CN107385064A - 一种同时扩增人常染色体snp和str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，可在单管反应中复合扩增15个SNP位点，15个STR位点及性别鉴定基因座Amelogenin。所述试剂盒包括PCR扩增反应试剂、复合扩增引物、阳性对照、等位基因Ladder、荧光内标。利用检测第三代遗传标记多态性位点(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism)ARMS‑PCR方法(Amplification Regractory Mutation System，ARMS)和荧光检测技术的结合，开发了一管同时检测31个DNA位点荧光试剂盒，该试剂盒对于解决法医领域的不均衡性混合样本，同一样本相同STR分型的区分，临床领域产前亲子鉴定，器官移植检测，产前疾病诊断等具有广泛的应用前景。可以作为继常染色体STR、Y染色体STR后的一种新型遗传标记试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及法医物证和司法鉴定领域，具体为一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增检验系统，集中体现的是检测第三代遗传标记多态性位点(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism)ARMS-PCR方法(Amplification Regractory Mutation System，ARMS)和荧光检测技术的结合应用。提供了一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。
背景技术
SNP全称Single Nucleotide Polymorphisms，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化，而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×106个。因此，SNP成为第三代遗传标记，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。
短串联重复序列(STR)是目前普遍应用的分子遗传标记，它片段小易扩增，适宜于检验微量和降解生物检材，各基因座的扩增条件相似而能够实现复合扩增和自动化检测，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点，非常适用于建立DNA数据库。上世纪90年代美国FBI选择了13个常染色体STR基因座(简称A-STR)用于建立DNA数据索引系统—CODIS(Combined DNA Index System)：CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA，目前该系统已被多个国家的DNA数据库在其基础上借鉴和发展。
目前法医学上用于个体识别的试剂盒都是基于STR的方法，但作为第三代遗传标记的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与STR相比，具有数量多、突变率低、遗传稳定、易于自动化、适用于高度降解检材分析等优点，其应用于法医学检案的优越性越来越明显，如用于推测样本的种族来源、识别身体特征等。且目前法医物证领域，都是将STR和SNP分开检测的，例如：中国专利申请号201010282414.X、“16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒”其涉及15个常染色体STR基因座与1个性别基因座的复合扩增；中国专利申请号201410145409.2、“一种线粒体荧光标记复合扩增试剂盒及其应用”其涉及61个线粒体SNP位点的复合扩增；中国专利申请号201210079459.6、“具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用”其涉及24个Y-STR位点的复合扩增；上述试剂盒存在的问题就是检测灵敏度有限，分型单一，对于STR分型一致的样本无法再区分；目前针对混合样本的常规检验方法，在涉及到男女混合样本时，Y-STR检验是一个主流选择，但如果是男男或女女的混合样本时，Y-STR的效用就大幅降低甚至没有；而对于一些混合比例极不均衡的样本，常规检验很可能会得出一个假阴性的结果。针对这些情况国内外也尚未有成熟的方法可供借鉴。
