TWI732303B - 一種用於偵測魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus,PMCV)的寡核苷酸對及探針 - Google Patents

一種用於偵測魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus,PMCV)的寡核苷酸對及探針 Download PDF

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Abstract

本發明涉及一種檢測魚病原體的方法。此外，本發明並涉及用於檢測魚病原體的寡核苷酸對。

Description

一種用於偵測魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus, PMCV)的寡核苷酸對及探針
本發明關於檢測魚病原體的方法，特別是關於使用寡核苷酸對檢測魚病原體的方法。
水產動物是人類重要的能量、蛋白質與必需營養的來源之一。大量捕撈野生水產動物對海洋資源耗盡的疑慮，使得水產養殖業日益受到重視。根據聯合國糧食及農業組織的統計，水產養殖對全球捕撈及養殖總產量的貢獻逐步提升，從2000年的25.7%增至2016年的46.8%。然而，密集養殖加上管理不良可能造成水產動物容易感染疾病、死亡，而造成漁民的損失。此外，水產動物的病害多由細菌或病毒引起，細菌性疾病與病毒性疾病的處理方法相差甚遠，一旦誤診，處理不當，就會造成巨大的損失。由此可見，在飼養漁場、蝦場密集監控疾病對管理而言是不可或缺的一環。本發明即提供了快速、方便的魚病原體檢測方法以供產業利用。
於一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法，包含提供一可能含有一魚病原體的一或多個核苷酸序列的樣本；提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates, dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates, dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates, dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates, dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)混合物；透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(convective polymerase chain reaction, cPCR)，以形成一PCR產物；以及偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制。
於另一方面，本發明涉及一種用於偵測魚病原體的寡核苷酸對，包含一第一引子與一第二引子。
在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針具有一寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(Piscine reovirus, PRV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10，以及SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 12。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(PRV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 2時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因(GenBank accession No. KY429943)的第71至第95個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 3所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(PRV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 2時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因(GenBank accession No. KY429943)的第52至第95個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 3所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(PRV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 4與SEQ ID NO: 5時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因(GenBank accession No. KY429943)的第52至第100個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 3所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(PRV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 6與SEQ ID NO: 7時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的Sigma 3蛋白基因(GenBank accession No. KX844958)的第343至第385個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 8所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(PRV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 9與SEQ ID NO: 10時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的Sigma 3蛋白基因(GenBank accession No. KX844958)的第350至第380個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 8所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚呼吸道與腸道病毒(PRV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 11與SEQ ID NO: 12時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因(GenBank accession No. KY429943)的第280至第315個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 13所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 21，以及SEQ ID NO: 23與SEQ ID NO: 24。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性胰臟壞死病毒(IPNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 14與SEQ ID NO: 15時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白(polyprotein)基因(GenBank accession No. KY548514)的第2010至第2057個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 16所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性胰臟壞死病毒(IPNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 17與SEQ ID NO: 18時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白(polyprotein)基因(GenBank accession No. KY548514)的第2345至第2408個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 19所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性胰臟壞死病毒(IPNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 20與SEQ ID NO: 21時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白(polyprotein)基因(GenBank accession No. KY548514)的第2533至第2580個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 22所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性胰臟壞死病毒(IPNV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 23與SEQ ID NO: 24時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白(polyprotein)基因(GenBank accession No. KY548514)的第2775至第2818個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 25所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性鮭魚貧血病毒(Infectious salmon anemia virus, ISAV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29與SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32與SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 35與SEQ ID NO: 36，以及SEQ ID NO: 37與SEQ ID NO: 38。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 27時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的開放讀碼框(Open reading frame, ORF) 1與ORF2基因(GenBank accession No. KX424589)的第282至第328個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 28所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 29與SEQ ID NO: 30時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的ORF1與ORF2基因(GenBank accession No. KX424589)的第79至第121個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 31所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 32與SEQ ID NO: 33時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的ORF1與ORF2基因(GenBank accession No. KX424589)的第244至第273個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 34所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 35與SEQ ID NO: 36時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的ORF1與ORF2基因(GenBank accession No. KX424589)的第237至第272個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 34所示。
