JP2005501878A - 経口ワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、ワクチン投与すべき水生動物（例えば、魚またはエビ）の飼料として用いられる多細胞生物と、該多細胞生物に給餌されて該多細胞生物の体内に閉じ込められる単細胞生物と含む経口ワクチンを特徴とする。単細胞生物は、水生動物内で免疫応答を誘導することができ、これにより該水生動物にワクチン投与を行う組換え抗原を発現するように形質転換されている。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、水生動物（例えば、魚やエビ）を、伝染病（例えば、細菌性、ウィルス性または寄生虫性疾患）に対して免疫するのに有用な新規な経口ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
水生動物を効率的に免疫化することが望まれている。たとえば、養魚場では伝染病がよく発生するが、これは水生環境における集約養殖が病原体の伝播を容易にするためである。（非特許文献１）。経口ワクチン投与によって水生動物の疾病を予防する場合、他の方法に比べて、ストレスが無く、労力を殆ど要せず、大規模な投与が可能であるといったいくつかの利点が得られる。しかしながら、多くの経口ワクチンでは、十分な用量の抗原を摂取できないこと、抗原の送達不良および消化管内での抗原の分解により、十分な効果が得られないことが分かっている。
【非特許文献１】
ダン（Ｄｕｎｎ）ら（１９９０年）Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第９巻、第２３−３頁。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、水生動物（例えば、魚やエビ）を、伝染病（例えば、細菌性、ウィルス性または寄生虫性疾患）に対して免疫するのに有用な新規な経口ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの態様において、本発明は、ワクチン投与すべき水生動物の飼料として用いる多細胞生物と、多細胞生物に給餌され、その結果該多細胞生物の体内に閉じ込められる（ｂｉｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）単細胞生物とを含む経口ワクチンを特徴とする。該単細胞生物は、水生動物内で免疫応答を誘導することにより該水生動物にワクチン投与することが可能な組換え抗原を発現するように予め形質転換されている。本明細書中で用いる「飼料」という用語には、飼料そのもの（例えば、餌）と飼料添加物とが含まれる。より詳細には、単細胞生物は目的とする抗原のアミノ酸配列をコードする異種核酸を含んでいる。核酸は組換えベクターの中にあり、このベクターは、発現すべき核酸に機能的に連結された１つ以上の調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）も含んでいる。抗原は、免疫応答を誘導できさえすれば、天然に存在する遺伝子内に見られる野生型のアミノ酸配列でなくてもよい。例えば、魚の経口ワクチンとしては、細菌抗原を発現するように形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（単細胞生物）を餌とし、これを内部に閉じ込める（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅ）アルテミア（ａｒｔｅｍｉａ）（多細胞生物）が挙げられる。
【０００５】
別の態様において、本発明は、経口ワクチンの調製方法を特徴とする。本方法は、（１）水生動物内で免疫応答を誘導することにより該水生動物にワクチン投与することが可能な組換え抗原を発現するように形質転換された単細胞生物を提供することと、（２）前記単細胞生物を多細胞生物に給餌することとを含む。給餌の結果、多細胞生物（例えば、アルテミア、クルマムシ、藻類、ゾウリムシ、またはカキ胚）は、単細胞生物（例えば、細菌または酵母）を体内に閉じ込める。このような多細胞生物を、経口ワクチンとして水生動物に給餌することができる。
【０００６】
また、ワクチン投与すべき水生動物に上述の経口ワクチンを給餌することにより、該動物にワクチンを経口送達する方法も本発明の範囲内である。
本発明の他の特徴、目的および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、水生動物を伝染病に対して免疫するための、予防的ワクチン投与もしくは治療的ワクチン投与用の経口ワクチンに関する。経口ワクチンは、単細胞生物を餌とすることで該単細胞生物を含有する多細胞生物を含む。多細胞生物に給餌される単細胞生物は、水生動物内で免疫応答を誘導することのできる組換え抗原を発現するように形質転換されている。水生動物に給餌される上記多細胞生物は、動物に対する経口ワクチンとして機能する。言い換えれば、単細胞、多細胞生物または水生動物内で発現される抗原は、上記単細胞生物が多細胞生物へ給餌され、該多細胞生物が水生動物へ給餌されるという２段階の給餌を経て水生動物へ送達される。この送達の結果、抗原は動物内で免疫応答を誘導することができる。
