CN113559024A - 莲花花瓣提取物发酵产品的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备莲花花瓣提取物的发酵产品的方法，所述方法包括下述步骤：(1)用莲花花瓣制得莲花花瓣提取物；(2)将处于对数生长中后期的乳杆菌或芽孢杆菌菌株接种到包含步骤(1)制得的莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中进行发酵；以及(3)回收发酵产物制成发酵产品。本发明还提供由所述方法制得的莲花花瓣提取物的发酵产品、包含所述发酵产品的组合物的化妆品或食品。

Description

莲花花瓣提取物发酵产品的制备方法及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体的是化妆品领域或食品领域。一 般而言，本发明涉及一种本草发酵方法，具体而言，本发明涉及制备莲 花花瓣提取物发酵产品的方法以及所制备的莲花花瓣提取物发酵产品的 用途。
背景技术
随着社会的进步和发展，日常生活节奏普遍加快，人们也面临日趋 严重的皮肤问题，如干燥、老化、青春痘粉刺、皮肤暗沉等，针对不同 皮肤问题的化妆品也越发不可或缺。天然植物中的活性成分因具有刺激 性小、渗透性佳、安全性高、疗效显著等特点，受到越来越多人的青睐， 是潜在的化妆品添加剂。
在中国，利用本草进行美容已有很长历史，推崇“回归自然”的理念 使得天然植物化妆品在国内外的市场份额不断增大。目前，从国际市场 现状来看，韩国、日本盛行本草发酵化妆品，在本草化妆品领域具有很 强的竞争力，其中最具代表的就是日本的SK-II以及2016年进军中国市 场的韩国LG生活健康旗下的SU:M37°，而我国本土的发酵化妆品在市场上还暂时处于劣势。
本草发酵化妆品利用微生物在特定发酵条件下对本草中成分进行转 化和分解，达到降低毒性，增加功效，提高肤感的作用。但是目前，本 领域对于有效的本草发酵技术和方法仍然存在需求。
发明内容
本发明的目的在于通过筛选适合发酵的植物种类、适合本草发酵的 菌种以及对本草发酵条件的优化、对发酵产物的质量评价和对本草发酵 产物护肤功效的评价研究而开发一种新颖有效的本草发酵方法，并将由 该发酵方法所得的发酵产物用作化妆品中的成分。
在第一方面，本发明提供一种制备莲花花瓣提取物的发酵产品的方 法，所述方法包括下述步骤：
(1)用莲花花瓣制得莲花花瓣提取物；
(2)将处于对数生长中后期的乳杆菌或芽孢杆菌菌株接种到包含步 骤(1)制得的莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中进行发酵；
(3)回收发酵产物制成发酵产品。
在一个实施方案中，步骤(1)中可以用乙醇水溶液或水制备莲花花瓣 提取物。在一个具体的实施方案中，取干燥的莲花花瓣用体积分数 50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇水溶液，在60℃条 件下，回流提取3次，时间分别为3h，3h和2h，然后对提取液进行抽 滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取物。在另一个具体的实施方 案中，取干燥的莲花花瓣用粉碎机粉碎，将粉末用体积分数50-100％、 优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇水溶液在室温下超声提取三次， 时间分别为0.5-3h，0.5-3h和0.5-2h，混合每次超声后的提取液，进行 真空抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取物，用于后续实验。 其中超声处理可以是前两次每次连续超声0.5-3小时，每次超声后离心， 第三次超声0.5-2小时，然后离心，将三次离心得到的过滤液合并进行后 续处理，例如每次以28Hz的频率进行超声，三次超声的时间可以分别为 3h，3h和2h或2h，2h和2h。
本领域技术人员应该理解，体积分数100％的乙醇水溶液实际上是指 纯乙醇(即，不含水)。在本发明中，“乙醇水溶液”有时也简称“乙 醇”，例如，“体积分数70％的乙醇水溶液”也简称为“体积分数70％ 的乙醇”。
另外，本领域技术人员还应该理解，在本发明中，“莲花”与“荷 花”可互换使用，并且本发明对莲花的品种和种植地没有限制。
在一个实施方案中，步骤(2)所用的菌株选自植物乳杆菌、发酵乳杆 菌、枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌。在一个具体的实施方案中，所述菌 株为选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.124、发酵乳 杆菌(Lactobacillus fermentum)DSMZ20052和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Sbutilis)CGMCC 1.943、纳豆芽孢杆菌I(Bacillus natto I) CGMCC No.19463或纳豆芽孢杆菌II(Bacillus natto II)CGMCCNo. 19462中的任一种菌株。在一个优选的实施方案中，所述菌株为植物乳杆 菌CGMCC1.124。
在一个实施方案中，步骤(2)中菌株的接种量为1％-4％(v/v)，例 如，1％-3％(v/v)、2％-3％(v/v)、1％、2％、3％、4％(v/v)，优 选为3％(v/v)。
在一个实施方案中，步骤(2)中乳杆菌或芽孢杆菌菌株在接种后培养 14-20h达到对数生长中后期，然后再接种到包含步骤(1)制得的莲花花瓣 提取物的液体发酵培养基中，发酵周期为12小时。
在一个实施方案中，步骤(2)中发酵培养基包含0.5至2重量％、优 选0.5重量％、1重量％、1.5重量％或2重量％的莲花花瓣提取物。
在一个实施方案中，步骤(2)中发酵培养基包含下述成分：莲花花瓣 提取物10g/L，柠檬酸铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，K2HPO4 2.0g/L， MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·7H2O0.05g/L。
在一个实施方案中，步骤(2)中发酵培养温度是30℃至40℃，优选 30℃、37℃或40℃。
在一个实施方案中，步骤(2)中在将甘油管中的菌株接种到种子培养 基时使菌株的初始OD600值为0.2，然后培育14～20h，按3％接种量(v/v) 转接到含有莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中，进行振荡发酵培养。
在一个实施方案中，步骤(3)中通过萃取回收发酵产物。可以用于萃 取的有机溶剂包括，但不限于，乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚或正丁醇 等。
在第二方面，本发明提供通过用乳杆菌或芽孢杆菌对莲花花瓣提取 物发酵制得的发酵产品，具体地，通过本发明第一方面的方法制得的莲 花花瓣提取物的发酵产品。
