JP2014198722A - 水産養殖用経口投与免疫賦活剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)先天的免疫を仲介するサイトカイン類。このグループの魚類における最良の特性を有するサイトカインはタイプIインターフェロン(IFN)であり、これにはIFNαとIFNβ、インターロイキン1(IL-1)ファミリー(IL-1α、IL-1β、IL-1レセプター拮抗体及びIL-18を含む)及び腫瘍壊死因子(TNF)ファミリー(TNFα、TNFβ、Ltβ及びFas配位子を含む。)などが含まれる。これらのうち、TNFαが免疫系の調節機能を有する最も重要な一員である。
(b)造血を調整するサイトカイン、
(c)リンパ球を調節するサイトカイン及び
(d)非特定エフェクター細胞を制御するサイトカイン。
FE4及びRE5(図1参照)によるsbTNFαの増幅のためのPCRにおけるテンプレート(鋳型)として、LPS刺激頭腎cDNAを使用した。両方のプライマーとも、プラスミドpET15b(Novagen社製)の同じ部位でPCR生成物を後クローニングするためのBamHI制限部位を有する。増幅はcDNAテンプレート、各dNTP50μM、プライマー0.2mM、MgCl2含有1X buffer PLUS及びEco Taq PULS DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)1単位を含有するサンプル中で行った。サイクル反応はエッペンドルフ・マスターサイクラー・グラジエント内で、95℃・2分間を1サイクル、95℃・45秒間を25サイクル、60℃・45秒間を25サイクル及び72℃・30秒間を25サイクル続いて72℃・10分間を1サイクルの順で行った。PCR生成物をQIAquick・PCR精製キット(Qiagen社製)で精製し、T4DNAリガーゼ(New England Biolabs社製)1単位を使用し、インサート:プラスミド(3:1)の関係でプラスミドpGEM-T Easy(Promega社製)と室温で16時間かけてライゲーションさせた。ライゲーション混合物を形質転換大腸菌DH5αコンピテントセル(形質転換受容性細胞)に対して使用し、そして、アンピシリンとX-Gal(Sigma社製)を含有するLBプレート内に展延させた。このプレートを37℃でインキュベーションし、幾つかの生成白色コロニーを選び出し、QIAprep・Spin・Miniprepキット(Qiagen社製)によるプラスミド単離及びBamHIによる消化を通じてインサートの存在を試験した。インサート(BamHI端部を有するsbTNFα,図2参照)を含有する特定のプラスミドはpVP81と命名された。このプラスミド及び500ngのpET15bを、pVP81のsbTNFα遊離のため及びpET15b線状化のために10単位のBamHIで消化させた。インサート及び直線プラスミドの両方とも、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen社製)によりアガロース低融点ゲル(Pronadisa社製)中で電気泳動することにより分離した後、精製し、そして、1単位のT4DNAリガーゼ(New England Biolabs社製)を使用し、室温で16時間かけてライゲーションさせた。ライゲーション混合物を形質転換大腸菌DH5αコンピテントセルに対して使用し、そして、アンピシリンを含有するLBプレート内に展延させた。このプレートを37℃でインキュベーションし、幾つかの生成コロニーのプラスミドを単離し、BamHI消化によるインサート遊離及びPvull消化によるインサート配向について試験した。選択されたプラスミドの配列をABI・Prism377遺伝子分析器(CIB,CSIC社製)で決定した。
大腸菌BL21(DE3)コンピテントセルをsbTNFα含有プラスミドpET15bで形質転換し、得られた混合物をアンピシリン含有LBプレート内に展延した。幾つかの生成コロニーをLB-アンピシリン媒体中で一晩培養した。新鮮なLB-アンピシリン中に希釈した後、培養物を37℃でOD600=0.8まで成長させ、1mMのイソプロピル-D-チオガラクトシド(IPTG; Applichem社製)を用いて0.25〜4時間、25℃又は37℃で誘導した。誘導培養物0.1mlを遠心分離(1400rpm)することにより全細胞抽出物中のタンパク質発現をチェックし、細胞ペレットを、SDS-PAGE及び抗ポリヒスチジンmAb(Sigma社製)を用いるウエスタン・ブロット法による分析のためにSDS-ローディングバッファー液中で煮沸することにより溶解させた。
