TWI227114B - Oral vaccine for aquatic animals - Google Patents

Description

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常生對水生動物之有效免疫方法。例如，魚類養殖 環境中：\因為魚類密集養殖會幫助病原體在水生 五.專播。見唐（D麵）等人（199〇)—⑽/㈣ 比23_3 ° 種疫“預防水生動物疾病 /、万去有許多優點：不易導致緊迫、只需少許勞力、 並=以大量使用。然而’許多口服疫苗因為無法攝取足量 :原、抗原遞送微弱、以及抗原在消化道降 有效。 〜 發明摘沭 本發明係指一種適用於水生動物（例如魚、蝦、蜂蟹或龍 蝦）之新穎Π服疫苗技術，以針對傳染性疾病（例如細菌性: 病毒性或寄生蟲疾病）之防治。 本發明一方面係針對以可供作水生動物的食物之多細胞 生物作為-免疫水生動物的口服疫苗，以及該多細胞生物包 埋單細胞生物及抗原之方法。該單細胞生物被基因轉殖而 表現把在此水生動物體内引起抵抗疾病反應之物質（包括重 組抗原、DNA、RNA及醣類），並從而促製水生動物免疫之 功犯。此中所述之r食物」包括食物本身（例如餌料、飼料） 以及食物添加物。更具體的說，該單細胞生物（如細菌）包含 具有忒物貝之異種核酸。該核酸係在一重組載體中，其亦 包含一或更多個與被表現之核酸有效連結之調控序列（例如 促進子或加強子）。該物質只需能引起免疫反應或是使水生 動物產生對抗疾病的能力，而不必要是自然存在基因及其 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準規格(21〇><297公釐） 1227114 A7

細菌性 豐年蝦 ^基^序列。例如，-包含經基因轉殖後而表現一 抗原之大腸捍菌（該單細胞生物）並將其包埋於 (ar/emza)(該多細胞生物）的魚口服疫苗。 、 本發明另_方面係針對製備口服疫苗之方法。該方法包 =⑴提供經基因轉殖以表現或攜帶能在水生動物中引起免 ，或抵抗疾病反應之重組抗原之單細胞生物，以及（2)以此 早細胞生物銀食多細胞生物。銀食的結果即是該多細胞生 物（例如豐年蝦、輪蟲、水藻、草履蟲或牡蠣胚胎）將單細胞 、物（例如細菌、酵母菌、派菌或乳酸菌）包埋於該生物内 邵。而該多細胞生物可再餵予水生動物以作為口服疫苗。 本發明範圍亦包括以上述口服疫苗餵食並將疫苗或抗病 物質經口遞送到該水生動物使其接受免疫之方法。 本發明之特徵、目的與優點等將於下附發明詳細說明與 專利申請範圍中陳明。 璧1明詳、-論7明 本發明係指針對’免疫水生動物感染性疾病之口服疫苗， 可用作預防疾病的接種或治療性的接種，或是抗病物質之 4送。此口服疫苗包括銀以並含有該單細胞生物之多細胞 生物。包埋於該多細胞生物之單細胞生物係經基因轉殖以 表現能在水生動物中引起免疫反應之重組抗原。該多細胞 生物供餵予水生動物並作為此動物之口服疫苗。換句話 就’在單細胞生物、多細胞生物或水生動物中所表現的抗 原係經兩個餵食的步驟以遞送到目標之水生動物：即將上 述之單細胞生物餵予該多細胞生物，再將前一步騾所得之

1227114 五、發明説明（ 夕、、、田胞生物餵予水生 原能在動物中引起免疫反應。’、…疋雙層包埋之抗 、；、/几^《師遲全然決足於要針對特定病原體所需之免 f反應。：旦鑑別出能觸發免疫反應之抗原後，吾人便可 千取包含该抗原密碼之核酸並複製並轉殖至包今一或更 個與該核酸有效相連之調控序列的重組載體中：此調控序 列可以疋王導抗原基本表現和可謗發之序列。設計此重組 載體時可考慮欲轉殖之單細胞生物宿主的狀況。其可包含 f有一個以上不同抗原密碼之核酸。例如，包含兩個抗^ 欲碼核阪並能針對相同或不同病原體引起免疫反應多價抗 原之重組載體。