在一个实施方案中，莲花花瓣提取物用乙醇水溶液或水提取。在一 个具体的实施方案中，莲花花瓣提取物通过下述方法制备：取干燥的莲 花花瓣用体积分数50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇 水溶液，在60℃条件下，回流提取3次，时间分别为3h，3h和2h， 然后对提取液进行抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取物。在 另一个具体的实施方案中，取干燥的莲花花瓣用粉碎机粉碎，将粉末用 体积分数50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇水溶液的 乙醇水溶液在室温下超声提取三次，时间分别为0.5-3h，0.5-3h和0.5-2 h，混合提取液，进行真空抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取 物，用于后续实验。其中超声处理可以是前两次每次连续超声0.5-3小时， 每次超声后离心，第三次超声0.5-2小时，然后离心，将三次离心得到的 过滤液合并进行后续处理，例如每次以28Hz的频率进行超声，三次超声 的时间可以分别为3h，3h和2h或2h，2h和2h。在一个实施方案中， 用于发酵的乳杆菌或芽孢杆菌选自植物乳杆菌、发酵乳杆菌、枯草芽孢 杆菌或纳豆芽孢杆菌。在一个具体的实施方案中，所述乳杆菌或芽孢杆 菌为选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.124、发酵乳 杆菌(Lactobacillusfermentum)DSMZ 20052和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Sbutilis)CGMCC1.943、纳豆芽孢杆菌I(Bacillus natto I) CGMCC No.19463或纳豆芽孢杆菌II(Bacillusnatto II)CGMCC No. 19462中的任一种菌株。在一个优选的实施方案中，所述菌株为植物乳杆 菌CGMCC 1.124。
在一个实施方案中，利用分级萃取、硅胶柱层析及制备级液相分离 得到莲花花瓣提取物的主要黄酮成分，经核磁和液相质谱法分析为山柰 酚-3-O-葡萄糖苷，利用标准品对照法确定经植物乳杆菌发酵后所得到的 莲花花瓣提取物的发酵产品的主要成分为槲皮素和山柰酚。
在一个实施方案中，本发明人检验证明莲花花瓣提取物本身及其主 要成分无抑制蘑菇酪胺酸酶的活性，在对黑色素瘤细胞无毒的浓度下， 无抑制黑色素的作用，而莲花花瓣提取物在经菌株发酵后对蘑菇酪氨酸 酶抑制作用增强，能够降低酪氨酸酶活性和降低黑色素含量。上述结果 表明，与莲花花瓣提取物相比，莲花花瓣提取物的发酵产物具有增强的 美白效果。
在一个实施方案中，本发明人检测莲花花瓣提取物及其发酵产物对 永生化人角质形成细胞HaCat细胞的丝聚蛋白基因FLG的表达具有明 显的促进作用，并且存在明显的剂量依赖性。丝聚蛋白是皮肤中的天然 保湿因子，上述结果表明，与莲花花瓣提取物相比，本发明的莲花花瓣 提取物的发酵产物具有增强的保湿效果。
在一个实施方案中，本发明人检测莲花花瓣提取物及其发酵产物对 间质胶原酶MMP-1具有明显的抑制作用，并且存在明显的剂量依赖性。 MMP-1介导的胶原裂解是皱纹形成的根源。上述结果表明，与莲花花瓣 提取物相比，本发明的莲花花瓣提取物的发酵产物具有增强的抗衰老效 果。
在第三方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含通过本发明 第一方面的方法制得的莲花花瓣提取物的发酵产品。
本发明的莲花花瓣提取物的发酵产品可以用于制备化妆品或食品， 例如，具有美白、保湿、抗衰老效果的化妆品，或者花茶或糕点等食品。
在第四方面，本发明涉及莲花花瓣提取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵 的发酵产品或包含所述发酵产品的组合物在制备化妆品中的用途。与不 包含莲花花瓣提取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵的发酵产品的化妆品相 比，包含所述发酵产品的化妆品具有增强的美白、保湿、抗衰老效果。
在第五方面，本发明涉及莲花花瓣提取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵 的发酵产品或包含所述发酵产品的组合物在制备食品中的用途。所述食 品可以是，但不限于花茶或糕点等。
在第六方面，本发明提供一种化妆品，所述化妆品包含莲花花瓣提 取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵的发酵产品以及其他活性成分。所述化妆 具有良好的美白、保湿、抗衰老效果。
在一个实施方案中，所述化妆品可以包含本发明第二方面的发酵产 品或本发明第三方面的组合物。
在一个实施方案中，所述莲花花瓣提取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵 的发酵产品经由本发明第一方面的方法制得。
在一个实施方案中，所述莲花花瓣提取物为莲花花瓣提取物。在优 选的实施方案中，所述莲花花瓣提取物为莲花花瓣经乙醇水溶液或水提 取的提取物。在优选的实施方案中，所述莲花花瓣提取物通过下述方法 制备：取干燥的莲花花瓣用体积分数50-100％、优选50-75％、更优选 70％或75％的乙醇水溶液，在60℃条件下，回流提取3次，时间分别为3h，3h和2h，然后对提取液进行抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花 花瓣提取物。在另一个优选的实施方案中，取干燥的莲花花瓣用粉碎机 粉碎，将粉末用体积分数50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％ 的乙醇水溶液在室温下超声提取三次，时间分别为0.5-3h，0.5-3h和 0.5-2h，混合提取液，进行真空抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣 提取物，用于后续实验。其中超声处理可以是前两次每次连续超声0.5-3 小时，每次超声后离心，第三次超声0.5-2小时，然后离心，将三次离心 得到的过滤液合并进行后续处理，例如每次以28Hz的频率进行超声，三 次超声的时间可以分别为3h，3h和2h或2h，2h和2h。
在一个实施方案中，所述莲花花瓣提取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵 制得发酵产品。
在一个实施方案中，用于发酵的乳杆菌或芽孢杆菌选自植物乳杆菌、 发酵乳杆菌、枯草芽孢杆菌或纳豆芽孢杆菌。在一个具体的实施方案中， 所述乳杆菌或芽孢杆菌为选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) CGMCC 1.124、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)DSMZ 20052和 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Sbutilis)CGMCC1.943、纳豆芽 孢杆菌I(Bacillus natto I)CGMCC No.19463或纳豆芽孢杆菌II(Bacillus natto II)CGMCC No.19462中的任一种菌株。在一个优选的 实施方案中，所述菌株为植物乳杆菌CGMCC 1.124。
在第七方面，本发明还提供一种护理皮肤的方法，所述方法包括向 受试者的皮肤涂抹有效量的本发明第五方面的化妆品。与不包含莲花花 瓣提取物经乳杆菌或芽孢杆菌发酵的发酵产品的化妆品相比，本发明包 含莲花花瓣提取物发酵产品的化妆品具有增强的美白、保湿和抗衰老的 作用。
在第八方面，本发明还提供一种食品，所述食品包含本发明第二方 面的发酵产品或本发明第三方面的组合物。
附图说明
图1显示用实施例1的五种菌株对莲花花瓣提取物发酵12小时后得 到的发酵产物的高效液相色谱(HPLC)结果。a:仅莲花花瓣提取物； b:枯草芽孢杆菌CGMCC 1.943发酵产物；c:纳豆芽孢杆菌II发酵产 物；d:纳豆芽孢杆菌I发酵产物；e:发酵乳杆菌DSMZ 20052发酵产 物；f:植物乳杆菌CGMCC 1.124发酵产物。
图2显示用实施例1的五种菌株对莲花花瓣提取物发酵前后的产物 对蘑菇酪氨酸酶催化活力的影响。
图3显示植物乳杆菌CGMCC 1.124对莲花花瓣提取物发酵前后的 提取物对胞外酪氨酸酶催化活力的影响。从左至右依次为：空白对照 (即，未接种植物乳杆菌CGMCC 1.124的发酵培养基，其中不包含莲 花花瓣提取物)，曲酸(kojic acid),植物乳杆菌发酵前(即，包含莲 花花瓣提取物(LPE)的发酵培养基),植物乳杆菌发酵产物，和植物乳 杆菌自身代谢产物。
