CN112618423B - 一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法及其应用，包括如下步骤：S1,类变形被孢霉干燥菌丝粉末制备：类变形被孢霉发酵物真空冷冻或真空恒温干燥后使用粉碎机对其进行粉碎，所得粉碎为白色粉末状，S2,类变形被孢霉提取液的制备：用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取，分别得到类变形被孢霉水提物和类变形被孢霉醇提物，上述制备的提取液用于化妆水、乳液或膏霜中。本发明，提供的类变形被孢霉提取液稳定性好，制备方法简单，步骤少具备促进细胞增殖，抗衰老和美白等多种功效。

Description

一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体为一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法及应用。
背景技术
衰老是生物随着时间的推移自发的必然过程。大多数人的皮肤衰老基本从25岁就开始了，主要表现在皱纹增多，色素沉着和皮肤松垂等，而皮肤老化的决定因素在于内外环境对真皮层内胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白、透明质酸的破坏以及皮肤水分的流失等。人真皮层80％是胶原蛋白，它的三维螺旋结构，如弹簧般支撑着皮肤，使皮肤富有弹性、光泽和平滑。胶原蛋白由皮肤中的成纤维细胞生成，存在于细胞外基质中，为皮肤提供结构稳定性，为结缔组织提供耐久性及粘结组织以支持细胞连接、细胞增生和诱导未分化细胞分化等作用。弹力蛋白是肌肤组成的重要成分，弹力蛋白在肌肤中仅含 5％，却是激发肌肤胶原蛋白和弹性纤维生成的关键，弹性纤维决定肌肤的紧致弹力，而弹性纤维的90％是由弹力蛋白组成。纤维蛋白可增加皮肤和粘模的紧致度和弹性。透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，广泛存在于结缔组织、上皮组织和神经组织中，是细胞外基质的主要成分之一。因此，促进肌肤的胶原蛋白、弹力蛋白、纤维蛋白和透明质酸的合成，能达到一定的抗衰老效果。
类变形被孢霉是一种接合菌，是丛野生冬虫夏草中分离出来，目前类变形被孢霉的开发利用基本空白，未见类变形被孢霉应用于化妆品中的相关技术报道。本发明通过对类变形被孢霉发酵液对细胞的作用机制，通过微生物发酵法，建立了一种可用于制备高安全性，且具有美白以及抗衰老效果的类变形被孢霉发酵液的微生物发酵方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，包括如下步骤：
S1,类变形被孢霉干燥菌丝粉末制备：
类变形被孢霉发酵物真空冷冻或真空恒温干燥后使用粉碎机对其进行粉碎，所得粉碎为白色粉末状。
S2,类变形被孢霉提取液的制备：
用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取，分别得到类变形被孢霉水提物和类变形被孢霉醇提物。
优选的，所述真空冷冻干燥条件为-20℃～-40℃预冷，当冷阱温度降至 -50℃以下时，放入待冷冻的类变形被孢霉发酵物，干燥室真空度保持 0.1-0.2MPa，直至完全干燥后停机取出真空包装备用。
优选的，所述真空恒温干燥条件为20℃～30℃、真空度保持130-200Pa，直至完全干燥后停机取出真空包装备用。
优选的，所述步骤S2中的用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取是采用超声波进行提取。
优选的，所述步骤S2中的用水对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为被孢霉菌丝体粉末和水的比例为1g：15～20mL，超声波提取时间为20-50 分钟，超声后选用5000-15000rpm离心转速，离心10～15分钟，取离心后上清，将上清液冷冻干燥即为类变形被孢霉水提物。
优选的，所述步骤S2中的用无水乙醇对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为类变形被孢霉菌丝体粉末和无水乙醇的比例为1g：15～20mL，超声波提取时间为20-50分钟，超声后2000-8000rpm转速进行离心，离心10 分钟，取离心后上清，上清液在0℃～4℃保持静置过夜后，再在0℃～4℃、 10000～15000rpm条件下离心10～15分钟，去除大部分饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸后将其放入旋转蒸发机去除乙醇，得到浅黄色油状物质，即为所需要的类变形被孢霉乙醇提取物。
优选的，所述旋转蒸发机旋转蒸发温度为35℃。
优选的，所述步骤S2中的类变形被孢霉菌丝体粉是经过100目筛筛选后的。
上述所述的制备方法制备的类变形被孢霉发酵物提取液用于化妆水、乳液或膏霜中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明，首次发现类变形被孢霉提取液的新活性，即能促进皮肤生成成纤维细胞，同时能更好的促进皮肤成纤维细胞分泌胶原蛋白及透明质酸。因此，本发明的发明人首次提出类变形被孢霉提取液具有制备护肤品的新用途。