或者該重組載體可包含非抗原性多肽（例如 輔助杬原決足基）之猎碼核酸，然而其本身或其所代表之多 肽可針對特定病原加強免疫反應。 該重組載體係經傳統基因轉殖作用或轉移感染技術引入 口適的單細胞生物，包括許多將外來核酸（例如Dn八）引入 合適單細胞生物宿主而屬於該技藝之技術，例如磷酸鈣或 氯化鈣共同沉澱法、DEAE聚葡萄糖媒介之轉移感染法、脂 感染法或電穿孔法。合適單細胞生物宿主之實例描述於高 朵（Goeddel) ( 1 990) Gwe心/叹少. 少則/(§J，Academic Press，聖地 牙哥’加州。接著便以一或更多個該單細胞生物餵食合適 的多細胞生物，而水生動物便因此食物或食物添加物之攝 食而被免疫接種。因此，上述得到之多細胞生物係用作口 服疫苗，其中抗原係位於一單細胞生物中並被包埋於該多 _ 6 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1227114 五 、發明說明（ 胞生物中。其特色係，該口服疫苗因 物的消化道中不被腸胃酵素降解而顯得有效在水生動 本特Γ例僅用以說明，而非以任何方式加以限制 技：1内容。在無進一步詳細闊述之下，咸信熟習此 二、可基於又中敘述使用本發明至最大程度。所有文中 引逑之文獻均全文併入作為參考文獻。 實乾 鸯參·使用斑馬魚。將斑馬魚置於例如 二c之口適概度並以循環過濾水飼養。在每個實驗的開 釔時魚年齡均為5 0天。魚在接種之前均以海蝦（豐年蝦無節 力蟲）餵食。餵食接種後則以每日魚初始體重5%之魚乾飼料 銀食。 建構質體與製備抗原·· I氤铎惠外秦l{Pseud〇m〇nas f " g/’a Exotoxin)(簡稱PE毒素）為引起醫院内感染之 細囷厂綠膿桿菌所產生之毒素，而其對實驗小白鼠 值（半致死劑量）為0.25微克（# g)。此外，重組綠膿桿菌外 母素（P E)能在動物模式中引起針對自然p £毒素挑戰之有效 保護。 具有除了訊息肽與c -端以外p e基因密碼之p j η 4質體係得 自於黃捧士（Hwang d a/. ( 1 98 7) Ce//. 48: 1 29- 1 3 6)之 贈。以£coR I與Hind III消化將PE基因自pJH4分離出 來’並將所分離之PE基因以相同限制酶之黏著端（Ec〇R i 與Hind III)嵌入另一質體pET24a而產生pET24a-PE質 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1227114 A7 _________ Β7 五、發明説明（5 ) 體。將該質體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)株中。將具有此 質體之細菌以含有50微克/毫升卡那黴素（Kanamycin)之 LB肉湯培養於37°C。當在600奈米（nm)之吸收值達到〇.6 時加入異丙基硫-Θ -D-半乳糖：y：(lsopropylthlo·々_D_ galaCt0S1de ’· IPTG)直到濃度為i 。15〇分鐘後收集該 細菌並以磷酸緩衝食鹽水（PBS)洗兩次而得到pE增沃（pE-enriched)之大腸桿菌。在餵予豐年蝦之前將細菌置於_2〇 C ’並以SDS-PAGE分析所表現之pe。 製備P E增沃之豐年蝦無節幼蟲·· γχ ± 之部誇海木 在連續光照與充足空氣之下孵化豐年蝦無節幼蟲。孵化後 40小時收集豐年蝦並餵以ΡΕ增沃之大腸样菌（或控制組大腸 桿菌）。餵食後收集豐年蝦無節幼蟲並以p B s洗五次。立即 以豐年蝦無節幼蟲餵食斑馬魚，或置於-20^直到下次使用 或分析。 石雲泳戽否方黑薹分# :以蛋白質分析組（則〇_ RAD? 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, California 94547, USA) 分析在豐年蝦樣品中之PE蛋白質。