CN117512165A - 一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及病原菌检测生物技术领域，公开了一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，包括RPA扩增体系、CRISPR/Cas检测体系和侧向流试纸条；RPA扩增体系包括LI‑F/LI‑R引物对和DH‑F/DH‑R引物对，LI‑F/LI‑R引物对包括Seq ID No.1和Seq ID No.2；DH‑F/DH‑R引物对包括Seq ID No.3和Seq ID No.4；CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a。本方案通过优化设计两对引物，即LI‑F/LI‑R引物对和DH‑F/DH‑R引物对，其中LI‑F/LI‑R引物扩增向日葵黑茎病菌的基因组DNA；而通过在DH‑F/DH‑R引物对中添加“GGG”的启动子序列，使得该引物扩增向日葵茎溃疡病菌基因组DNA的扩增产物为RNA；便于在同时扩增时分别形成向日葵黑茎病菌基因组核酸的DNA产物和向日葵茎溃疡病菌基因组核酸的RNA产物，从而可以采用两种检测方式同时对两种目标病原物进行检测，避免相互干扰。
Description
技术领域
本发明涉及病原菌检测生物技术领域，具体涉及一种一管法同时检测两种向日葵茎部真菌病害的检测试剂盒及使用方法。
背景技术
向日葵是我国重要的油料作物之一，栽培面积仅次于大豆和油菜，不仅具有重要的经济价值，还有观赏价值、药用价值。向日葵黑茎病菌(Leptosphaeria lindquistii)和向日葵茎溃疡病菌(Diaporthe helianthi)是侵染向日葵茎部的两种毁灭性有害生物，分别于2007年和2010年被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。为防止检疫性有害生物的传入及扩散，需持续加强进境向日葵检验检疫和田间种植监测。
目前针对向日葵种子的病菌检疫鉴定，大多按照出入境检验检疫行业标准《向日葵黑茎病菌检疫鉴定方法》(SN/T 3174-2012)和《向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法》(GB/T31792-2015)，分别进行检查。检查方法包括症状检查、分离培养有疑似症状的带病组织、单菌落挑选和纯化、显微镜观察、核酸提取、通用引物常规PCR并测序、特异性引物和探针的实时荧光PCR检测等步骤，整个过程不仅耗时长，而且需要专业技术人员进行形态学鉴定以及专门的实验室仪器进行分子鉴定，不适合在田间对向日葵检疫性真菌病害进行快速筛查与检测。
针对发生在同样部位、具有相似症状的植物病原物进行同时检测和特异性鉴定，具有相当难度和挑战性。现有技术曾报道采用三重PCR技术同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌(CN 102943118 B：同步检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的三重PCR引物及其扩增方法和用途)，以及采用DPO-PCR同时检测向日葵黑茎病菌和向日葵白锈病菌(CN 104946638 A：一种向日葵白锈病菌和黑茎病菌的多重DPO-PCR检测试剂盒及其应用)。但这些基于PCR的方法需要热循环设备、凝胶电泳仪、实时荧光PCR仪等专门设备，耗时长、灵敏度不高，限制了其在实验室之外的诊断应用；且现有两种病菌DNA同时扩增时，易相互干扰，使得扩增产物之间可能出现混合体，进而“污染”扩增结果，使得检测结果不准确。
因此，建立一种快速、灵敏、同步检测向日葵茎部两种真菌病害的方法，不仅有效弥补现有技术的不足，还能为口岸快速检疫以及田间早期诊断提供新技术，具有重要意义。
发明内容
本发明意在提供一种一管法同时检测两种向日葵茎部真菌病害的检测试剂盒及使用方法，以解决现有技术同时检测向日葵茎部的两种病原物灵敏度不高的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒，包括RPA扩增体系、CRISPR/Cas检测体系和侧向流试纸条；所述RPA扩增体系包括LI-F/LI-R引物对和DH-F/DH-R引物对，所述LI-F/LI-R引物对包括Seq ID No.1和Seq ID No.2；DH-F/DH-R引物对包括Seq ID No.3和Seq ID No.4；所述CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a。