在某些具體實施例中，該病原體為感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 37與SEQ ID NO: 38時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的ORF1與ORF2基因(GenBank accession No. KX424589)的第235至第286個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 34所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus, PMCV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 39與SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 42與SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 45與SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 48與SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 51與SEQ ID NO: 49，以及SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 49。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(PMCV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 39與SEQ ID NO: 40時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的第6266至第6306個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 41所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(PMCV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 42與SEQ ID NO: 43時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的第5632至第5672個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 44所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(PMCV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 45與SEQ ID NO: 46時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的第5693至第5747個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 47所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(PMCV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 48與SEQ ID NO: 49時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的第6294至第6331個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 50所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(PMCV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 51與SEQ ID NO: 49時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的第6271至第6331個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 50所示。
在某些具體實施例中，該病原體為魚心肌炎病毒(PMCV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 52與SEQ ID NO: 49時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的第6290至第6331個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 50所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚甲病毒(Salmonid alphavirus, SAV)，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 53與SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 56與SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 59與SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 63，以及SEQ ID NO: 65與SEQ ID NO: 66。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚甲病毒(SAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 53與SEQ ID NO: 54時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚甲病毒(SAV)的基因組(GenBank accession No. KC122926)的第611至第653個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 55所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚甲病毒(SAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 56與SEQ ID NO: 57時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚甲病毒(SAV)的基因組(GenBank accession No. KC122926)的第145至第181個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 58所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚甲病毒(SAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 59與SEQ ID NO: 60時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚甲病毒(SAV)的基因組(GenBank accession No. KC122926)的第2691至第2761個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 61所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚甲病毒(SAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 62與SEQ ID NO: 63時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚甲病毒(SAV)的基因組(GenBank accession No. KC122926)的第1032至第1075個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 64所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚甲病毒(SAV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 65與SEQ ID NO: 66時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚甲病毒(SAV)的基因組(GenBank accession No. KC122926)的第969至第1011個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 67所示。
在某些具體實施例中，該病原體為佩魯蘭新副變形蟲(Neoparamoeba perurans )，且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 68與SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 71與SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 74與SEQ ID NO: 75，以及SEQ ID NO: 77與SEQ ID NO: 78。
在某些具體實施例中，該病原體為佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 68與SEQ ID NO: 69時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S核糖體核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因(GenBank accession No. KU985058)的第462至第520個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 70所示。
在某些具體實施例中，該病原體為佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 71與SEQ ID NO: 72時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S rRNA基因(GenBank accession No. KU985058)的第355至第405個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 73所示。
在某些具體實施例中，該病原體為佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 74與SEQ ID NO: 75時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S rRNA基因(GenBank accession No. KU985058)的第234至第281個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 76所示。
在某些具體實施例中，該病原體為佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 77與SEQ ID NO: 78時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S rRNA基因(GenBank accession No. KU985058)的第357至第380個核苷酸之間的13至24個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 79所示。
在某些具體實施例中，該病原體為Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 80與SEQ ID NO: 81，以及SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 84。
在某些具體實施例中，該病原體為Ca. B. cysticola (CBc)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 80與SEQ ID NO: 81時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體Ca. B. cysticola 的16S核糖體核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因(GenBank accession No. JQ723599)的第1068至第1125個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 82所示。
在某些具體實施例中，該病原體為Ca. B. cysticola (CBc)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 83與SEQ ID NO: 84時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體Ca. B. cysticola 的16S rRNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第1212至第1241個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 85所示。
在某些具體實施例中，該病原體為微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 92與SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 95與SEQ ID NO: 97，以及SEQ ID NO: 96與SEQ ID NO: 97。
在某些具體實施例中，該病原體為微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 86與SEQ ID NO: 87時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲D. lepeophtherii 的16S核糖體核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因(GenBank accession No. JQ723599)的第967至第1010個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 88所示。
在某些具體實施例中，該病原體為微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 89與SEQ ID NO: 90時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲D. lepeophtherii 的16S rRNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第1246至第1285個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 91所示。
在某些具體實施例中，該病原體為微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 92與SEQ ID NO: 93時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲D. lepeophtherii 的16S rRNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第1366至第1414個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 94所示。
在某些具體實施例中，該病原體為微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 95與SEQ ID NO: 97時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲D. lepeophtherii 的16S rRNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第815至第859個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 98所示。