【０００８】
勿論、どのような抗原を発現させるかは、誘導される免疫応答が標的病原体に対するものかどうかによって異なる。免疫応答の引き金となる抗原が同定されている場合には、その抗原をクローニングして同抗原をコードする核酸とこの核酸に機能的に連結された１つ以上の調節配列とを含む組換えベクターとすることができる。調節配列としては、抗原を恒常的に発現させる調節配列、ならびに誘導可能な配列を用いることができる。組換えベクターは、単細胞生物が形質転換されるような要素に基づいて設計することができる。組換えベクターは異なる抗原をコードする２つ以上の核酸を含んでいてもよい。例えば、組換えベクターが２つの抗原をコードする核酸を含み、同一または異なる病原体に対する免疫応答を誘導できるようにしてもよい。あるいは、組換えベクターは、抗原性はないが、それ自体またはコードされるペプチドが標的病原体に対する免疫応答を高める役目をするポリペプチド（例えば、ヘルパーエピトープ）をコードする核酸を含んでいてもよい。
【０００９】
上記組換えベクターは、外来の核酸（例えばＤＮＡ）を適当な宿主単細胞生物に導入するための様々な当該技術分野で認識されている技術、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクチン、またはエレクトロポーレーションを含む、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって、適当な単細胞生物中に導入される。適当な単細胞生物の例は、例えば、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）（１９９０年）Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）の中に記載されている。１つ以上の上記単細胞生物を、ワクチン投与すべき水生動物への飼料または飼料添加物である適切な多細胞生物に給餌する。したがって、ここで得られる多細胞生物は経口ワクチンとして機能するが、この経口ワクチンにおいて、抗原は、多細胞生物の体内に閉じ込められた単細胞生物中にある。水生動物の消化管では様々な抗原分解が起こるため、意外にもこのような経口ワクチンが効果的であることがわかってきた。
【００１０】
以下の具体例は、説明のみを意図しており、開示の残りの部分を多少なりとも限定するものではないと解釈すべきである。当業者であれば、これ以上詳述しなくても、本明細書中の記載に基づいて本発明をその最大限可能な範囲で利用できるに違いない。本願に列挙する全ての出版物は、その全体が参照により本願に組み込まれる。
【実施例】
【００１１】
（材料と方法）
（動物）
ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）を用いた。ゼブラフィッシュは２８．５℃などの適当な温度に維持し、再循環濾過水中で飼育した。各実験の開始時には、魚は５０日齢であった。ワクチン投与までのあいだ、魚には通常のブライン・シュリンプ（アルテミアノープリウス幼生）を給餌した。ワクチン投与後、１日あたり魚の体重の５％の量のペレット状の乾燥餌による給餌を開始した。
【００１２】
（プラスミドの構築と抗原の調製）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＥ毒素）は、院内感染の原因となる細菌であり、マウスに対するＬＤ_５０値（半致死量）は１μｇである。組換え型のシュードモナス細菌外毒素Ａ（ＰＥ）もまた、動物モデルにおける天然型ＰＥ毒素の負荷に対し効果的に防御することができる。
【００１３】
シグナルペプチドとＣ末端とを有しないＰＥ遺伝子をコードするプラスミドｐＪＨ４は、ホァン（Ｈｗａｎｇ）博士からの寄贈品である（Ｈｗａｎｇら（１９８７年）、Ｃｅｌｌ、第４８巻、１２９〜１３６頁）。ＰＥ遺伝子をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩによる消化によりｐＪＨ４から単離し、単離したＰＥ遺伝子を同じ制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）の接着末端を有する別のプラスミドｐＥＴ２４ａに挿入することにより、プラスミドｐＥＴ２４ａ−ＰＥを作成した。得られたプラスミドで大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。プラスミドを含む細菌を、カナマイシンを５０μｇ／ｍＬの濃度で含むＬＢブロス中、３７℃で培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達した時点で、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドを終濃度１ｍＭとなるように添加した。１５０分後、細菌をハーベストし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＥ富化大腸菌を得た。細菌をアルテミアに給餌するまで−２０℃で保存し、発現ＰＥタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。