ARMS技术的原理是在DNA序列一段的突变处设计两个引物，突变位点位于引物的3’末端，一个相应于正常等位基因序列引物，一个相应于突变基因序列引物，再在DNA另一端设计一个共用引物，从而用PCR对突变基因进行检测。ARMS-PCR和荧光凝胶电泳技术的结合具有诸多的检测优势，例如：检测位点数量多、灵敏度高、稳定性好、经济高效、耗时短和通量高等。经对现有技术文档的检索发现，尚未有用此方法同时检测SNP-STR位点的报道。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，本发明拟在多色荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术(CE)的基础上，将ARMS-PCR方法(Amplification Regractory MutationSystem，ARMS)和荧光检测技术相结合，利用SNP和短串联重复序列多态性(STR)两种遗传标记组合配对(简称SNP-STR)，开发SNP-STR检验试剂，对于法医现场案件各种混合样本检测，同一STR分型样本区分，产前亲子鉴定等领域具有广泛的应用前景，SNP-STR是在基因组中相距少于500bp的两种遗传标记的组合，它既有STR高多态性的特点，又有SNPs双等位基因特异分型优势。它可以通过设计针对SNPs的特异性引物，在现有法医物证常规检验设备和方法的基础上，对现场物证不均衡的混合样本进行准确分型。该方法能适应当前案件现场的复杂性，抗干扰能力强，特异性高，为破案提供线索与证据，并能满足刑侦工作的需求。
技术方案：发明201010282414.X提供了一个同时扩增15个常染色体基因座及1个性别基因座的方案。本发明在201010282414.X方案基础上，将D6S1043基因座改为D19S433基因座，这样使得常染色体基因座和ABI(Applied Biosystems,USA)公司的IdentifilerTM试剂盒基因座一样，测试数据完全匹配国家常染色体数据库，利用上述15个常染色体STR序列，在UCSC数据库中查找适合法医DNA检验的SNP-STR的组合遗传标记，通过群体调查筛选出多态性好的SNP-STR组合基因座，构建复扩体系，设计分析软件，通过模拟样本和实际案件评估验证其法医效能，从而建立一种检测新型遗传分子标记SNP-STRs的荧光复合扩增试剂盒。
一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括扩增以下DNA位点的引物；具体为15个SNP-STRs基因座：rs16887642-D7S820、rs11642858-D16S539、rs9531308-D13S317、rs13413321-TPOX、rs79373318-TH01、rs10414287-D19S433、rs17651965-CSF1PO、rs17077990-D3S1358、rs2070018-FGA、rs9678338-D2S1338、rs216870-vWA、rs11908851-D21S11、rs535823682-D18S51、rs57346531-D8S1179、rs25768-D5S818和1个性别基因座Amel。
优选的，所述基因座中每个SNP位点均紧密连锁一个STR位点，且二者被同时检测。
优选的，所述15个SNP-STRs基因座均包含两条正向引物及一条反向引物。
优选的，所述引物的序列为：rs16887642-D7S820，正向引物SEQ ID NO:1～2，反向引物SEQ ID NO:3；rs11642858-D16S539，正向引物SEQ ID NO:4～5，反向引物SEQ ID NO:6；rs9531308-D13S317，正向引物SEQ ID NO:7～8，反向引物SEQ ID NO:9；rs13413321-TPOX，正向引物SEQ ID NO:10～11，反向引物SEQ ID NO:12；rs79373318-TH01，正向引物SEQ ID NO:13～14，反向引物SEQ ID NO:15；rs10414287-D19S433，正向引物SEQ ID NO:16～17，反向引物SEQ ID NO:18；rs17651965-CSF1PO，正向引物SEQ ID NO:19～20，反向引物SEQ ID NO:21；rs17077990-D3S1358，正向引物SEQ ID NO:22～23，反向引物SEQ ID NO:24；rs2070018-FGA，正向引物SEQ ID NO:25～26，反向引物SEQ ID NO:27；Amel，正向引物SEQ ID NO:28，反向引物SEQ ID NO:29；rs9678338-D2S1338，正向引物SEQ ID NO:30～31，反向引物SEQ ID NO:32；rs216870-vWA，正向引物SEQ ID NO:33～34，反向引物SEQ ID NO:35；rs11908851-D21S11，正向引物SEQ ID NO:36～37，反向引物SEQ ID NO:38；rs535823682-D18S51，正向引物SEQ ID NO:39～40，反向引物SEQ ID NO:41；rs57346531-D8S1179，正向引物SEQ ID NO:42～43，反向引物SEQ ID NO:44；rs25768-D5S818，正向引物SEQ ID NO:45～46，反向引物SEQ ID NO:47。