在某些具體實施例中，該病原體為微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 96與SEQ ID NO: 97時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體微孢子蟲D. lepeophtherii 的16S rRNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第817至第859個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 98所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腮痘病毒(Salmon gill poxvirus, SGPV)且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 99與SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 102與SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 105與SEQ ID NO: 106，以及SEQ ID NO: 108與SEQ ID NO: 109。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腮痘病毒(SGPV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 99與SEQ ID NO: 100時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組(GenBank accession No. KT159937)的第99272至第99318個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 101所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腮痘病毒(SGPV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 102與SEQ ID NO: 103時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組(GenBank accession No. KT159937)的第123213至第123239個核苷酸之間的13至27個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 104所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腮痘病毒(SGPV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 105與SEQ ID NO: 106時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組(GenBank accession No. KT159937)的第123202至第123232個核苷酸之間的13至30個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 107所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腮痘病毒(SGPV)，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 108與SEQ ID NO: 109時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組(GenBank accession No. KT159937)的第123556至第123610個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 110所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚立克次體(Piscirickettsia salmonis )且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 111與SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114與SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116與SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 119與SEQ ID NO: 120，以及SEQ ID NO: 122與SEQ ID NO: 123。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚立克次體(P. salmonis )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 111與SEQ ID NO: 112時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S核糖體核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因(GenBank accession No. AY498634)的第952至第1065個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 113所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚立克次體(P. salmonis )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 114與SEQ ID NO: 115時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S rRNA基因(GenBank accession No. AY498634)的第1014至第1050個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 113所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚立克次體(P. salmonis )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 116與SEQ ID NO: 117時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S rRNA基因(GenBank accession No. AY498634)的第315至第331個核苷酸之間的13至17個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 118所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚立克次體(P. salmonis )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 119與SEQ ID NO: 120時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S rRNA基因(GenBank accession No. AY498634)的第529至第545個核苷酸之間的13至17個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 121所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚立克次體(P. salmonis )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 122與SEQ ID NO: 123時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S rRNA基因(GenBank accession No. AY498634)的第1181至第1200個核苷酸之間的13至20個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 124所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(Renibacterium salmoninarum )且該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 126與SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 127與SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 130與SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 133與SEQ ID NO: 134，以及SEQ ID NO: 136與SEQ ID NO: 137。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(R. salmoninarum )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 125與SEQ ID NO: 128時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(extracellular protein precursor, ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)的第1035至第1065個核苷酸之間的13至31個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 129所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(R. salmoninarum )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 126與SEQ ID NO: 128時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)的第1024至第1065個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 129所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(R. salmoninarum )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 127與SEQ ID NO: 128時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)的第1037至第1065個核苷酸之間的13至29個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 129所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(R. salmoninarum )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 130與SEQ ID NO: 131時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)的第782至第806個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 132所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(R. salmoninarum )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 133與SEQ ID NO: 134時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)的第880至第964個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 135所示。
在某些具體實施例中，該病原體為鮭魚腎菌(R. salmoninarum )，且當該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO: 136與SEQ ID NO: 137時，該寡核苷酸探針序列為一介於該病原體鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)的第646至第738個核苷酸之間的13至35個鹼基對的寡核苷酸；在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO: 138所示。
於一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法。在某些具體實施例中，該方法為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)。在某些具體實施例中，該方法為反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)。在某些具體實施例中，該方法為熱對流聚合酶連鎖反應(convective polymerase chain reaction, cPCR)。在某些具體實施例中，該方法為即時聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)。
於一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法，包含: 提供一可能含有魚病原體的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)，以形成一PCR產物；以及 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於另一方面，本發明涉及一種魚病原體檢測方法，包含: 提供一可能含有魚病原體的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該寡核苷酸引子對定義在該病原體的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)，以形成一PCR產物；以及 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於又一方面，本發明涉及一種用於偵測魚病原體的寡核苷酸對。
於再一方面，本發明涉及一種用於偵測魚病原體的寡核苷酸對與寡核苷酸探針。
應當進一步理解的是，在某些具體實施例中，本文揭露的寡核苷酸對及/或寡核苷酸探針可用於各種基礎PCR技術之變異，例如，但不限於，反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)、即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR)，以及熱不對稱性交錯聚合酶連鎖反應(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)。
