CN110200275A - 益生菌发酵玫瑰花渣产品及其制备 - Google Patents

益生菌发酵玫瑰花渣产品及其制备 Download PDF

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姜文明
汪修武
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Abstract

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种采用益生菌发酵玫瑰花渣获得的产品及其制备方法。本发明采用植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌复合发酵玫瑰花渣，获得一种多酚、黄酮物质含量高、抗氧化能力强的产品，有助于解决玫瑰加工副产物再利用问题，也为天然植物多酚、黄酮类物质的开发和利用提供了新途径。

Description

益生菌发酵玫瑰花渣产品及其制备
技术领域：
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种采用益生菌发酵玫瑰花渣获得的产品及其制备方法。
背景技术：
玫瑰(Rosa rugosa)为蔷薇科蔷薇属的多年生常绿落叶灌木，含有丰富的芳香物质及黄酮、花色苷、多糖及多酚等有效成分，可作为食品、化妆品、香料、色素及药物的原料。玫瑰资源的开发利用以提取精油为主，玫瑰精油不仅具有芬芳怡人的香气，同时还有美容养颜的功效，价值之高素有“液体黄金”的美誉。纵观国内外，一般采用水蒸气蒸馏法提取玫瑰精油，但精油得率非常低，因此生产过程伴随产生大量的副产物——固态的残渣和液态的废水，花渣作为生产精油的工业副产物，其中还含有大量的黄酮、多酚、多糖、花色苷、膳食纤维等物质，具有一定的开发价值，但其通常视作废弃物，这样既浪费了玫瑰资源，又对环境造成一定污染。随着玫瑰产业的发展，如何对玫瑰花渣进行综合利用，成为当前亟待解决的问题。
目前，我国对玫瑰花渣的再利用方向主要集中在对其营养成分的提取纯化，也有少量研究者把玫瑰花渣作为食品和饲料的辅料进行开发。根据报道，在花渣中添加一定比例的玫瑰鲜花，可以加工成玫瑰花酱，还可以调整配方加工成茶或者食品添加剂等。
花渣里含有许多天然玫瑰花色素，由于色素极易与水相溶，可以把玫瑰花色素添加到食品中代替化学合成色素。Mollov等(2007)把从玫瑰花渣中提取出来的多酚类物质添加到草莓中，探究其对草莓花色苷的热稳定性，结果表明花渣中多酚类物质的加入能降低草莓花青素的热降解，从而提高了草莓产品的色泽稳定性。此外，张佳婵等(2014)采用乙醇提取法提取玫瑰花和玫瑰花渣中的黄酮类物质，探究了最优提取工艺并分析了粗提物冻干粉的抗氧化活性。
目前对玫瑰花渣基础成分的研究已取得一定成果，但在此基础上的应用研究还鲜有报道。在玫瑰花渣基础成分的研究上加以更深层次的研究应用为花渣最大的发展前景，且将研究成果应用到生产实际中，能使玫瑰花渣得到综合利用，实现多方面效益的统一。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明采用植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌复合发酵玫瑰花渣，获得一种多酚、黄酮物质含量高、抗氧化能力强的产品，有助于解决玫瑰加工副产物再利用问题，也为天然植物多酚、黄酮类物质的开发和利用提供了新途径。
本发明提供的益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其制备方法如下：
(1)玫瑰花渣发酵基质制备：取经过精油提取后剩余的玫瑰花渣进行干燥，利用粉碎机将其粉碎后过100目筛，配置成浓度为0.5-2g/L的水溶液，使之充分混合，在121℃条件下灭菌15min制备成玫瑰花渣发酵基质；
(2)复合发酵：在玫瑰花渣发酵基质中接入0.5-2％的植物乳杆菌发酵液，和0.5-2％的纳豆芽孢杆菌发酵液，35-40℃，100-150rpm，发酵35-45h；
优选地，植物乳杆菌的接种量为1％，纳豆芽孢杆菌的接种量为1％；
优选地，发酵温度为38℃；
优选地，发酵时间为40h；
优选地，所述植物乳杆菌具体为植物乳杆菌B7；
优选地，所述纳豆芽孢杆菌具体为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)BNCC185324；
优选地，所述植物乳杆菌发酵液的制备方法如下：将植物乳杆菌按1-1.5％接种量接种于在MRS培养基中，于37℃培养12-16h，优选14h；
所述MRS液体活化培养基组成为：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，用去离子水定容至1000mL；
优选地，所述纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌按1-1.5％接种量接种于在营养肉汤培养基(NA)中，于37℃培养12-16h，优选14h；
所述营养肉汤培养基(NA)组成为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖10.0g，酵母膏5.0g，蒸馏水定容至1000mL，调培养基pH 7.0-7.2。