本发明，首次提出从自然获取的菌种分离得到提取液。因此，本申请的护肤化合物是纯天然化合物，并非是有机合成产物。
本发明，提供的类变形被孢霉提取液稳定性好，制备方法简单，步骤少具备促进细胞增殖，抗衰老和美白等多种功效。
附图说明
图1是本发明的样品细胞增殖性检测结果柱状图。
图2是本发明的样品对透明质酸促进实验检测结果柱状图。
图3是本发明的样品对胶原蛋白促进实验检测结果柱状图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法；
S1,类变形被孢霉干燥菌丝粉末制备：
类变形被孢霉发酵物真空冷冻后使用粉碎机对其进行粉碎，所得粉碎为白色粉末状，真空冷冻干燥条件为-20℃～-40℃预冷，当冷阱温度降至-50℃以下时，放入待冷冻的类变形被孢霉发酵物，干燥室真空度保持0.1-0.2MPa，直至完全干燥后停机取出真空包装备用。
S2,类变形被孢霉提取液的制备：
用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取，类变形被孢霉菌丝体粉末是经过100目筛筛选后的，分别得到类变形被孢霉水提物和类变形被孢霉醇提物，步骤S2中的用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取是采用超声波进行提取，步骤S2中的用水对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为被孢霉菌丝体粉末和水的比例为1g：15～ 20mL，超声波提取时间为20-50分钟，超声后选用5000-15000rpm离心转速，离心10分钟，取离心后上清，将上清液冷冻干燥即为类变形被孢霉水提物，步骤S2中的用无水乙醇对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为类变形被孢霉菌丝体粉末和无水乙醇的比例为1g：15～20mL，超声波提取时间为20-50分钟，超声后2000-8000rpm转速进行离心，离心10分钟，取离心后上清，上清液在0℃～4℃保持静置过夜后，再在0℃～4℃、10000～15000rpm 条件下离心10～15分钟，去除大部分饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸后将其放入旋转蒸发机去除乙醇，得到浅黄色油状物质，即为所需要的类变形被孢霉乙醇提取物，旋转蒸发机旋转蒸发温度为35℃。
上述的制备方法制备的类变形被孢霉发酵物提取液用于化妆水、乳液或膏霜中。
实施例2
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法；
S1,类变形被孢霉干燥菌丝粉末制备：
类变形被孢霉发酵物真空恒温干燥后使用粉碎机对其进行粉碎，所得粉碎为白色粉末状，真空恒温干燥条件为20℃～30℃、真空度保持130-200Pa，直至完全干燥后停机取出真空包装备用。
S2,类变形被孢霉提取液的制备：
用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取，类变形被孢霉菌丝体粉末是经过100目筛筛选后的，分别得到类变形被孢霉水提物和类变形被孢霉醇提物，步骤S2中的用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取是采用超声波进行提取，步骤S2中的用水对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为被孢霉菌丝体粉末和水的比例为1g：15～ 20mL，超声波提取时间为20-50分钟，超声后选用5000-15000rpm离心转速，离心10分钟，取离心后上清，将上清液冷冻干燥即为类变形被孢霉水提物，步骤S2中的用无水乙醇对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为类变形被孢霉菌丝体粉末和无水乙醇的比例为1g：15～20mL，超声波提取时间为 20-50分钟，超声后2000-8000rpm转速进行离心，离心10分钟，取离心后上清，上清液在0℃～4℃保持静置过夜后，再在0℃～4℃、10000～15000rpm 条件下离心10～15分钟，去除大部分饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸后将其放入旋转蒸发机去除乙醇，得到浅黄色油状物质，即为所需要的类变形被孢霉乙醇提取物，旋转蒸发机旋转蒸发温度为35℃。
上述的制备方法制备的类变形被孢霉发酵物提取液用于化妆水、乳液或膏霜中。
成纤维细胞的细胞增殖实验(MTT检测法)
采用成纤维细胞MTT检测法进行细胞增殖率检测。收集处于指数生长期的人皮肤成纤维细胞，消化后接种至96孔板。取实施例2,3获得的类变形被孢霉菌菌丝醇提物和类变形被孢霉菌菌丝水提物，按照表1配置成不同浓度的受试物，并采用无任何添加细胞作为阳性对照。待细胞铺板率达到40％时，分别加入类变形被孢霉菌菌丝醇提物和类变形被孢霉菌菌丝水提物，然后将培养板放置在37℃、5％的CO2培养箱中培养。细胞孵育培养24h，弃掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加150μL二甲基亚砜，酶标仪490nm读取OD值。