优选的，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ ID NO:1，0.04μM；SEQ ID NO:2，0.06μM；SEQ ID NO:3，0.1μM；SEQ ID NO:4，0.06μM；SEQ ID NO:5，0.09μM；SEQ ID NO:6，0.12μM；SEQ ID NO:7，0.05μM；SEQ ID NO:8，0.08μM；SEQ ID NO:9，0.014μM；SEQ ID NO:10，0.08μM；SEQ ID NO:11，0.1μM；SEQ ID NO:12，0.2μM；SEQ ID NO:13，0.07μM；SEQ IDNO:14，0.1μM；SEQ ID NO:15，0.2μM；SEQ ID NO:16，0.08μM；SEQ ID NO:17，0.1μM；SEQ IDNO:18，0.2μM；SEQ ID NO:19，0.1μM；SEQ ID NO:20，0.12μM；SEQ ID NO:21，0.24μM；SEQ IDNO:22，0.12μM；SEQ ID NO:23，0.15μM；SEQ ID NO:24，0.3μM；SEQ ID NO:25，0.14μM；SEQID NO:26，0.21μM；SEQ ID NO:27，0.34μM；SEQ ID NO:28，0.02μM；SEQ ID NO:29，0.02μM；SEQ ID NO:30，0.18μM；SEQ ID NO:31，0.2μM；SEQ ID NO:32，0.4μM；SEQ ID NO:33，0.2μM；SEQ ID NO:34，0.24μM；SEQ ID NO:35，0.4μM；SEQ ID NO:36，0.3μM；SEQ ID NO:37，0.35μM；SEQ ID NO:38，0.6μM；SEQ ID NO:39，0.4μM；SEQ ID NO:40，0.46μM；SEQ ID NO:41，0.8μM；SEQ ID NO:42，0.48μM；SEQ ID NO:43，0.52μM；SEQ ID NO:44，0.8μM；SEQ ID NO:45，0.56μM；SEQ ID NO:46，0.6μM；SEQ ID NO:47，1.0μM。
PCR是一个复杂的分子动力学过程。随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计和修改大量特异性引物并进行复杂的测试，摸索复合扩增系统中各引物之间最优的浓度比例，最终保证不降低试剂盒特异性及灵敏度的前提下复合检测更多的STR基因座及其连锁的SNP位点。本发明通过复杂的设计和实验摸索确定如下表的引物序列及对应的浓度。
表1 各个连锁DNA位点的引物及浓度
优选的，所述SNP-STRs基因座的两条正向引物5’端采用不同荧光染料标记。
优选的，基因座rs16887642-D7S820、rs11642858-D16S539、rs9531308-D13S317、rs13413321-TPOX、rs79373318-TH01、rs10414287-D19S433、rs17651965-CSF1PO、rs17077990-D3S1358、rs2070018-FGA的两条正向引物的5’端荧光标记为6-FAM或HEX；基因座rs9678338-D2S1338、rs216870-vWA、rs11908851-D21S11、rs535823682-D18S51、rs57346531-D8S1179及rs25768-D5S818的两条正向引物的5’端荧光标记为TAMRA或ROX；性别基因座Amel的正向引物的5’端荧光标记为TAMRA或ROX。
优选的，所述试剂盒引物以外的组分为反应缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、Allelic Ladder以及荧光分子量内标，所述反应缓冲液为Tris-HCl 50mM、KCl 50mM、MgCl22.0mM和dNTPs 0.2mM，BSA 0.8mg/mL。
表2、试剂盒包含组分
优选的，所述试剂盒的扩增程序为：变性，95℃2min；10个循环，94℃30s，60℃1min，72℃1min；20个循环，90℃30s，58℃1min，72℃1min；终止延伸，60℃30min；4℃保温维持。
表3、试剂盒扩增程序
本发明试剂盒的扩增产物采用毛细管电泳方法检测。
所述试剂盒在个体识别、产前亲子鉴定、法医领域的不均衡性混合样本、案件排查或常染色体数据库中的应用。
本发明试剂盒具有很强的检材适应性，包括采用Chelex法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。
综上所述，本发明选择了公安部DNA数据库常用的常染色体15个STR位点和一个性别鉴定基因座，并通过UCSC数据库检索到上述15个常染色体STR位点的连锁的SNP位点，选择单倍型频率分布较均衡(趋向50％)的SNP位点，在多色荧光标记复合扩增和毛细管电泳技术(CE)的基础上，将ARMS-PCR方法(Amplification Regractory Mutation System，ARMS)和荧光检测技术相结合，利用SNP和短串联重复序列多态性(STR)两种遗传标记组合配对(简称SNP-STR)，开发SNP-STR检验试剂，对于法医现场案件各种混合样本检测，同一STR分型样本区分，产前亲子鉴定等领域具有广泛的应用前景。
