B (zh) 高通量测序用分子标签接头及其合成方法与应用
CN107164365B (zh) 应用三代测序技术检测染色体端粒dna全长的方法
CN113215663B (zh) 一种基于高通量测序的胃癌靶向治疗基因组文库的构建方法及引物
CN113186291B (zh) 基于多重pcr的引物组和试剂盒
CN114277114A (zh) 一种扩增子测序添加唯一性标识符的方法及应用
CN110964844B (zh) 一种用于定性参苓白术散的引物、试剂盒及方法
CN112266963B (zh) 一种联合检测慢性粒细胞白血病检测试剂盒
CN111793623A (zh) 62个多等位snp-ngs的分型遗传标记组合物、试剂盒、鉴定体系以及分型方法
Shepel et al. Mapping of 55 new rat microsatellite markers from chromosome-specific libraries
CN111485024A (zh) 用于个体特征确认的引物组合、及其应用
CN107227368B (zh) 肠癌临床用药突变基因检测试剂盒
CN112831555B (zh) 一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用
CN109609694B (zh) 基于Illumina测序技术检测乙型肝炎分型及多耐药位点的试剂盒及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20230930

Address after: Room 101, Building 2, No. 366 Tongyun Street, Liangzhu Street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 311113

Applicant after: Hangzhou Shengting Medical Laboratory Co.,Ltd.

Address before: 311113 Room 301, building 11, No. 362, Tongyun street, Liangzhu street, Yuhang District, Hangzhou City, Zhejiang Province

Applicant before: Hangzhou Shengting Medical Technology Co.,Ltd.

TA01 Transfer of patent application right