His 6 -sbTNFαのp424-GPDへのクローニング
613pbのHis6-sbTNFαを含む断片の増幅のためにTNF-ECOF及びTNF-ECORプライマー(図1参照)と共にPCRにおけるテンプレートとしてsbTNFα含有プラスミドpET15bを使用した。両方のプライマーとも、プラスミドp424-GPD(ATCC87357)の同じ部位内でPCR生成物をクローニングするためのEcoRI制限部位を含有する。増幅は、テンプレートを5ng、MgCl2を2.5mM、各dNTPを50μM、プライマーを0.2mM、1X・High・Speec添加剤、1X buffer PLUS及びEco・Taq・PLUS・DNAポリメラーゼを2単位含有するサンプル中で行った。サイクル反応はSmartサイクラーII(Cepheid社製)中で、95℃・5分間を1サイクル、95℃・30秒間を30サイクル、62℃・45秒間を30サイクル及び72℃・2分間を30サイクル、続いて72℃・10分間を1サイクルの順で行った。臭化エチジウムを0.5μg/ml含有する0.8%アガロースゲル(Pronadisa社製)中で電気泳動することによりPCR生成物を分離し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen社製)で精製した。精製断片及びp424-GPD250ngをEcoRI(Fermentas社製)10単位により37℃で消化させ、その後、T4DNAリガーゼ(Fermentas社製)5単位を用いて22℃でライゲーションさせた。ライゲーション反応生成物を大腸菌DH5αコンピテントセルに形質転換させ、アンピシリン100μg/mlを有するLBプレート内でプラスミド含有コロニーを選別した。2X・PCR・Master・Mix(Fermentas社製)及びPRO-GPD及びTER-GPDプライマー(図1参照)を用いるコロニーPCRにより組換体を識別した。得られたHis6-sbTNFα含有プラスミドp424-GPDをQIAprep・Spin・Miniprepキット(Qiagen社製)で精製し、EcoRIによる消化後のインサート遊離及び消化Smal及びNcolによるインサート配向について試験した。また、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学)によりプラスミドの配列を決定した。
形質転換に使用された出芽細胞菌株はEGY48(Invitrogen社製)であった。形質転換用のEGY48を作製するために、YPD培地(2%ペプトン、1%酵母エキス、2%グルコース)中でOD600=0.5まで成長させた培養物100mlの細胞を2500rpmで4℃で5分間遠心分離した。滅菌水で洗浄後、細胞を1X・LiAc-TE(0.1M酢酸リチウム, 10mM Tris pH7.5,1mMEDTA pH8.0)に再懸濁させた。形質転換のために、濃度0.3μg/μlのDNA10μlを細胞50μl及びDNA担体50μgと混合した(サーモンのDNAを予め煮沸しておいてから使用した)。続いて、この混合物を1X・LiAc-TE-PEG(1X・LiAc-TEは前記のものと同一であり、PEGは40%)混合物に添加し、30℃で30分間インキュベーションし、その後、DMSOを10%まで添加し、42℃で10分間インキュベーションした。細胞をMMSS+SDC-Trp(グルコース2%、酵母窒素塩基0.17%、硫酸アンモニウム0.25%、1Mソルビトール及びSDC-Trpを含有する最少培地)プレートに展延し、コロニーが出現するまで30℃で数日間インキュベーションした。SDC(完全合成デキストロース, Synthetic Dextrose Complete)はアデニン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン及びウラシルを20mg/l,ロイシン、リジン、チロシン及びイソロイシンを30mg/l,フェニルアラニンを50mg/l,スレオニンを200mg/l,バリンを150mg/lそれぞれ含有する。
His 6 -sbTNFαのpPCICZAへのクローニング
