CN112831555B - 一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用。所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。使用本发明的参考品进行文库构建，并且分别使用用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上、下游引物组进行两轮特异性扩增，能够准确、高效地检测α型地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用。
背景技术
地中海贫血(Thalassemia)是我国长江以南各省(区)发病率最高的一种单基因遗传病，主要类型是α和β地中海贫血，分别是由于α或β珠蛋白基因发生缺失或者点突变，使其编码的人α或β珠蛋白链缺失或不足，导致严重的溶血性贫血。当α-珠蛋白基因全部缺失(--/--，重型α-地贫)时，患者在胎儿时期发病，表现为重度贫血伴全身水肿等症状(HbBarts’hydropsfetalis，巴氏胎儿水肿综合征)。该疾病对胎儿来说是致命的，同时可能对母体带来严重甚至危及生命的并发症。
目前地中海贫血主要靠输血和去铁治疗维持，也可采用骨髓移植治疗手段，但代价十分昂贵，对患儿家庭带来沉重负担。通过产前诊断选择性流产受累胎儿是世界上公认的首选对策。因此，针对高风险地中海贫血胎儿的产前诊断是实现人群预防和控制的重要手段。随着DNA分析技术的不断发展，各种快速、简便的产前诊断方法被应用于地中海贫血的产前诊断。然而，传统获取胎儿遗传物质进行的产前诊断为有创性操作，即通过穿刺手术采集绒毛、羊水或脐带血，可能造成胎儿损伤、流产或宫内感染等风险。
相关研究发现妊娠母体血浆中存在胎儿DNA，基于此类胎儿遗传物质的产前诊断更安全，且易于被受试者接受，也避免了获取胎儿遗传物质的创伤性操作导致的不必要风险。随着无创产前检测技术应用于临床，单基因病无创产前诊断对于地中海贫血的防控具有重要意义。基于二代测序技术检测胎儿游离DNA进行地中海贫血无创产前筛查是本领域重要进展。利用二代测序技术对母体外周血浆中游离DNA进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，得到胎儿的遗传信息。
但目前该技术的发展受到参考品获取方面的限制，目前针对无创产前地中海贫血基因检测技术没有参考品，从而严重制约了相关产品研发和现有产品的质量控制。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测地中海贫血基因的参考品，能够根据胎儿DNA含量和地中海贫血基因位点的检测频率，获得母体和胎儿的基因型信息。
本发明还提出一种具有上述参考品的制备方法。
根据本发明的第一方面，提出了一种检测地中海贫血基因的参考品，所述参考品包括片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA。
在本发明的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA包括来源于地中海贫血基因杂合子、阴性母体组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸；所述片段化的胎儿基因组DNA包括来源于地中海贫血基因纯合突变、杂合子、阴性胎儿组织或外周血白细胞的基因组的片段化核酸。
在本发明的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA包括来源于母体组织或外周血的基因组的片段化核酸；片段化的胎儿基因组DNA包括来源于胎儿组织或外周血的基因组的片段化核酸。
在本发明的一些实施方式中，所述片段化的母体基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述片段化的胎儿基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变。
在本发明的一些实施方式中，片段化的母体DNA和片段化的胎儿DNA的片段大小为150-200bp。
在本发明的一些实施方式中，片段化的胎儿DNA的含量占参考品总量的5-30％(v/v)。
根据本发明的第二方面，提出了上述参考品的制备方法，所述制备方法如下步骤：
S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA；
S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化；
S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品，其中，片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的5-30％。
在本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，所述母体样本的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述胎儿样本的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变。
在本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，样本为人体组织或外周血。
在本发明的一些实施方式，基因组DNA的样本类型分为样本1-样本5，其中，样本1为α-地贫SEA位点为纯合突变(--SEA/--SEA)的胎儿组织样本，样本2为α-地贫SEA位点为杂合突变(--SEA/αα)的胎儿组织样本，样本3为α-地贫SEA位点为野生型(αα/αα，下同)的胎儿组织样本，样本4为α-地贫SEA位点为杂合突变(--SEA/αα)的女性的外周血样本，样本5为α-地贫SEA位点为野生型(αα/αα)的女性的外周血样本。
在本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组DNA提取采用基因组提取试剂盒Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit。
在本发明的一些实施方式，所述步骤S1中，基因组纯化采用试剂盒Genomic DNAClean&Concentrator-10进行纯化。
在本发明的一些实施方式，所述步骤S2中，基因组DNA片段化采用超声波细胞破碎仪破碎细胞。
在本发明的一些实施方式，所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功率70～80W，温度4～12℃，时间5～8min。