本方案的原理及优点是：
1、相比于现有技术中因两种DNA同时扩增容易出现“污染”现象使得检测结果不准确而言，本方案通过优化设计两对引物，即LI-F/LI-R引物对和DH-F/DH-R引物对，其中LI-F/LI-R引物对扩增向日葵黑茎病菌基因组核酸，得到DNA扩增产物；而通过在DH-F/DH-R引物对中添加“GGG”的启动子序列，使得该引物扩增向日葵茎溃疡病菌基因组核酸的同时，得到RNA扩增产物；如此，便于在同时扩增时分别形成靶定于向日葵黑茎病菌核酸的DNA产物和向日葵茎溃疡病菌核酸的RNA产物，从而可以采用2种检测方式同时对2种目标病原物进行检测，避免相互干扰扩增结果。
2、本发明利用CRISPR/Cas12(Cpf1)和CRISPR/Cas13(C2c2)特异性识别核酸的特性，分别识别向日葵黑茎病菌的DNA产物和向日葵茎溃疡病菌的RNA产物，同时切割相应的报告分子，形成不同的切割产物，再通过侧向流试纸条(胶体金试纸条)上的不同抗体对切割产物的捕获，直接读取检测结果，实现对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡菌的基因组核酸的同时检测，具有高灵敏度、高特异性及快速可视化检测的优点。
优选的，所述RPA扩增体系包括扩增反应酶干粉(包含Bsu聚合酶、重组酶、单链DNA结合蛋白和dNTP混合物)、酶干粉溶解缓冲液、醋酸镁和转录试剂，所述转录试剂包括T7RNAPolymerase Mix，NTP Buffer Mix，二硫苏糖醇(DTT)；所述转录试剂与RPA扩增体系试剂放置于同管不同位置。
有益效果：本方案采用上述设置，便于在扩增样品DNA时，通过翻转或离心的方式将反应管盖子内侧转录试剂释放，即可快速扩增-转录反应获得向日葵茎溃疡病菌核酸的RNA产物，使得向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的基因组核酸以不同形式扩增富集，便于同时对两种病菌进行检测，提高检测效率。
优选的，所述CRISPR/Cas检测体系还包括1×NEBuffer 3.1(10mM NaCl,5mMTris-HCl,1mM MgCl2,10μg/mL)、LI crRNA、DH crRNA、探针和无酶无菌水。
有益效果：本方案采用上述设置，便于扩增产物在CRISPR/Cas检测体系中被特异性识别的同时启动CRISPR/Cas的单碱基切割活性而切割报告分子，从而放大扩增产物信号而被侧向流试纸条或荧光检测仪识别。
优选的，所述报告分子包括胶体金试纸条报告分子或荧光报告分子。
有益效果：本方案采用上述设置，便于以荧光检测仪(包括手持式荧光笔)或者胶体金试纸条上的抗体检测CRISPR/Cas检测体系中的切割产物，从而快速识别检测样品中是否含有向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌核酸中的一种或两种，实现向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的快速同时检测。
优选的，所述侧向流试纸条上包含抗体标记金纳米、链霉亲和素、地高辛抗体和羊抗鼠二抗(IgG)，侧向流试纸条报告分子包括侧向流试纸条DNA报告分子和侧向流试纸条RNA报告分子，所述侧向流试纸条DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-抗原分子-CCCCCCCCCCCCCCC-Biotin-3'，所述侧向流试纸条RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-抗原分子-UUUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3'，所述抗原分子为抗原分子为羧基荧光素(FAM)、荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、地高辛(Dig)中任一种。
有益效果：本方案采用上述设置，便于在检测阶段，通过CRISPR/Cas检测体系中的报告分子与侧向流试纸条上的金标抗体特异性结合，形成的大分子被试纸条上控制线、检测线上位置的不同分子捕获，形成特异性条带，从而便于快速辨别检测样品中水会否含有目标菌(本方案试剂盒检测的目标菌为向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌)。