618pbのHis6-sbTNFαを含む断片の増幅のためにTNF-ECOF及びTNF-ECORプライマー(図1参照)と共にPCRにおけるテンプレートとしてsbTNFα含有プラスミドpET15bを使用した。両方のプライマーとも、プラスミドpPCICZA(Invitrogen社製)の同じ部位内でPCR生成物をクローニングするためのEcoRI制限部位を含有する。増幅は、テンプレートを5ng、MgCl2を2.5mM、各dNTPを50μM、プライマーを0.2mM、1X・High・Speec添加剤、1Xbuffer PLUS及びEco・Taq・PLUS・DNAポリメラーゼを2単位含有するサンプル中で行った。サイクル反応はSmartサイクラーII(Cepheid社製)中で、95℃・5分間を1サイクル、95℃・30秒間を30サイクル、55℃・45秒間を30サイクル及び72℃・2分間を30サイクル、続いて72℃・10分間を1サイクルの順で行った。臭化エチジウムを0.5μg/ml含有する0.8%アガロースゲル(Pronadisa社製)中で電気泳動することによりPCR生成物を分離し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen社製)で精製した。精製断片及びpPICZA200ngをEcoRI(Fermentas社製)10単位と共に37℃で消化させ、その後、T4DNAリガーゼ(Fermentas社製)5単位を用いて22℃でライゲーションさせた。ライゲーション反応生成物を大腸菌TOP10F'コンピテントセルに形質転換させ、ゼオシン(Invitrogen社製)25μg/mlを有するLBローソルトプレート内でプラスミド含有コロニーを選別した。2X・PCR・Master・Mix(Fermentas社製)及びPIC5及PIC3プライマー(図1参照)を用いるコロニーPCRにより組換体を識別した。得られたHis6-sbTNFα含有プラスミドpPCICZAをQIAprep・Spin・Miniprepキット(Qiagen社製)で精製し、EcoRIによる消化後のインサート遊離及びXholによる消化を通じてインサート配向について試験した。また、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学)によりプラスミドの配列を決定した。組換プラスミドにおいて、sbTNFαのスターコドンATGは、酵母における外来遺伝子発現(Romanosらの1992年の論文参照)のために、酵母のコンセンサス配列AAAAATGTCT(図3参照)中に存在する。このコンセンサス配列はプライマーTNF-ECOPP中に含まれる。
アルコール資化酵母のエレクトロポレーションの前に、後のアルコール資化酵母のゲノムDNAにおける組換及び組込みのために、His6-sbTNFα含有プラスミドpPICZAを37℃でSacl又はPmelによる消化を通じて線状化させた。線状プラスミドの全量5μgをMiniElute・Reaction・Cleanupキット(Qiagen社製)で精製し、滅菌水10μlで溶離した。エレクトロポレーションに使用したアルコール資化酵母菌株はX-33であった。エレクトロポレーション用のX-33を作製するために、OD600=1.5の培養物100mlの細胞を1500xgで4℃で5分間遠心分離した。滅菌水で2回洗浄後、細胞を1Mのソルビトール中に再懸濁させ、前記のように遠心分離し、そして最後に1Mのソルビトール100ml中に再懸濁させた。エレクトロポレーションを行うために、DNA10μlを細胞80μlと混合し、氷冷された0.2cmのエレクトロポレーション・キュベット(BioRad社製)に移送した。5分間インキュベーションした後、MicroPulserエレクトロポレーター(BioRad社製)により25μF、1.5kV及び400Ωの条件でパルスを印加した。その直後に、氷冷された1Mソルビトール溶液1mlをキュベットに添加し、得られた混合物を30℃で1時間インキュベーションした。細胞をゼオシン(Invitrogen社製)100μg/mlを有するYPDSプレート上に展延し、コロニーが出現するまで30℃で数日間インキュベーションした。PIC5及びPIC3プライマーと2X・PCRマスターミックス(Fermentas社製)を用いるPCR法によりインサートの存在に関して幾つかの形質転換体を分析し、His6-sbTNFα発現に関して測定した。特定のコロニーにおいて、ゲノムDNA精製キット(Fermentas社製)を用いてゲノムDNAを単離し、そして、His6-sbTNFα含有DNA断片をEcoTaq・PULS・DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)で増幅し、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学)によりその配列を決定した。
