CN113025751A - 非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用，引物组合包括：上游引物ASFV‑MF：5’‑TCAGTATCCATTCCCTTCG‑3’；下游引物ASFV‑MR：5’‑TTGTGCCAATCTCGGTGT‑3’，并以此提供了一种方便诊断的试剂盒，建立相应的检测方法。与现有技术相比，本发明的引物序列灵敏度高，条带明亮，最低检测限度为1.40×10³copise/μL；进一步地，本发明建立了一个快速精准检测ASFV病毒的试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、成本低的特点。

Description

非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及非洲猪瘟病毒的基因检测，尤其是涉及一种非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、发热、高度接触传染性疾病。家猪与野猪普遍易感，软蜱为ASFV的贮藏宿主和媒介。该病于1921年首先在肯尼亚爆发，此后很长一段时间ASF仅在非洲南部的大多数国家流行，1957年，ASFV第一次传播到非洲以外的国家：葡萄牙，原因是飞机上的废弃物饲喂了里斯本机场附近的家猪。随后ASF在欧洲的其他国家爆发。2018年8月初，扈荣良研究员率先报道我国第一例非洲猪瘟疫情，短短一年之内，该病蔓延至全国30个省市自治区，已造成全国20％以上减产率，损失超过百亿元，目前该病防控形势异常严峻复杂。ASFV的潜伏期为5-15天，一旦爆发病程短，病死率高，可达100％。临场症状复杂且难以与其他疾病进行区分，多表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。然而，非洲猪瘟发病后并没有有效的治疗措施，且该病毒具有复杂的免疫逃避机制，缺乏典型的中和抗体，也没有有效的疫苗防疫，因此建立一种快速、灵敏、准确的检测方法显得尤为重要。

ASFV是一种直径约为170-200nm的正20面体病毒，由内部的双链DNA和外周的衣壳及囊膜组成，大小约170～190kb。ASFV基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区，ASFV基因组大小变化由可变区决定。ASFV的整个基因组含有151个开放阅读框(ORFs)，可以编码150-200种蛋白质，大致可分成5大种类，包括分泌性蛋白、假定膜蛋白、参与核甘酸和核酸代谢(DNA修复)的酶以及蛋白修饰的酶。P72蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，位于ASFV的较保守的编码区，同时经过近半个世纪的遗传进化，仍保持较高的同源性，然而P72存在部分变异频率较高的区域，因此P72也被用于ASFV的基因分型。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用。本发明的引物序列灵敏度高，条带明亮，最低检测限度为1.40×10³copise/μL。进一步地，本发明建立了一个快速精准检测ASFV病毒的试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、成本低的特点。

本发明通过分析ASFV的遗传进化树，选取与国内流行的ASFV毒株同源性最高的几个分支以及近几年各国流行的ASFV典型毒株的P72基因序列进行比对，根据比对结果，以国内流行的ASFV毒株的P72中段的同源性较高的序列作为模板设计引物，目的片段为428bp，且设计的引物避开变异区，能够最大限度识别目前流行的所有ASFV毒株，并研制方便诊断的试剂盒，建立相应的检测方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面提供一种非洲猪瘟病毒的引物组合，包括：

上游引物ASFV-MF：5’-TCAGTATCCATTCCCTTCG-3’(SEQ ID NO:1)；

下游引物ASFV-MR：5’-TTGTGCCAATCTCGGTGT-3’(SEQ ID NO:2)。

本发明第二方面提供一种非洲猪瘟病毒的试剂盒，含有所述的引物组合，记为PCRMix。

优选地，该试剂盒还包括：阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。

优选地，所述的PCR Mix中，上游引物ASFV-MF与下游引物ASFV-MR的摩尔比为1:1。

优选地，所述的阳性对照为含有428bpASFV基因序列的重组质粒。

优选地，所述的阴性对照为双蒸水。

优选地，所述的PCR扩增液包括Taq PCR Mix(2×)。

本发明第三方面提供所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，将其应用于检测非洲猪瘟病毒，包括以下方法：

S1：提取待测样品的总DNA备用；

S2：配制反应体系：取样品DNA、PCR Mix和PCR扩增液，并用双蒸水定容至一定体积，配置得到反应体系；

S3：扩增程序：进行PCR扩增；

S4：琼脂糖凝胶电泳：在溶解的琼脂糖凝胶中，加入核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，进行电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果；

S5：参照待测样品对阳性对照和阴性对照进行处理；

S6：结果判断。

优选地，步骤S6中：阳性对照出现428bp扩增条带，阴性对照无条带出现时，实验结果成立，待测样品出现428bp的扩增条带为非洲猪瘟病毒核酸阳性，否则为阴性。

优选地，步骤S2中，取样品DNA 2μL，PCR Mix 2μL，PCR扩增液12.5μL，加入双蒸水10.5μL，配置25μL反应体系。

优选地，步骤S3中，扩增程序包括：94℃5min，循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计35个循环，再72℃延伸10min。