图4显示α-MSH对B16F10细胞存活率(A)及黑色素含量(B) 的影响。
图5显示熊果苷(Arbutin)对B16F10细胞存活率(A)及黑色素 含量(B)的影响。
图6显示莲花花瓣提取物经植物乳杆菌CGMCC 1.124发酵前后对 B16F10细胞存活率(A)及黑色素含量(B)的影响。(A)：从左至右 依次为：不接菌的植物乳杆菌发酵培养基(即，包含莲花花瓣提取物 (LPE)的发酵培养基)，植物乳杆菌发酵后的莲花花瓣提取物(FLPE)， 植物乳杆菌自身代谢产物，(B)从左至右依次为：空白对照(无α-MSH 刺激)，α-MSH刺激，熊果苷(Arbutin)，不接菌的植物乳杆菌发酵 培养基(即，包含莲花花瓣提取物LPE的发酵培养基)，植物乳杆菌发 酵后的莲花花瓣提取物(FLPE)，植物乳杆菌自身代谢产物。
图7显示植物乳杆菌CGMCC 1.124的生长曲线。
图8显示氮源及离子添加优化的结果。a:莲花花瓣提取物；b-e: MRS培养基中全部离子化合物+莲花花瓣提取物(b),1％胰蛋白胨(c),3％ 胰蛋白胨(d)，5％胰蛋白胨(e)；f:清水+莲花花瓣提取物。
图9显示莲花花瓣提取物发酵前后供试物和对照品的HPLC图谱及 对应紫外吸收图谱。A～F分别代表：莲花浸膏(即，莲花花瓣提取物)， 芦丁，槲皮苷，金丝桃苷，槲皮素，山柰酚。
图10显示莲花花瓣提取物HPLC-DAD图谱(A，UV 210nm)以 及石油醚萃取部分(B)、二氯甲烷萃取部分(C)、乙酸乙酯萃取部分(D)、 正丁醇萃取部分(E)的HPLC图谱。
图11显示莲花花瓣提取物乙酸乙酯提取部分经硅胶柱分离5:1二氯 甲烷-甲醇洗脱液(v/v)洗脱的组分的HPLC图谱。
图12显示不同供试物对蘑菇酪氨酸酶活力的影响。从左至右依次 为：空白对照(具体为PBS缓冲液)，曲酸，熊果苷，山柰酚-3-O-葡萄 糖苷，槲皮素和山柰酚。
图13显示莲花花瓣提取物发酵前后主要成分对B16F10细胞存活率 (A)及黑色素含量(B，C，D)的影响。空白为阴性对照，具体为PBS 缓冲液。
图14显示莲花花瓣提取物发酵前后主要成分对胞内酪氨酸酶活力的 影响。空白为阴性对照，具体为PBS缓冲液。
图15显示莲花花瓣提取物及其发酵产物对永生化人角质形成细胞 HaCat细胞的FLG基因的表达具有明显的促进作用，并且存在明显的剂 量依赖性。从左至右依次为：空白对照(即，PBS缓冲液)；12.5和25 μg/ml的莲花花瓣提取物(LP)，12.5和25μg/ml的莲花花瓣提取物的 发酵产物(FLP)。
图16显示莲花花瓣提取物及其发酵产物对MMP-1具有明显的抑制 作用，并且存在明显的剂量依赖性。从左至右依次为：MMP-1抑制剂筛 选试剂盒自带的MMP-1抑制剂；12.5和25μg/ml的莲花花瓣提取物 (LP)，12.5和25μg/ml的莲花花瓣提取物的发酵产物(FLP)。
具体实施方式
本发明人以莲花提取物(具体是莲花花瓣提取物)为研究对象，利 用五种益生菌(植物乳杆菌CGMCC 1.124、发酵乳杆菌DSMZ 20052、 枯草芽孢杆菌CGMCC 1.943、纳豆芽孢杆菌I CGMCC No.19463和纳 豆芽孢杆菌II CGMCC No.19462)对其进行发酵，分析莲花花瓣提取物 发酵前后的主要成分的变化，证明植物乳杆菌CGMCC 1.124可将莲花 花瓣提取物黄酮类物质转化，且转化率最高。进一步将发酵前后的产物 在美白模型上检测，证明莲花花瓣提取物经植物乳杆菌CGMCC 1.124 发酵后的产物具有良好的美白、保湿和抗衰老功效。
本发明人还优化了莲花花瓣提取物发酵的条件，并利用高效液相色 谱法等技术，定性定量分析本草发酵前后功效成分的变化，以进一步阐 明本草发酵产物作为功效化妆品添加剂的物质基础，为后续产业化应用 提供参考。
具体地，本发明提供下述实施方案：
1.一种制备莲花花瓣提取物的发酵产品的方法，所述方法包括下述 步骤：
(1)用莲花花瓣制得莲花花瓣提取物；
(2)将处于对数生长中后期的乳杆菌或芽孢杆菌菌株接种到包含步 骤(1)制得的莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中进行发酵；以及
(3)回收发酵产物制成发酵产品。
2.根据第1项所述的方法，其中步骤(1)中用乙醇水溶液或水制备莲 花花瓣提取物，优选地，取干燥的莲花花瓣用体积分数50-100％、优选 50-75％、更优选70％或75％的乙醇水溶液，在60℃条件下，回流提取 3次，时间分别为3h，3h和2h，然后对提取液进行抽滤，滤液减压浓 缩至干，制得莲花花瓣提取物；或者，取干燥的莲花花瓣用粉碎机粉碎， 将粉末用体积分数50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇 水溶液在室温下超声提取三次，时间分别为0.5-3h，0.5-3h和0.5-2h， 混合提取液，进行真空抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取物； 其中所述莲花花瓣提取物的主要成分是山柰酚-3-O-葡萄糖苷。
3.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)所用的菌株选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Sbutilis)或纳豆芽孢杆菌 (Bacillus natto)。
4.根据第3项所述的方法，其中步骤(2)所用的菌株为选自植物乳杆 菌CGMCC1.124、发酵乳杆菌DSMZ 20052和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.943、纳豆芽孢杆菌I CGMCCNo.19463或纳豆芽孢杆菌II CGMCC No.19462中的任一种菌株，优选为植物乳杆菌CGMCC1.124。
5.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)中菌株的接种量为1％至4％ (v/v)，例如，1％-3％(v/v)、2％-3％(v/v)、1％、2％、3％、4％ (v/v)，优选为3％(v/v)。
6.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)中乳杆菌或芽孢杆菌菌株在 接种后培养14-20h达到对数生长中后期，然后再接种到包含步骤(1)制 得的莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中，发酵周期为12小时。
7.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)中发酵培养基包含0.5至2 重量％、优选0.5重量％、1重量％、1.5重量％或2重量％的莲花花瓣 提取物。
8.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)中发酵培养温度是30℃至 40℃，例如30℃、37℃或40℃。
9.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)中发酵培养基包含下述成分： 莲花花瓣提取物10g/L，柠檬酸铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·7H2O 0.05g/L。
10.根据第1项所述的方法，其中步骤(2)中在将菌株接种到液体发 酵培养基中之前将待接种菌株的培养液的OD600值均调为0.2，然后按1％ 至4％(v/v)、优选3％(v/v)的接种量转接到含有莲花花瓣提取物的 液体发酵培养基中，进行振荡发酵培养。
11.根据第1项所述的方法，其中步骤(3)中通过萃取回收发酵产物， 其中用于萃取的有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚或正丁醇。