以萊姆利（Laemmli)缓衝 液（LaemmH，U. K. (1970)訂e (1 ⑽心幻 227:65〇_685) 將樣品同質化並煮沸5分鐘。以含有3]〇3之8%聚丙烯醯胺 凝膠（SDS-PAGE)分析PE蛋白質並於電泳後以寇姆西藍 (Coomw Blue)染色。在所有大腸桿菌所表現之蛋白質中 其超過4 0 %。在免疫點墨分析中，樣品中之p e蛋白質係電 泳於凝膠上並轉移到硝纖維素紙，接著與兔子抗？£抗體以 及二級抗體（與鹼性磷酸酶結合之山羊抗兔子）培養，接著以 -8- 41¾本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公澄] - 1227114 A7 __ _B7 、發明説明l ) 一 驗性鱗酸酶受質（BIO-RAD)染色。所有步騾均依供應商 (BIO-RAD)所建議之條件進行。抗PE抗體係經接種兔子而 產生。以250微克乳化於佛氏（preun(j’s)完全佐劑之p e蛋白 ^施打兔子。混合兔子抗p E抗體以製備於西方點墨分析。 #禮#席雀：以pE增沃之豐年蝦無節幼蟲餵食接種前空 腹2 4小時之斑馬魚。在餵食時將水流停止。每日餵魚*次。 以控制組豐年蝦無節幼蟲餵食控制組魚（非接種魚）。6週後 接種魚與非接種魚均以乾飼料餵食。3週後以注射LD^量之 P E毒素（Sigma)攻毒魚隻。 户五##攻毒試發：為了決定PE在斑馬魚之⑶^直，我們 測驗了五個實驗組（每組有6隻非接種魚）。分別以〇、〇 5、 1、1.5與2微克ΡΕ毒素經腹腔注射到飢餓24小時而以2〇〇 ppm2-苯氧乙醇麻醉的五個組。因此便以5 〇天大隻斑馬魚決 疋P E對斑馬魚之L D 5 Q值落在I —丨.2微克的範圍之間。在接 下來的實-驗中均以1.2微克pe毒素刺激接種魚。 鐸承/^之充虔愈麟允荸聲龙：在餵以增沃之豐年蝦無 節幼蟲後之魚，分別在〇、i、2、3、6與12小時6組，每組 取3隻並置於冰上丨分鐘。將魚解剖並於4 %福馬林中固定隔 夜，在以PBS沖洗與脫水後以固體石蠟包埋。切出連續剖面 後貼於以聚-L-賴氨酸處理過之載玻片，並培養於含有3% 雙氧水之PBS溶液以抑制内生之過氧化酶。接著以pBS_ E(含1 mM EDTA之PBS)沖洗載玻片並以5〇%(5〇%乙醇與 50〇/〇水）與9〇%乙醇（9〇%乙醇與1〇%水）將之脫水。以兔子 杬P E血清（1 : 1〇00)和與辣根過氧化酶（HRp)結合之山羊抗兔 —_ -9- 巧張尺巧用中國國家標準(CNS) M規格(2ι〇χ 297公赞) ------- 1227114 A7 ___________ B7_______ 五、發明説明（7 ) 子（1.2 0 0)進行免疫過氧化酶反應以偵測P E蛋白質。以HRP 文質（水中0.0 12% v/v之過氧化氫）以及色原質（0·4毫克/毫 升）顯現結合物。在加胺乙基咔唑到剖面1 5分鐘後以PBS-E 冲洗載破片兩次。接著以酸性蘇木精反染色剖面5分鐘，以 氨水顯藍1分鐘，在以PBS沖洗。利用水作為增強溶液以觀 察結果’而在顯微鏡下以4〇到4〇〇倍率檢視載玻片。染色後 具有重組ΡΕ之組織為淡紅到棕色。 結果 僅：因為儘管年齡相同魚的體重仍然有異，所 以決定Ρ Ε毒素對5 〇天齡斑馬魚之l D 5 〇值在1到1.2微克之間 並/夬i以1.2微克作為之後刺激之劑量。由經腹腔注射刺激 21隻非接種魚以確定ld5Q值。1〇隻（50%)魚死於1週内， 其中7隻（3 3%)死於2到3天内。更進一步，超過80%的魚在 皮膚與脂肪組織觀察到出血症狀。所有的魚在注射後接失 去食悠長-達7到1 〇天。然而，經腹腔注射p B s之控制組魚沒 有出血症狀也沒有任何一天失去食慾。 口观瘦芬之身力：經腹腔注射1.2微克PE毒素以刺激餵以 口服疫苗而接種的i 6隻魚。4隻（死亡率為2 5 %)接種過的魚 死於5天内。