在本发明的一些实施方式，所述超声波细胞破碎仪采用的参数为超声波功75W，温度10℃，时间6min。
在本发明的一些实施方式，所述步骤S3中，所述参考品为R1-R5。
在本发明的一些实施方式，所述参考品R1由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本1片段化的胎儿DNA(--SEA/--SEA)组成；所述参考品R2由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本2片段化的胎儿DNA(--SEA/αα)组成；所述参考品R3由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本3片段化的胎儿DNA(αα/αα)组成；所述参考品R4由90％样本5片段化的母体DNA(αα/αα)和10％样本2片段化的胎儿DNA(--SEA/αα)组成；所述参考品R5由90％样本4片段化的母体DNA(--SEA/αα)和10％样本3片段化的胎儿DNA(αα/αα)组成。
本发明第三方面提供一种用于地中海贫血突变型与缺失型基因检测的引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.44所示的引物。
在本发明的一些实施方式，所述的引物组包括引物分组1、引物分组2，其中，所述引物分组1由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.22混合配制而成，所述引物分组2为SEQ IDNO.23～SEQ ID NO.44混合配制而成。
在本发明的一些实施方式，所述的引物组中上游特异性引物组1包括用于扩增α型地贫基因的上游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1；所述下游特异性引物组1包括用于扩增α型地贫基因的下游引物组1以及用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1；所述上游特异性引物组2包括用于扩增α型地贫基因的上游引物组2以及用于计算胎儿游离DNA比例的上游引物组2；所述下游特异性引物组2包括用于扩增α型地贫基因的下游引物组2以及计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2。
在本发明的一些实施方式，所述用于扩增α型地贫基因的上游引物组1序列如SEQID NO.1所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组1序列如SEQ IDNO.2-11所示；所述用于扩增α型地贫基因的下游引物组1序列如SEQ ID NO.12所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组1序列如SEQ ID NO.13-22所示。所述用于扩增α型地贫基因的上游引物组2序列如SEQ ID NO.23所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的上游引物组2序列如SEQ ID NO.24-33所示；所述用于扩增α型地贫基因的下游引物组2序列如SEQ ID NO.34所示；所述用于计算胎儿游离DNA比例的多个SNP位点的下游引物组2序列如SEQ ID NO.35-44所示。
在本发明的一些实施方式，所述的引物组中的上游引物和下游引物分别位于检测点左侧和右侧，同侧的特异性引物1的3’端和特异性引物2的5’端有10-15个碱基的重合，特异性引物1的5’端有生物素修饰，特异性引物2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列。
本发明第四方面提供一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，包括如下步骤：筛选SNP位点；提取孕妇血浆中游离DNA和上述参考品并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；对所述游离DNA和上述参考品进行文库测序；构建所述地贫基因上SNP位点的基因型，结合所述游离DNA和上述参考品文库测序信息，确定胎儿所述SNP位点相应的基因型。
在本发明的一些实施方式，所述参考品建库的起始DNA量可以为5ng～50ng，优选10～20ng。
在本发明的一些实施方式，所述孕妇血浆中游离DNA从2ml血浆中提取得到，游离DNA量为5ng～30ng。
在本发明的一些实施方式，所述DNA文库的构建方法包括：对母体外周血游离DNA连接带有特异标签序列和任选的样本标签序列的接头序列；使用预文库扩增引物序列对上一步的连接产物进行预文库扩增，其中所述预文库扩增引物序列与所述接头序列互补结合；将上一步得到的预文库分为上游预文库和下游预文库，分别使用上游特异性引物组1和下游特异性引物组1对所述上游预文库和下游预文库进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1；对所述上游特异性扩增产物1和下游特异性扩增产物1，分别使用上游特异性引物组2和下游特异性引物组2进行特异性扩增，分别得到上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2，将所述上游特异性扩增产物2和下游特异性扩增产物2混合后，使用两端的通用引物进行扩增，得到可上机测序的文库。
本发明第五方面上述参考品的应用，所述应用为上述参考品在制备用于检测地中海贫血试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测地中海贫血基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述的参考品。