优选的，所述荧光探针包括荧光DNA报告分子和荧光RNA报告分子，所述荧光DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-荧光基团-CCACC-淬灭基团-3'；所述荧光RNAreporter的序列为供Cas13a切割的5'-荧光基团-UUUUU-淬灭基团-3'，所述荧光基团为FAM、FITC、菁染料(Cy5)或其它与检测器激发波长和发射波长匹配的荧光基团；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、其它可淬灭荧光基团的物质。
优选的，所述Cas12a识别的靶向序列的crRNA为LI-crRNA1或LI-crRNA2，所述LI-crRNA1为Seq ID No.5，所述LI-crRNA2为Seq ID No.6；所述Cas13a识别的靶向序列的crRNA为DH-crRNA，所述DH-crRNA为Seq ID No.7。
有益效果：本方案采用上述设置，便于Cas12a和Cas13在检测阶段分别识别不同病菌的核酸扩增片段，同时特异性切割不同的报告分子，获得能特异性识别检测的切割片段，从而实现两种病菌的一管法同时检测。
本方案还提供一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒的使用方法，基于上述一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒步骤，包括将待测样品DNA添加至RPA扩增体系中扩增获得扩增产物后，将扩增产物添加进CRISPR/Cas检测体系中获得包含切割片段的检测溶液，再通过侧向流试纸条或荧光检测仪对检测溶液中结果进行显示。
有益效果：本发明系首次采用两种CRISPR/Cas蛋白同时检测2种发生在向日葵茎部的病原物基因组核酸，一个切割DNA报告分子，一个切割RNA报告分子，并通过对报告分子进行不同基团的修饰，从而实现在一管中同时扩增两种真菌基因组核酸，并且在同一张侧向流试纸条上进行同时检测，具有灵敏度高、特异性好、耗时短、不依赖大型实验设备等优势。这此优势使得本发明开发的胶体金试纸条检测方法方便用于田间病害调查和基层实验室对2种向日葵茎部病害的快速检测和鉴定诊断。
附图说明
图1为本发明实施例中采用胶体金试纸条检测试剂盒中侧向流试纸条检测原理示意图。
图2为本发明实施例中采用胶体金试纸条检测试剂盒检测待测样品后的结果示意图。
图3为本发明实施例中采用荧光检测试剂盒检测待测样品后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道有信号的结果示意图。
图4为本发明实施例中采用荧光检测试剂盒检测待测样品后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道有信号的结果示意图。
图5为本发明实施例中采用荧光检测试剂盒检测待测样品后在实时荧光PCR仪中465/510nm和618/660nm均有信号的结果示意图。
图6展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道的特异性检测结果。
图7展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵茎溃疡病菌后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道的特异性检测结果。
图8展示采用胶体金试纸条检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌后在胶体金试纸条的特异性检测结果。
图9展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道的灵敏性检测结果。
图10展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵茎溃疡病菌后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道的灵敏性检测结果。
图11展示采用胶体金试纸条检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌后在胶体金试纸条的灵敏性检测结果。
图12展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道的检测结果。