如本文所用，術語「魚病原體」意指在魚生物體內外發現的病毒性、細菌性及寄生性病原體。魚病原體的實例如，但不限於：魚呼吸道與腸道病毒(Piscine reovirus, PRV)、感染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(Infectious salmon anemia virus, ISAV)、魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus, PMCV)、鮭魚甲病毒(Salmonid alphavirus, SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(Neoparamoeba perurans )、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(Salmon gill poxvirus, SGPV)、鮭魚立克次體(Piscirickettsia salmonis )，以及鮭魚腎菌(Renibacterium salmoninarum )。
如本文所用，術語「熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)」是指一種聚合酶連鎖反應，其中，將一裝有一PCR樣品的管狀容器底部嵌入一穩定熱源中，並控制該PCR的參數，包括該PCR樣品的總體積、黏度、表面溫度，以及該管狀容器的內徑，使得該PCR樣品的底部到頂部的溫度梯度下降，誘導熱對流並且使得PCR樣品的變性、黏合、聚合在該管狀容器的不同區域中依序且重複發生。熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)的詳細描述請參見如美國專利號8,187,813，其以引用的方式將其整體併入本文。
如本文所用，術語「螢光分子」意指一物質或其一部份，其係能夠在可偵測的範圍內顯示螢光。如本文所用，術語「螢光抑制分子」意指一物質或其一部份，其係能夠抑制當由一光源激發時由該螢光分子所發射的螢光。在某些具體實施例中，術語「螢光分子」與「螢光抑制分子」為TaqMan™分析套組(Applied Biosystems Inc.，加州，美國)的螢光分子與螢光抑制分子。TaqMan™分析套組的詳細描述請參見如，Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276- 7280；美國專利號5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式將其整體併入本文。
該螢光分子的例子包括，但不限於，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine, CYA)、6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、5,6-羧基羅丹明-L LO (5,6-carboxyrhodamine-l lO, R110)、6羧基羅丹明-6G (6- carboxyrhodamine-6G, R6G)、N’,N’,N’,N’ -四甲基-6-羧基羅丹明(N’,N’,N’,N’ -tetramethyl-6-carboxyrhodamine, TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(6-carboxy-X-rhodamine, ROX)、2’,4’,5’,7’-四氯4-7-二氯螢光素(2’,4’,5’,7’-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein, TET)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基羅丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6 carboxyrhodamine, JOE)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯熒光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein, HEX)、ALEXA螢光、Cy3螢光與Cy5螢光。該螢光抑制分子的例子包括，但不限於，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid, Dabcyl)、黑洞螢光抑制劑1 (Black Hole Quencher 1, BHQ1)、黑洞螢光抑制劑2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞螢光抑制劑3 (Black Hole Quencher 3, BHQ3)、二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(dihydro cyclo pyrrolo indole tripeptide minor groove binder, MGB)、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine, TAMRA)。在某些具體實施例中，該螢光分子為6-羧基螢光素(FAM)，且該螢光抑制分子為二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(MGB)。在某些具體實施例中，該螢光分子為6-羧基螢光素(FAM)，且該螢光抑制分子為黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1)或二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(MGB)。
除非本文另有定義，否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行。一般而言，本文所描述之用以連結以下技術的命名法，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學與蛋白質及核酸化學及雜合反應的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明，本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行，且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。
實施例
實施例 1 病原體魚呼吸道與腸道病毒 ( PRV) 的檢測
病原體魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因(GenBank accession No. KY429943)以及Sigma 3蛋白基因(GenBank accession No. KX844958)的片段分別被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pPRV-L1以及pPRV-S3質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pPRV-L1或pPRV-S3質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠(ethidium bromide)染色顯現。
傳統PCR的結果如表1所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的存在。 【表1】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0001
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因或Sigma 3蛋白基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pPRV-L1或pPRV-S3質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表2所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因或Sigma 3蛋白基因的RNA或102 個拷貝數的pPRV-L1或pPRV-S3質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表2】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0002
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表3所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的樣品，而偵測不到含有感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表3】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0003
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pPRV-L1或pPRV-S3質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pPRV-L1或pPRV-S3質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pPRV-L1或pPRV-S3質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pPRV-L1或pPRV-S3質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 2 病原體感染性胰臟壞死病毒 ( IPNV) 的檢測
病原體感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白(polyprotein)基因(GenBank accession No. KY548514)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pIPNV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pIPNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表4所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的存在。 【表4】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0004
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pIPNV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表5所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的VP5與多聚蛋白基因的RNA或102 個拷貝數的pIPNV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表5】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0005
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表6所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表6】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0006
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pIPNV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pIPNV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pIPNV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少10個拷貝數的pIPNV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 3 病原體感染性鮭魚貧血病毒 (ISAV) 的檢測
病原體感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的開放讀碼框(ORF) 1與ORF2基因(GenBank accession No. KX424589)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pISAV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pISAV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表7所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的存在。 【表7】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0007
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的ORF1與ORF2基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pISAV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表8所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的ORF1與ORF2基因的RNA或102 個拷貝數的pISAV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表8】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0008
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表9所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的樣品，而偵測不到含有感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表9】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0009
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pISAV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pISAV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pISAV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pISAV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 4 病原體魚心肌炎病毒 (PMCV) 的檢測
