CN103992960A - 一种用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉、制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉、制备方法及其用途，其中酵母菌干粉包括表达MCH的酵母菌，其制备方法为以已克隆的黄鳝MCH基因为模板,通过PCR获得MCH基因,将其载体pHIL-D2进行体外重组,构建质粒；通过电转化将MCH基因整合到酵母GS115的染色体上,用PCR方法筛选、表达，从而获得表达MCH的酵母菌；将上述酵母菌扩大培养，培养后经诱导、分离以及干燥得到酵母菌干粉，将酵母菌干粉添加到黄鳝饲料中进行喂食用来促进黄鳝生长。本发明提供的酵母菌干粉加入到黄鳝饲料中进行黄鳝养殖，能使黄鳝增重率达到30%，饲料添加酵母工程菌具有明显地促进黄鳝生长的作用。

Description

一种用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉、制备方法及其用途

技术领域

本发明属于渔业科学应用技术领域，具体涉及一种用于用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉、制备方法及其用途。

背景技术

黄鳝(Monopterus albus)，俗称鳝鱼，属于硬骨鱼纲、合鳃目、合鳃科、黄鳝属，广泛存在于亚洲地区，中国仅产1种。其体型细，形状似蛇或鳗，营养价值极高。目前已在中国中南部开展大面积的养殖，中国目前的养殖总产量已经达到36万吨，由于其生长快，成活率高以及对网箱养殖条件的适应性好，它被当作中国水产养殖的首选品种之一。鳝鱼肉质细嫩，鲜美可口，营养价值高，具有滋补强身和药用功能，是人们喜爱的滋补水产品，深受中国消费者的青睐。为了繁荣市场，丰富人民生活，发展池塘养殖已变得日益迫切，对黄鳝的生物学特性,生长变化规律等方面的研究已成为重要的课题。近年来其水产养殖发展很快。在水产养殖中高效饵料的研制是增产增收的基本途径。如何捉高饵料转化率，缩短养殖周期，降低生产成本，提高水产养殖品的产量和质量被越来越多的科研工作者和养殖户所关注。

黑色素浓集激素（MCH）是一种由19个氨基酸组成的神经肽,最先于鲑鱼脑垂体腺内分离得到，它通过使黑色素细胞中的黑色素浓集来调节硬骨鱼类的皮肤颜色,因此而得名。MCH在许多生理过程中起作用,包括调节硬骨鱼类皮肤的颜色;调节下丘脑-垂体-肾上腺轴;调节肠道内的水和电解质出入;刺激大鼠神经垂体分泌催产素;调节感觉过程等。而目前研究的重点是MCH在调节进食行为和能量代谢方面的作用。最近一系列研究发现MCH在调节体重方面具有重要的作用:（1）过表达MCH的转基因小鼠抵抗胰岛素且患有肥胖症；（2）在大鼠脑室内注射MCH导致进食过多引发肥胖；（3）基因工程肥胖鼠和禁食小鼠相比下丘脑中的MCH mRNA水平增高；（4）缺乏MCH的小鼠食量减少，代谢率增高，导致体重减轻和脂肪含量下降。这一切都表明MCH具有促进食欲，促进生长的作用。

目前国内外成功率高、效益好的方式多采取网箱高密度投饵养鳝，为了获得较快的黄鳝生长速度从而提高经济效益，渔民主要采用高蛋白饲料进行投喂，一般均采用鱼糜、蚯蚓、鱼粉等进行饲喂，由于世界鱼粉市场供需不平衡, 鱼粉价格不断上扬, 使养殖成本上升, 同时蚯蚓及鱼糜的养殖成本也逐年上升，从而严重制约了水产养殖业的发展。此外随着养殖规模和强度的不断扩大，未食的残饵以及养殖体的排泄物等对养殖水体及周围水环境的影响越来越突出，结果导致鱼病增加，养殖水体富营养化，最终使得黄鳝生长停滞，养殖不能继续。因此寻找一条减少鱼粉等蛋白性饲料的使用并能促进黄鳝生长的配合饲料成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对以上现有技术中的不足而提供一种用于促进黄鳝生长的饲料及其制备和实施方法。

本发明是通过以下技术手段实现的：

一种用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉，包括表达MCH的酵母菌。

所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉，其中表达MCH的酵母菌的制备方法可以为以已克隆的黄鳝MCH 基因为模板, 通过 PCR方法获得 MCH 基因, 将MCH基因与含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因启动子的载体 pHIL-D2 进行体外重组, 构建 pHIL-MCH 酵母整合型质粒；通过电转化将MCH 基因整合到酵母 GS115 的染色体上, 用 PCR 方法筛选阳性转化子, 并用点杂交筛选多拷贝转化子, 经甲醇诱导AOX 启动子, 而使 rMCH 得以表达，从而获得表达MCH的酵母菌。