图13展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵茎溃疡病菌后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道的检测结果。
图14展示采用胶体金试纸条检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌后在胶体金试纸条的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
方案汇总
一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒，包括胶体金试纸条检测试剂盒和荧光检测试剂盒两种。
本方案的第一种试剂盒——胶体金试纸条检测试剂盒包括RPA扩增体系、CRISPR/Cas检测体系和侧向流试纸条，侧向流试纸条结构如图1所示。
RPA扩增体系包括分管放置的扩增试剂和转录试剂。扩增试剂的扩增缓冲液、扩增反应酶干粉和醋酸镁，三者均为市售试剂。扩增试剂包括LI-F/LI-R引物对、DH-F/DH-R引物对、扩增缓冲液、扩增反应酶干粉和醋酸镁；转录试剂包括T7 RNA Polymerase Mix、NTPBuffer Mix和二硫苏糖醇(DTT)。LI-F/LI-R引物对包括Seq ID No.1和Seq ID No.2；DH-F/DH-R引物对包括Seq ID No.3和Seq ID No.4。
LI扩增产物的序列为GCTCCATGTACCAGCTCACCTCTTTCTGATTCTAC-CCATGTTTTTTGCGTACTACTTGTTTCCTCGGCGGGCTTGCCCGCCGATAGGACAAAAC AAAACCTTTTGCA；DH扩增和转录产物的序列为GGUCACCGCUUCCCGCCCUC-UCUCUCAGCUGCGCACGCGUCACAAUCGAUCCGCCGCAACGGUCUGCGCUUGCAAU GUACCCCGAGCGACCGAUCAUUAAAUCUAUCACGAUCUAUCACG。
作为一种参考，本方案中RPA扩增体系采用的扩增反应酶干粉、扩增缓冲液Rehydration buffer和醋酸镁采用TwistDX Co.公司的Basic kit试剂盒。转录试剂采用的T7RNA Polymerase Mix、NTP Buffer Mix购自于New England Biolabs，DTT购自于Sigma Aldrich。具体的扩增体系包括1管扩增反应酶干粉溶解于Rehydration buffer29.5μL、LI-F/LI-R(10μM)各2μL、DH-F/DH-R(10μM)各2μL、醋酸镁(280mM)2.5μL中的反应液；扩增体系包括T7 RNA Polymerase Mix 1μL、NTP Buffer Mix 5μL和0.1M DTT 1μL。本检测采用51μL体系，但不限于此，包含对相应成分的比例调整。
CRISPR/Cas检测体系则包括Cas12a(作为一种参考，本方案购买New EnglandBiolabs的试剂，货号M0653T)、Cas13a(作为一种参考，本方案购买ToloBio的试剂，货号32117-03)、1×NEBuffer 3.1(包括10mM NaCl,5mM Tris-HCl,1mM MgCl2,10μg/mL)、LIcrRNA、DH crRNA、探针和无酶无菌水。
LI crRNA包括LI-crRNA1或LI-crRNA2，为Cas12a识别的靶向序列的crRNA，LI-crRNA1为Seq ID No.5，LI-crRNA2为Seq ID No.6；DH-crRNA为用于Cas13a识别的靶向序列的crRNA，DH-crRNA为Seq ID No.7。
侧向流试纸条上包含抗体标记金纳米、链霉亲和素、地高辛抗体(DIG抗体)和羊抗鼠二抗(IgG)(其结构具体如图1所示)，侧向流试纸条报告分子包括侧向流试纸条DNA报告分子和侧向流试纸条RNA报告分子，侧向流试纸条DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-抗原分子-CCCCCCCCCCCCCCC-Biotin-3'，侧向流试纸条RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-抗原分子-UUUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3'，抗原分子为羧基荧光素(FAM)、荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、地高辛(Dig)中任一种。作为一种参考，胶体金试纸条检测试剂盒中侧向流试纸条DNA报告分子的序列为FAM-CCCCCCCCCCCCCCC-Biotin，侧向流试纸条RNA报告分子的序列为Dig-UUUUUUUUUUUUUUU-Biotin。