sbTNFαのpET15bへのクローニング
FE4及びRE5(図1参照)によるsbTNFαの増幅のためのPCRにおけるテンプレート(鋳型)として、シーバスの肝臓から得られたcDNAを使用した。両方のプライマーとも、プラスミドpET15b(Novagen社製)の同じ部位でPCR生成物を後クローニングするためのBamHI制限部位を有する。増幅はcDNAテンプレート、各dNTP50μM、プライマー0.2mM、MgCl2含有1X buffer PLUS及びEco Taq PULS DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)1単位を含有するサンプル中で行った。サイクル反応はSmartサイクラー(Cepheid社製)内で、95℃・5分間を1サイクル、95℃・45秒間を30サイクル、55℃・45秒間を30サイクル及び72℃・90秒間を30サイクル続いて72℃・10分間を1サイクルの順で行った。0.8%アガロースゲル(Pronadisa社製)中で電気泳動することにより分離した後、PCR生成物をQIAquick・PCR精製キット(Qiagen社製)で精製した。精製断片及びプラスミドpET15bをBamHIを10単位使用し、37℃で2時間かけて消化し、PCR精製キットによる前記PCR精製物をT4DNAリガーゼ(Fermentas社製)1単位を用いて22℃でライゲーションさせた。ライゲーション混合物を形質転換大腸菌DH5αコンピテントセル(形質転換受容性細胞)に対して使用し、そして、アンピシリン含有LBプレート内に展延させた。このプレートを37℃でインキュベーションし、2X・PCRマスターミックス(fermentas社製)及びプライマーT7F及びT7R(図1参照)を用いるコロニーPCR法により組換体を識別した。幾つかの生成コロニーのプラスミドをQIAprep・Spin・Miniprepキット(Qiagen社製)で単離し、BamHI消化によるインサート遊離及びPvull消化によるインサート配向について試験した。組換プラスミドの配列はABI・Prism3130遺伝子分析器(SACE,Murcia大学製)で決定した。
シーバスHis6-sbTNFαの大腸菌の形質転換及び発現測定は実施例1に述べた方法と同様な方法で実施した。
His 6 -sbTNFαのpPICZAへのクローニング
シーバスのHis6-sbTNFαのpPICZAへのクローニングは実施例3に述べた方法と同様な同様な方法で行った。シーバスのHis6-sbTNFαを含有する生成プラスミドpPICZAの配列をABI・Prism3130遺伝子分析器(SACE,Murcia大学製)で決定した。実施例3で述べたように、sbTNFαのスターコドンATGは、酵母における外来遺伝子発現(Romanosらの1992年の論文参照)のために酵母のコンセンサス配列AAAAATGTCT(図4参照)中に存在する。このコンセンサス配列はプライマーTNF-ECOPP中に含まれる。
エレクトロポレーションは実施例3に述べた方法と同様な方法で行った。しかし、プラスミドの線状化はPmel(Fermentas社製)で行った。選択されたコロニーにおいて、ゲノムDNA精製キット(Fermentas社製)でDNAを単離し、His6-sbTNFα含有DNA断片をEcoTaq・PULS・DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)で増幅し、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学製)によりその配列を決定した。
His 6 -sbTNFαのpET15bへのクローニング
