CN102796177A

CN102796177A - 一种改造体抗菌肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102796177A
Application number: CN2012102875456A
Authority: CN
Inventors: 王义鹏; 于海宁; 秦松
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2012-08-13
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体的说是一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-1及其制备方法和应用。改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-1，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1586.98Da，等电点8.96。本发明改造抗菌肽Kunyuenin-1具有极强的抗氧化活性和一定的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

Description

一种改造体抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明提供属于生物医学技术领域，具体的说是一种昆嵛林蛙（Ranakunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-1及其制备方法和应用。

背景技术

自由基指任何包含一个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、单线态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一步引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。

目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关，如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。

昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)属于两栖纲无尾目蛙科蛙属，为中国特有种，仅分布于山东省烟台市昆嵛山。目前关于昆嵛林蛙形态、发育和分子进化已有报道，但是关于昆嵛林蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-1及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-1，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1586.98Da，等电点8.96。

所述改造体抗菌肽为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸。

改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物或化妆品添加剂的用途。

本发明的有益效果在于：本发明根据昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨基酸序列，利用分子改造方法设计Kunyuenin的改造体Kunyuenin-1，该改造体具有极强的抗氧化活性和一定的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆：

1）昆嵛林蛙皮肤总RNA提取：

①取300mg昆嵛林蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为昆嵛林蛙皮肤总RNA。

2）昆嵛林蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit。

（1）cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①经DEPC处理（DEPC处理是在含0.1％（V/V）DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干）的离心管中加入1μl昆嵛林蛙皮肤总RNA、1μl 3’端一链合成引物（3’In-Fusion SMARTer CDS Primer）和2.5μl DEPC处理的水（DEPC处理的水是含0.1％DEPC(V/V)的水，放置过夜，高压灭菌）使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心（2000rpm，30s），离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-FusionSMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备），2.0μl 5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl 10mM dNTPMix、1.0μl SMARTer V Oligonucleot ide、0.25μl RNase Inhibitor和1.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心（2000rpm，30s），在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

（2）采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA LibraryConstruction Kit建库试剂盒中配备）

①将2μl cDNA第一链（mRNA反转录）、80μl去离子水、10μl10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

（3）昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆筛选：

根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94℃4min，94℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化进CaCl₂-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABIPRISM 377进行核苷酸测序。

测定结果：

编码昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No.1所示：

atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct 60

ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc 120

gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt 180

ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac 240

aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 279。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因核苷酸的序列表为：序列长度为279个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：昆嵛林蛙皮肤。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的化学合成：

Ⅰ、昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。

Ⅲ、纯化的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin是昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因编码的一种环状多肽，含有十四个氨基酸残基，分子量1584.97Da，等电点8.96。昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin全序列为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸，其中两个半胱氨酸残基之间形成一对分子内二硫键，且C末端酰胺化。

制备Kunyuenin-1：

Ⅰ、Kunyuenin-1的制备方法：根据上述Kunyuenin的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，利用HPLC反相柱层析脱盐。

Ⅲ、纯化的Kunyuenin-1用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

测定结果为：

Kunyuenin-1是昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的一种变异体。Kunyuenin-1是一种直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1586.98Da，等电点8.96。Kunyuenin-1全序列为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸，且C末端酰胺化。

实施例2Kunyuenin-1药理实验：

1.Kunyuenin-1抗氧化活性测定：

DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate）（2,2′-二苯代苦味酰基苯肼）用甲醇溶解配成6×10-5M的溶液。将48μl DPPH溶液分别与上述2μl不同浓度的Kunyuenin-1样品混合，分别室温下避光静置30min，并分别于517nm处测定吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行（表1），紫外分光光度计调零时使用甲醇。

DPPH·清除率(％)=(AB－AA)/AB×100（AB:空白对照组吸光值;AA:样品组吸光值）。

表1.Kunyuenin-1抗氧化活性

结果如表1所示，Kunyuenin-1具有极强的抗氧化活性，且其活性随着浓度的升高而逐步增强。在样品浓度为400μg/ml时，其DPPH清除率I％达到68.9％。

2.Kunyuenin-1抗菌活性检测

分别挑取保存于斜面上的试验菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌090223+和星形诺卡菌090312+）均匀涂布于MH固体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）平板上，将经过灭菌的0.5cm直径的滤纸片置于培养基表面，滴加溶解于灭菌去离子水的2mg/ml的Kunyuenin-1样品溶液10μl，于37℃倒置培养18－20小时，观察抑菌圈形成与否。若样品具有抗菌活性，则会在滤纸片周围形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明样品抗菌活性越强。

3.Kunyuenin-1最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration）测定：

试验菌株分别接种到MH液体培养基（购自青岛海博生物技术有限公司）中，37℃振荡培养到对数生长期，而后将培养至对数生长期的培养液用新鲜MH液体培养基稀释到2×10⁵ cfu/ml。

取1.9mL上述稀释的细菌培养液，加入经0.22μm孔径膜过滤的2mg/ml的昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin-1样品溶液0.1mL作为第一管,第一管混匀后取出1mL加入第2管中，依次倍比稀释（参见表1），自第9管吸出1mL弃去，第10管系对照管。

表.1稀释方法

上述各管混匀后放置37°C缓慢振荡培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。结果如表2所示。

由表2可见，Kunyuenin-1对金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌具有较强的抗菌活性，表明其在金黄色葡萄球菌和星形诺卡菌感染的治疗方面具有一定应用潜力。

表2.Kunyuenin-1抗菌活性

菌株	MIC(μg/ml)
		金黄色葡萄球菌ATCC25923	>100
金黄色葡萄球菌090223+	75
		星形诺卡菌090312+	75

MIC：最小抑菌浓度，以上结果为三次独立重复实验平均值。

4.Kunyuenin-1溶血活性测定：

将采集的兔血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的Kunyuenin-1样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％=A_样品-A_阴性对照/A_阳性对照×100％。结果表明样品浓度为100μg/ml，Kunyuenin-1的溶血百分比为15.4％，说明Kunyuenin-1具有较低的溶血活性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药和化妆品领域进一步的开发应用。

Claims

1.一种改造体抗菌肽，其特征在于：改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Ranakunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-1，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1586.98Da，等电点8.96。

2.按权利要求1所述的改造体抗菌肽，其特征在于：所述改造体抗菌肽为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸。

3.一种权利要求1所述的改造体抗菌肽的应用，其特征在于：所述改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物或化妆品添加剂的用途。