作为一种参考，胶体金试纸条检测试剂盒的CRISPR/Cas检测体系包括：10×NEBuffer 3.1(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/mL)3μL，Cas12a(10μM)0.4μL，Cas13a(10μM)0.4μL，LI crRNA(10μM)0.8μL，DH crRNA(10μM)0.8μL，试纸条DNA报告分子(10μM)2μL，试纸条RNA报告分子(1μM)1μL，无酶无菌水17.6μL。
本方案的第二种试剂盒——荧光检测试剂盒与胶体金试纸条试剂盒的区别在于，荧光试剂盒中探针为荧光探针，包括荧光DNA报告分子和荧光RNA报告分子。其中，荧光DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-荧光基团-CCACC-淬灭基团-3'；荧光RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-荧光基团-UUUUU-淬灭基团-3'，荧光基团为羧基荧光素(FAM)、荧光素5-异硫氰酸酯(FITC)、菁染料(Cy5)或其它与检测器激发波长和发射波长匹配的荧光基团；淬灭基团为BHQ1、BHQ2、其它可淬灭荧光基团的物质。作为一种参考，荧光DNA报告分子的序列为5'-FAM-CCACC-BHQ1-3'，荧光RNA报告分子的序列为5'-Cy5-UUUUU-BHQ2-3'。
作为一种参考，本方案荧光检测试剂盒的CRISPR/Cas反应体系包括：10×NEBuffer 3.1(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/mL)3μL，Cas12a(10μM)0.4μL，Cas13a(10μM)0.4μL，LI crRNA(10μM)0.8μL，DH crRNA(10μM)0.8μL，DNA reporter(5μM)0.8μL，RNA reporter(5μM)1.6μL，无酶无菌水18.2μL。
本方案中RPA扩增试剂的反应酶干粉、干粉溶解缓冲液和醋酸镁既可采用TwistAmp公司的TwistAmpBasic kit提供的试剂，也可采用中国其它公司生产的RPA或RAA核酸扩增试剂盒提供的试剂；磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒或快速DNA提取试剂盒可采用任何公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒或植物DNA快速提取试剂盒；引物、荧光DNA报告分子、试纸条DNA报告分子、荧光RNA报告分子、试纸条RNA报告分子等核酸和探针可由任何正规引物合成公司合成。
本方案中crRNA及引物对的序列详见表1。
表1本方案中crRNA及引物对序列
实施例1
本发明提供一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1、提取真菌或植物样品基因组核酸，得到待测DNA样品；
待测样品包括从待测病菌或向日葵茎杆表皮或向日葵叶或向日葵种子。利用磁珠法植物基因组DNA或快速DNA提取试剂盒提取基因组核酸。本方案使用的磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒或快速DNA提取试剂盒获得待测核酸。
S2、RPA扩增阶段：将S1中待测样品加入RPA扩增体系中进行基因靶点扩增，获得扩增产物；
取40μL RPA扩增试剂添加至反应离心管底部，加入4μL核酸样品，用移液枪吸打均匀。取7μL转录试剂，置于离心管盖的内侧。把反应管放置于便携式恒温仪上，37℃反应20min，拿出离心管，上下颠倒混匀，使得离心管盖内的转录试剂与离心管内的扩增体系混合均匀；继续放于37℃反应30min。
S3、CRISPR/Cas检测阶段：将S2中扩增产物加入CRISPR/Cas检测体系中，在37℃反应20min，获得含切割产物的检测溶液；
把4μL RPA扩增产物添加至CRISPR/Cas检测体系中，进行双目标检测，获得含切割产物的检测溶液；
S4、结果显示阶段：将侧向流试纸条或荧光检测仪对随S3中检测溶液进行检测，读取检测结果；