プライマーTNFRO-BAMF及びTNFRO-BAMR(図1参照)を用いるsbTNFα増幅のためのPCR法におけるテンプレートとしてターボットの肝臓から得られたcDNAを使用した。両方のプライマーとも、プラスミドpET15b(Novagen社製)の同じ部位でPCR生成物を後クローニングするためのBamHI制限部位を有する。増幅はcDNAテンプレート、各dNTP50μM、プライマー0.2mM、MgCl2含有1X buffer PLUS及びEco Taq PULS DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)1単位を含有するサンプル中で行った。サイクル反応はSmartサイクラー(Cepheid社製)内で、95℃・5分間を1サイクル、95℃・45秒間を30サイクル、55℃・45秒間を30サイクル及び72℃・90秒間を30サイクル続いて72℃・10分間を1サイクルの順で行った。0.8%アガロースゲル(Pronadisa社製)で電気泳動することにより分離した後、PCR生成物をQIAquick・PCR精製キット(Qiagen社製)で精製した。精製断片及びプラスミドpET15bをBamHI10単位により37℃で2時間かけて消化し、PCR精製キットによる前記PCR精製物をT4DNAリガーゼ(Fermentas社製)1単位を用いて22℃でライゲーションさせた。ライゲーション混合物を形質転換大腸菌DH5αコンピテントセル(形質転換受容性細胞)に対して使用し、そして、アンピシリン含有LBプレート内に展延させた。このプレートを37℃でインキュベーションし、2X・PCRマスターミックス(fermentas社製)を用いるコロニーPCR法により組換体を識別した。幾つかの生成コロニーのプラスミドを単離し、BamHI消化によるインサート遊離及びPvull消化によるインサート配向について試験した。選択されたプラスミドの配列をABI・Prism377遺伝子分析器(CIB,CSIC社製)で決定した。
大腸菌の形質転換及びターボットHis6-sbTNFαの発現測定は実施例1に述べた方法と同様な方法で実施した。
His 6 -sbTNFαのpPICZAへのクローニング
ターボットのHis6-sbTNFαのpPICZAへのクローニングは実施例3に述べた方法と同様な同様な方法で行った。ターボットのHis6-sbTNFαを含有する生成プラスミドpPICZAの配列をABI・Prism3130遺伝子分析器(SACE,Murcia大学製)で決定した。実施例3で述べたように、sbTNFαのスターコドンATGは、酵母における外来遺伝子発現(Romanosらの1992年の論文参照)のために酵母のコンセンサス配列AAAAATGTCT(図5参照)中に存在する。このコンセンサス配列はプライマーTNF-ECOPP中に含まれる。
エレクトロポレーションは実施例3に述べた方法と同様な方法で行った。しかし、プラスミドの線状化はPmel(Fermentas社製)で行った。選択されたコロニーにおいて、ゲノムDNA精製キット(Fermentas社製)でDNAを単離し、His6-sbTNFα含有DNA断片をEcoTaq・PULS・DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)で増幅し、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学製)によりその配列を決定した。
大腸菌、出芽酵母又はアルコール資化酵母において発現されたHis6-sbTNFαは、AKTA・Explorer・FPLC(GE Healthcare社製)を用いてアフィニティクロマトグラフ法により精製した。精製はNi2+による固定金属イオンアフィニティクロマトグラフ法(ヒスチジン標識タンパク質の精製方法)によりHisTrap・FFカラム(GE Healthcare社製)を用いて行った。280nmにおける吸収をUNICORN5.10により測定した。容量1mlのカラムを、少なくとも5カラム容量のバインディングバッファー(20mM燐酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、5mMイミダゾール,pH7.4)を流速1ml/分で平衡化させた。次いで、成長培養物のサンプルを超音波又はビーズビーターで粉砕し、更に遠心分離してペレットを除去し、明澄な上澄液を得た。実施例2で述べたように、この直後に、この上澄液2mLをカラム内に装填した。吸収が安定したベースラインに達するまで(10〜15カラム容量)、カラムをバインディングバッファーで洗浄した。最後に、カラムに結合したタンパク質を溶出するために、溶出バッファー(20mM燐酸ナトリウム、0.5M塩化ナトリウム、5mMイミダゾール,pH7.4)の量を増大させる20〜25カラム容量の直線勾配を適用した。自動画分収集器を使用し、溶出液1mlの画分を収集した。His6-sbTNFαの存在について、SDS-PAGE及び抗ポリヒスチジンmAb(Sigma社製)を用いる免疫ブロット法によりタンパク質を含有する画分を試験した。選択された画分を合わせ、Bradfold(Sigma社製)によりHis6-sbTNFαの量を測定した。