一种以上所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，按照以下步骤进行制备：

（1） 工程菌的培养: 表达MCH的将酵母菌接种于 YPD 平板培养基中, 摇床 30℃条件下培养，挑菌电泳观察有MCH表达的单菌落菌种于已预先灭菌装有YPD培养基的试管中, 30℃摇振培养 ；

（2） 工程菌的扩大培养: 用预先灭菌，装有无机盐培养基的容器，加入上述工程菌培养液, 30℃摇振培养, 培养完毕后分装并保存于-70℃冰箱中备用；

（3） 工程菌中试：取保存于-70℃冰箱中的工程菌, 接种于YPD培养基中, 30℃摇振培养，培养完毕后移至已预先灭菌的接料瓶中, 泵入装有无机盐培养基的发酵罐中进行发酵，其中无机盐培养基预先灭菌并将温度恢复至 30℃，当酵母生长至 OD600为30-45时, 每天加入体积分数为发酵液量0.5%-1%的甲醇诱导4-5天，收集菌液, 采用低温超声波法进行降解酵母细胞壁，于4℃冰柜中沉淀, 去上清液, 沉淀物置于冷冻干燥机中干燥，即得用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉。

所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，步骤（1）中摇振培养转速可以为200r/min，培养时间可以为24-30h。

所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，步骤（2）中摇振培养转速可以为170r/min，培养时间可以为6-8天。

所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，步骤（3）中摇振培养转速可以为200r/min，培养时间可以为2天。

所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，步骤（3）中发酵条件可以为pH 5.5, 温度30℃。

一种用于促进黄鳝生长的酵母菌饲料，其中饲料中含有以上所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉。

一种以上所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌饲料实施的促进黄鳝生长的方法，包括如下步骤：

（1）黄鳝的人工养殖：采取网箱养殖的方式对黄鳝进行人工养殖；

（2）第一年黄鳝的人工驯化：于每年6-11月，选择规格相同的黄鳝在网箱里进行人工养殖，网箱里移植水花生，在黄鳝配合饲料里添加1%的酵母粉；

（3）黄鳝越冬：当年11月份至第二年4月份，黄鳝继续养殖在网箱里，同时停止投喂；

（4）第二年黄鳝增重：第二年5月份开始，黄鳝继续养殖在网箱里，并开始重新投喂，每天投放黄鳝配合饲料，饲料中含1% 酵母菌干粉，一直饲喂到上市前1周，停喂酵母菌。

按照本发明提供的用于促进黄鳝生长的酵母菌饲料以及实施的促进黄鳝生长的方法获得的黄鳝具有如下特点：

1. 利用基因工程技术生产出 rMCH重组酵母菌, 可以直接掺入饲料中喂养，免除从工程菌中提纯 rMCH 的复杂操作，同时酵母菌本身也是一种营养物质。此外实验表明MCH小肽可通过黄鳝肠道吸收并发挥作用。

2. 本发明采用的重组菌具有增强食欲、促进生长的作用，网箱养殖试验表明具有明显的促生长效应, 是应用外源性MCH促进鱼类生长安全可行的一条途径

本发明在研究中成功的在酵母表达系统中成功的表达了黄鳝MCH激素，动物试验证实以表达MCH的酵母细胞拌喂黄鳝可以提高黄鳝生长速度，体重增加达29.8%以上。

具体实施方式：

实施例1

1. rMCH酵母菌干粉制备：

（1）工程菌的构建和培养:

根据GeneBank中MCH基因的同源序列合成MCH DNA序列，序列见SEQ ID NO.1，并在序列两端加上EcoR І和Not І酶切位点，将人工合成的DNA和pHIL-D2质粒分别用EcoR І和Not І双酶切后进行连接、转化。通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子，命名为pHIL-MCH。

将获得的重组载体pHIL-MCH质粒用Sal І酶切，回收片段后电击转化巴斯德毕赤酵母,毕赤酵母感受态准备、电击转化均参照Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册,将获得的转化子分别点种到MM 和MD 平板，并设阳性对照GS115 β-gal (His+Mut+) 和阴性对照GS115Albumin (His+ Muts)，在MM 平板和MD 平板均能正常生长的菌落为阳性菌落, 随机挑选30 个阳性菌落接种5 mL BMGY 中，30 ℃剧烈振荡培养24 h，离心收集菌体，加3 mL BMMY 诱导培养基，30 ℃继续培养48 h。筛选出酶活性较高的菌株，命名为GS115-pHIL-MCH。通过对上清液进行SDS-PAGE 分析，检测重组蛋白的表达情况。