在本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测地中海贫血基因的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.44所示的引物组。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于制备胎儿地中海贫血基因的无创产前检测试剂。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测地中海贫血基因的参考品，通过高通量测序技术，构建相应的DNA文库，本发明采用的建库方法中，检测位点不仅包括地中海贫血基因，还包括用于计算胎儿DNA比例的多个SNP位点，针对SNP位点也使用不同的引物进行两轮特异性扩增，能够高效、准确的计算胎源DNA含量，因此可以根据胎儿DNA含量和地中海贫血基因位点的检测频率，获得母体和胎儿的基因型信息；本发明通过孕妇外周血即可实现对胎儿基因型的准确检测，实现对地中海贫血无创产前检测，且本发明的方法所需的样本量少，仅需要2mL的外周血即可实现对样本的基因型准确检测；本发明特别针对地贫基因设计了高效的引物，以及计算胎儿DNA比例的多个SNP位点的引物。使用本发明的参考品进行文库构建，能够准确、高效地检测α型地贫基因突变，其结果与羊水穿刺检测分型一致，但安全性、无创性和高效性方面明显优于羊水穿刺检测。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例一中组织细胞和外周血白细胞的DNA的片段分布图，泳道1为Takara的100bp DNA Ladder，泳道2为样本1片段化核酸，泳道3为样本2片段化核酸，泳道4为样本3片段化核酸，泳道5为样本4片段化核酸，泳道6为样本5片段化核酸；
图2为本发明实施例二中孕妇外周血样本1的游离DNA的片段分布图；
图3为本发明实施例二中孕妇外周血样本2的游离DNA的片段分布图；
图4为本发明实施例二中孕妇外周血样本3的游离DNA的片段分布图；
图5为本发明实施例二中孕妇外周血样本4的游离DNA的片段分布图；
图6为本发明实施例二中孕妇外周血样本5的游离DNA的片段分布图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1参考品的制备
样本选择：样本1是α-地贫SEA位点为纯合突变(表示为--SEA/--SEA，下同)的胎儿组织样本，样本2是α-地贫SEA位点为杂合突变(表示为--SEA/αα，下同)的胎儿组织样本，样本3是α-地贫SEA位点为野生型(表示为αα/αα，下同)的胎儿组织样本，样本4是α-地贫SEA位点为杂合突变(--SEA/αα)的女性的外周血样本，样本5是α-地贫SEA位点为野生型(αα/αα)的女性的外周血样本。
1、基因组DNA提取
使用基因组提取试剂盒(Qiagen，Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)基因组DNA对样本1，样本2，样本3，样本4，样本5进行gDNA提取，操作步骤参照试剂盒的操作说明书。基因组DNA提取结束后，用基因组纯化试剂盒(ZYMO RESEARCH，Genomic DNA Clean&Concentrator-10)进行纯化，操作步骤参照试剂盒的操作说明书。纯化后的gDNA用Qubit核酸定量仪(Themo Fisher Scientific，Qubit2.0)进行定量。提取的核酸于-20℃保存，长期保存于-80℃。
2、基因组DNA片段化
使用covaris M220超声波破碎仪将样本1，样本2，样本3，样本4，样本5提取的基因组DNA进行片段化，基因组DNA放置于50ul的超声打断管中(microTUBE-50AFA FiberScrew-Cap)，根据仪器说明书将超声打断的时间设置为360秒(具体实验参数见表1)，以获得150bp-200bp的目的片段，得到片段化的母体DNA(样本4和样本5)和片段化的胎儿DNA(样本1，样本2和样本3)。
表1
| Temperature(℃) | 10 |
| Peak Incident Power(W) | 75 |
| Duty Factor | 10％ |
| Cycles per Burst | 200 |
| Treatment Time(s) | 360 |
片段化的核酸用2×Beckman Agencourt AMPure XP beads(100ul)进行纯化，Qubit2.0核酸定量仪进行定量。取适量片段化的核酸用2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳如图1所示，5个片段化的样本DNA主带在150-200bp之间。图1的Marker为100bp DNA Ladder。
3、参考品的配制
以胎儿DNA含量为10％进行配制。按照胎儿DNA：母体DNA的比例为1：9的比例将片段化的胎儿DNA(样本1，样本2和样本3)和片段化的母体DNA(样本4和样本5)按照不同基因型组合方式进行混合(具体见表2)，总共有五种类型的组合(按照排列组合有母体为野生型，胎儿为纯合突变的组合类型，但该种组合类型在遗传学上不成立，所以予以排除)，配制的参考品分别编号为R1，R2，R3，R4，R5，并根据胎儿DNA的含量计算出SEA位点的突变频率理论值(表2)。
表2
实施例2样本游离DNA的提取
实施例1中的五种基因型组合的孕妇外周血样本来源于合作医院的送检样本(这五例样本已经过羊水穿刺检测，分型结果已知)。对送检孕妇的外周血样本进行游离DNA的提取，文库构建，高通量测序，生物信息分析，分析出母亲和胎儿的基因型。五例孕妇外周血样本的基因型信息见表3。
表3
| 孕妇样本编号 | 母亲基因型 | 胎儿基因型 |
| S1 | --SEA/αα | --SEA/--SEA |
| S2 | --SEA/αα | --SEA/αα |
| S3 | --SEA/αα | αα/αα |
| S4 | αα/αα | --SEA/αα |
| S5 | αα/αα | αα/αα |
从孕妇外周血中提取游离DNA的流程如下：
1、从外周血中分离血浆：
(1)将装有孕妇外周血的采血管(约10ml)上下颠倒10次，放至预冷的大型离心机中，4℃，1600×g，离心10分钟。
(2)小心地将采血管从离心机中取出，放在15ml离心管架上。
(3)血样离心后，分为底部红细胞层，中间白细胞层(红白色薄层)以及上清血浆层；小心的将血浆转至1.5mL离心管中(血浆共3-4管)。
(4)最后将中间层的白细胞转至1.5mL离心管中。
(5)将3-4管血浆放入小型离心机中，室温，16000×g，离心10分钟。
(6)再次将血浆转至新的1.5mL离心管中(3-4管)。血浆于-20℃保存，长期保存置于-80℃。
2、血浆游离DNA提取：
采用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行血浆游离DNA的提取，提取血浆体积为2ml，提取结束后，Qubit2.0测定游离DNA的浓度，然后通过Bioanalyzer 2100(Agilent)电泳进行质控。五例孕妇血浆样本提取的游离DNA电泳图见图2-6，游离DNA的主峰在170bp左右。
实施例3DNA的文库构建及测序
为了对参考品和孕妇游离DNA的α-地贫SEA位点进行高通量测序，需要先对其进行文库的构建，文库构建采用本实验室的建库流程。参考品建库的起始DNA量可以为15ng。孕妇2ml血浆提取的游离DNA全部用于文库构建，游离DNA量为20ng。