12.5%アクリルアミド/ビサクリルアミドを用いるSDS-ポリアクリルミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)によりHis6-sbTNFαを有するサンプルを分析した。ゲルをcoomassie(登録商標)0.1%で30分間染色し、His6-sbTNFαに対応する21kDaのバンドを区別した。
発酵による形質転換酵母の培養をバイオリアクターシステム(Applicon社製)で行った。
発酵が所望のバイオマスに達し、かつ、組換TNF・His6-sbTNFαの最適発現が得られた後、培養液を無菌的に採取し、20%マロデキストリン及び10%保護ポリマーKollicoat(登録商標)・MAE100P(BASF社製)を用いて製剤化した。
滅菌完全海水500mlが入ったフラスコ内でアルテミア・ノープリウス幼生を孵化させた。フラスコ内の海水は水槽用空気ポンプに接続された空気ホースにより曝気し、往復振盪水浴中で28℃に維持した。孵化してから24時間後に、ノープリウス幼生を富化システムに採取した。このシステムは、容量100mlの複数個のフラスコからなり、各フラスコには新鮮な海水が入れられており、各フラスコは全て同じ水浴中に配置され、そして、それぞれ別々に曝気されている。全ての実験について、海水0.5mlのサンプルを採取することにより、孵化率及びノープリウス幼生の個数を見積もった。
His 6 -sbTNFαのpPICZαAへのクローニング
615pbのHis6-sbTNFα含有断片の増幅のために、TNF-ECOF及びTNF-ECOR(図1参照)によるPCR法におけるテンプレートとしてsbTNFα含有プラスミドpET15bを使用した。両方のプライマーとも、プラスミドpPICZαAの同じ部位内でPCR生成物をクローニングするためのEcoRI制限部位を含有する。増幅は、テンプレートを5ng、MgCl2を2.5mM、各dNTPを50μM、プライマーを0.2mM、1X・High・Speec添加剤、1X buffer PLUS及びEco・Taq・PLUS・DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)を2単位含有するサンプル中で行った。サイクル反応はSmartサイクラーII(Cepheid社製)中で、95℃・5分間を1サイクル、95℃・30秒間を30サイクル、55℃・45秒間を30サイクル及び72℃・2分間を30サイクル、続いて72℃・10分間を1サイクルの順で行った。臭化エチジウムを0.5μg/ml含有する0.8%アガロースゲル(Pronadisa社製)中で電気泳動することによりPCR生成物を分離し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen社製)で精製した。精製断片及びpPICZαA200ngをEcoRI(Fermentas社製)10単位により37℃で消化させ、その後、T4DNAリガーゼ(Fermentas社製)5単位を用いて22℃でライゲーションさせた。ライゲーション反応生成物を大腸菌TOP10F'コンピテントセルに形質転換させ、ゼオシン(Invitrogen社製)25μg/mlを有するLBプレート内でプラスミド含有コロニーを選別した。2X・PCR・Master・Mix(Fermentas社製)及びPICα及びPIC3プライマーを用いるコロニーPCRにより組換体を識別した。得られたHis6-sbTNFα含有プラスミドpPICZαAをQIAprep・Spin・Miniprepキット(Qiagen社製)で精製し、EcoRIによる消化後のインサート遊離及び消化Smal及びNcolによるインサート配向について試験した。また、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学)によりプラスミドの配列を決定した。