将上述表达MCH的酵母菌接种于 YPD 平板培养基中, 摇床 30℃条件下培养，挑菌于已预先灭菌装有5 mL YPD 培养基的试管中, 30℃摇振(200r/ min) 培养 24-30h。工程菌的扩大培养：用 1000 mL的三角瓶, 每瓶装有 200 mL无机盐培养基, 预先灭菌, 每瓶加入 5 mL上述工程菌培养液, 30℃摇振(170r/ min) 培养6-8d, 以 10 mL/管分装并保存于-70℃冰箱中备用。

（2）工程菌中试：发酵试验及发酵产物的预处理: 取保存于-70℃冰箱中的工程菌10 mL, 接种于200mL YPD 培养基, 30℃摇振(200r/ min) 培养2d；移至已预先灭菌的接料瓶中, 泵入体积为 30L的发酵罐中( 装有 20 L无机盐培养基, 培养基预先灭菌并将温度恢复至 30℃) 进行发酵( pH 为 5.5, 温度为30℃, rpm-pO2的关系由电脑操作系统控制) 。当酵母生长至 OD600为30-45时, 每天加入甲醇 0.5%-1% 诱导4-5d, 收集菌液, 采用低温超声波法进行适当地降解酵母细胞壁，于4℃冰柜中沉淀, 去上清液, 沉淀物装于帆布袋中置于冷冻干燥机中干燥, 得 rMCH酵母菌干粉。

将以上制得的rMCH酵母菌干粉加入到黄鳝配合饲料中，其中加入方式为在黄鳝配合饲料中添加1%的酵母菌干粉，混合均匀即得到用于促进黄鳝生长的饲料。

2. 用以上制备的用于促进黄鳝生长的饲料进行饲喂实验：2012-2013年姜堰市一黄鳝养殖基地进行本发明的饲喂实验，按以下步骤进行：

（1）2012年4月将黄鳝养殖网箱架设在池塘内，网箱规格为长3米、宽2米、高1.5米，为30目聚乙烯无结网片加工而成。共设120个网箱。池塘水温为20-28℃，水中溶氧大于6mg/L, pH值7.5-8。

（2）2012年4月中下旬进行水体消毒、放苗前15天设置水花生作为黄鳝的栖息巢，水花生的种植面积为网箱的2/3左右，以模拟黄鳝的自然适宜生态条件。

（3）2012年5-6月份挑选健康、体表无伤、规格一致的黄鳝移入到网箱里养殖。放养密度为1.5kg/m²,每个网箱放养9-10kg。每个网箱放养10尾泥鳅，以避免黄鳝互相缠绕。

（4）制备重组MCH酵母菌按1%的比例（重量比）拌在黄鳝饲料中。

（5）在黄鳝移入网箱三天后开始投喂黄鳝配合饲料，进行开口驯化。待黄鳝习惯人工饲料1-2周开始饲喂含重组酵母菌的黄鳝配合饲料。

（6）黄鳝配合饲料中酵母菌的比例为0.5%，以后可逐渐加至1%。每天傍晚5点左右投喂，黄鳝配合饲料的蛋白水平控制在38%以内，投喂量按体重的4-8%进行投喂，第二天清晨有少量残饵即为饱食。未吃的残饵应及时清理掉，以免腐败污染水质。

（7）黄鳝越冬：当年10月份开始到第二年4月份，黄鳝继续养殖在网箱里，但减少投喂，直到停止。

（8）从2013年5月温度回升开始，黄鳝继续养殖在原网箱内，并重新开始投喂重组酵母菌。投喂的饲料为鲢鱼和粉碎的蚯蚓加1%的酵母菌打碎制成食糜，黄鳝配合饲料的蛋白水平控制在38%以内。每天傍晚4点左右投喂在固定的地点。

（9）黄鳝养殖的日常管理：整个养殖期间，每天投喂新鲜的饲料，第二天早晨及时收集并妥善处理未吃完的残饵，防止污染水质，每天两次巡塘，及时发现问题，保持良好的水质和生态环境，每周用戊二醛进行消毒，按40mg/m³水体均匀泼洒。

有益效果：应用本发明后，经称重对比，喂以重组菌的实验组对比正常试验组增重达30.2%以上。

实施例3

用实施例2中制备的用于促进黄鳝生长的饲料进行饲喂实验，2011-2012年泰兴市一黄鳝养殖基地进行本发明的重组菌饲喂实验，按以下步骤进行：

（1）2011年3月选择合适的池塘架设黄鳝养殖网箱，网箱规格为长4米、宽3米、高1.5米，为30目聚乙烯无结网片加工而成。共设40个网箱。池塘水温为20-28℃，水中溶氧大于6mg/L，pH值7.5-8。