【００１４】
（ＰＥ富化アルテミアノープリウス幼生の調製）
連続光と十分な空気を与えた状態で、２９±１℃の新鮮な海水中でアルテミアノープリウス幼生を孵化させた。孵化後４０時間目にアルテミア幼生を回収し、ＰＥ富化大腸菌（または対照大腸菌）を給餌した。給餌後、アルテミアノープリウス幼生を回収し、ＰＢＳで５回洗浄した。アルテミアノープリウス幼生は直ちにゼブラフィッシュに給餌するか、または後で使用または分析するために−２０℃で保存した。
【００１５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびウェスタンブロッティング）
アルテミア試料中のＰＥタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（米国９４５４７カリフォルニア州ハーキュリーズ、アルフレッドノーベルドライブ２０００に所在のバイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ））を用いて分析した。試料をＬａｅｍｍｌｉバッファ（ラムリ、ユー．ケイ．（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．）（１９７０年）、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）、第２２７巻、６５０〜６８５頁）中にホモジナイズし、５分間煮沸した。ＳＤＳを含む８％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってＰＥタンパク質を分析し、電気泳動後にクーマシーブルーで染色した。ＰＥタンパク質は大腸菌が発現した全タンパク質の４０％を超えていた。イムノブロッティングアッセイにおいては、試料中のＰＥタンパク質をゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース紙に転写し、ウサギ抗ＰＥ抗体および二次抗体（アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体）とともにインキュベートした後、アルカリホスファターゼ基質（バイオラッド）で染色した。実験は業者（バイオラッド）の推奨する条件下で実施した。抗ＰＥ抗体は、免疫化によりウサギにおいて産生させた。フロイント完全アジュバント中に乳化させた２５０μｇのＰＥタンパク質をウサギに投与した。プールしたウサギ抗ＰＥ抗体画分をウェスタンブロット分析用に調製した。
【００１６】
（ワクチン投与計画）
ＰＥ富化アルテミアノープリウス幼生を、ワクチン投与前２４時間絶食させたゼブラフィッシュに給餌した。給餌の間、水流は停止させた。給餌は１日に４回行った。対照の魚（ワクチン非投与魚）には、対照のアルテミアノープリウス幼生を給餌した。６週間後、ワクチン投与魚とワクチン非投与魚のいずれにも、ペレット状の乾燥餌を給餌した。３週間後、ＰＥ毒素（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いて魚に負荷をかけた。
【００１７】
（ＰＥ毒素による負荷試験）
ゼブラフィッシュにおけるＰＥのＬＤ_５０値を求めるために、５つの実験群（各群につき６匹のワクチン非投与魚）について試験した。５群を２４時間絶食させ、２００ｐｐｍの２−フェノキシエタノールを用いて麻酔し、それぞれ、０，０．５，１，１．５および２μｇのＰＥ毒素を腹腔内注射した。このようにして、ゼブラフィッシュに対するＰＥのＬＤ_５０値は、５０日齢のゼブラフィッシュにおいて１〜１．２μｇの範囲であると決定された。続く実験において、１．２μｇのＰＥ毒素を用いてワクチン投与魚に負荷をかけた。
【００１８】
（魚におけるＰＥ摂取の免疫組織化学的研究）
富化アルテミアノープリウス幼生を給餌した後、６群（各群３匹）をそれぞれ、０，１，２，３，６および１２時間目に屠殺し、氷上に１分間おいた。魚を解剖して、４％ホルマリン中で一晩固定し、ＰＢＳでリンスして脱水した後、パラフィンワックス中に包埋した。連続切片に裁断し、ポリ−Ｌ−リジン処理したスライドグラス上に置き、３％Ｈ_２Ｏ_２含有ＰＢＳ溶液とともにインキュベートして内在性ペルオキシダーゼを不活性化した。次にスライドグラスをＰＢＳ−Ｅ（１ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ）でリンスし、５０％エタノール（エタノール５０％と水５０％（体積比））および９０％エタノール（エタノール９０％と水１０％（体積比））で脱水した。ウサギ抗ＰＥ血清（１：１０００）と、ヤギ抗ウサギ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（１：２００）とを用いたイムノペルオキシダーゼ反応により、ＰＥタンパク質を検出した。コンジュゲートをＨＲＰ基質（０．０１２％（体積比）過酸化水素水）および色素体（０．４ｍｇ／ｍＬ）によって可視化した。切片にアミノエチルカルバゾールを１５分間作用させた後、スライドグラスをＰＢＳ−Ｅで２回洗浄した。切片を酸ヘマトキシリンで５分間対比染色し、アンモニア水で１分間処理して青色にしてから、ＰＢＳでリンスした。検出は、封入剤として水を用い、スライドグラスを顕微鏡下、４０〜４００倍率で観察することによって行った。組換えＰＥを含む組織は赤褐色に染まった。