有益效果：(1)本发明将ARMS-PCR方法和荧光检测技术结合，实现了常染色体SNP和STR位点的同步扩增，极大的提高了检测速度和效率，满足实际公安案件的需要；(2)本发明结合了两种遗传标记的优势，在现有法医物证常规检验设备和方法的基础上，对现场物证不均衡的混合样本可以准确分型，极大了推动了案件排查力度；(3)本发明同步扩增了STR位点连锁的SNP位点，可同时获得两种遗传标记的分型，对于同一STR分型的样本，可根据SNP位点进行区分，提高了试剂盒的分型能力，对于案件排查和个体识别具有显著作用；(4)本发明创造性改良ARMS-PCR方法，利用现有毛细管电泳平台，实现多个SNP和多个STR位点的复合扩增，选择的STR位点和现有数据库完全一致；(5)本发明所述试剂盒具有灵敏度高、稳定性好、检材来源广泛及检测能力强的优点。
附图说明
图1是试剂盒引物设计原理图；
图2是对照品，实际提取样本T1电泳图谱；
图3是等位基因分型标准物的电泳图谱；
图4是检测混合样本主副成份原理图；
图5是男女混合比T1:X1(100:1)的扩增图谱；
图6是对实际样本T2检测图谱；
图7是产前亲子鉴定样本检测图谱。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1检测基因座的确定；试剂盒引物组、扩增体系、扩增方法的确定
一、基因座的确定
发明201010282414.X提供了一个同时扩增15个常染色体基因座及1个性别基因座的方案。本发明在201010282414.X方案基础上，将D6S1043基因座改为D19S433基因座，这样使得常染色体基因座和ABI(Applied Biosystems,USA)公司的IdentifilerTM试剂盒基因座一样，测试数据完全匹配国家常染色体数据库，通过对5000多名无关个体进行基因型检测，根据各基因座等位基因的分布频率统计分析个体识别力(DP)、杂合度(H)、非父排除率(PE)等数据，结果表明有15个A-STR基因座的DP值均接近0.9，H均大于0.7，PE值在0.5以上，具有较好的法医学应用价值；
利用上述15个常染色体STR序列，在UCSC数据库中查找适合法医DNA检验的SNP-STR的组合遗传标记，通过群体调查筛选出多态性好的SNP-STR组合基因座，进一步的，所选择的位点包括：rs16887642-D7S820、rs11642858-D16S539、rs9531308-D13S317、rs13413321-TPOX、rs79373318-TH01、rs10414287-D19S433、rs17651965-CSF1PO、rs17077990-D3S1358、rs2070018-FGA、Amel、rs9678338-D2S1338、rs216870-vWA、rs11908851-D21S11、rs535823682-D18S51、rs57346531-D8S1179及rs25768-D5S818。每个STR基因座信息如表4：
表4、各STR基因座信息
上述STR位点连锁的对应SNP位点，根据SNP位点的分型确定了各位点的类型，其中和D7S820连锁的rs16887642位点的等位基因C为野生型，T为突变型；和D16S539连锁的rs11642858位点的等位基因T为野生型，G为突变型；和D13S317连锁的rs9531308位点的等位基因T为野生型，G为突变型；和TPOX连锁的rs13413321位点的等位基因C为野生型，A为突变型；和TH01连锁的rs79373318位点的等位基因G为野生型，A为突变型；和D19S433连锁的rs10414287位点的等位基因A为野生型，T为突变型；和CSF1PO连锁的rs17651965位点的等位基因G为野生型，C为突变型；和D3S1358连锁的rs170779908位点的等位基因C为野生型，G为突变型；和FGA连锁的rs2070018位点的等位基因A为野生型，G为突变型；和D2S1338连锁的rs9678338位点的等位基因C为野生型，A为突变型；和vWA连锁的rs216870位点的等位基因A为野生型，T为突变型；和D21S11连锁的rs11908851位点的等位基因A为野生型，G为突变型；和D18S51连锁的rs535823682位点的等位基因T为野生型，C为突变型；和D8S1179连锁的rs57346531位点的等位基因A为野生型，G为突变型；和D5S818连锁的rs25768位点的等位基因C为野生型，T为突变型；具体信息如下表5：
表5、各SNP位点信息
二、荧光标记SNP-STRs复合扩增体系的优化及建立
1、引物设计
确定好各SNP-STRs位点的基因序列和SNP等位基因类型后，采用Oligo6.0软件进行引物设计，其原理如图1所示，本发明的所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，每个新型遗传标记位点(SNP-STR)上游正向引物的5’端用不同荧光素标记，下游共用引物为非标记引物，除遵循普通引物设计的一般原则外，为增加两条非标记引物的特异性，在距离引物3’端2-5个碱基处人为地引入错配碱基，引入错配的原则为：若3’端为弱错配(A-C，G-T)，则引入强错配(A-G，C-T)；若3’端为中错配(A-A，G-G,C-C,T-T)，则引入中错配；若3’端为强错配(A-G，C-T)，则引入弱错配；