（2）2011年4月份开始以聚维酮碘水体消毒、网箱内放置水花生作为黄鳝的栖息巢，水花生的种植面积为网箱的60%左右为宜，模拟黄鳝的自然适宜生态条件。

（3）2011年6-7月份挑选健康、体表无伤、规格一致的黄鳝移入到网箱里养殖。放养密度为1.5kg/m²,每个网箱放养15kg。每个网箱放养15尾泥鳅，以避免黄鳝互相缠绕。

（4）制备重组菌，按1%的比例（重量比）拌在黄鳝饲料中。

（5）在黄鳝移入网箱三天后开始投喂蚯蚓，进行开口驯化。待黄鳝习惯人工饲料1-2周开始饲喂含重组菌的配合饲料。

（6）配合饲料中重组菌的比例为0.5%，以后可逐渐加至1%。每日下午5点左右投喂，配合饲料的蛋白水平控制在38%以内，投喂量按体重的4-8%进行投喂，第二天清晨有少量残饵即为饱食。及时清理掉未吃的残饵，避免残饵腐败污染水质。

（7）黄鳝越冬：当年10月份开始到第二年4月份，黄鳝继续养殖在网箱里，但减少投喂，直到停止。

（8）从2010年5月温度回升开始，黄鳝继续养殖在原网箱内，并重新开始投喂重组菌。投喂的饲料为鲢鱼和粉碎的蚯蚓加1%的重组菌打碎制成食糜，配合饲料的蛋白水平控制在38%以内。每日下午5点左右投喂在固定的地点。在对黄鳝进行称重前2天，停喂重组菌。

（9）黄鳝养殖的日常管理：整个养殖期间，每天投喂新鲜的饲料，第二天早晨及时收集并妥善处理未吃完的残饵，防止污染水质，每天两次巡塘，及时发现问题，保持良好的水质和生态环境，每周用戊二醛进行消毒，按40mg/m³水体均匀泼洒。

有益效果：应用本发明后，实验组与对照组称重比较后发现实验组具有明显的生长优势，增重效果明显，达29.8%以上，表明重组蛋白具有生物活性，黄鳝MCH重组蛋白可通过口服被黄鳝肠道吸收，并产生了明显的促生长效应。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 一种用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉、制备方法及其用途

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaattccag gagggacacc atgaggtgca tggtgggaag ggtgtaccgg ccttgctggg 60

aagtgatttg cggccgcttt a 81

Claims (8)

1.一种用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉，其特征在于，包括表达MCH的酵母菌。

2.根据权利要求1所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉，其特征在于，表达MCH的酵母菌的制备方法为以已克隆的黄鳝MCH 基因为模板, 通过 PCR方法获得 MCH 基因, 将MCH基因与含甲醇酵母的醇氧化酶AOX基因启动子的载体 pHIL-D2 进行体外重组, 构建 pH IL-MCH 酵母整合型质粒；通过电转化将MCH 基因整合到酵母 GS115 的染色体上, 用 PCR 方法筛选阳性转化子, 并用点杂交筛选多拷贝转化子, 经甲醇诱导AOX 启动子, 而使 rMCH 得以表达，从而获得表达MCH的酵母菌。

3.一种权利要求1所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行制备：

（1） 工程菌的培养: 表达MCH的将酵母菌接种于 YPD 平板培养基中, 摇床 30℃条件下培养，挑菌电泳观察有MCH表达的单菌落菌种于已预先灭菌装有YPD培养基的试管中, 30℃摇振培养 ；

（2） 工程菌的扩大培养: 用预先灭菌，装有无机盐培养基的容器，加入上述工程菌培养液, 30℃摇振培养, 培养完毕后分装并保存于-70℃冰箱中备用；

（3） 工程菌中试：取保存于-70℃冰箱中的工程菌, 接种于YPD培养基中, 30℃摇振培养，培养完毕后移至已预先灭菌的接料瓶中, 泵入装有无机盐培养基的发酵罐中进行发酵，其中无机盐培养基预先灭菌并将温度恢复至 30℃，当酵母生长至 OD600为30-45时, 每天加入体积分数为发酵液量0.5%-1%的甲醇诱导4-5天，收集菌液, 采用低温超声波法进行降解酵母细胞壁，于4℃冰柜中沉淀, 去上清液, 沉淀物置于冷冻干燥机中干燥，即得用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉。

4.根据权利要求3所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，其特征在于，步骤（1）中摇振培养转速为200r/min，培养时间为24-30h。

5.根据权利要求3所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）中摇振培养转速为170r/min，培养时间为6-8天。

6.根据权利要求3所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中摇振培养转速为200r/min，培养时间为2天。

7.根据权利要求3所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉的制备方法，其特征在于，步骤（3）中发酵条件为pH 5.5, 温度30℃。

8.权利要求1所述的用于促进黄鳝生长的酵母菌干粉用于制备黄鳝饲料的用途。