CN111485024A - 用于个体特征确认的引物组合、及其应用 - Google Patents

Abstract

一种用于个体特征确认的引物组合、及其应用，引物组合包括SEQ ID NO：1至806共403对扩增引物中的至少30对引物，覆盖至少30个位点。本发明具有检材适应性高、涵盖范围广、实用程度高、简便性、成本低、操作简便的特点，可用于对犯罪嫌疑人样本的分型检测，家谱构建或溯源及基于性别犯罪的建库排查，疑难降解样本的分型检测，样本表型的判断和预测，二联体、三联体亲权鉴定，全同胞、半同胞关系鉴定。

Description

用于个体特征确认的引物组合、及其应用

技术领域

本发明涉及个体特征鉴定技术领域，具体涉及一种用于个体特征确认的引物组合、及其应用。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeats，STR)，是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2～6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列。STR基因位点长度一般在100～300bp之间。因个体间DNA片断长度或DNA序列差异而呈高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传。因其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点，已广泛应用于法医学个体识别领域。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，是指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。其具有分布密度高、有较高的遗传稳定性和易实现分析的自动化这几方面特点。故SNPs也被认为是继STR后的第三代遗传标记，从而在法医物证检验方面的应用引起了高度重视。

表型是具有特定基因型的个体，在一定环境条件下，所表现出来的性状特征的总和。表型是由基因型决定的，其遗传符合孟德尔遗传规律。这一系列表型的确定使这一技术的实用性和应用范围得到了显著提升。

法医物证学是法医学研究的主要内容之一，其是一门以法医物证为研究对象，以提供科学证据为目的，研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的学科。而人类遗传学是法医物证学的重要基础。

传统的一代STR检测通常通过毛细管电泳检测，故只能通过长度多态性来实现有限位点的基因分型。目前市场一般为18个STR位点左右的检测试剂盒。

基于NGS(下一代测序)的检测技术，包括：(1)杂交捕获技术，其原理是根据DNA序列互补原理，设计与目标序列互补的特异性探针，并合成在固相或液相芯片上，打断样品基因组DNA，加上测序接头后与探针杂交，最终将目标区域捕获下来，后续经过回收、构建文库并直接高通量测序。固相杂交法，即将探针固定在固体支持物上，典型代表是基因芯片。杂交后先洗脱未杂交上的DNA片段，再将与探针杂交的DNA洗脱下来，进行扩增，构建高通量测序文库。而液相杂交捕获技术，不难理解是在溶液环境中，让目标DNA与带有生物素标记的探针直接杂交，再通过生物素-亲和素的反应使目标片段锚定在带有亲和素的微珠上，后面过程也是洗脱、富集、扩增、构建测序文库等，目前液相杂交系统逐渐成为基因捕获主流。其中有代表性的是安捷伦(Agilent)公司推出的SureSelect目标序列捕获系统。(2)多重PCR扩增，该技术是利用多重PCR扩增、富集样品基因组中目标区域的DNA片段，再进行文库构建和高通量测序。类似产品主要有Illumina FGx，基于STR和SNP位点的亲子鉴定和个体识别。

现有技术的缺点包括：(1)一代STR检测通常通过毛细管电泳检测20个位点左右，位点数较少，对于疑难关系判定存在一定难度；(2)一代STR仅能通过等位基因长度的多态性判断分型结果，对于样本基因变异和等位基因丢失能检度较低；(3)基于NGS的检测技术中，杂交捕获技术的试验所需要的分析仪器比较复杂，操作比较繁琐，且对低量样本的检测准确性不高；而同样采用多重PCR扩增获取目标序列的Illumina FGx分型系统中不包含线粒体及X染色体上的STR及SNP位点，对于母系溯源及基于性别犯罪的建库排查仍有一定缺陷；(4)基于NGS的STR检测技术不包含表型位点，在表型判定方面有一定的不足。

发明内容

本发明提供一种用于个体特征确认的引物组合、及其应用。

根据第一方面，一种实施例中提供一种用于人个体特征确认的引物组合，包括SEQID NO：1至806共403对扩增引物中的至少30对引物，覆盖至少30个位点。

在优选实施例中，上述引物组合包括SEQ ID NO：1至806共403对扩增引物中的至少40对引物、优选至少50对、80对、100对、150对、200对、250对、300对、350对、400对引物，最优选全部403对扩增引物。