12.通过第1-11项中任一项的方法制得的莲花花瓣提取物的发酵产 品。
13.根据第12项所述的莲花花瓣提取物的发酵产品，其主要成分为 槲皮素和山柰酚。
14.根据第12项所述的莲花花瓣提取物的发酵产品，其中与未发酵 的莲花花瓣提取物相比，所述发酵产品具有增强的蘑菇酪氨酸酶抑制作 用，能够降低酪氨酸酶活性和降低黑色素含量，能够增加丝聚蛋白基因 FLG的表达水平，并且能够抑制间质胶原酶MMP-1的活性。
15.一种组合物，所述组合物包含第12项所述的莲花花瓣提取物的 发酵产品。
16.第12项所述的莲花花瓣提取物的发酵产品或第15项所述的组合 物在制备化妆品或食品中的用途。
17.根据第16项所述的用途，其中与不包含所述莲花花瓣提取物的 发酵产品的化妆品相比，所述化妆品具有增强的美白、保湿和抗衰老效 果。
18.一种化妆品，所述化妆品包含第12项所述的莲花花瓣提取物的 发酵产品或第15项所述的组合物以及其他活性成分。
19.一种食品，所述食品包含第12项所述的莲花花瓣提取物的发酵 产品或第15项所述的组合物以及其他成分。
20.第19项所述的食品，所述食品是花茶或糕点。
本领域技术人员应该理解，对于数值范围，其涵盖该范围内的任意 值和端点值以及该范围内任意两个数值组成的亚范围。例如，50-100％ 将涵盖50％与100％之间任意值，例如，51％、51.5％、55％、60％等等， 也涵盖两个端点值50％和100％，还涵盖在这之间的较小的范围，例如， 50-90％，55-75％等等。
本发明的各个方面将在下述实施例中进一步描述。根据下述具体实 施例的描述，本领域技术人员能够更好地理解本发明要求保护的技术方 案的范围。本领域技术人员能够理解，这些具体的实施例仅是举例说明 的目的，并不将本发明的保护范围限制于此。
生物材料保藏信息
用于本发明的纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，在本发明中称为纳豆 芽孢杆菌I(Bacillus natto I)和纳豆芽孢杆菌II(Bacillus natto II)， 于2020年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center， CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所)，它们的保藏编号分别为CGMCC No.19463和CGMCC No.19462。
实施例
除非另有说明，下述实施例中所用的试剂均为市售试剂。
实施例1制备莲花花瓣提取物发酵产物并检测发酵产物的美白活性
1.实验材料
1.1供试物
莲花花瓣由相宜本草化妆品有限公司商购得到，具体为抚仙湖莲花 花瓣。
小鼠黑色素瘤B16F10细胞：购于中国科学院细胞所。
熊果苷(Arbutin)购于韶远化学科技(上海)有限公司，α-MSH购于 Abcam公司。
1.2实验菌株
植物乳杆菌CGMCC 1.124(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌 DSMZ 20052(Lactobacillus fermentum)和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.943 (Bacillus subtilissubsp.Sbutilis)均购自国重室菌种保藏中心(中国上海 市徐汇区梅陇路130号，华东理工大学生物工程学院国重室菌种保藏中 心)，纳豆芽孢杆菌I(Bacillus natto I)CGMCCNO.19463和纳豆芽 孢杆菌II(Bacillus natto II)CGMCC NO.19462均已由申请人于2020年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC，地 址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。
2.培养基组成
2.1乳杆菌培养基
(1)种子培养基(MRS培养基)：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g， 酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g， K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·7H2O0.05g，吐温80 1.0 g。用去离子水使其溶解，终体积定容至1L，pH为6.2±0.2，121℃， 灭菌20min。
(2)发酵培养基：供试物10g，蛋白胨10.0g,柠檬酸三铵2.0g， 醋酸钠5.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·7H2O 0.05 g，吐温80 1.0g。用去离子水使其溶解，终体积定容至1L，pH为6.2± 0.2，121℃，灭菌20min。
(3)活化斜面培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉 5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，K2HPO4 2.0g， MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·7H2O0.05g，琼脂15.0g，吐温80 1.0g。 用去离子水使其溶解，终体积定容至1L，pH为6.2±0.2，121℃，灭菌 20min。
2.2芽孢杆菌培养基
(1)种子培养基：葡萄糖15.0g，胰蛋白胨20.0g，黄豆粉10.0g， Na2HPO4 5.0g，NaH2PO4 1.0g,CaCl2 0.2g，MnSO4·7H2O 0.5g。用去 离子水使其溶解，终体积定容至1L，pH为7.3±0.2，121℃，灭菌20 min。
(2)发酵培养基：供试物10.0g，Na2HPO4 5.0g，NaH2PO4 1.0g, CaCl2 0.2g，MnSO4·7H2O 0.5g。用去离子水使其溶解，终体积定容至 1L，pH为7.3±0.2，121℃，灭菌20min。
(3)活化斜面培养基：葡萄糖15.0g，胰蛋白胨20.0g，黄豆粉10.0 g，Na2HPO4 5.0g，NaH2PO4 1.0g,CaCl2 0.2g，MnSO4·7H O 0.5g，琼 脂15.0g。用去离子水使其溶解，终体积定容至1L，pH为7.3±0.2， 121℃，灭菌20min。
3.实验方法
3.1莲花花瓣提取物的制备
取干燥的莲花花瓣用体积分数70％的乙醇水溶液，60℃条件下，回 流提取3次，时间分别为3h，3h和2h，然后对提取液进行抽滤，滤液 减压浓缩至干，用于后续实验。
3.2莲花花瓣提取物的发酵
用灭菌后的接种环蘸取少量无菌水，再蘸取少量菌种粉末，放于适 量无菌水中充分搅拌，制成悬浊液。取少量悬浊液，在活化斜面培养基 平板上划线，置培养箱中恒温培养24～48h，挑取少量平面上长出的单 菌落，镜检观察确定后，保存于甘油管中待后续的发酵实验使用。
从甘油管中吸取菌液，接种到盛有10mL种子培养基的50mL锥形 瓶中，用新鲜的种子培养基将1.2实验菌株中的五个菌株培养液的初始 OD600值均调为0.2，植物乳杆菌、发酵乳杆菌和芽孢杆菌分别在30℃、 37℃和40℃温度下，纳豆芽孢杆菌I和II在40℃温度下，150r/min震 荡培养至各自的对数中后期。按3％(v/v)接种量转接到盛有10mL发 酵培养基的50mL锥形瓶中，不接菌的发酵培养基作为空白对照，培养 12h，用乙酸乙酯萃取发酵液，将三次萃取回收的乙酸乙酯溶液减压浓 缩至干，用甲醇溶出残留物，置于烘箱烘干后，加入1mL DMSO使发 酵提取物终浓度为100mg/ml，超声溶解，0.22μM滤膜过滤，保存于 4℃冰箱供活性测定和HPLC分析。
3.3发酵转化后供试物成分的改变
1)HPLC样品的制备