本方案使用胶体金试纸条试剂盒检测时，可采用胶体金试纸条直接读取结果，步骤如下：将S3中含切割产物的检测溶液与70μL去离子水混合，将试纸条浸入混合物中，观察控制线和检测线，当液体到达试纸条顶端2min后取出试纸条。在5min内进行肉眼观察并判定结果，如果待测样品出现与阳性对照样品一样位置的明显检测线条带，说明样品含有目标菌，否则样品不含有目标菌，结果如图2所示。
结果判读：如果待测样品出现与阳性对照样品一样位置的明显检测线条带，说明样品含有目标菌，否则样品不含有目标菌。
实施例2
本方案基本同实施例1，区别在于，S3中采用荧光检测试剂盒检测样品中是否含有病菌。本实施例具体采用采用实时荧光PCR仪获得结果，步骤如下：将S3中含切割产物的检测溶液直接放入实时荧光PCR仪中，设置激发波长/检测波长分别为465/510nm和618/660nm，记录荧光信号，结果如图3、图4和图5所示。
结果判读：如果465/510nm通道有信号，说明含有向日葵黑茎病菌核酸(如图3所示)；如果618/660nm通道有信号，说明含有向日葵茎溃疡病菌核酸(如图4所示)；如果465/510nm和618/660nm均有信号，说明同时含有向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌核酸(如图4所示)。
实施例3：向日葵检茎部真菌病害的快速检测试剂盒的特异性测试
本实验例选用样品为向日葵黑茎病菌(LI)、向日葵茎溃疡病菌(DH)和向日葵黑茎病菌的近似种(如2.大豆北方茎溃疡病菌；3.大豆南方茎溃疡病菌；4.油菜茎基溃疡病菌；5.油菜黑胫病菌)或同一寄主可能发生的其它菌(如6.黑白轮枝菌；7.大丽轮枝菌；8.可可轮枝菌；均已经测序验证的真菌核酸)、空白对照(如9.向日葵种子；water，无菌水)，分别采用荧光检测试剂盒和胶体金试纸条检测试剂盒进行检测，检测试剂盒的检测特异性。
图6展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道的特异性检测结果(图片说明：激发波长/荧光波长:465/510nm；Li1.向日葵黑茎病菌1；Li2.向日葵黑茎病菌2；1.向日葵茎溃疡病菌；2.大豆北方茎溃疡病菌；3.大豆南方茎溃疡病菌；4.油菜茎基溃疡病菌；5.油菜黑胫病菌；6.黑白轮枝菌；7.大丽轮枝菌；8.可可轮枝菌；9.向日葵种子；water.无菌水)。
图7展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵茎溃疡病菌后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道的特异性检测结果(图片说明：激发波长/荧光波长:618/660nm；Dh1.为向日葵茎溃疡病菌1；Dh2.向日葵茎溃疡病菌2；1.向日葵黑茎病菌；2.大豆北方茎溃疡病菌；3.大豆南方茎溃疡病菌；4.油菜茎基溃疡病菌；5.油菜黑胫病菌；6.黑白轮枝菌；7.大丽轮枝菌；8.可可轮枝菌；9.向日葵种子:water.无菌水)。
图8展示采用胶体金试纸条检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌后在胶体金试纸条(本方案中也称为侧向流试纸条)的特异性检测结果(图片说明：Dh.向日葵茎溃疡病菌；Li.向日葵黑茎病菌；Dc.大豆北方茎溃疡病菌；Da.大豆南方茎溃疡病菌；Lm.油菜茎基溃疡病菌；Lb.油菜黑胫病菌；K929.黑白轮枝菌；V3.大丽轮枝菌；Vth1.可可轮枝菌；Sunflower.向日葵种子；water.无菌水)。
实验数据表明，在众多阳性对照(序号2-8的其他病菌)和空白对照(向日葵种子或无菌水)中，本方案的荧光检测试剂盒和胶体金试纸条检测试剂盒均能清晰地显示检测结果，对检测向日葵黑茎病菌(LI)和向日葵茎溃疡病菌(DH)进行特异性检测。
实施例4：向日葵检茎部真菌病害的快速检测试剂盒的灵敏性测试
本实验例中，把向日葵黑茎病菌(LI)和向日葵茎溃疡病菌(DH)的基因组核酸各8.0ng，进行10倍梯度稀释；得到0.8ng、0.08ng、8pg、0.8pg、0.08pg等梯度浓度，以无菌水(water)为空白对照，分别采用荧光检测试剂盒和胶体金试纸条检测试剂盒，按照上述步骤进行RPA扩增、CRISPR/Cas荧光/胶体金试纸条检测，检测试剂盒的灵敏性。
图9展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道的灵敏性检测结果(图片说明：激发波长/荧光波长:465/510nm；1，8ng；2，0.8ng；3，0.08ng；4，8pg；5，0.8pg；6，0.08pg；W，water)。