【００１９】
（結果）
（ＬＤ_５０の決定）
ゼブラフィッシュの体重は同じ日齢であっても異なるため、５０日齢のゼブラフィッシュに対するＰＥ毒素のＬＤ_５０値は、１〜１．２μｇであると決定され、１匹あたり１．２μｇを負荷用量として用いた。ＬＤ_５０を確認するために、２１匹のワクチン非投与魚に対して腹腔内注射による負荷をかけた。この群においては、１０匹（５０％）が１週間以内に死亡し、７匹（３３％）が２〜３日で死亡した。さらに、８０％を超える魚についてその皮膚および脂肪組織に出血症状が観察された。全ての魚が注射後７〜１０日までの間に食欲を失った。これに対し、ＰＢＳを腹腔内注射した対照の魚は、出血の症状もみせず、食欲を失ったのはわずか１日の間であった。
【００２０】
（経口ワクチンの効力）
経口ワクチンを給餌することによってワクチン投与を受けた１６匹の魚に対して、１．２μｇのＰＥ毒素の腹腔内注射による負荷をかけた。４匹のワクチン投与魚が５日以内に死亡した（死亡率２５％）。比較対照としては、ワクチン非投与群（通常の大腸菌で飼育したアルテミアによる模擬ワクチン投与群）の６匹の魚のうち、４匹の魚が５日以内に死亡した（死亡率７５％）。この結果から、アルテミアの体内に閉じ込められた組換え大腸菌を含む経口ワクチンは有効であることが分かる。さらに、ワクチン投与魚は食欲を失ってもいたが、ワクチン非投与群のＰＥ負荷から生き延びた魚に比べて２〜３日早く回復した。
【００２１】
（富化アルテミアノープリウス幼生の至適調製時間）
富化アルテミアの至適調製時間を見積もるために、ＰＥタンパク質を発現する大腸菌（ＢＬ２１，ＤＥ３）を、アルテミアノープリウス幼生に給餌した。給餌後、０，１５，３０，４５，６０，９０および１２０分の時点でアルテミアノープリウス幼生を屠殺し、ＰＢＳで５回洗浄して表面に付着した大腸菌を除去した。アルテミアノープリウス幼生試料を６Ｍ尿素中に懸濁し、超音波破砕した。該試料から抽出されたＰＥタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ウサギ抗ＰＥ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析によって検出した（上記参照）。この結果、アルテミアノープリウス幼生中のＰＥタンパク質の量は給餌後に増加し、３０分〜６０分後に安定期に達し、その後降下することが分かる。したがって、上記の実験例におけるアルテミアノープリウス幼生の至適給餌時間は４５分間である。
【００２２】
（組換え型および細菌由来の天然型抗原の比較）
ＰＥ毒素を産生するＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの６つの菌株（ＡＴＣＣ１５６９３，ＡＴＣＣ２９２６０，ＡＴＣＣ３３４４９，ＡＴＣＣ３３３５４，ＡＴＣＣ３３３５５およびＡＴＣＣ３３３５９）と、ＰＥ富化組換え大腸菌とを別個にアルテミアノープリウス幼生に給餌した。上記７種のアルテミアノープリウス幼生試料より抽出したＰＥタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ウサギ抗ＰＥ抗体を用いたウェスタンブロッティング分析（上記参照）によって検出した。ＰＥ富化組換え大腸菌で飼育したアルテミアは、ＰＡＧＥゲル分析によって容易に観察可能な量のＰＥタンパク質を含んでいたが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの６菌株で飼育したアルテミアは、ＰＡＧＥゲル分析において検出可能な量のＰＥタンパク質を全く示さなかった。この結果から、特異的抗原を有する組換え大腸菌を給餌すると、アルテミアを未処理の細菌病原体で飼育する従来技術と比べて、抗原の量が増加することが示された。ゴメス‐ギル（Ｇｏｍｅｚ−Ｇｉｌ）ら（１９９８年）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 第６４巻、第２３１８〜２３２２頁を参照のこと。このように、アルテミアノープリウス幼生の体内に閉じ込められた組換えＰＥ富化大腸菌を含む経口ワクチンを摂取した魚は、免疫応答を誘発するのに十分な量のＰＥタンパク質を得ることができる。
【００２３】
（魚の腸内におけるＰＥタンパク質の摂取）
抗ＰＥ抗体を用いたイムノアッセイによる組織学的観察から、アルテミアノープリウス幼生の給餌後１〜３時間の間に魚の腸管内腔にＰＥタンパク質が観察され、取込みは給餌から２時間で最大量に達することが分かった。データから、ＰＥタンパク質の粒子が粘膜を通過して上皮細胞に進入することが判明した。粒子は６時間後から消失し始め、１２時間後には完全に消失していた。
【００２４】
（本発明の経口ワクチンの安全性評価）
経口ワクチンを給餌した全ての魚において、形態、食欲、遊泳挙動または死に関する異常は何も見られなかった。
【００２５】
（他の実施形態）
本明細書中に開示した全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書中に開示の各特徴は、同一、同等または類似の目的を果たす代替の特徴と置き換え可能である。このように、特に説明しない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴を包括したものの一例にすぎない。
