CN103172720A - 一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G及其编码序列的基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G，它是具有序列表中SEQIDNO：1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQIDNO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQIDNO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNO：2衍生的蛋白质。本发明提供的务川臭蛙抗氧化肽具有极强的抗氧化活性、分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单的特点，将其应用在抗氧化药物或化妆品添加剂中，可以提高药物或化妆品添加剂的抗氧化效果。由于该基因是务川臭蛙本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响其安全性，可广泛应用于药物或化妆品添加剂生产中。

Description

一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G及其编码序列的基因与应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，尤其是一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G及及编码序列的基因与应用。 

背景技术

任何包含一个未成对电子的原子或原子团，均称之为自由基。能够有效清除来自于生存环境或者自身代谢产物的有毒活性物质对所有的生物机体来说都非常重要。对有氧呼吸生物来说，自由基特别是活性氧自由基如超氧阴离子自由基、过氧化氢自由基等的形成是需氧呼吸代谢过程中不可避免的副产物，正常生理状况下线粒体完成有氧呼吸的过程中，会有1-2%的氧气转化为超氧阴离子自由基，并由此产生一系列破坏性极强的氧化自由基如羟基自由基，通过脂质过氧化、蛋白质变性或者对遗传物质DNA的损伤对细胞或组织造成严重破坏。 

目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关，如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。抗氧物目前在国内外应用广泛, 需求量逐渐增多, 现在被用于预防治疗多种疾病, 如心血管疾病、肿瘤、关节炎、肾功能损伤、糖尿病、自身免疫性疾病等。此外，抗氧化物近年在化妆品领域的应用兴起,尤其是天然抗氧化物。由于皮肤的光老化作用是由于紫外线诱导皮肤细胞产生大量的氧自由基堆积而造成的。现在许多护肤品中加入抗氧化剂, 有减少雀斑、防辐射、延缓衰老、调节免疫和提高皮肤自我保护的作用。 

为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统等。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶（SOD）和小分子抗氧化多肽。 

务川臭蛙（Odorrana wuchuanensis)属于两栖纲无尾目蛙科臭蛙属，为中国特有种，仅分布于贵州省务川仡佬族苗族自治县。目前关于务川臭蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。 

发明内容

技术要求 

本发明所要解决的技术问题是提供一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G。

本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白片段的编码序列。 

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因片段在制备抗氧化药物或化妆品添加剂的应用。 

本发明是这样实现的：一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G，它是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。 

所述的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；该务川臭蛙抗氧化肽是直链多肽，含有26个氨基酸残基，分子量为3016.60 Da，等电点为10.30。 

务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的编码基因，它是下列核苷酸之一： 

（1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（2）编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸；

（3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的编码基是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 

务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G在制备抗氧化药物或化妆品添加剂的应用。 

有益效果 

通过基因工程的方法将本发明提供的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G具有极强的抗氧化活性、分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单的特点，将其应用在抗氧化药物或化妆品添加剂中，可以提高药物或化妆品添加剂的抗氧化效果。由于该基因是务川臭蛙本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响其安全性，可广泛应用于药物或化妆品添加剂生产中。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 

本发明的实施例1：务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G基因克隆。 

1）务川臭蛙皮肤总RNA提取： 

①取300 mg务川臭蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1 m1总RNA提取缓冲液( Trizol，美国Invitrogen公司产品 )，充分混匀，而后于4℃，12000 rpm离心10 min。

②离心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000 rpm离心10分钟，弃除沉淀。 

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000 rpm离心10分钟，收集沉淀用75%（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为务川臭蛙皮肤总RNA。 

2）务川臭蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit。 

（1）cDNA第一链合成( mRNA 反转录 )： 

①经DEPC处理（DEPC处理是在含0.1% （V/V）DEPC的水浸泡过夜，高压灭菌，烘干）的离心管中加入1 μl 务川臭蛙皮肤总RNA、1 μl 3’端一链合成引物（3’In-Fusion SMARTer CDS Primer）和2.5 μl DEPC处理的水（DEPC处理的水是含0.1% DEPC(V/V)的水，放置过夜，高压灭菌）使总体积达到 4.5 μl，混匀后短暂离心（2000 rpm，30 s），离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂（均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备），2.0 μl 5×第一链缓冲液、0.25 μl 100 mM DTT、1.0 μl 10 mM dNTP Mix、1.0 μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25 μl RNase Inhibitor和1.0 μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心（2000 rpm，30 s），在42℃ 保温 90 min，然后68℃保温10 min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2 μl所合成的cDNA第一链备用。 

（2）采用长末端聚合酶链式反应(LD- PCR)方法扩增第二链（所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备） 

①将2 μl cDNA第一链（mRNA 反转录）、80 μl 去离子水、10 μl 10×Advantage 2 PCR 缓冲液、2 μl 50×dNTP 混合物、2 μl 5’PCR引物、2 μl CDS /3’ PCR引物以及2 μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增： 95℃，1 min；18个循环：95℃，15 sec，65℃，30 sec，68℃，6 min。循环结束后，将离心管中合成的 cDNA 双链－80℃保存。 

（3）务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G基因克隆筛选： 

根据蛙科抗菌肽信号肽区保守序列设计正向引物进行PCR扩增，其序列为5’-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH 公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 sec，57℃ 30 sec和72 ℃ 1 min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒（天根生物）进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体 (Takara, 大连)，转化进CaCl₂-MgCl₂法制备好的DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素和蓝白斑双重筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer, model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。

测定结果： 

编码务川臭蛙抗氧化肽 wuchuanin-G的基因自5’端至3’端序列如SEQ ID No.1所示。

务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G基因核苷酸的序列表为：序列长度为325个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源： 务川臭蛙皮肤。 