取500μL 100mg/ml的发酵提取物加入500μL的甲醇溶液进行稀释， 0.22μm滤膜过滤，取滤过液进行HPLC分析。
2)HPLC条件
检测器：DAD G1315B；泵：G1311QuatPump；固定相：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，4.6×250mm，5μm；检测波长为 350nm；柱温为35℃；流速为1.0mL/min；流动相为乙腈和水(v/v)， 洗脱程序见表1。进样量为10μL。
表1.莲花花瓣提取物HPLC流动相梯度程序
Figure BDA0002468442480000151
3.4发酵后产物对蘑菇酪氨酸酶的影响
本实验设置添加供试物的实验组、添加曲酸的阳性对照组和只添加 同浓度溶媒的空白对照组。
a.各供试物用PBS溶液依次稀释成梯度浓度(400、200、100、 50、25、12.5、6.25μg/mL或μM)。取20μL供试物溶液加入96孔板 中。
b.以L-酪氨酸(0.5mM)为底物，测定蘑菇酪氨酸酶的单酚酶活 力和二酚酶活力。往96孔板中加入L-酪氨酸(0.5mM)160μL，混合 均匀后37℃恒温保温。
c.96孔板中加入37℃预热的250U/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液20μL (酪氨酸酶的最终浓度为25U/mL)，立刻混匀。37℃下，测定490nm 处的吸光度值，记录30min反应的吸光值变化。
d.酪氨酸酶活性抑制率计算公式：
抑制率(％)＝[(△A-△B)/△A]×100％。
△A：含相同浓度DMSO的空白对照在30min内的吸光度变化值 (A30-A0)；
△B：测试样品在30min内的吸光度变化值(B30-B0)。
3.5美白模型的建立
B16F10细胞在自然状态下可产生一定量的黑色素，而在促黑激素 α-MSH的刺激下可产生大量的黑色素，一是为了增加实验结果的明显 性二是为了探究药物对α-MSH刺激下产黑色素的影响，利用α-MSH构 建美白模型。
B16细胞培养于含10％胎牛血清、100units/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃恒温，5％CO2及饱和湿 度的培养箱培养，每2-3天传代一次。
取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度约为6～8×104个细胞 /mL，接种于10cm培养板中，除空白对照外，每孔加入不同浓度的促 黑色素生成激素α-MSH，于37℃恒温，5％CO2及饱和湿度的培养箱 培养48h，测定黑色素含量，从而确定阴性对照α-MSH的量，在确定 α-MSH的基础上，用不同浓度的熊果苷与选定的α-MSH共同孵育，确 定阳性对照组熊果苷的浓度，进而建立美白模型。
3.6细胞存活率测定(MTT法)
a.按照细胞传代的方法，分别取处于指数生长期的B16细胞，用胰 蛋白酶消化后并吹打均匀，用电子细胞计数器对混合均匀的细胞悬液进 行细胞密度测定，而后用新鲜的DMEM培养液将细胞密度调节约为 2×104个细胞/mL，将它们以每孔100μl的体积接入96孔培养板，置于 37℃通5％CO2的培养箱中培养过夜，至细胞完全贴壁生长。
b.用100μl含有不同浓度供试物的含有2.5％血清的新鲜培养基培 替换原培养基，每组设置5个平行，继续置于37℃，5％CO2培养箱中 培养48h。
c.细胞供试物作用结束以后，为避免供试物和MTT反应，因此用 PBS清洗细胞1次后于96孔板中加入100μL用DMEM无血清培养基 培养基稀释的MTT溶液(终浓度为0.5mg/mL)，继续培养4～6小时。
d.弃掉上清液，每孔加入150μL DMSO，溶解蓝紫色结晶物，10 min后，轻微振荡使结晶溶解充分。
e.以570nm为检测波长，630nm为参照波长，用酶标仪测定吸光 值。
3.7发酵后产物对黑色素含量的影响
本实验设置添加供试物的实验组、含最高浓度熊果苷的阳性对照 组、添加α-MSH的阴性对照组及添加同浓度溶媒的空白对照组。
a.按照细胞传代的方法，取处于指数生长期的B16细胞，用胰蛋 白酶消化后并吹打均匀，用新鲜的DMEM培养液将细胞密度调节约为 6～8×103个/mL，以每平皿10mL的量接种于10cm的培养皿中，置于 37℃通5％CO2的培养箱中培养过夜，至细胞完全贴壁生长。
b.除空白对照组外，其余各组均加入含有一定浓度α-MSH的熊果 苷及不同浓度供试物的10ml新鲜有血清培养基(血清含量2.5％)。 继续置于37℃通5％CO2培养箱中培养48h。
c.药物孵育后将孔板中培养基弃去，并用预冷的PBS溶液清洗两 次后，胰酶消化细胞，收集B16细胞于离心管中，4℃，12000rpm离 心10min，吸弃上清，对细胞团进行拍照后，每管加入100μL的1mol/L NaOH溶液(含10％DMSO)，置于100℃中保温1h，至细胞团块完全溶解。置于酶标仪中，以405nm为测量波长吸光值。
e.计算胞内相对黑色素含量，以供试物的不同浓度为横坐标，胞内 黑色素相对含量为纵坐标，作图。
f.胞内相对黑色素含量计算公式：
相对黑色素含量(％)＝实验组A405/空白组A405。
3.8发酵条件优化
a.接种量及接种时间对发酵的影响：
将不同浓度的植物乳杆菌(1％，3％，4％,v/v)接种到种子培养基 中，每2h或4h测定一次细胞密度，直至生长达到稳定期，确定接种 量及接种时间。
b.蛋白胨(氮源)浓度对发酵的影响：
改变发酵培养基中蛋白胨的浓度(0,1％,3％，5％，w/w)，通过 HPLC检测不同浓度蛋白胨对发酵转化的影响，确定添加蛋白胨浓度。
c.离子化合物对发酵的影响：
去离子水溶解的莲花花瓣提取物与添加MRS培养基中全部离子溶 解的莲花花瓣提取物作为发酵培养基，通过HPLC检测离子对发酵转化 的影响，确定是否添加离子。
4.实验结果
4.1莲花花瓣提取物经五种菌株发酵后的产物对蘑菇酪氨酸酶的影响
酪氨酸酶是黑色素生成过程中的关键酶、限速酶，是筛选美白抑制 剂的关键靶点，因此发明人对发酵后产物进行酪氨酸酶活的测定。
由图2可知，植物乳杆菌CGMCC 1.124发酵产物具有显著酪氨酸 酶抑制活性，因此选择植物乳杆菌CGMCC 1.124为复筛菌株(在下文 中有时也简称为植物乳杆菌)。
4.2五种菌株对莲花花瓣提取物成分改变的研究
用“1.2实验菌株”中的五种菌株对莲花花瓣提取物发酵12小时后得 到的发酵产物的高效液相色谱(HPLC)结果见图1。图1中f表示莲花 花瓣提取物经植物乳杆菌CGMCC1.124发酵的产物的峰集中在洗脱时 间约55-62分钟时，且峰高值大。由图1可以看出，植物乳杆菌CGMCC 1.124可将莲花花瓣提取物黄酮类物质转化，且转化率最高。
4.3植物乳杆菌发酵后产物对蘑菇酪氨酸酶的影响
为了探究植物乳杆菌CGMCC 1.124发酵后莲花花瓣提取物活性的 改变的原因，分别测定植物乳杆菌发酵后提取物、未发酵的莲花花瓣提 取物及植物乳杆菌自身代谢产物进行酪氨酸酶活的测定。
由图3可知，莲花花瓣提取物经植物乳杆菌发酵后的产物对酪氨酸 酶有抑制作用，100μg/ml时相对胞外酪氨酸酶催化活力为78.1±7.7％， 并呈现剂量依赖抑制酪氨酸酶活力，但植物乳杆菌自身代谢产物对酪氨 酸酶活力无影响，由此可推测，活性的改变是由于莲花花瓣提取物在发 酵后成分的转化。
4.4成功建立美白模型
为了构建美白模型，首先对促黑色素激素采用MTT法测试了其对 细胞的毒性作用，其目的在于找出一个合适的安全剂量范围用于后续作 用浓度的筛选。结果如图4(A)所示。在不同浓度(50、100、200和 400nm)α-MSH作用下，B16F10细胞存活率均在80％左右且细胞状态 良好，因此后续的实验以400nm为最高浓度进行α-MSH作用浓度的筛 选。实验结果观察可发现即使低浓度50nm存活率也未达到100％，猜 测原因可能是α-MSH刺激下B16F10细胞会产生大量的树突，导致细 胞接触抑制严重，细胞个数减少，因此用MTT法测得的存活率相对较 少。