图10展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵茎溃疡病菌后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道的灵敏性检测结果(图片说明：激发波长/荧光波长:618/660nm；1，8ng；2，0.8ng；3，0.08ng；4，8pg；5，0.8pg；6，0.08pg；W，water)。
图11展示采用胶体金试纸条检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌后在胶体金试纸条的灵敏性检测结果(图片说明：1，8ng；2，0.8ng；3，0.08ng；4，8pg；5，0.8pg；6，0.08pg；7，water)。
实验数据表明，本方案胶体金试纸条检测试剂盒和荧光检测试剂盒均可检测到0.8pg向日葵黑茎病菌基因组DNA(LI)、8pg向日葵茎溃疡病菌基因组DNA(DH)，具有高的检测灵敏性。
实施例5：向日葵检茎部真菌病害的快速检测试剂盒检测实际样品
实际样品包括向日葵茎溃疡病菌和向日葵黑茎病菌单独或共同接种向日葵茎秆或菌丝加到植物组织中的模拟实际植物样品，共计15个，其中，样品1-5是LI和DH共同侵染的向日葵茎组织；样品6是LI单独侵染的向日葵茎组织；样品7-15是DH单独侵染的向日葵茎组织；W，阴性对照。
图12展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌后在实时荧光PCR仪中465/510nm通道的检测结果(图片说明：1-5，LI和DH共同侵染的向日葵茎组织；6，Ll单独侵染的向日葵茎组织；7-15，DH单独侵染的向日葵茎组织；W，阴性对照)。
图13展示采用荧光检测试剂盒检测向日葵茎溃疡病菌后在实时荧光PCR仪中618/660nm通道的检测结果(图片说明：1-5，LI和DH共同侵染的向日葵茎组织；6，Ll单独侵染的向日葵茎组织；7-15，DH单独侵染的向日葵茎组织；W，阴性对照)。
图14展示采用胶体金试纸条检测试剂盒检测向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌后在胶体金试纸条的检测结果(图片说明：1-5，LI和DH共同侵染的向日葵茎组织；6，Ll单独侵染的向日葵茎组织；7-15，DH单独侵染的向日葵茎组织；W，阴性对照)。
实验数据表明，本方案的胶体金试纸条检测试剂盒和荧光检测试剂盒均能通过“一管法”快速对同一个待测样本中的向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌进行互不干扰的扩增及剪切，并通过相关方式显示检测和判断结果，有效缩短口岸快速检疫以及田间早期诊断向日葵样品中两种病原菌所需时间，提升这两种病原菌的检出效率和灵敏度，便于推广至相关场景中广泛应用。
实施例6：本方案与现有技术检测效果比较
针对测试样品中LI和DH检测，设置了实施例4与现有技术的对比试验，试验结果表明，实施例4的测定方法可以完全区分开LI和DH，灵敏度高、特异性强，可以实现对向日葵茎部病害的快速检测和鉴定诊断。
表2实验例2与现有技术的对比试验结果
注：AT代表向日葵白锈病菌(Albugo tragopogonis)；LI代表向日葵黑茎病菌；DH代表向日葵茎溃疡病菌；
表2中序号对应的参考文献如下：
1.陈燕，张祥林，王翀，王文正，刘彬，应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究，新疆农业科学，2012，3：470-476.
2.乾义柯，魏霜，黄法余，陈永青，陈卫民，向日葵茎溃疡病菌RPA检测方法的建立，植物保护，2021，35(2)：39-43.
3.Elverson,T.R.,Kontz B.J.,Markell S.G.,Harveson R.M.and MathewF.M.2020.Quantitative PCR Assays Developed for Diaporthe helianthi andDiaporthe gulyae for Phomopsis Stem Canker Diagnosis and Germplasm Screeningin Sunflower(Helianthus annuus).Plant Disease 104(3):793-800.