本发明的实施例2：务川臭蛙抗氧化肽 wuchuanin-G的化学合成。 

Ⅰ、务川臭蛙抗氧化肽 wuchuanin-G的化学合成方法：根据基因推导的成熟肽氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A, Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐。 

Ⅱ、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）。 

Ⅲ、纯化的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。 

编码务川臭蛙抗氧化肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。 

务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G是基因编码的一种直连多肽，含有二十六个氨基酸残基，分子量3016.60Da，等电点10.30。 

本发明的实施例3：务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的在制备抗氧化药物中的应用。 

本发明的实施例4：务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的在制备化妆品添加剂中的应用。 

本发明的实施例5：务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的药理实验。 

1、务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G 抗氧化活性测定： 

ABTS（3-ethylbezothiazoline-6-sulfonic acid）（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）用PBS缓冲液(pH7.4) 配成2 mM的ABTS储存液。将ABTS储存液和70 mM过硫酸钾（K₂S₂O₈）水溶液按体积比250:1混合，于室温避光放置15-16 h。试验开始前，将ABTS·⁺释至734 nm波长处的吸光值为0.80±0.03。将4 μl不同浓度的上述wuchuanin-G抗氧化肽样品和96 μl上述校正过的ABTS·⁺溶液混合，室温放置10 min后，于734 nm波长处检测反应液的吸光值。空白对照组为溶解样品所用灭菌去离子水。实验做三个平行（表1） 。

ABTS·⁺清除率 I(%)= (A_B－A_A)/ A_B  ×100（AB: 空白对照组吸光值; AA: 样品组吸光值）。 

表1. 务川臭蛙抗氧化肽 wuchuanin-G 抗氧化活性 

结果如表1所示，务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G 具有极强的抗氧化活性，且其活性随着浓度的升高而逐步增强。在样品浓度为320 μg/ml时，其ABTS·⁺清除率I%达到57.95%。

2、务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G 溶血活性测定： 

将采集的健康人血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成10⁷-10⁸ cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G 样品混合，37℃保温30 min，再于1000 rpm离心5 min，上清液于540 nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H%=A_样品-A_阴性对照/A_阳性对照×100%。结果表明样品浓度为200 μg/ml，务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G 的溶血百分比为5.91%；样品浓度为100 μg/ml wuchuanin-G的溶血百分比为0.84%说明务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G不具有的溶血活性，不易引起人体红细胞破裂溶解而对人体产生伤害，因此十分利于其在医药和化妆品领域进一步的开发应用。

本发明涉及的序列及记号分列如下：

 (1) SEQ ID NO. 1的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：325bp

  (B)类型：核苷酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：直链状

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.：1

 (2) SEQ ID NO. 2的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：26 a.a

  (B)类型：氨基酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：直链状

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列描述：SEQ ID NO.：2

(3) SEQ ID NO. 3的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：21bp

  (B)类型：核苷酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：直链状

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.3

(4) SEQ ID NO. 4的信息

(i)序列特征：

  (A)长度：21bp

  (B)类型：核苷酸

  (C)链性：单链

  (D)拓扑结构：直链状

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.4。

SEQUENCE LISTING                       

序列表

<110>  贵州师范大学

<120>  一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G及其编码序列的基因与应用

<130>  nm:

<160>  4    

<170>  PatentIn version

<210>  1

<211>  325

<212>  DNA

<213>  务川臭蛙皮肤

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(325)

<223> 

      atgttccccttgaagaaattcctattgctccttttcttttttgggatcgtctcctcatct 60

ccctgttttagaaagagagatgccgatgaagaaggaaatgaagaaaatggagctgaagct 120

aaaatggaagacataaaaagagcagttccctggagatttccagcaactgggtttggacca 180

gttgaaaagccctttaggaaactactttgtagaaaggattaatcttgaattggaagtaat 240

ctgatgtggaatattatttagctaaatgctaaatgtctaaaaaaaaataaacacatcaca 300

aatacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 325

 

<210>  SEQ ID NO. 2

<211>  26

<212> 

<213>  人工合成

<400>  2

Ala  Val  Pro  Trp  Arg  Phe  Pro  Ala  Thr  Gly  Phe  Gly  Pro  Val  Glu

1                  5                       10                       15

Lys  Pro  Phe  Arg  Lys  Leu  Leu  Cys  Arg  Lys  Asp

                   20                       25

 

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>用NCBI数据库进行检索，根据蛙属抗菌肽cDNA序列的信号肽保守区域进行引物设计，并进行contigs的拼接，然后用Macvector软件设计,用于以用于PCR扩增。

<400> 3

CCAAA GATGT TCACC TTGAA G  21

 

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>在合成cDNA2链时在cDNA2链两端各加上了一个已知序列接头。故在扩增皮肤抗菌肽基因时，下游引物序列和建库试剂盒提供的3’-PCR引物序列相同。

 

<400> 4

CGGGG TACGA TGAGA CACCA T  21

Claims (5)

1.一种务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G，其特征在于：它是具有序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个以上氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G，其特征在于：所述的务川臭蛙抗氧化肽具有序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；该务川臭蛙抗氧化肽是直链多肽，含有26个氨基酸残基，分子量为3016.60 Da，等电点为10.30。

3.一种如权利要求1所述的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的编码基因，其特征在于：它是下列核苷酸之一：

（1）序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

（2）编码序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多核苷酸；

（3）在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G的编码基因，其特征在于：务川臭蛙抗氧化肽的编码基是序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

5.一种如权利要求3所述的务川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-G在制备抗氧化药物或化妆品添加剂的应用。