在α-MSH安全无毒浓度(400nm、200nm、100nm、50nm)下对 其刺激的B16F10细胞的黑色素含量进行测定，结果如图4(B)所示， B16F10细胞在自然状态下能产生一定量的黑色素，而α-MSH刺激可以 增加B16F10细胞黑色素的含量，各浓度对其黑色素增加含量均在20％ 左右，并不呈现浓度依赖，因此选择50nm用于后续实验。
确定促黑色素激素α-MSH含量后，在此基础上对熊果苷的作用浓 度进行进一步的确定，采用MTT法测试了其对细胞的毒性作用，以细 胞存活率大于80％，且细胞形态没有明显改变的最大浓度作为安全浓度 进行后续实验，由图5(A)可知，可以100μm熊果苷为最大作用浓度 测定其对α-MSH刺激下黑色素含量的影响。结果如图5(B)所示，熊 果苷呈剂量依赖式降低B16F10细胞黑色素含量，100μm熊果苷处理 B16F10细胞黑色素含量为α-MSH刺激时的85％，可显著降低黑色素 含量，至此美白模型建立成功，促黑色素生成激素作用浓度为50nm， 熊果苷为100μm。
4.5植物乳杆菌发酵后产物对黑色素含量的影响
如图6(A)所示，MTT法检测了植物乳杆菌发酵前、植物乳杆菌发 酵后及植物乳杆菌自身代谢产物对B16F10细胞存活率的影响，以细胞 存活率大于80％，且细胞形态没有明显改变的最大浓度作为安全浓度进 行后续实验，由图6(A)可知，莲花花瓣提取物及植物乳杆菌发酵后提取 物最高无毒性浓度12.5μm，在此浓度下测定其对α-MSH刺激下黑色素 含量的影响。结果如图6(B)所示，莲花花瓣提取物经植物乳杆菌发酵后 产物呈剂量依赖式降低B16F10细胞黑色素含量，12.5μm植物乳杆菌 发酵产物(FLPE，植物乳杆菌发酵后)处理B16F10细胞黑色素含量为 α-MSH刺激时的85％，而莲花花瓣提取物(LPE，植物乳杆菌发酵前) 及植物乳杆菌自身代谢产物(图6(B)最右侧两个柱)均无抑制作用，说 明莲花花瓣提取物经植物乳杆菌发酵后改变其抑制黑色素生成的能力 是由于产生的新物质发挥了作用，并不是植物乳杆菌自身的代谢产物， 后续对发酵转化后的物质进行成分分析及活性评价，进一步验证植物乳 杆菌发酵后产生黑色素抑制能力的机制。
需要说明的是，由于菌自身会产生一些初级和刺激代谢产物，这些 代谢产物可能会有一些作用，因此，本发明人测定了培养在种子培养基 中的植物乳杆菌的代谢产物是否具有抑制酪氨酸酶和黑色素含量的活 性。图3的结果充分证明了植物乳杆菌自身的代谢产物对酪氨酸酶活力 无影响，图6(B)的结果充分证明了植物乳杆菌自身的代谢产物没有抑制 黑色素生成的能力。
5.发酵条件优化
接种量及接种时间的优化
由植物乳杆菌CGMCC 1.124生长曲线(图7)可知，接种量为1％， 3％和4％(v/v)时，植物乳杆菌延滞期分别为6h，4h和4h，为了缩 短延滞期时间，降低发酵成本，选择3％(v/v)接种量。由于对数中后 期细胞代谢活性最强，因此选择14-20h为接种时间。换言之，将植物 乳杆菌接种到种子培养基中培养14-20h，然后取适量菌液接种到发酵 培养基混合物中进行发酵。
氮源及离子添加优化
结果见图8，通过HPLC定性分析，胰蛋白胨(e)对发酵过程无显著 影响，故不添加,而离子的添加过程对发酵有显著影响，因此确定发酵 培养基为MRS培养基中全部离子化合物(即，柠檬酸三铵，醋酸钠， K2HPO4，MgSO4·7H2O，MnSO4·7H2O)加莲花花瓣提取物(b)。
在实施例1中，本发明人筛选了常用于发酵莲花花瓣提取物的5种 益生菌，检测发现植物乳杆菌可高效地将莲花花瓣提取物中极性高的物 质转化为极性低的物质。通过蘑菇酪氨酸酶抑制活性及对B16细胞黑色 素含量的抑制活性比较，发现莲花花瓣提取物经发酵的产物确实能显著 提高莲花花瓣提取物美白活性。通过对接种量、接种时间及培养基进行 优化，发现3％接种量(v/v)、14-20h接种时间及添加MRS离子化合 物能提高了转化率，降低发酵成本。
实施例2莲花花瓣提取物发酵前后成分的定性定量分析
1实验材料
供试物：莲花花瓣提取物以及猜测的莲花花瓣提取物中主要成分的 单体。本发明人最开始猜测莲花花瓣提取物可能含有的成分为槲皮素， 山柰酚，芦丁，金丝桃苷，槲皮苷。
2实验方法
2.1莲花花瓣提取物的主要成分分析
在本研究中，主要通过高效液相色谱法对提取物及相关标准品进行 分析。
a.HPLC条件分析：可参见实施例1中3.3部分。
b.配制莲花花瓣提取物溶液以及对照品标准液，并通过二倍稀释法 稀释对照品溶液。且在进样前，都需用0.22μm微孔滤膜将溶液过滤。
c.按上述色谱条件对对照品溶液进行HPLC分析，每个浓度平行 进样3次，以对照品检测浓度(mg/L)为横坐标，以其峰面积为纵坐标 作3种标准品(槲皮素、山柰酚、山柰酚-3-O-葡萄糖苷)的标准曲线图 和标准方程。
d.根据上述色谱条件对莲花花瓣提取物进行HPLC分析，得到其 色谱图，并计算含量。
3实验结果
3.1莲花花瓣提取物的成分分析
3.1.1HPLC法对莲花花瓣提取物发酵前后定性分析
为了确定莲花花瓣提取物发酵前主要成分以及发酵后成分，将猜测 的莲花花瓣提取物可能含有的单体成分芦丁，槲皮苷，金丝桃苷，槲皮 素，山柰酚成分制成对照品溶液，在同一色谱条件下对莲花花瓣提取物 发酵前后供试物和对照品进行HPLC测定。莲花花瓣提取物发酵前后供 试物和对照品的HPLC图谱及对应紫外吸收图谱如图9所示。
由图9(A～F)的保留时间以及紫外图谱可知，所测试的几种单品均 非莲花花瓣提取物发酵前主要成分，需要对其进行下一步的提取分离和 鉴定，莲花花瓣提取物经发酵后黄酮苷绝大部分转化为槲皮素和山柰 酚。
3.1.2莲花花瓣提取物主要成分的提取分离
1)莲花花瓣提取物主要成分的分离提取
将500g干燥的莲花花瓣粉碎后在体积分数75％乙醇水溶液中经超 声波提取三次(每次连续超声2h，频率28Hz)，每次超声后过滤，保 留滤液并将滤渣用体积分数75％乙醇水溶液混悬后进行下一次超声提 取，合并三次的滤液，回收乙醇得95％乙醇浸膏物。加水混悬后依次用 石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，对萃取物进行减压浓缩， 得到四个部分的浸膏物，通过HPLC检测各部分含有成分如图10所 示。
2)莲花花瓣提取物乙酸乙酯提取部分化学成分的分离和鉴定
乙酸乙酯部分以适量硅胶拌样，上硅胶柱，进行硅胶色谱层析分 离，分别用二氯甲烷-甲醇(10:1，8:1，5:1，3:1，v/v)为流动相进行梯 度洗脱，薄层色谱和高效液相色谱检测，在5:1二氯甲烷-甲醇洗脱液 (v/v)洗脱的组分中含有莲花花瓣提取物主要成分，其HPLC检测的色 谱图如图11所示。
3)莲花乙酸乙酯提取部分化学成分的分离和鉴定
利用制备液相获得发酵前主要成分，经过核磁和HPLC-MS鉴定， 莲花花瓣提取物发酵前的主要成分为山柰酚-3-O-葡萄糖苷。
3.1.3莲花花瓣提取物主要成分及转化后成分定量分析
为了对莲花花瓣提取物中主要成分的含量进行定量分析，将山柰酚 -3-O-葡萄糖苷、槲皮素和山柰酚对照品分别进行二倍稀释，在相同色 谱条件下进行HPLC分析，把对照品浓度当成横坐标，峰面积当纵坐标 绘制线性曲线，得到标准曲线结果如表2所示。
表2.标准品的线性方程
Figure BDA0002468442480000231
通过标准曲线对莲花花瓣提取物发酵前主要成分(即，山柰酚-3-O- 葡萄糖苷)及发酵后槲皮素和山柰酚的含量进行了定量分析，结果如表 3所示。
表3.莲花花瓣提取物主要成分含量
Figure BDA0002468442480000232
实施例3莲花花瓣提取物的作用机制研究
1实验材料
供试物：槲皮素和山柰酚为本发明人按照标准方法在实验室中自 提，HPLC验纯，纯度均为>98％，山柰酚-3-O-葡萄糖苷按照实施例2 所述的方法从莲花花瓣提取物中分离和纯化。
小鼠黑色素瘤B16F10细胞：购于中国科学院细胞所。
熊果苷：购于韶远化学科技(上海)有限公司。
HaCat细胞:购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
DMEM培养液：购自SIGMA。