需要说明的是，引物对可以在SEQ ID NO：1至806所示的403对引物对中成对地任意选择，由于引物必须成对使用，因此以“一对”作为一个选择单元，例如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2构成一对引物，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4构成一对引物，SEQ ID NO：843和SEQID NO：806构成一对引物，其余以此类推。

在优选实施例中，上述引物组合同时覆盖STR位点、SNP位点、以及线粒体高变区。

在优选实施例中，上述SNP位点进一步包括与表型相关的位点。

在优选实施例中，上述引物组合覆盖129个STR位点、275个SNP位点、和2段线粒体高变区。

在优选实施例中，上述SNP位点中包含87个与表型相关的位点。

在优选实施例中，上述引物组合覆盖常染色体、X染色体、和Y染色体上的位点，以及线粒体上的高变区。

根据第二方面，一种实施例中提供一种用于人个体特征确认的复合扩增试剂盒，该试剂盒中包括第一方面的引物组合。

在优选实施例中，上述试剂盒进一步包括DNA聚合酶和反应缓冲液。

根据第三方面，一种实施例中提供一种第一方面的引物组合、或第二方面的试剂盒在人个体特征确认中的应用。

在优选实施例中，上述应用包括：人个体样本的分型检测，家谱构建或溯源，基于性别犯罪的建库排查，样本表型的判断和预测，亲权鉴定。

在优选实施例中，上述亲权鉴定包括二联体亲权鉴定、三联体亲权鉴定、全同胞关系鉴定、和/或半同胞关系鉴定。

根据第四方面，一种实施例中提供一种人个体特征确认方法，包括：采用第一方面的引物组合、或第二方面的试剂盒对上述个体的核酸样本进行扩增，然后对扩增产物进行测序文库构建并进行测序，以确定上述个体中上述引物的覆盖位点的序列信息。

在优选实施例中，上述扩增是上述引物组合中全部引物在同一反应体系中的复合扩增。

在优选实施例中，上述引物组合中各引物是等比例进行混合。

在优选实施例中，上述核酸样本来源于人的血液、骨骼、毛发、唾液、或含有胎儿细胞的羊水。

在优选实施例中，上述核酸样本的量至少为78pg。

本发明的引物组合包括SEQ ID NO：1至806共403对扩增引物中的至少30对引物，具有以下有益效果：

(1)检材适应性高：本发明不仅适用于血液(血斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、含有胎儿细胞的羊水等多种类型的检材，同时对微量样本、高度降解和混合样本也能实现精准分型。

(2)涵盖范围广：本发明中的STR、SNP(包含表型位点)、线粒体位点的分布涵盖了常染色体、性染色体、线粒体，可以应用于标准的二联体、三联体亲权鉴定，家谱构建或溯源及基于性别犯罪的建库排查，全同胞、半同胞关系鉴定以及疑难降解样本的分型检测。

(3)实用程度高：本发明中SNP位点中包含的表型位点可以对被检者的性状做出科学的判断和预测，在优选方案中，包含血型、单双眼皮、是否乙醇过敏等一系列对犯罪嫌疑人的锁定有很重要意义的性状，故本发明在法医分析领域的实用程度相较于其他试剂盒更为优越。

(4)简便性：在优选方案中，本发明使通过单一体系实现对129个STR、275个SNP(包含87个表型位点)、2段线粒体高变区的精准分型成为了可能，大大提升了基因分型的效率。

(5)成本低、操作简便：本发明使用二代高通量测序在提高分型精准性的同时还降低了检测成本，且在优选方案中可以对406个位点一次性的实现精准分型，这大大提升了检测效率和降低了检测难度。

附图说明

图1为本发明实施例中通过毛细管电泳测序所取得的分型结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本发明旨在通过建立一个可以同时容纳STR位点、SNP位点以及线粒体高变区的基因分型检测体系，实现简单、高效、精准、全面的个体识别和表型判定与预测。该系统结合了人类基因组数据，在优选方案中，总共选择406个位点，具体为129个STR、275个SNP(包含87个表型位点)、2个线粒体高变区，这些位点分布在常染色体、X染色体、Y染色体和线粒体上。