优选地，步骤S4中，用1g琼脂糖放入100mL TAE中，得到1％的琼脂糖凝胶，于微波炉中溶解，再加入5μL的核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取10μL PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)P72蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，位于ASFV的较保守的编码区，然而P72存在部分变异频率较高的区域，因此P72也被用于ASFV的基因分型。本发明通过分析ASFV的遗传进化树，选取与国内流行的ASFV毒株同源性最高的几个分支以及近几年各国流行的ASFV典型毒株，参照NCBI GenBank中公布的ASFV毒株的P72蛋白的基因序列进行比对，根据比对结果，以国内流行的ASFV毒株的P72基因中段的保守序列作为模板设计，能够最大限度识别目前流行的所有ASFV毒株；

2)本发明的目的片段为P72基因的第1038-1467bp，共428bp，比对17个国内流行以及国际近年流行的毒株的P72基因核苷酸序列，该序列的同源性为100％

3)本发明设计的引物序列灵敏度高，条带明亮，最低检测限度为1.40×10³copise/μL；

4)本发明的特异性较强，对于猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒，猪圆环病毒，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒，均无特异性条带，保证检测的准确性；

5)本发明建立了一个快速精准检测ASFV病毒的试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、成本低的特点。

附图说明

图1为本发明目的片段电泳结果，其中：泳道1：阴性对照，泳道2：本发明非洲猪瘟P72基因目的片段。

图2为本发明实施例敏感性试验电泳结果，其中：泳道1：阴性对照、泳道2：1.40×10⁶copise/μL、泳道3：1.40×10⁵copise/μL、泳道4：1.40×10⁴copise/μL、泳道5：1.40×10³copise/μL、泳道6：1.40×10²copise/μL、泳道7：1.40×10¹copise/μL、泳道8：1.40×10⁰copise/μL。

图3为本发明实施例特异性试验电泳结果，其中：泳道1：阴性对照，2：本发明非洲猪瘟P72基因目的片段，泳道3：猪瘟病毒，泳道4：猪伪狂犬病毒，泳道5：猪蓝耳病毒，泳道6：猪圆环病毒，泳道7：猪细小病毒和泳道8：猪乙型脑炎病毒。

图4、图5和图6分别为不同毒株的P72基因核苷酸序列比对(第1038-1467bp)。

具体实施方式

实施例1

如图4～6所示，通过对17个国内流行以及国际近年流行的毒株进行P72基因核苷酸序列比对，发中段序列最为保守，同源性为100％，因此选取该段基因序列进行引物设计，目的片段为P72基因的第1038-1467bp同源性为100％。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

使用本发明的试剂盒进行非洲猪瘟病毒的检测。

1、阳性标准品的制备

用已知ASFV的阳性样品提取DNA，按照天根的DNA病毒提取试剂盒，进行总DNA的提取，采用25μL的体系，反应体系2×PCR Mix 12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA 2μL，TRUEscript Enzyme Mix 0.8μL以及RNase free H₂O(无核酸酶水)7.7μL；PCR扩增程序：94℃5min；循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环；再72℃延伸10min。扩增完成后，所有产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用天根的胶回收试剂盒进行纯化回收，连接到pEASY-T1载体并转化到DH5ɑ感受态细胞，挑取阳性克隆，用LB培养液摇菌扩增后，将菌液送到上海生工生物工程有限公司进行测序。

经生工测序，确定PCR产物为目的片段，共428bp，序列为：ttgtgccaatctcggtgttgatgaggattttgatcggagatgttccaggtaggttttaatcctataaacatatattcaatgggccatttaagagcagacattagtttttcatcgtggtggttattgttggtgtgggtcacctgcgttttatggacacgtatcagcgaaaagcgaacgcgttttacaaaaaggttgtgtatttcaggggttacaaacaggttattgatgtaaagttcattattcgtgagcgagatttcattaatgactcctgggataaaccatggtttaaagcgtatattgcgtctactggggcgtccagctataaaacgtgactggcgtacaaaaagtccaggaaattcattcaccaaatccttttgcgatgcaagctttatggtgataaagcgctcgccgaagggaatggatactga(SEQ ID NO:3)。

2、敏感性实验

用天根的质粒提取试剂盒提取标准质粒，用NanoDrop 2000核酸浓度测定仪检测浓度为656ng/ul，换算稀释为终浓度为1.40×10¹⁰copise/μL，进行10倍梯度稀释后作为模板，取其中浓度为1.40×10⁶、1.40×10⁵、1.40×10⁴、1.40×10³、1.40×10²、1.40×10¹、1.40×10⁰copise/μL进行敏感度测定，以双蒸水为阴性对照，按提供PCR的反应体系及程序进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图所示，结果显示第6泳道为1.40×10⁴copise/μL条带仍然较明显，稀释到1.40×10³copise/μL，即第7泳道条带仍有不明显但肉眼可见的条带，表明本发明最低能检测限为1.40×10³copise/μL，参见图2。

3、特异性试验

以发明人保存的经过鉴定为阳性的猪瘟病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒，猪圆环病毒，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒作为模板，用本发明中的引物进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图3所示，结果显示，只有ASFV泳道在428bp处出现一条明亮的特异性条带，其他样品均无特异性条带出现，表明本发明具有较强的特异性。