MMP-1抑制剂筛选试剂盒：购自SIGMA。
2实验方法
2.1供试物对B16F10细胞存活率的影响
测试基本上按照实施例1中3.6所述的方法进行。
(1)B16F10细胞用新鲜的含10％有血清的培养基调整密度为 2×104个细胞/mL，接种于96孔板，每孔100μL。于37℃CO2培养箱 中培养贴壁12h；
(2)用含有2.5％血清的新鲜培养基配种浓度不同的供试物，并加 入到96孔板中，空白对照组加等体积溶媒。5％CO2，37℃孵育48h；
(3)每孔加MTT 0.5mg/mL 100μL，5％CO2，37℃黑暗条件下 孵育4h。去上清，加入150μL DMSO，震荡以570nm为实验波长， 630nm为参照波长，检测吸光值；
(4)计算细胞存活率，并以细胞存活率作图。
Figure BDA0002468442480000241
2.2供试物对B16F10细胞蘑菇酪氨酸酶活力的影响
蘑菇酪氨酸酶活性抑制实验基本按照实施例1第3.4节所述的方法进 行。
根据王英存等(“红景天提取物应用于化妆品的生化和细胞学功效 评价”，《日用化学品科学》，2018年第3期，第44-50页)的方法并 改良进行蘑菇酪氨酸酶活性抑制试验。各供试物用PBS溶液依次稀释成 梯度浓度(400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL或μM)。取20 μL供试物溶液加入96孔板中。以L-酪氨酸(0.5mM)为底物，测定蘑 菇酪氨酸酶的单酚酶活力和二酚酶活力。往96孔板中加入L-酪氨酸(0.5 mM)160μL，混合均匀后37℃恒温保温。96孔板中加入37℃预热的 250U/mL的蘑菇酪氨酸酶溶液20μL(酪氨酸酶的最终浓度为25U/mL)，立刻混匀。37℃下，测定490nm处的吸光度值，记录30min 反应的吸光值变化。计算半抑制浓度IC50值。酪氨酸酶活性抑制率计 算公式：
抑制率(％)＝[(△A-△B)/△A]×100％。
△A：含相同浓度DMSO的空白对照在30min内的吸光度变化值 (A30-A0)；
△B：测试样品在30min内的吸光度变化值(B30-B0)。
2.3供试物对B16F10细胞黑色素含量的影响
测试基本上按照实施例1第3.7节所述的方法进行。
用培养液调节B16F10细胞密度为6～8×103个/mL，以每孔10 mL接种于10cm平皿中，在37℃，5％CO2条件下培养16h后，更 换为含有50nmα-MSH以及不同质量浓度样品的新鲜培养基(含有2.5％ 血清)，阳性药物α-熊果苷为100μm，共培养48h。弃上清并用PBS 洗涤，PBS清洗后用0.25％的胰酶消化细胞，离心并收集细胞，加入 100μL含有10％DMSO的1Mol/L NaOH裂解细胞，100℃条件下 孵育1h，用酶标仪在405nm处测定细胞裂解液中的吸光值，计算黑 色素合成率。其中，对照孔加入与样品同体积的PBS。B16细胞的蛋白 浓度以BCA法测定，用于吸光值的校正。数据统计以对照组的百分比 表示。
2.4供试物对B16F10胞内酪氨酸酶活力的影响
用培养液调节B16F10细胞密度为6～8×103个/mL，以每孔2mL 接种于6孔板中，在37℃，5％CO2条件下培养16h后，更换为含有 50nmα-MSH以及不同质量浓度样品的新鲜培养基(含有2.5％血清)， 阳性对照α-熊果苷为100μM，共培养48h。弃上清并用预冷的PBS 洗涤，用Western及IP解液裂解细胞，在4℃，15000r/min离心10 min，收集上清液；通过BSA方法进行蛋白定量。然后取100μg蛋白 全裂解液与50μl 1mg/ml L-DOPA在37℃下反应2h，检测405nm处 吸光值(A)。
酪氨酸酶相对活性＝A处理组/A对照组×100％
2.5供试物对HaCat细胞FLG基因表达作用
丝聚蛋白(filaggrin,FLG)是人体皮肤角质层中连接角蛋白纤维的 重要分子，是皮肤中的天然保湿因子。在FLG单体协助连接下，角蛋 白纤维规则地聚集，在表皮的最外层形成坚实的物理屏障，可以防止表 皮水分的丢失和外界过敏物质的入侵。FLG由角质形成细胞合成，分布 在角质层的不同部分，并随角质形成细胞迁移过程逐渐被酶降解，降解 为天然保湿因子等角质层需要的小分子物质，在保湿、屏障完整性方面 发挥重要的作用。
一种检测保湿性的方法是在体外检测本发明的莲花花瓣提取物的 发酵产物对人永生化角质形成细胞(HaCat细胞)中FLG基因相对表 达的影响。与对照相比，HaCat细胞FLG基因相对表达水平增加，将 表明莲花花瓣提取物的发酵产物具有良好的保湿效果。
2.5.1、实验试剂与材料
细胞：人永生化角质形成细胞(HACAT细胞)购自中国科学院上 海生命科学研究院细胞资源中心；
DMSO：购自SIGMA；
DMEM培养液：购自SIGMA；
2.5.2、实验仪器与设备
超净工作台：HEAL FORCE；
细胞培养箱150I：THERMO HERH CELL；
超纯水过滤仪：MILLIPORE；
DK-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备；
低温高速离心机、PCR扩增仪、移液器和涡旋振荡仪： EPPENDORF；
-80℃低温冰箱、NanoDrop 2000分光光度计：Thermo Fisher；
分析天平FA2104N：上海菁海仪器。
2.5.3、实验方法
HaCat细胞接种于12孔板，每孔加DMEM培养液450μL，培养 24h，待细胞完全贴壁，加入PBS配制的待测物，设组：对照组和实验 组，继续培养24h后，利用试剂盒或Trizol试剂提取总RNA，质控和 调整RNA浓度，RT-PCR反转录为cDNA，RT-qPCR TapMan Probe 检测和FLG基因相对表达量，2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。
设组A：对照组：不加待测物，待测物体积用PBS缓冲溶液代替；
B：实验组：加待测物。
2.6供试物对MMP-1的抑制作用
基质金属蛋白酶(MMPs)是一类锌离子(Zn2+)依赖性的、结构 和功能均高度同源的水解酶家族，是降解细胞外基质的主要酶类，具有 强大的细胞外基质降解能力。MMPs酶家族包括间质胶原酶 (MMP-1)、72KD明胶酶(MMP-2)、基质溶解素-1(MMP-3)和 92KD明胶酶(MMP-9)在内的26个编码金属蛋白酶，而其中MMP-1 介导的胶原裂解是皱纹形成的根源。在氧自由基(ROS)诱导的皮肤老 化进程中，MMP-1首先发挥作用，降解大部分的胶原成分，而被 MMP-1初步降解的胶原成分将继续被MMP-3和MMP-9等降解，同时 MMP-3和MMP-9将促进MMP-1前体的表达，进而引起新一轮的胶原 降解，引起皮肤粗糙和皱纹加深。
因此，一种检测抗衰老性的方法是在体外检测莲花花瓣提取物的发 酵产物对MMP-1的抑制作用。与对照相比，对MMP-1的抑制作用增强， 表明莲花花瓣提取物的发酵产物具有增强的抗衰老效果。
2.6.1实验试剂与材料
MMP-1抑制剂筛选试剂盒：购自SIGMA。
2.6.2实验仪器与设备
荧光酶标仪：美谷MD。
2.6.3实验方法
参考购自SIGMA的MMP-1抑制剂筛选试剂盒说明书进行操作。
3实验结果
3.1供试物对蘑菇酪氨酸酶活力的影响
供试物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用如图12所示，阳性对照熊果苷的 效果不及曲酸，莲花花瓣提取物的主要成分(即，山柰酚-3-O-葡萄糖苷) 无抑制蘑菇酪胺酸酶的活性，而槲皮素和山柰酚都具有显著抑制蘑菇酪 氨酸酶活性的作用，且山柰酚的效果很显著。这说明莲花花瓣提取物经 菌株发酵后所得发酵产物的蘑菇酪氨酸酶抑制活性提高，更适合用于化 妆品。
3.2供试物细胞存活率及对其黑色素含量的影响