本发明中使用的引物均为生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1、引物设计
(1)针对α地中海贫血基因--αSEA突变位点设计合成引物
上游引物和下游引物分别位于检测点左侧和右侧。同侧的特异性引物1的3’端和特异性引物2的5’端有10-15个碱基的重合。特异性引物1的5’端有生物素修饰。特异性引物2的5’端含有用于高通量测序文库的接头序列。具体的，引物序列如表4所示：
表4
(2)带有特异标签序列和样本标签序列(index)的接头序列：
ADT-F：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNATTAAGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.45)；ADT-R：pGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO.46)。
其中，NNNNNNNN是特异标签序列，ATTAAGG是样本标签序列(index)，以上接头序列需要退火成双链。
(3)预文库扩增引物序列：
Pre-lib-primer-F：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.47)；
Pre-lib-primer-R：GCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.48)。
(4)终文库扩增引物序列(通用引物)Seq-lib-primer-F：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO.49)；Seq-lib-primer-R：ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO.50)。
5、本发明实施例的检测方法和检测试剂盒，具体建库步骤为：
(1)DNA末端修复，配置如表5所示反应体系(反应一)，充分混匀，瞬时离心，在热循环仪上进行如下反应：37℃20min；72℃20min；4℃保存。
表5
| 试剂 | 体积(ul) |
| DNA | 40.5 |
| T4 DNA连接酶缓冲液+10mM ATP | 5 |
| 10mM dNTP混合液 | 2 |
| T4 DNA聚合酶(Enzymatics公司) | 1 |
| T4 DNA磷酸化酶(Enzymatics公司) | 0.5 |
| rTaq(Takara公司) | 1 |
| 总体积 | 50 |
(2)DNA片段连接带有特异性标签序列和样本标签序列的接头序列，配制反应体系(反应二)如表6所示。将配制好的反应体系充分混匀，瞬时离心，在热循环仪上进行如下反应：20℃15min；65℃10min；4℃保存。
表6
| 试剂 | 体积(ul) |
| 反应一 | 50 |
| DNA连接酶缓冲液 | 27 |
| DNA连接酶(Enzymatic公司) | 1 |
| 接头序列(SEQ ID NO.45-46) | 2 |
| 总体积 | 80 |
(3)反应结束后，立即使用30ul XP beads纯化，26ul超纯水或者洗脱液中洗脱。
(4)PCR预扩增：在冰上配制如下反应体系，如表7所示。
表7
充分混匀，瞬时离心，在热循环仪上进行如下反应：95℃，3min，1循环；95℃，15s，62℃，30s，72℃，30s，10循环；72℃，5min，1循环；4℃保存。
(5)反应终产物使用50ul XP beads回收纯化，使用Qubit定量，预文库浓度在20～80ng/ul，表明预文库构建成功。取两等份预文库，分别命名为上游预文库和下游预文库，每份100ng，进行下一步扩增。
(6)特异性扩增1：每份样品预文库为上游预文库和下游预文库，分别使用对应的上、下游特异性引物1和特异性引物2，直到使用通用引物扩增时将每份样品上、下游引物的扩增产物合并，再使用通用引物扩增。
在冰上配制如下反应体系，如表8所示：
表8
PCR反应程序如下：95℃，10min，1循环；(95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min)20循环；72℃，7min，1循环，4℃保存。
(7)扩增产物用1.2×XP beads回收，24ul超纯水或者洗脱液洗脱，洗脱液进行下一步扩增。
(8)特异性扩增2：在冰上配制如表9所示反应体系。PCR反应程序如下：95℃，10min，1循环；(95℃，30s，62℃，30s，72℃，1min)15循环；72℃，7min，1循环，4℃保存。
表9
(9)扩增产物用1.2×XP beads回收，每一个样品的上下游扩增产物可以合并回收，最终用26ul超纯水或者洗脱液洗脱，洗脱液进行通用引物扩增。
(10)通用引物扩增：在冰上配置如如表10所示的反应体系，充分混匀，瞬时离心，在热循环仪上进行如下反应：98℃，45s，1循环；98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s，10循环；72℃，1min，1循环；4℃保存。
表10
(11)反应产物用1.0×XP beads回收，最后使用30ul洗脱液洗脱，即为最终上机文库。
(12)用Illumina NEXTseq CN500测序仪进行75PE测序。
(13)测序数据信息分析
过滤掉低质量测序读长(reads)后，对于每一对pair-end reads根据所连接的分子标签序列和扩增引物序列归类，当reads起始部分序列与实验加入的引物序列和分子标签不一致时，reads将被过滤掉。保留下来的pair-end reads用BWA MEM人类参考基因组(hg19)比对，按同起始、同终止位置且分子标签一致的序列聚类到同一组，得到唯一的分子标签组序列，将唯一的分子标签组序列重新比对到参考基因组(BWA MEM)，用GATK软件对Indel周围的序列重新比对，用samtools软件进行SNP和小的插入缺失检测，用FACTERA软件进行--SEA缺失检测。根据位点的唯一的分子标签组序列的总深度和相关SNP位点等位基因(allele)的深度，计算胚胎DNA含量，并对胎儿地贫相关的SNP，INDEL，--SEA型缺失进行分型。
测试例：
根据上述实施例，对参考品R1～R5和五例孕妇进行地中海贫血基因检测结果分别如表11和表12所示：
表11
表12