アルコール資化酵母のエレクトロポレーションの前に、後のアルコール資化酵母のゲノムDNAにおける組換及び組込みのために、His6-sbTNFα含有プラスミドpPICZαAを37℃でSacl又はPmelによる消化を通じて線状化させた。線状プラスミドの全量5μgをMiniElute・Reaction・Cleanupキット(Qiagen社製)で精製し、滅菌水10μlで溶離した。エレクトロポレーションに使用したアルコール資化酵母菌株はX-33であった。エレクトロポレーション用のX-33を作製するために、OD600=1.5の培養物100mlの細胞を1500xgで4℃で5分間遠心分離した。滅菌水で2回洗浄後、細胞を1Mのソルビトール中に再懸濁させ、前記のように遠心分離し、そして最後に1Mのソルビトール100ml中に再懸濁させた。エレクトロポレーションを行うために、DNA10μlを細胞80μlと混合し、氷冷された0.2cmのエレクトロポレーション・キュベット(BioRad社製)に移送した。5分間インキュベーションした後、MicroPulserエレクトロポレーター(BioRad社製)により25μF、1.5kV及び400Ωの条件でパルスを印加した。その直後に、氷冷された1Mソルビトール溶液1mlをキュベットに添加し、得られた混合物を30℃で1時間インキュベーションした。細胞をゼオシン(Invitrogen社製)100μg/mlを有するYPDSプレート上に展延し、コロニーが出現するまで30℃で数日間インキュベーションした。PIC5及びPIC3プライマーと2X・PCRマスターミックス(Fermentas社製)を用いるPCR法によりインサートの存在に関して幾つかの形質転換体を分析し、His6-sbTNFα発現に関して測定した。特定のコロニーにおいて、ゲノムDNA精製キット(Fermentas社製)を用いてゲノムDNAを単離し、そして、His6-sbTNFα含有DNA断片をEcoTaq・PULS・DNAポリメラーゼ(Ecogen社製)で増幅し、ABI・Prism3130遺伝子アナライザー(SACE,Murcia大学)によりその配列を決定した。
体重120gの健康なヨーロッパヘダイ(Sparus aurata L.)(硬骨魚類,スズキ目,タイ科)のサンプルを容量2m3の遊泳海水水槽内で飼育した。海水には20%水槽容量/時の流量で酸素6ppmを溶解させた。水槽は常温及び日長に維持され、市販のペレット飼料(スペインのブルゴスに所在するTrouvit社製)を1日に2回給餌した。試験群には、基礎飼料に対照酵母又は成熟(活性)sbTNFα過剰発現マイクロカプセル化酵母を0.1、1又は10%追加した餌を2日毎に給餌した。全てのサンプリングタイム(処置から2日、4日、6日及び10日後)時点で、標本魚の体重を測定し、頭腎及び腸管を採取し、光学顕微鏡で検査し、かつ、遺伝子発現を調査した。ここに述べた試験法は、実験動物の使用に関する欧州連合理事会(European Union Council)(86/609/EU)のガイドライン及びスペインのMurcia大学の生命倫理委員会のガイドラインに従っている。呼吸性バースト活性は、異なる刺激時間後の頭腎ロイコサイト懸濁液により生成されたルミノール依存性化学ルミネッセンス(Sepulcreらの2007年の論文参照)として測定した。全ての試験は5匹の魚と3重のサンプルを用いて行った。結果の有効性を確保するために、同じ試験を2回繰り返した。SPSS・13.0.1統計ソフトウエアパッケージを全ての統計分析に使用した。試験群間の差を決定するために、データは平方偏差(ANOVA)及びテューキー(Tukey)多重範囲検定により分析した。
用語「又は」に関して、例えば「A又はB」は、「Aのみ」、「Bのみ」ならず、「AとBの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
Claims (14)
- (1)腸溶保護ポリマーによりマイクロカプセル化された少なくとも魚類組換サイトカイン、ここで前記サイトカインは酵母中で過剰発現されたものである、
又は
(2)腸溶保護ポリマーによりマイクロカプセル化された酵母、ここで前記酵母は魚類組換サイトカインを発現する、
からなることを特徴とする経口投与可能な免疫賦活剤。 - 前記酵母はメタノール資化酵母(Pichia pastoris)であることを特徴とする請求項1に記載の免疫賦活剤。
- 前記組換サイトカインは、ヨーロッパヘダイ(Sparus aurata)、ヨーロピアンシーバス(Dicentrarchus labrax)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss)、イシビラメ(Psetta maxima)、シマアジ(Dentex dentex)、シャープスナウト・シーブリーム(Diplodus puntazzo)、スペインダイ(Pagellus bogaraveo)、コルビナ(Argyrosomus regius)、及びヨーロッパウナギ(Anguilla anguilla)などのような水産養殖に適した魚類由来の魚類サイトカインであることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の免疫賦活剤。