将B16F10细胞与不同浓度的供试物(山柰酚-3-O-葡萄糖苷(K3G)、 槲皮素(quercetin)和山柰酚(kaempferol))共孵育，其细胞存活率 见图13(A)，以存活率百分之80％为界，槲皮素(quercetin)和山柰 酚(kaempferol)分别选择10μm和5μm，山柰酚-3-O-葡萄糖苷(K3G) 选择20μM进行实验。对三种物质分别进行黑色素含量的测定，结果如 图13(B，C，D)所示，山柰酚-3-O-葡萄糖苷及山柰酚对B16F10细胞 均无黑色素抑制作用，而槲皮素呈现剂量依赖式降低黑色素含量。
3.3供试物对胞内酪氨酸酶活力的影响
在测定三种物质对B16F10细胞黑色素影响后，进而对其对酪氨酸 酶活性的影响进行测定，结果如图14所示，槲皮素呈剂量依赖式降低酪 氨酸酶活性，这与其对黑色素含量的影响结果一致。
3.4、供试物对Hacat细胞FLG基因表达作用实验结果
结果参见图15，供试物莲花花瓣提取物及其发酵产物对FLG的表 达都具有明显的促进作用，并且存在明显的剂量依赖性。莲花花瓣提取 物发酵后的产物对FLG表达的促进作用明显强于未发酵的莲花花瓣提取 物。
3.5、供试物对MMP-1抑制作用实验结果
结果参见图16，供试物莲花花瓣提取物及其发酵产物对MMP-1都 具有明显的抑制作用，并且存在明显的剂量依赖性。莲花花瓣提取物发 酵后的产物对MMP-1的抑制作用明显强于未发酵的莲花花瓣提取物。
综上所述，本发明人通过比较梯度浓度的山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲 皮素及山柰酚对蘑菇酪氨酸酶抑制作用，发现槲皮素和山柰酚均具有显 著的酪氨酸酶抑制活性，且山柰酚活性优于阳性对照曲酸。进一步通过 胞内黑色素抑制实验发现仅槲皮素可降低胞内黑色素含量，且以浓度依 赖方式降低酪氨酸酶活性，这些实验结果表明槲皮素为莲花花瓣提取物 发酵后产物的物质基础，进一步证明莲花花瓣提取物在经菌株发酵后对 蘑菇酪氨酸酶抑制作用增强，能够降低酪氨酸酶活性和降低黑色素含量， 具有增强的美白效果，对保湿相关基因FLG基因的表达具有明显的促进 作用，对MMP-1的抑制作用更强，更适合用作化妆品的成分。
通过上述具体实施例的描述，本领域技术人员能够更好地实施本发 明。然而，本领域技术人员应该理解，在被背离由权利要求书所限定的 本发明的范围的前提下，可以对这些具体实施方案进行改进或组合，这 些改进或组合也在本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种制备莲花花瓣提取物的发酵产品的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)用莲花花瓣制得莲花花瓣提取物；
(2)将处于对数生长中后期的乳杆菌或芽孢杆菌菌株接种到包含步骤(1)制得的莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中进行发酵；以及
(3)回收发酵产物制成发酵产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中用乙醇溶液制备莲花花瓣提取物，优选地，取干燥的莲花花瓣用体积分数50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇水溶液，在60℃条件下，回流提取3次，时间分别为3h，3h和2h，然后对提取液进行抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取物；或者，取干燥的莲花花瓣用粉碎机粉碎，将粉末用体积分数50-100％、优选50-75％、更优选70％或75％的乙醇水溶液在室温下超声提取三次，时间分别为0.5-3h，0.5-3h和0.5-2h，混合提取液，进行真空抽滤，滤液减压浓缩至干，制得莲花花瓣提取物；
其中所述莲花花瓣提取物的主要成分是山柰酚-3-O-葡萄糖苷。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)所用的菌株选自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Sbutilis)或纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(2)所用的菌株为选自植物乳杆菌CGMCC1.124、发酵乳杆菌DSMZ 20052和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.943、纳豆芽孢杆菌I CGMCCNo.19463或纳豆芽孢杆菌II CGMCC No.19462中的任一种菌株，优选为植物乳杆菌CGMCC1.124。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中菌株的接种量为1％至4％(v/v)，例如，1％-3％(v/v)、2％-3％(v/v)、1％、2％、3％、4％(v/v)，优选为3％(v/v)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中乳杆菌或芽孢杆菌菌株在接种后培养14-20h达到对数生长中后期，然后再接种到包含步骤(1)制得的莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中，发酵周期为12小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中发酵培养基包含0.5至2重量％、优选0.5重量％、1重量％、1.5重量％或2重量％的莲花花瓣提取物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中发酵培养温度是30℃至40℃，例如30℃、37℃或40℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中发酵培养基包含下述成分：莲花花瓣提取物10g/L，柠檬酸铵2.0g/L，醋酸钠5.0g/L，K2HPO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·7H2O 0.05g/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中在将菌株接种到液体发酵培养基中之前将待接种菌株的培养液的OD600值均调为0.2，然后按1％至4％(v/v)、优选3％(v/v)的接种量转接到含有莲花花瓣提取物的液体发酵培养基中，进行振荡发酵培养。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中通过萃取回收发酵产物，其中用于萃取的有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚或正丁醇。
12.通过权利要求1-11中任一项的方法制得的莲花花瓣提取物的发酵产品。
13.根据权利要求12所述的莲花花瓣提取物的发酵产品，其主要成分为槲皮素和山柰酚。
14.根据权利要求12所述的莲花花瓣提取物的发酵产品，其中与未发酵的莲花花瓣提取物相比，所述发酵产品具有增强的蘑菇酪氨酸酶抑制作用，能够降低酪氨酸酶活性和降低黑色素含量，能够增加丝聚蛋白基因FLG的表达水平，并且能够抑制间质胶原酶MMP-1的活性。
15.一种组合物，所述组合物包含权利要求12所述的莲花花瓣提取物的发酵产品。
16.权利要求12所述的莲花花瓣提取物的发酵产品或权利要求15所述的组合物在制备化妆品或食品中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中与不包含所述莲花花瓣提取物的发酵产品的化妆品相比，所述化妆品具有增强的美白、保湿和抗衰老效果。
18.一种化妆品，所述化妆品包含权利要求12所述的莲花花瓣提取物的发酵产品或权利要求15所述的组合物以及其他活性成分。
19.一种食品，所述食品包含权利要求12所述的莲花花瓣提取物的发酵产品或权利要求15所述的组合物以及其他成分。
20.根据权利要求19所述的食品，所述食品是花茶或糕点。
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