在引物设计时，需保证引物的长度适中，具有相似的物理特性和反应动力学特点、Tm值和GC含量相近、引物之间不能形成二聚体；引物设计时需要考虑到引物扩增的特异性，摸索距离3’端不同位置的人为突变碱基，直至可以特异性的扩增出SNP-STRs位点，而不产生非特异和假阳性扩增。
2、复合扩增
经过大量实验和修改优化后，最终确定同时分析人基因组DNA 31个DNA位点的荧光标记复合扩增的试剂盒，其中PCR扩增体系由如下组成：
表6、扩增体系组成
其中所述的Reaction Mix中各组分反应终浓度为Tris-HCl 50mM、KCl 50mM、MgCl2 2.0mM和dNTPs 0.2mM，BSA 0.8mg/mL。
其中31个DNA位点对应的引物及其引物浓度如表1所示。将所述31个DNA位点按如下分组并进行荧光标记：rs16887642C-D7S820、rs11642858T-D16S539、rs9531308T-D13S317、rs13413321C-TPOX、rs79373318G-TH01、rs10414287A-D19S433、rs17651965G-CSF1PO、rs17077990C-D3S1358和rs2070018A-FGA为第一组，引物荧光标记物为6-FAM；rs16887642T-D7S820、rs11642858G-D16S539、rs9531308G-D13S317、rs13413321A-TPOX、rs79373318A-TH01、rs10414287T-D19S433、rs17651965C-CSF1PO、rs17077990G-D3S1358和rs2070018G-FGA为第二组，引物荧光标记物HEX；rs9678338C-D2S1338、rs216870A-vWA、rs11908851A-D21S11、rs535823682T-D18S51、rs57346531A-D8S1179及rs25768C-D5S818为第三组，引物荧光标记物为TAMRA；Amel、rs9678338A-D2S1338、rs216870T-vWA、rs11908851G-D21S11、rs535823682C-D18S51、rs57346531G-D8S1179及rs25768T-D5S818为第四组，引物荧光标记物为ROX；
试剂盒的扩增步骤如下：
(1)将PCR扩增管置于热循环仪上；
(2)选择下面推荐的程序进行扩增；
(3)扩增后的产物应避光保存；
热循环仪的扩增程序：95℃2min；10个循环，94℃30s，60℃1min，72℃1min；20个循环，90℃30s，58℃1min，72℃1min；终止延伸，60℃30min；4℃保温维持
电泳结束后，将PCR扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL产物或试剂盒等位基因分型标准物与0.5μL荧光分子量内标AGCU Marker SIZ-500和12μL去离子甲酰胺混合，避免产生气泡，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，遗传分析仪电泳检测，用片段分析软件GeneMapper分析电泳数据。对照品实际提取样本T1和等位基因分型标准物的分型结果如图2、图3所示。
实施例2确定PCR反应程序
本发明试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的扩增程序，以保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。首先，循环数测试：分别测试了28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，实验证明最佳循环为30个；其次退火温度测试：分别测试了57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，实验证明最佳温度为61℃和59℃。最终扩增程序如下表：
实施例3不均衡样本分型
采用实施例1中的方案，利用该方案中新型遗传分子标记SNP-STRs的荧光复合扩增试剂盒对法医物证现场不均衡混合样本进行扩增检测。
1、模拟混合样本：采用实际提取样本X1(女性样本)，实际提取样本T1(男性样本)标准品，模拟不同比例的男女混合斑作为扩增模板。混合斑样本实际提取样本X1和实际提取样本T1的总量为1.0ng，PCR扩增体系为25μl体系，比例分别为1:1、1:10、1:20、1:50、1:100；10:1、20:1、50:1、100:1。
2、扩增检测
按照实施例1所述方案进行PCR扩增、电泳检测和结果分析。
3、结果与分析