比較之下在6隻非接種魚（用餵以正常大腸样菌 <豆年却又典節幼蟲模擬接種）中4之死於5天内（死亡率為 7 ：)%)。結果顯示包含由豐年蝦將重組大腸桿菌包埋之口服 疫苗為有效的。而且，接種魚也失去食慾，但仍比非接種 組而存活於Ρ E刺激者早2至3天恢復。 製備增沃之豐年蝦無節幼蟲之最佳時間·· γλ策谭蛋每 ______ -10- 用中國國冢標準(CNS) Μ規格（巧X挪公釐)----- 1227114 A7 B7 五、發明説明（8 ) 質之大腸桿菌餵食豐年蝦無節幼蟲以評估製備增沃之豐年 蝦的最佳時間。在餵食後0、1 5、3 0、4 5、6 0、9 0與1 2 0 分鐘宰殺豐年蝦無節幼蟲，並以PBS洗五次以.避免黏附於表 面之大腸样菌。以6 Μ尿素懸浮豐年蝦無節幼蟲樣品並將之 震碎。以SDS-PAGE分析萃取自此樣品之ΡΕ蛋白質並以兔子 抗ΡΕ抗體進行西方點墨分析（見上文）。結果顯示豐年蝦無 節幼蟲中之Ρ Ε蛋白質量在餵食後增加，而在3 0到6 0分鐘時 達到飽和並接著下降。所以，在此實例實驗中餵食豐年蝦 無節幼蟲之最佳時間為45分鐘。 纪#f愈彝細磨冷桌戎次：分別以6株具有ΡΕ毒素綠膿捍 菌（ATCC 15693、ATCC 29260、ATCC 33449、ATCC 33354、ATCC 33355與ATCC 33359)以及PE增沃之重組大腸 桿菌餵食豐年蝦無節幼蟲。以SDS-PAGE分析分離自7個豐 年蝦無節幼蟲樣品之PE蛋白質並以兔子抗PE抗體進行西方 點墨分析f見上文）檢測。以PE增沃之大腸桿菌餵食之豐年 蝦具有之Ρ E蛋白質’能輕易地以PAGE凝膠分析測得，而以6 株綠膿桿菌餵食之豐年蝦在PAGE凝膠分析上不具任何可檢 測之PE蛋白質。結果顯示以具有特定抗原之重組大腸桿菌 餵食與先前技藝中使用原來之細菌抗原餵食相比確實能增 加抗原量。見高美吉（Gomez-Gil)等人（ 1998)Ehv/r⑽ 64:2318-23 22。因此，在攝取包含以豐年蝦無 節幼蟲將重組Ρ E增沃之大腸桿菌包埋之口服疫苗後，魚能 輕易地獲得足量的PE蛋白質以引起免疫反應。 ，靡鏵取尸五蛋冷# :以抗PE抗體對魚腸組織樣本之免疫 -11 - 本纸張足度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 1227114 A7 B7 發明説明（9 組織學染色觀察分析指出在餵食豐年蝦後小時可在魚 腸内腔中觀察到PE蛋白質，而攝取量在銀食後2小時達到最 向。貧料顯示PE蛋白質微粒穿過黏膜並進入上皮細胞。微 粒在6小時開始消失並在1 2小時後完全消失。 本發明之口服疫苗之安全性評估.·料藏❹m之 魚均沒有外觀上、食慾上、游泳行為或死亡之不正常現 象。

其他具體實施例 所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組 口說月曰中揭777之每一技術特點可以提供相同、等同或 裝 相似目的，其他方式替換。目此，除非另有特別說明，文 中所有揭不〈特點均只是等同或相似特點之，般系列之實 例。 由上iC可知癌習此技蟄者能輕易地了解本發明之必要 特徵，在脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變 與调整以應用於不同用途與條件。 -12 -

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Claims (1)