从表中可以看出，通过本发明配制的参考品R1～R5采用本实验室的方法进行建库和分析后，得到的基因型信息与配制时使用的DNA样本的基因型信息一致。同时，将与参考品基因型相同的孕妇血浆样本S1～S5的游离DNA进行建库，也得到了同样的结果。表明本发明的方法配制的参考品可模拟真实样本，用于无创产前地中海贫血基因检测技术的研发质控。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 一种检测地中海贫血基因的参考品及其制备方法与应用
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcgcggc ctggggttca cttggggggc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagagcag aaaggtatgg gctcaactag 30
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcttttatt ctatacttct ctaatactca cct 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttctccctg ttccggggac atcaccttcc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatttttagg gcagtgaaac tcctctacag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagtcttac tttgcttttt taaattagct 30
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgttaggatg tacacacatt ttaat 25
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agacattact gctttgaaga ctttgtgtat 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctatcgcca agtggtgaga caatcgccga 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttagtcatg aagttttctg agtgccagtg 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtaataataa caacactaat ggcggtaaac 30
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaactcctg gacttaagtg atcctcctg 29
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tataatccca caccactctt tgtttgctct 30
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accctataat gctctgtgaa acacctattt gtt 33
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aagatggcca gggaagtgtg agtgacccta 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagcgttata tgttctacag gtttagacaa 30
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgggaaggct gcatggtgaa tataa 25
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttcaagcatt cactgaaggt cttggaacgt 30
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tagaaccttt tggactagtt atgcc 25
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagtgaaag gggtccgatg gtactcactg 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatcttcagt ggggatgtag cacattttgc 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
atcatgttgg caacatgctt ggagatcccc 30
<210> 23
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agatgtgtat aagagacagg ttcacttggg gggcgccttg gggaggttc 49
<210> 24
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agatgtgtat aagagacagt atgggctcaa ctagctatgt tacaacttc 49
<210> 25
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agatgtgtat aagagacagc ttctctaata ctcacctgtt ctaatgagat tt 52
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agatgtgtat aagagacagg ggacatcacc ttccagtctc caag 44
<210> 27
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agatgtgtat aagagacagg aaactcctct acagcatact gtaatgatg 49
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agatgtgtat aagagacagg cttttttaaa ttagctcttc atgcagcac 49
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agatgtgtat aagagacagc acacatttta atattttggt acca 44
<210> 30
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agatgtgtat aagagacagg aagactttgt gtatactaaa tgtgggtaa 49