a、利用SNP-STRs遗传标记复合扩增试剂盒对混合样本进行检测时，若混合两样本间SNP位点同为纯合型，且其中一种为纯合野生型，另外一种为纯合突变型，则可准确分别得出两种样本的分型(图4，混合样本1),若混合两样本间SNP位点一个为纯合型，一个为杂合型，则只能分辨出杂合型中的一种STR分型(图4，混合样本2)；
b、当检测混合斑样本时，本发明的试剂盒展示了其高灵敏度的检测优势，本发明对于检测大量男性样本中混有及少量女性样本，或者大量女性样本中混合少量男性样本，或者不均衡男性混合样本，或者不均衡女性混合样本，或者多种不同样本混合均可检测，图5所示为当25μl体系中模板总量为1ng，其中实际提取样本T1(男性)和实际提取样本X1(女性)样本的比例为100:1时的检测结果，由图5可知：连锁位点rs9531308-D13S317、rs79373318-TH01、rs17077990-D3S1358、rs9678338-D2S1338及rs216870-vWA实际提取样本T1(男性)和实际提取样本X1(女性)两个样本的SNP位点均为纯合型，且等位基因分型相反，因此可准确扩增出实际提取样本X1(女性)样本的该五个位点的分型，分别是：11、8/9.3、14/15、19/23、17/18，其余位点也可得出部分STR分型，对于现场案件排查具有重要意义。
实施例4同一STR分型的不同亚型
采用实施例1中的方案，利用该方案中新型遗传分子标记SNP-STRs的荧光复合扩增试剂盒对法医物证同一STR分型的样本可以分出不同的亚型。
1、收集案件中的血斑：样品由某公安局提供。
2、样品DNA提取：基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、PCR扩增及毛细管电泳分析。结果如图2、图3、图6。
本试剂盒实现了A-STR基因座和连锁SNP位点同步检测分析，原本需要两次的检验程序缩减到一次完成，减少了检测时间，提高了检测效率，从而增加了抓获犯罪嫌疑人的机会；另外一次检验减少了样品所需的绝对量，从而增加了犯罪嫌疑人遗留在案件现场的有效物证量，最终更多的物证信息增加了侦查线索。总而言之，随着刑事案件的增多，现有检测试剂盒已不能很好的满足公安实战对于法医DNA的快速检验和现场检验能力的要求，而A-STR和SNP一起检测，可以达到缩短检测时间的同时提高排除和确定犯罪嫌疑人的效率，图6显示，案件提取实际样本的扩增图谱，根据图谱分型可得出15个STR位点的基因座分型，同时检测出15个SNP位点的分型，具体分型如下表：
根据上表中信息可以看出：对不同常染色体STR基因座连锁的SNP位点进行扩增分型，可以得出不同等位基因的亚型，例如D3S1358的15号等位基因，有两种亚型分别是15C和15G，联合使用多个基因座，可很大程度提高试剂盒的个体识别率。
实施例5产前亲子鉴定
采用实施例1中的方案，利用该方案中新型遗传分子标记SNP-STRs的荧光复合扩增试剂盒对怀孕30-36周的孕妇外周血进行扩增检测，以期进行产前亲子鉴定。
1、收集怀孕30-36周孕妇的外周血：某医院提供；
2、样品DNA提取：基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2014法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3、PCR扩增及毛细管电泳分析。结果如图7。
怀孕30-36周的孕妇外周血中通常含有胎儿游离DNA，但由于含量少，周期短的原因，普通STR试剂盒无法扩增出游离胎儿DNA的分型，但本发明试剂盒具有较高的灵敏度，如图7所示，D7S820位点扩增出胎儿的DNA分型，和父亲的DNA进行对比发现，该基因座有一个同源等位基因来自于父亲，说明新型试剂盒在产前亲子鉴定领域有重大的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
<130>
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agaacacttg tcatagttta gaac 24
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<212> DNA
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agaacacttg tcatagttta gaat 24
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<212> DNA
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gtatctatca tccatctctg t 21
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gtatctatca tccatctctg g 21
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aggcagatcc caagctcttc 20
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tacattcatt aatatacatg 20