Figure BDA0002861373320000051
表1测试浓度设定表
根据读取的OD值，代入计算公式：(给药孔OD-调零孔OD)/(对照孔OD- 调零孔OD)×100％＝细胞增殖率，得到细胞增殖率检测结果见图1。
ELISA法测定成纤维细胞产生的透明质酸的量。
将人类皮肤成纤维细胞(HACAT)细胞接种在96孔板中(200μL/孔，细胞接种量为1×104个/孔，培养基采用含10％牛血清MEM基础培养基，于37℃、 5％CO2培养箱中过夜培养。24h后，加入表2的样品，并采用无任何添加细胞作为阳性对照，培养箱培养48h。将每组细胞培养物离心收集上清。利用透明质酸测定试剂盒ELISA法测定上清中透明质酸的含量。结果如图2显示类变形被孢霉在一定浓度范围内，透明质酸含量呈现上升趋势，具有比较好的促进作用。
Figure BDA0002861373320000052
表2测试浓度设定表
测定类变形被孢霉提取液促进胶原蛋白生成的效果
将人类皮肤成纤维细胞(HACAT)细胞接种在96孔板中(200μL/孔，细胞接种量为1×104个/孔，培养基采用含10％牛血清MEM基础培养基，于37℃、 5％CO2培养箱中过夜培养。24h后，加入表2的样品，并采用无任何添加细胞作为阳性对照，培养箱培养48h。将每组细胞培养物离心收集上清。利用胶原蛋白测定试剂盒ELISA法测定上清中透明质酸的含量。结果如图3显示类变形被孢霉在一定浓度范围内，胶原蛋白含量呈现上升趋势，具有比较好的促进作用
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1,类变形被孢霉干燥菌丝粉末制备：
类变形被孢霉发酵物真空冷冻或真空恒温干燥后使用粉碎机对其进行粉碎，所得粉碎为白色粉末状；
S2,类变形被孢霉提取液的制备：
用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取，分别得到类变形被孢霉水提物和类变形被孢霉醇提物。
2.根据权利要求1所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述真空冷冻干燥条件为-20℃～-40℃预冷，当冷阱温度降至-50℃以下时，放入待冷冻的类变形被孢霉发酵物，干燥室真空度保持0.1-0.2MPa，直至完全干燥后停机取出真空包装备用。
3.根据权利要求1所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述真空恒温干燥条件为20℃～30℃、真空度保持130-200Pa，直至完全干燥后停机取出真空包装备用。
4.根据权利要求1所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的用水和无水乙醇两种方法对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取是采用超声波进行提取。
5.根据权利要求4所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的用水对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为被孢霉菌丝体粉末和水的比例为1g：15～20mL，超声波提取时间为20-50分钟，超声后选用5000-15000rpm离心转速，离心10分钟，取离心后上清，将上清液冷冻干燥即为类变形被孢霉水提物。
6.根据权利要求1所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的用无水乙醇对类变形被孢霉菌丝体粉末进行提取的方式为类变形被孢霉菌丝体粉末和无水乙醇的比例为1g：15～20mL，超声波提取时间为20-50分钟，超声后2000-8000rpm转速进行离心，离心10分钟，取离心后上清，上清液在0℃～4℃保持静置过夜后，再在0℃～4℃、10000～15000rpm条件下离心10～15分钟，去除大部分饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸后将其放入旋转蒸发机去除乙醇，得到浅黄色油状物质，即为所需要的类变形被孢霉乙醇提取物。
7.根据权利要求6所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述旋转蒸发机旋转蒸发温度为25℃～35℃。
8.根据权利要求1所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的类变形被孢霉菌丝体粉是经过100目筛筛选后的。
9.根据权利要求1至8任一项所述的一种类变形被孢霉发酵物提取液制备方法中制备的提取液应用于制备化妆水、乳液或膏霜中。
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"A comprehensive molecular phylogeny of the Mortierellales";L. Wagner et.al;《RESEARCH ARTICLE》;20131231;77-93 *

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