<210> 31
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agatgtgtat aagagacagg tgagacaatc gccgagcagt gagaccatc 49
<210> 32
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agatgtgtat aagagacagt tctgagtgcc agtggaactg tcctggttc 49
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agatgtgtat aagagacagc taatggcggt aaacaccatc atcatcttg 49
<210> 34
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agatgtgtat aagagacagt cctggactta agtgatcctc ctgccccag 49
<210> 35
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agatgtgtat aagagacagc cactctttgt ttgctctatt ttggttctc 49
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agatgtgtat aagagacagt ctgtgaaaca cctatttgtt agataaattg at 52
<210> 37
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
agatgtgtat aagagacagg aagtgtgagt gaccctaggg gttgtgccc 49
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agatgtgtat aagagacagt tctacaggtt tagacaagtg tatcctaac 49
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agatgtgtat aagagacagg ctgcatggtg aatataagaa ctgaattct 49
<210> 40
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agatgtgtat aagagacagc tgaaggtctt ggaacgtatc ccctgtgga 49
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
agatgtgtat aagagacagt tttggactag ttatgccact cctgaggag 49
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
agatgtgtat aagagacagg tccgatggta ctcactgctc agcaatagg 49
<210> 43
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agatgtgtat aagagacagg gatgtagcac attttgctat ttgagatgg 49
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agatgtgtat aagagacaga catgcttgga gatccccaga tcaaaggtg 49
<210> 45
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nnattaaggg tgactggagt tcagacgtgt 60
gctcttccga tct 73
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gatcggaaga gc 12
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 48
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gctcttccga tct 13
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
atgatacggc gaccaccgag atctacactc gtcggcagcg tc 42
Claims (4)
1.一种检测地中海贫血基因的参考品在制备用于检测地中海贫血试剂中的应用，其特征在于，包括：片段化的母体基因组DNA和片段化的胎儿基因组DNA；所述片段化的母体基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述片段化的胎儿基因组DNA的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变；片段化的母体基因组DNA来源于女性的外周血的样本；片段化的胎儿基因组DNA来源于胎儿组织样本；所述片段化的母体DNA和所述片段化的胎儿DNA的片段大小分别为150-200bp；所述片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的10%。
2.一种用于检测地中海贫血基因的参考品的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下步骤：
S1、分别提取、纯化母体样本和胎儿样本的基因组DNA；
S2、将步骤S1所得的基因组DNA片段化；
S3、将步骤S2片段化的母体基因组DNA和胎儿基因组DNA按比例配制成参考品，其中，片段化的胎儿基因组DNA的含量占参考品总量的10%；
所述步骤S1中，所述母体样本的α-地贫SEA位点为野生型或杂合突变；所述胎儿样本的α-地贫SEA位点为野生型、纯合突变或杂合突变。
3.一种地中海贫血基因的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1中所述的参考品。
4.根据权利要求3所述的地中海贫血基因的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.44所示的引物组。
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