上述试剂盒，包括引物组合(记为PCR Mix)、阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。

PCR Mix中：

上游引物ASFV-MF：5’-TCAGTATCCATTCCCTTCG-3’；

下游引物ASFV-MR：5’-TTGTGCCAATCTCGGTGT-3’。

上游引物ASFV-MF与下游引物ASFV-MR的摩尔比为1:1。

阳性对照为含有428bpASFV基因序列的重组质粒。

阴性对照为双蒸水。

PCR扩增液包括Taq PCR Mix(2×)。

将上述试剂盒应用于检测非洲猪瘟病毒，包括以下方法：

S1：提取待测样品的总DNA备用；

S2：配制反应体系：取样品DNA2μL，PCR Mix 2μL，PCR扩增液12.5μL，加入双蒸水10.5μL，配置25μL反应体系；

S3：扩增程序：进行PCR扩增，扩增程序包括：94℃5min，循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计35个循环，再72℃延伸10min；

S4：琼脂糖凝胶电泳：用1g琼脂糖放入100mL TAE中，得到1％的琼脂糖凝胶，于微波炉中溶解，再加入5μL的核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取10μL PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果；

S5：参照待测样品对阳性对照和阴性对照进行处理；

S6：结果判断：阳性对照出现428bp扩增条带，阴性对照无条带出现时，实验结果成立，待测样品出现428bp的扩增条带为非洲猪瘟病毒核酸阳性，否则为阴性。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 福建傲农生物科技集团股份有限公司、泰和县傲牧育种有限公司、广西柯新源原种猪有限责任公司、厦门银祥集团有限公司

<120> 非洲猪瘟病毒的引物组合、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列(African swine fever virus)

<400> 1

tcagtatcca ttcccttcg 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(African swine fever virus)

<400> 2

ttgtgccaat ctcggtgt 18

<210> 3

<211> 428

<212> DNA

<213> 人工合成序列(African swine fever virus)

<400> 3

ttgtgccaat ctcggtgttg atgaggattt tgatcggaga tgttccaggt aggttttaat 60

cctataaaca tatattcaat gggccattta agagcagaca ttagtttttc atcgtggtgg 120

ttattgttgg tgtgggtcac ctgcgtttta tggacacgta tcagcgaaaa gcgaacgcgt 180

tttacaaaaa ggttgtgtat ttcaggggtt acaaacaggt tattgatgta aagttcatta 240

ttcgtgagcg agatttcatt aatgactcct gggataaacc atggtttaaa gcgtatattg 300

cgtctactgg ggcgtccagc tataaaacgt gactggcgta caaaaagtcc aggaaattca 360

ttcaccaaat ccttttgcga tgcaagcttt atggtgataa agcgctcgcc gaagggaatg 420

gatactga 428

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒的引物组合，其特征在于，包括：

上游引物ASFV-MF：5’-TCAGTATCCATTCCCTTCG-3’；

下游引物ASFV-MR：5’-TTGTGCCAATCTCGGTGT-3’。

2.一种非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组合，记为PCRMix。

3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：阳性对照、阴性对照和PCR扩增液。

4.根据权利要求2或3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的PCR Mix中，上游引物ASFV-MF与下游引物ASFV-MR的摩尔比为1:1。

5.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有428bp的ASFV基因序列的重组质粒。

6.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照为双蒸水。

7.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增液包括Taq PCR Mix(2×)。

8.如权利要求2～7任一所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，其特征在于，将其应用于检测非洲猪瘟病毒，包括以下方法：

S1：提取待测样品的总DNA备用；

S2：配制反应体系：取样品DNA、PCR Mix和PCR扩增液，并用双蒸水定容至一定体积，配置得到反应体系；

S3：扩增程序：进行PCR扩增；

S4：琼脂糖凝胶电泳：在溶解的琼脂糖凝胶中，加入核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，进行电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果；

S5：参照待测样品对阳性对照和阴性对照进行处理；

S6：结果判断。

9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，其特征在于，步骤S6中：阳性对照出现428bp扩增条带，阴性对照无条带出现时，实验结果成立，待测样品出现428bp的扩增条带为非洲猪瘟病毒核酸阳性，否则为阴性。

10.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下条件中的任一项或多项：

(i)步骤S2中，取样品DNA 2μL，PCR Mix 2μL，PCR扩增液12.5μL，加入双蒸水10.5μL，配置25μL反应体系；

(ii)步骤S3中，扩增程序包括：94℃5min，循环94℃30s，55℃30s，72℃1min，共计35个循环，再72℃延伸10min；

(iii)步骤S4中，用1g琼脂糖放入100mL TAE中，得到1％的琼脂糖凝胶，于微波炉中溶解，再加入5μL的核酸染料轻轻摇匀，在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后取10μL PCR扩增产物，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳，待Marker和条带都跑开后，由凝胶成像仪观察并拍照，获得检测结果。

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