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<212> DNA
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gctcagggga ggaactggga acca 24
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ttggaagact gatgcagaaa gt 22
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atcttctctc tttcttcctc tct 23
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tcacactccg atgagctc 18
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actcagcttc agcccatacc g 21
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cttccttttc cctctactca g 21
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aattaggcat atttacaagc tag 23
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ccctgggctc tgtaaagaat ag 22
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<212> DNA
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<400> 47
ttccagtttc ctctttcag 19
Claims (10)
1.一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增以下DNA位点的引物；具体为15个SNP-STRs基因座：rs16887642-D7S820、rs11642858-D16S539、rs9531308-D13S317、rs13413321-TPOX、rs79373318-TH01、rs10414287-D19S433、rs17651965-CSF1PO、rs17077990-D3S1358、rs2070018-FGA、rs9678338-D2S1338、rs216870-vWA、rs11908851-D21S11、rs535823682-D18S51、rs57346531-D8S1179、rs25768-D5S818和1个性别基因座Amel。
2.根据权利要求1所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述基因座中每个SNP位点均紧密连锁一个STR位点，且二者被同时检测。
3.根据权利要求1所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述15个SNP-STRs基因座均包含两条正向引物及一条反向引物。
4.根据权利要求1所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述引物的序列为：rs16887642-D7S820，正向引物SEQ ID NO:1～2，反向引物SEQ ID NO:3；rs11642858-D16S539，正向引物SEQ ID NO:4～5，反向引物SEQ IDNO:6；rs9531308-D13S317，正向引物SEQ ID NO:7～8，反向引物SEQ ID NO:9；rs13413321-TPOX，正向引物SEQ ID NO:10～11，反向引物SEQ ID NO:12；rs79373318-TH01，正向引物SEQ ID NO:13～14，反向引物SEQ ID NO:15；rs10414287-D19S433，正向引物SEQ ID NO:16～17，反向引物SEQ ID NO:18；rs17651965-CSF1PO，正向引物SEQ ID NO:19～20，反向引物SEQ ID NO:21；rs17077990-D3S1358，正向引物SEQ ID NO:22～23，反向引物SEQ ID NO:24；rs2070018-FGA，正向引物SEQ ID NO:25～26，反向引物SEQ ID NO:27；Amel，正向引物SEQ ID NO:28，反向引物SEQ ID NO:29；rs9678338-D2S1338，正向引物SEQ ID NO:30～31，反向引物SEQ ID NO:32；rs216870-vWA，正向引物SEQ ID NO:33～34，反向引物SEQ ID NO:35；rs11908851-D21S11，正向引物SEQ ID NO:36～37，反向引物SEQ ID NO:38；rs535823682-D18S51，正向引物SEQ ID NO:39～40，反向引物SEQ ID NO:41；rs57346531-D8S1179，正向引物SEQ ID NO:42～43，反向引物SEQ ID NO:44；rs25768-D5S818，正向引物SEQ ID NO:45～46，反向引物SEQ ID NO:47。