为了实现这一宗旨，本发明通过如下技术路线实现：

(1)位点筛选

通过对相关资料文献的大量分析以及对市面上类似试剂盒的调查研究，对STR和SNP位点的多态性、突变率以及部分SNP位点与表型的对应关系行了统计，同时结合公安建库所要求的STR位点，本发明最终筛选出129个STR、275个SNP(包含87个表型位点)、2段线粒体高变区。

(2)引物设计

针对用上述方法筛选的共计406个位点，用NCBI和PrimerPrimier5软件为每一个位点设计特异性引物。设计的每对引物都需要具有以下特点：(1)PCR反应的退火温度在58℃左右；(2)不能产生引物二聚体或者由错配产生的其他非特异性产物，这一点需要通过琼脂糖凝胶电泳来进行验证，从而保证引物在扩增过程中不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。最后引物合成后用HPLC法来对其进行纯化。

(3)DNA提取

本发明中的DNA模板来源主要为人类的血液(血斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、含有胎儿细胞的羊水。通过低浓度检出的测试确定本发明的最低DNA投入量可低至78pg。

(4)复合扩增

本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。扩增体系在各种型号的反应热循环仪上均可以采用以下的温度循环条件：95℃预变性15min；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸30s，该步骤重复28个循环。

(5)测序

利用二代测序平台，使用单端200读长的测序方法。测序后的下机数据通过过滤分析和数据比对处理，从而得到各个位点的准确分型以及碱基序列。

本发明通过对不同犯罪现场的人类DNA的精准分型实现对犯罪嫌疑人的个体识别和表型预测，从而实现案件的侦破，同时为案件的审判提供证据支持。本发明包含的位点中有87个表型位点，包括表征血型、单双眼皮、耳廓形状、乙醇代谢等一系列对胎儿表型预测和犯罪嫌疑人表型画像有显著作用的位点。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1

一、位点选择和引物设计

本实施例通过对相关资料文献的大量分析以及对市面上类似试剂盒的调查研究，对STR和SNP位点的多态性、突变率以及部分SNP位点与表型的对应关系行了统计，同时结合公安建库所要求的STR位点，最终筛选出129个STR、275个SNP(包含87个表型位点)、2段线粒体高变区。

针对这129个STR、275个SNP(包含87个表型位点)、2段线粒体高变区共406个位点，使用NCBI和PrimerPrimier5为每一个位点设计特异性引物。设计的每对引物都需要具有以下特点：(1)PCR反应的退火温度在58℃左右；(2)不能产生引物二聚体或者由错配产生的其他非特异性产物，这一点需要通过琼脂糖凝胶电泳来进行验证，从而保证引物在扩增过程中不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。最后引物合成后用HPLC法来对其进行纯化。本实施例中最终引物的序列，如表1所示。

二、DNA提取

本实施例采用上海美吉生物医药科技的快速DNA提取试剂盒对包含血液、毛发、指甲、唾液不同类型的DNA样本进行提取，利用Qubit荧光定量方法对DNA浓度进行检测，对较高或较低浓度的DNA样本进行稀释和浓缩。最终本实施例所有的DNA样本的浓度都在3至10ng范围，能够满足后续试验的需求。

三、PCR扩增

采用本实施例的复合扩增技术对所提取的DNA样品进行PCR扩增，25μL体系包括：反应缓冲液10μL、引物混合溶液2.5μL、DNA样品2.5μL、ddH₂O 9μL、Taq DNA聚合酶1μL。

其中，缓冲体系中包括：10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl₂，50mM KCl，10mM DMSO，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)，各0.2mM的由四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合组成的dNTP混合物。Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶。每个扩增体系(25μL)需要2U至4U的Taq DNA聚合酶。

其中，引物混合液为表1的403对引物的等比混合液，所有引物对均在一个体系内进行反应。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性20秒钟、58℃退火1分钟、72℃延伸20秒钟，重复28次；循环结束后，72℃延伸10分钟；4℃保存。