病原體魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組(GenBank accession No. HQ339954)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pPMCV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pPMCV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表10所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測魚心肌炎病毒(PMCV)的存在。 【表10】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0010
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組片段的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pPMCV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表11所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的魚心肌炎病毒(PMCV)的基因組片段的RNA或102 個拷貝數的pPMCV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表11】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0011
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表12所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有魚心肌炎病毒(PMCV)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表12】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0012
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pPMCV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pPMCV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pPMCV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pPMCV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測魚心肌炎病毒(PMCV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 5 病原體鮭魚甲病毒 (SAV) 的檢測
病原體鮭魚甲病毒(SAV)的基因組(GenBank accession No. KC122926)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pSAV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pSAV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表13所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測鮭魚甲病毒(SAV)的存在。 【表13】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0013
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl鮭魚甲病毒(SAV)的基因組片段的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pSAV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表14所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的鮭魚甲病毒(SAV)的基因組片段的RNA或102 個拷貝數的pSAV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表14】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0014
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表15所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有鮭魚甲病毒(SAV)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表15】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0015
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pSAV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pSAV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pSAV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pSAV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測鮭魚甲病毒(SAV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 6 病原體佩魯蘭新副變形蟲 (N. perurans ) 的檢測
佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )為造成阿米巴腮病(Amoebic gill disease, AGD)的病原體。佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S核糖體核糖核酸(rRNA)基因(GenBank accession No. KU985058)的片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pAGD質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pAGD質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表16所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的存在。 【表16】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0016
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S rRNA基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pAGD質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表17所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的18S rRNA基因的RNA或102 個拷貝數的pAGD質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表17】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0017
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表18所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表18】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0018
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pAGD質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pAGD質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pAGD質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pAGD質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans )的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 7 病原體 Ca. B. cysticola (CBc) 的檢測
病原體Ca. B. cysticola (CBc)的16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因(GenBank accession No. JQ723599)片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pCBc質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pCBc質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表19所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測Ca. B. cysticola (CBc)的存在。 【表19】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0019
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µlCa. B. cysticola (CBc)的16S rRNA基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pCBc質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表20所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的Ca. B. cysticola (CBc)的16S rRNA基因的RNA或102 個拷貝數的pCBc質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表20】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0020
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表21所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表21】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0021
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pCBc質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pCBc質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pCBc質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pCBc質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測Ca. B. cysticola (CBc)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 8 病原體微孢子蟲 D. lepeophtherii (Des) 的檢測
病原體微孢子蟲D. lepeophtherii (Des)的16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因(GenBank accession No. JQ723599)片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pDes質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pDes質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表22所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測微孢子蟲D. lepeophtherii (Des)的存在。 【表22】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0022
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl微孢子蟲D. lepeophtherii (Des)的16S rRNA基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pDes質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表23所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的微孢子蟲D. lepeophtherii (Des)的16S rRNA基因的RNA或102 個拷貝數的pDes質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表23】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0023
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表24所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表24】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0024