【００２６】
上記の記載から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を容易に突き止めることができ、かつ本発明の思想と範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更形態および修正形態を作製して、様々な用途や条件に適応させることができる。例えば、上述の経口ワクチンを、他の家畜（例えば、ブタやニワトリ）またはヒトを免疫するため用いることも可能である。このように、他の実施形態も特許請求の範囲に含まれる。

Claims (27)

1. ワクチン投与すべき水生動物の飼料として用いられる多細胞生物と、
   該多細胞生物に給餌されて該多細胞生物の体内に閉じ込められる単細胞生物とを含む経口ワクチンであって、
   単細胞生物は、水生動物内で免疫応答を誘導することにより該水生動物へのワクチン投与を行う組換え抗原を発現するように形質転換されることを特徴とする経口ワクチン。
2. 単細胞生物は細菌または酵母であることを特徴とする請求項１に記載の経口ワクチン。
3. 多細胞生物は、アルテミア、クルマムシ、藻類、ゾウリムシ、またはカキ胚であることを特徴とする請求項１に記載の経口ワクチン。
4. 単細胞生物は細菌または酵母であることを特徴とする請求項３に記載の経口ワクチン。
5. 水生動物は魚またはエビであることを特徴とする請求項１に記載の経口ワクチン。
6. 水生動物は魚であることを特徴とする請求項５に記載の経口ワクチン。
7. 多細胞生物はアルテミアであることを特徴とする請求項６に記載の経口ワクチン。
8. 単細胞生物は細菌であることを特徴とする請求項７に記載の経口ワクチン。
9. 単細胞生物は大腸菌であることを特徴とする請求項８に記載の経口ワクチン。
10. 組換え抗原は細菌性抗原であることを特徴とする請求項９に記載の経口ワクチン。
11. 水生動物内で免疫応答を誘導することにより該水生動物にワクチン投与を行う組換え抗原を発現するように形質転換された単細胞生物を提供する工程と、該単細胞生物を多細胞生物に給餌して、該単細胞生物を体内に閉じ込めている多細胞生物を含む経口ワクチンを得る工程とを含む経口ワクチンの調製方法。
12. 単細胞生物は細菌または酵母であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 多細胞生物は、アルテミア、クルマムシ、藻類、ゾウリムシ、またはカキ胚であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
14. 単細胞生物は細菌または酵母であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 水生動物は魚またはエビであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
16. 水生動物は魚であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
17. 多細胞生物はアルテミアであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 単細胞生物は細菌であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 単細胞生物は大腸菌であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 組換え抗原は細菌性抗原であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. ワクチン投与すべき水生動物に多細胞生物を給餌する工程を含むワクチンの経口送達方法であって、該多細胞生物が、水生動物内で免疫応答を誘導することにより該水生動物へのワクチン投与を行う組換え抗原を発現するように形質転換された単細胞生物を体内に閉じ込めていることを特徴とする方法。
22. 単細胞生物は細菌または酵母であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 多細胞生物は、アルテミア、クルマムシ、藻類、ゾウリムシ、またはカキ胚であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
24. 水生動物は魚またはエビであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
25. 水生動物は魚であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 単細胞生物は大腸菌であり、多細胞生物はアルテミアであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
27. 組換え抗原は細菌性抗原であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。