- 前記免疫賦活剤は、アルテミア(Artemia sp.)及びワムシ(phylum Rotifera)から選択される多細胞生物に給餌されることを特徴とする請求項1〜3の何れかに記載の免疫賦活剤。
- (a)選択されたサイトカインをコーディング(解読)するcDNAの組織を魚類から選別し、そして単離するステップと、
(b)少なくとも適当な酵母宿主微生物におけるサイトカイン発現のための少なくとも発現ベクターに前記cDNAをクローニングするステップと、
(c)少なくとも酵母宿主微生物の宿主細胞を培養し、組換サイトカイン又は当該組換サイトカインを含有する少なくとも酵母宿主微生物の培養物を得るステップと、
(d)組換サイトカイン又は当該組換サイトカインを含有する少なくとも酵母宿主微生物をマイクロカプセル化し、マイクロカプセル化された組換サイトカイン又は当該組換サイトカイン含有マイクロカプセル化酵母宿主微生物を得るステップとからなることを特徴とする請求項1に記載の経口投与可能な免疫賦活剤の製造方法。 - 前記少なくとも酵母宿主微生物はメタノール資化酵母(Pichia pastoris)、出芽酵母(Saccharomyces cereviciae)及びクルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)から選択されることを特徴とする請求項5に記載の製造方法。
- 前記(d)マイクロカプセル化ステップは、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メタクリル酸コポリマー、マルトデキストリン、キトサン、ゼラチン、スターチ及びアラビアゴムから選択される腸溶保護ポリマーの存在下で噴霧して噴霧乾燥させることにより行われることを特徴とする請求項5又は請求項6に記載の製造方法。
- 水産養殖される魚類の免疫刺激用としての請求項1〜4の何れかに記載の経口投与可能な免疫賦活剤の使用方法であり、前記魚類はヨーロッパヘダイ(Sparus aurata)、ヨーロピアンシーバス(Dicentrarchus labrax)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss)、イシビラメ(Psetta maxima)、シマアジ(Dentex dentex)、シャープスナウト・シーブリーム(Diplodus puntazzo)、スペインダイ(Pagellus bogaraveo)、コルビナ(Argyrosomus regius)及びヨーロッパウナギ(Anguilla anguilla)から選択されることを特徴とする経口投与可能な免疫賦活剤の使用方法。
- 水産養殖される魚類の免疫刺激用としての請求項1〜4の何れかに記載の経口投与可能な免疫賦活剤の使用方法であり、前記組換サイトカインは、免疫刺激されるべき同じ魚類の種から由来することを特徴とする経口投与可能な免疫賦活剤の使用方法。
- 前記免疫刺激は、給餌中に飼料と共に前記免疫賦活剤を投与することにより行われることを特徴とする請求項8又は請求項9に記載の使用方法。
- 前記免疫刺激は、
(a)経口投与可能な免疫賦活剤を、アルテミア(Artemia sp.)及びワムシ(phylum Rotifera)から選択される多細胞生物に投与するステップと、
(b)富化された多細胞生物を得るステップと、
(c)引き続いて、前記富化多細胞生物を魚類種に給餌するステップと、
により行われることを特徴とする請求項8〜10の何れかに記載の使用方法。 - 請求項1?4の何れかに記載された経口投与可能な免疫賦活剤で富化された多細胞生物。
- 水産養殖におけるワクチンアジュバントとしての、請求項1〜4の何れかに記載の経口投与可能な免疫賦活剤の使用方法。
- 魚類用のワクチンを更に含有し、前記ワクチンは前記組換サイトカインと共にマイクロカプセル化されていることを特徴とする請求項1〜4の何れかに記載の経口投与可能な免疫賦活剤。
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