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pDes質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pDes質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pDes質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pDes質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測微孢子蟲D. lepeophtherii (Des)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 9 病原體鮭魚腮痘病毒 (SGPV) 的檢測
病原體鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組(GenBank accession No. KT159937)片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pSGPV質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pSGPV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表25所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測鮭魚腮痘病毒(SGPV)的存在。 【表25】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0025
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組片段的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pSGPV質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表26所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的鮭魚腮痘病毒(SGPV)的基因組片段的RNA或102 個拷貝數的pSGPV質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表26】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0026
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表27所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有鮭魚腮痘病毒(SGPV)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表27】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0027
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pSGPV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pSGPV質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pSGPV質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pSGPV質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測鮭魚腮痘病毒(SGPV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 10 病原體鮭魚立克次體 (P. salmonis ) 的檢測
鮭魚立克次體(P. salmonis )為造成魚類立克次體症(Salmonid Rickettsial Septicaemia, SRS)的病原體。鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因(GenBank accession No. AY498634)片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pSRS質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pSRS質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表28所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測鮭魚立克次體(P. salmonis )的存在。 【表28】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0028
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S rRNA基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pSRS質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表29所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的鮭魚立克次體(P. salmonis )的16S rRNA基因的RNA或102 個拷貝數的pSRS質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表29】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0029
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表30所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV)，以及鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表30】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0030
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pSRS質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pSRS質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pSRS質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pSRS質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測鮭魚立克次體(P. salmonis )的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 11 病原體鮭魚腎菌 (R. salmoninarum ) 的檢測
鮭魚腎菌(R. salmoninarum )為造成魚類細菌性腎病(Bacterial kidney disease, BKD)的病原體。鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因(GenBank accession No. Z12174)片段被插入一選殖載體中，該選殖載體可為，但不限於，pUC57、pGEM-T，以得到pBKD質體。
1. 傳統聚合酶連鎖反應
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：106 個拷貝數的pBKD質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94o C持續3分鐘，以及35個循環的94o C 30秒、60o C 30秒以及72o C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如表31所示，各引子對擴增了各目標序列的正確大小的片段，而在負對照組中則無目標序列被擴增(結果未顯示)。該結果表明，各引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的存在。 【表31】各引子對與探針組合進行傳統PCR的結果
Figure 108135518-A0304-0031
2. 熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)
50 µl的PCR混合物含有5 µl鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因的RNA (分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 拷貝數/µl)或pBKD質體(分別為102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))、0.2 µM dNTP、1X cPCR緩衝液，以及1-5 U Taq DNA聚合酶、1-5 U反轉錄酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一熱對流聚合酶連鎖反應(cPCR)儀中一段指定的時間(約30~45分鐘)。以該cPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。重複上述cPCR分析試驗8次(n = 8)以評各估引子對與探針的敏感度。
敏感度測試的結果如表32所示，各引子對及探針的組合皆可100%正確偵測到樣品中含有102 拷貝數/µl的鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的57KD細胞外蛋白前體(ECP)基因的RNA或102 個拷貝數的pBKD質體，其敏感度可達102 拷貝數/µl及102 個拷貝數。 【表32】各引子對與探針組合的敏感度測試結果(n = 8)
Figure 108135518-A0304-0032
此外，以不同的魚病原體基因質體(106 拷貝數/µl)作為cPCR模板分析上述各引子對及探針組合的專一性。cPCR方法如上所述。專一性測試的結果如表33所示，各引子對及探針的組合皆可正確偵測到含有鮭魚腎菌(R. salmoninarum ，在表中以BKD表示)的樣品，而偵測不到含有魚呼吸道與腸道病毒(PRV)、感染性胰臟壞死病毒(IPNV)、感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)、魚心肌炎病毒(PMCV)、鮭魚甲病毒(SAV)、佩魯蘭新副變形蟲(N. perurans ，在表中以AGD表示)、Candidatus Branchiomonas cysticola (CBc)、微孢子蟲Desmozoon lepeophtherii (Des)、鮭魚腮痘病毒(SGPV) ，以及鮭魚立克次體(P. salmonis ，在表中以SRS表示)的樣品。該結果顯示各引子對及探針組合具有專一性。 【表33】各引子對與探針組合的專一性測試結果
Figure 108135518-A0304-0033
 “+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
3. 即時聚合酶連鎖反應 (real-time PCR, qPCR)
以稀釋的pBKD質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pBKD質體、0.01-2 µM正向引子、0.01-2 µM反向引子、0.01-2 µM探針(各探針序列的5’端及3’端分別接合一螢光分子6-羧基螢光素(FAM)以及一螢光抑制分子黑洞螢光抑制劑1 (BHQ1))，總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42o C 5分鐘、94o C 10秒，以及40個循環的94o C 10秒以及60o C 30分鐘。在60o C的步驟中記錄螢光測量的結果並計算。連續稀釋(10倍)的pBKD質體的即時PCR分析的標準曲線。結果顯示，至少102 個拷貝數的pBKD質體可被偵測到，且各引子對與探針組合的標準曲線的R2 值皆大於0.99，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
上述實施例結果表明，本發明的引子對與探針可用於cPCR擴增反應以檢測鮭魚腎菌(R. salmoninarum )的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
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Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024

Claims (1)

  1. 一種用於偵測魚心肌炎病毒(Piscine myocarditis virus,PMCV)的寡核苷酸對及探針，包含一第一引子與一第二引子，該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：39與SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42與SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48與SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：49，以及SEQ ID NO：52與SEQ ID NO：49；以及一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針具有一寡核苷酸探針序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，其中該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：39與SEQ ID NO：40時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：41所示；該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：42與SEQ ID NO：43時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：44所示；該第一引子與該第二引子的序列組合為SEQ ID NO：45與SEQ ID NO：46時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：47所示；以及該第一引子與該第二引子的序列組合選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO：48與SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51與SEQ ID NO：49，以及SEQ ID NO：52與SEQ ID NO：49時，該寡核苷酸探針序列如SEQ ID NO：50所示。
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