四、文库构建和测序

在上述扩增体系按上述程序进行扩增后得到各位点扩增产物混合物，对复合扩增产物进行Qubit荧光定量，取出其中50ng进行华大基因BGISEQ-500平台的二代测序文库构建。

其中用到的建库试剂盒和测序试剂盒为BGISEQ-500平台配套的试剂盒。

将定量后的复合扩增产物加水补至40μL，随后加入末端修复缓冲液(Buffer Mix)和末端修复酶混合物(Enzyme Mix)进行末端修复和加A尾处理。反应体积为50μL/管，反应条件为热盖110℃；37℃30min；65℃15min；4℃保存。

反应完成后向上述PCR管中加入5μL接头混合物(Adaptor Mix)，吹打混匀；随后加入接头连接缓冲液20.4μL，接头连接酶混合物(Enzyme Mix)4.6μL。反应体积为80μL/管，反应条件为热盖110℃；20℃60min；4℃保存。

反应结束后，取出PCR管，加入20μL无核酸酶水补至100μL。用0.5倍体积(50μL)Ampure XP磁珠纯化，纯化完成后最终采用46μL水复溶，吸取44μL用于后续试验。

向连接后的44μL纯化产物中加入100μL KAPA HiFi Hot Start Ready Mix、Pre-PCR Primer Mix 12μL、无核酸酶水44μL，总体积200μL，混匀后分装在两个PCR管内进行PCR反应。反应体积为100μL/管，反应条件为95℃3分钟；然后进入6个循环：98℃变性20秒钟、60℃退火15秒、72℃延伸15秒钟；循环结束后，72℃延伸10分钟；4℃保存。

每个PCR管采用1倍体积，即200μL的Ampure XP磁珠纯化，纯化完成后最终溶解在40μL水中，全部吸取，用Qubit荧光定量方法进行定量。

将构建好的文库样本依据测定的浓度取170ng，总量48μL，其余用水补齐。混合文库(Poling)后的样品95℃反应3min，3min反映后立即置于冰上冰浴10min。

之后将样品环化，具体反应体系包括介导序列混合物(Splint Oligo Mix)11.6μL和介导连接酶混合物(Splint Ligase Enzyme Mix)0.2μL，反应总体系59.8μL，反应条件为37℃，30min；4℃保存。

将环化后的产物取出20μL，加入DNA纳米球(DNB)制备缓冲液(冰上完成)，进行DNB制备的步骤，反应条件为95℃，1min；65℃，1min；40℃，1min；降至4℃取出。

接下来给反应产物中加入DNB聚合酶混合液40μL和制备DNB的酶混合物(enzymeMixII)4μL，反应总体系为84μL，反应条件为30℃，15min，4℃保存。

当PCR仪降至4℃时立即结束程序，取出PCR管置于冰上，立即加入20μL的DNB终止缓冲液，并用扩口吸头缓慢滴混5～8次，切勿震荡，用ssDNA试剂盒检测DNB浓度，当浓度大于10ng/μL时进行DNB转载的步骤，随后上机测序。

表1检测位点及引物

表1中，HVR I和HVR II分别为线粒体DNA高变区I和线粒体DNA高变区II；SNP位点的命名规则是，基因座名称为“rs”开头者为SNP位点，除“rs”开头的SNP位点以外，M479、L298、P202和P256为Y染色体的单倍型；STR的命名规则是，位于蛋白质编码区的STR，包括内含子区的基因，使用编码链命名，这适用于VWA(GenBank:M25716)，TPOX(Gc:nBank:M68651)和CSFIPO(CenBank:X14720)，与蛋白质编码基因无关的重复序列，如D#S#基因座，如D18S51(GenBank；L18333)、D21Sll(GenBank；M84567)，当然，表1中也包括其他的命名方式。

本实施例中的exon6-261-C、exon7-803/802/796/703-C中exon代表外显子，后面的数字代表其是第几个外显子，如exon6代表第六个外显子，“-”后的数字代表其是外显子的第多少位碱基，最后是碱基的具体内容，其中exon7-803/802/796/703-C所对应的引物对对应4个目标区域。chr16-1、chr16-2、chr16-3、chr16-4中chr代表16号染色体，因无法确定具体碱基位置故用序号1、2、3、4以示前后顺序。