1. Ϊ227114 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 I 一種口服疫苗，其包含：（A)可供作水生動物攝食之多細 胞生物；（B)以之銀食該多細胞生物並被包埋於其中的單 細胞生物；其中該單細胞生物係經基因轉殖以表現能在 水生動物中引起免疫反應並因而免疫該水生動物之重組 抗原，或使水生動物產生對抗疾病的物質。 2. 如申請專利範圍第1項之口服疫苗，其中單細胞生物選 自細菌、酵母菌、弧菌及乳酸菌等微生物。 3. 如申請專利範圍第1項之口服疫苗，其中多細胞生物選 自豐年蝦、輪蟲、水藻、草履蟲及牡屬胚胎。 4. 如申請專利範圍第3項之口服疫苗，其中單細胞生物選 自細菌、酵母菌、弧菌及乳酸菌等微生物。 5. 如申請專利範圍第1項之口服疫苗，其中水生動物選自 魚、蝦、螃蟹及龍蝦。 6. 如申請專利範圍第5項之口服疫苗，其中水生動物為 备。 - 7. 如申請專利範圍第6項之口服疫苗，其中多細胞生物為 豐年蝦。 8. 如申請專利範圍第7項之口服疫苗，其中單細胞生物為 細菌。 9. 如申請專利範圍第8項之口服疫苗，其中單細胞生物為 大腸桿菌。 10:申請專利範圍帛9項之口服疫苗，其中重組抗原為細 囷抗原。 U.如申請專利範圍第1項之口服疫苗，其中抗病物質選自 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1227114 A8 B8 C8 ____D8 六、申請專利範圍 DNA、RNA、蛋白.質及醣類。 12. —種製備口服疫苗的方法，其包含：提供經基因轉殖以 表現能在水生動物中引起免疫反應並因而免疫該水生動 物之重組抗原，或可以使水生動物產生對抗疾病的物質 之單細胞生物；以單細胞生物銀食多細胞生物而獲得包 含將單細胞生物包埋之多細胞生物之口服疫苗。 13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中單細胞生物選自細 菌、酵母菌、弧菌及乳酸菌等微生物。 14. 如申請專利範圍第12項之方法，其中多細胞生物選自豐 年蝦、輪蟲、水藻、草履蟲及牡i厲胚胎。 15. 如申請專利範圍第1 4項之方法，其中單細胞生物選自細 菌、酵母菌、弧菌及乳酸菌等微生物。 16·如申请專利範圍第1 2項之方法，其中水生動物選自争、 蝦、螃蟹及龍蝦。 17.如申請參利範圍第1 6項之方法，其中水生動物為争。 18·如申請專利範圍第1 6項之方法，其中多細胞生物為豐年 蝦。 19.如申請專利範圍第1 8項之方法，其中單細胞生物為細 菌。 20·如申請專利範圍第1 9項之方法，其中單細胞生物為大腸 样菌。- 21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中重組抗原為細菌抗 原。 22. 如申請專利範圍第1 2項之方法，其中抗病物質選 -14- 1227114 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 DNA、RNA、蛋白·質及醣類。 23. —種經口遞送疫苗之方法，其包括以多細胞生物餵食欲 免疫之水生動物，其中多細胞生物包埋有經基因轉殖以 表現能在水生動物中引起免疫反應並因而免疫該水生動 物之重組抗原，或使水生動物產生對抗疾病的物質之單 細胞生物。 24·如申請專利範圍第23項之方法，其中單細胞生物選自細 菌、酵母菌、弧菌及乳酸菌等微生物。 25.如申巧專利範圍第2 3項之方法，其中多細胞生物選自豐 年教、輪蟲、水藻、草履蟲及牡螺胚胎。 26·如申請專利範圍第23項之方法，其中水生動物選自魚、 蝦、镑蟹及龍蝦。 27.如申請專利範圍第26項之方法，其中 。 汉如申請專鄉㈣27項之方法，其中多細胞生4物為豐年 JLny - ° -一'一 29. 如申請專利範圍.第28項之方法，其中單細胞生物為細 菌。 30. 如申請專利範圍第23項之方法’其中遞送之抗病物質選 自dna'rna、蛋白質及醣類。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) -15-