4.张娜,乾义柯,尚爽,et al.,不同引物PCR检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用[J].植物保护学报，2015，42：801-805.
5.段维军,段丽君,吕燕,et al.,向日葵黑茎病菌TaqMan-MGB探针实时荧光快速检测方法，植物病理学报，2021，51：975-86.
6.张娜,乾义柯,魏霜,et al.,两种向日葵检疫性真菌病害的多重DPO-PCR检测方法，植物检疫，2015，29：35-8.
7.张伟宏，廖芳，罗加凤，李关荣，检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测，西南大学学报(自然科学版)，2013,，35(1)：10-15.
实验数据表明，采用本方案试剂盒可完成双目标同时检测，还不限制实验检测场地，不仅实验室内可进行，在实验室外的田间地头现场及野外也能完成样品检测，使用非常方便；而且检测灵敏度高，具体的，检测限低至0.8pg(LI)和8pg(DH)，无论是植物染病早期或海关植物携带病菌，均可快速、精确检测。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒，其特征在于：包括RPA扩增体系、CRISPR/Cas检测体系和侧向流试纸条；所述RPA扩增体系包括LI-F/LI-R引物对和DH-F/DH-R引物对，所述LI-F/LI-R引物对包括Seq ID No.1和Seq ID No.2；DH-F/DH-R引物对包括Seq ID No.3和Seq ID No.4；所述CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a。
2.根据权利要求1所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述RPA扩增体系还包括扩增反应酶干粉、扩增缓冲液、醋酸镁和转录试剂，所述转录试剂包括T7 RNA Polymerase Mix，NTP Buffer Mix，二硫苏糖醇；所述转录试剂与RPA扩增体系中其他试剂放于同一反应管的不同位置。
3.根据权利要求2所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas检测体系还包括1×NEBuffer 3.1、LI crRNA、DHcrRNA、探针和无酶无菌水。
4.根据权利要求3所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述探针包括侧向流试纸条报告分子或荧光探针。
5.根据权利要求4所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述侧向流试纸条上包含抗体标记金纳米、链霉亲和素、地高辛抗体和羊抗鼠二抗，侧向流试纸条报告分子包括侧向流试纸条DNA报告分子和侧向流试纸条RNA报告分子，所述侧向流试纸条DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-抗原分子-CCCCCCCCCCCCCCC-Biotin-3'，所述侧向流试纸条RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-抗原分子-UUUUUUUUUUUUUUU-Biotin-3'，所述抗原分子为FAM、FITC、罗丹明、地高辛中任一种。
6.根据权利要求5所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述荧光探针包括荧光DNA报告分子和荧光RNA报告分子，所述荧光DNA报告分子的序列为供Cas12a剪切的5'-荧光基团-CCACC-淬灭基团-3'；所述荧光RNA报告分子的序列为供Cas13a切割的5'-荧光基团-UUUUU-淬灭基团-3'，所述荧光基团为FAM、FITC、菁染料或其它与检测器激发波长和发射波长匹配的荧光基团；所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、其它可淬灭荧光基团的物质。
7.根据权利要求6所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒及使用方法，其特征在于：所述Cas12a识别的靶向序列的LI crRNA为LI-crRNA1或LI-crRNA2，所述LI-crRNA1为Seq ID No.5，所述LI-crRNA2为Seq ID No.6；所述Cas13a识别的靶向序列的DH crRNA为DH-crRNA，所述DH-crRNA为Seq ID No.7。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种一管法同时检测两种向日葵茎部病害的检测试剂盒的使用方法，基于上述一管法同时检测向日葵茎部病害的检测试剂盒完成，其特征在于：包括将待测样品DNA添加至RPA扩增体系中扩增获得扩增产物后，将扩增产物添加进CRISPR/Cas检测体系中获得包含切割片段的检测溶液，再通过侧向流试纸条或荧光检测仪对检测溶液中结果进行显示。
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