5.根据权利要求1、3或4所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ ID NO:1，0.04μM；SEQID NO:2，0.06μM；SEQ ID NO:3，0.1μM；SEQ ID NO:4，0.06μM；SEQ ID NO:5，0.09μM；SEQ IDNO:6，0.12μM；SEQ ID NO:7，0.05μM；SEQ ID NO:8，0.08μM；SEQ ID NO:9，0.014μM；SEQ IDNO:10，0.08μM；SEQ ID NO:11，0.1μM；SEQ ID NO:12，0.2μM；SEQ ID NO:13，0.07μM；SEQ IDNO:14，0.1μM；SEQ ID NO:15，0.2μM；SEQ ID NO:16，0.08μM；SEQ ID NO:17，0.1μM；SEQ IDNO:18，0.2μM；SEQ ID NO:19，0.1μM；SEQ ID NO:20，0.12μM；SEQ ID NO:21，0.24μM；SEQ IDNO:22，0.12μM；SEQ ID NO:23，0.15μM；SEQ ID NO:24，0.3μM；SEQ ID NO:25，0.14μM；SEQID NO:26，0.21μM；SEQ ID NO:27，0.34μM；SEQ ID NO:28，0.02μM；SEQ ID NO:29，0.02μM；SEQ ID NO:30，0.18μM；SEQ ID NO:31，0.2μM；SEQ ID NO:32，0.4μM；SEQ ID NO:33，0.2μM；SEQ ID NO:34，0.24μM；SEQ ID NO:35，0.4μM；SEQ ID NO:36，0.3μM；SEQ ID NO:37，0.35μM；SEQ ID NO:38，0.6μM；SEQ ID NO:39，0.4μM；SEQ ID NO:40，0.46μM；SEQ ID NO:41，0.8μM；SEQ ID NO:42，0.48μM；SEQ ID NO:43，0.52μM；SEQ ID NO:44，0.8μM；SEQ ID NO:45，0.56μM；SEQ ID NO:46，0.6μM；SEQ ID NO:47，1.0μM。
6.根据权利要求1、3或4所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述SNP-STRs基因座的两条正向引物5’端采用不同荧光染料标记。
7.根据权利要求1、3或4所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，基因座rs16887642-D7S820、rs11642858-D16S539、rs9531308-D13S317、rs13413321-TPOX、rs79373318-TH01、rs10414287-D19S433、rs17651965-CSF1PO、rs17077990-D3S1358、rs2070018-FGA的两条正向引物的5’端荧光标记为6-FAM或HEX；基因座rs9678338-D2S1338、rs216870-vWA、rs11908851-D21S11、rs535823682-D18S51、rs57346531-D8S1179及rs25768-D5S818的两条正向引物的5’端荧光标记为TAMRA或ROX；性别基因座Amel的正向引物的5’端荧光标记为TAMRA或ROX。
8.根据权利要求1所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒引物以外的组分为反应缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、Allelic Ladder以及荧光分子量内标，所述反应缓冲液为Tris-HCl 50mM、KCl 50mM、MgCl22.0mM和dNTPs 0.2mM，BSA 0.8mg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种同时扩增人常染色体SNP和STR位点的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为：变性，95℃2min；10个循环，94℃30s，60℃1min，72℃1min；20个循环，90℃30s，58℃1min，72℃1min；终止延伸，60℃30min；4℃保温维持。
10.权利要求1所述试剂盒在个体识别、产前亲子鉴定、法医领域的不均衡性混合样本、案件排查或常染色体数据库中的应用。
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