本实施例采用的STR名称和SNP的“rs”开头的名称都能从NCBI等数据库查询到基因组的相应位置，其它名称也都是已经公开使用的名称。

实施例2准确性测试

采用本发明方法对标准品(9947a)的25个STR位点进行分型，同时采用被称为分型金标准的毛细管电泳测序对该标准品进行分型，将二者取得的分型结果进行对比，从而验证本发明方法分型的准确性。具体方法参照实施例1，在此不再累述。

本发明方法所取得的25个STR位点的分型结果如表2所示，通过毛细管电泳测序所取得的分型结果如图1所示。可以看到通过本发明方法所取得的分型结果与毛细管电泳所取得的分型结果完全一致。这证明了本发明方法的准确性。

表2使用本发明方法的分型结果

实施例3灵敏度测试

本实施例使用9947a和9948两个标准品，对本发明方法的分型灵敏度进行测试。DNA起始量从10ng降至0.078ng时，位点检出率仍高达99.59％。结果如表3和表4所示。位点检出率的计算方法为检出位点的个数/总位点个数，检出位点个数针对STR位点是指深度大于50×且成功分型的位点个数，针对SNP位点是指深度大于100×且成功分型的位点个数。由此可见，本发明方法在低DNA起始量的复杂条件下仍可以保持超高的位点检出率，进一步说明本发明方法的可靠性和稳定性。

表3 9947a低起始量位点检出率

表4 9948低起始量位点检出率

实施例4家系验证

采用本发明方法对6个家庭中的20个家系样本进行亲子鉴定。具体步骤参照实施例1。分型结果如表5，从表5中可以看出这20个样本分型结果与孟德尔遗传定律一致，证明了本发明在实际应用中的准确性。

表5

以上实施例证明，本发明建立的多重PCR系统，可以对129个STR、275个SNP(包含87个表型位点)总计406个位点进行有效的扩增。同时，本发明方法在位点涵盖全面性、准确性，灵敏度方面相比于市场上其他同类产品具有更优越的性能。同时其还具有检材适应性高、涵盖范围广、实用程度高、简便性、成本低、操作简便以及包含了表型位点可以进行个体特征确认的优势。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种用于人个体特征确认的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括SEQ ID NO：1至806共403对扩增引物中的至少30对引物，覆盖至少30个位点。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括SEQ ID NO：1至806共403对扩增引物中的至少40对引物、优选至少50对、80对、100对、150对、200对、250对、300对、350对、400对引物，最优选全部403对扩增引物。

3.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合同时覆盖STR位点、SNP位点、以及线粒体高变区；

任选地，所述SNP位点进一步包括与表型相关的位点。

4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合覆盖129个STR位点、275个SNP位点、和2段线粒体高变区；

任选地，所述SNP位点中包含87个与表型相关的位点。

5.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合覆盖常染色体、X染色体、和Y染色体上的位点，以及线粒体上的高变区。

6.一种用于人个体特征确认的复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1至5中任一项所述的引物组合；

任选地，所述试剂盒进一步包括DNA聚合酶和反应缓冲液。

7.权利要求1至5中任一项所述的引物组合、或权利要求6所述的试剂盒在人个体特征确认中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：人个体样本的分型检测，家谱构建或溯源，基于性别犯罪的建库排查，样本表型的判断和预测，亲权鉴定；

任选地，所述亲权鉴定包括二联体亲权鉴定、三联体亲权鉴定、全同胞关系鉴定、和/或半同胞关系鉴定。

9.一种人个体特征确认方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求1至5中任一项所述的引物组合，或权利要求6所述的试剂盒对所述个体的核酸样本进行扩增，然后对扩增产物进行测序文库构建并进行测序，以确定所述个体中所述引物的覆盖位点的序列信息。

10.根据权利要求8所述的人个体特征确认方法，其特征在于，所述扩增是所述引物组合中全部引物在同一反应体系中的复合扩增；

任选地，所述引物组合中各引物是等比例进行混合；

任选地，所述核酸样本来源于人的血液、骨骼、毛发、唾液、或含有胎儿细胞的羊水；

任选地，所述核酸样本的量至少为78pg。

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