有益效果：
玫瑰花渣经益生菌复合发酵后，对比发酵液基本成分含量显示，在最优条件下，多酚含量增加了24.65mg/100mL，黄酮含量增加了10.24mg/100mL，蛋白质含量增加了6.86％，可溶性膳食纤维增加了10.75％，粗纤维下降了4.37％，脂肪下降了0.38％，总糖下降了7.13％，还原糖增加了1.52％。
利用LC-MS/MS技术共鉴定出多酚类化合物15种，通过峰面积归一法计算，不同类型的多酚类化合物含量均有提升，其中最优条件下对香豆酸的含量提升了8倍，没食子酸含量提升了5倍、槲皮素提升了4倍，绿原酸为发酵液中新增加的多酚单体物质。
益生菌复合发酵过程中测定发酵液中SOD酶、淀粉酶及蛋白酶的酶活力均在发酵40h时达到最大值，最优条件下分别为52.81±1.85U/mL、36.30±3.11U/mL和9.53±0.41U/mL。发酵液的抗氧化活性在发酵过程中逐渐增强，ABTS清除能力、羟基自由基清除能力及DPPH清除能力在发酵后清除率分别增加了60.93％、57.70％、37.00％。
附图说明：
图1益生菌复合发酵玫瑰花渣液相色谱图(发酵前)
其中：1.4'-甲基柚皮素；2.柚皮素；3.二甲花翠素；4.山奈酚；5.对香豆酸；6.没食子酸；7.表儿茶素；8.槲皮素；9.矢车菊色素鼠李糖苷；10.红景天素；11.矮牵牛素鼠李糖苷；13.樱桃甙；14.4-羟基苯甲酸；15.芹菜苷；
图2益生菌复合发酵玫瑰花渣液相色谱图(发酵后)
其中：1.4'-甲基柚皮素；2.柚皮素；3.二甲花翠素；4.山奈酚；5.对香豆酸；6.没食子酸；7.表儿茶素；8.槲皮素；9.矢车菊色素鼠李糖苷；10.红景天素；11.矮牵牛素鼠李糖苷；12.绿原酸；13.樱桃甙；14.4-羟基苯甲酸；15.芹菜苷；
图3发酵液酶活变化曲线；
图4发酵液清除自由基能力变化曲线。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明测定花渣发酵液多酚类化合物的变化的方法如下：
益生菌复合发酵玫瑰花渣提取物中的酚类物质通过LC-MS/MS技术进行定性和定量分析。首先，将样品进行前处理，取200mL样品，加70％乙醇3mL，4℃过夜，期间涡旋3次保证提取充分。提取后，将离心机转速设置为10000rpm，离心10min后取上清液，并进行冷冻干燥。上样前，取200μL浓度为70％的甲醇复溶。
液相色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(2.1×100mm，3.5μm)，流动相A：0.1％甲酸的水溶液，流动相B：0.1％甲酸的乙腈溶液，进行梯度洗脱0min-1min，0％-98％A；1min-13min，98％-10％A；13min-16min，10％A；16min-16.1min，10％A；16.1min-20min，10％-98％A，流速：0.3mL/min。
质谱条件：电喷雾电离(ESI)源，正离子电离模式，离子源温度120℃，脱溶剂温度500℃，脱溶剂氮气流600L/h，锥孔反吹氮气50L/h。正离子模式毛细管电离电压分别为3.0kV，取样锥孔电压为27eV，萃取锥孔4eV，质量范围100-1500m/z。结果通过人工解析和数据库比对共同分析。
本发明测定发酵过程中发酵液多酚及单体含量变化的方法如下：
样品制备：吸取20mL样品用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，取乙酸乙酯50mL于分液漏斗中萃取，然后收集上清液，并把下层液体倒入烧杯里，重复实验三次。加适量浓盐酸于下层液中，调节pH至2.0，然后向分液漏斗中加入乙酸乙酯再进行萃取，收集上清液。合并有机相，利用旋转蒸发仪在35℃蒸发多余的有机溶剂至干，然后将干燥的残余物溶解在10mL的甲醇中，待测。
色谱条件：色谱柱为Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为30℃；进样量为20μL；流速为1mL/min；检测波长280nm；流动相A为2％乙酸水溶液；流动相B为色谱甲醇。采用梯度洗脱程序：流动相B在0-10min从5％上升到30％，在10-25min从30％上升到50％，在25-30min从50％上升到60％，在30-35min从60％上升到70％。
定性：以甲醇为溶剂分别配置4种单酚标准液，在如上色谱条件下进行检测，从而确定标准物质的保留时间。
定量：精确称量各标准样品0.0010g，溶于甲醇中，然后分别定容至10mL容量瓶，稀释成不同浓度梯度。在上述色谱条件的基础上进行检测，横坐标为浓度X，纵坐标为峰面积Y，制作标准曲线。相同色谱条件下对样品进行检测，在标准曲线上，依据各峰面积得到对应的含量。
本发明培养植物乳杆菌所用的MRS液体培养基组成为：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，用去离子水定容至1000mL。
本发明培养纳豆芽孢杆菌所用的营养肉汤培养基(NA)组成为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖10.0g，酵母膏5.0g，蒸馏水定容至1000mL，调培养基pH 7.0-7.2。
以下将以植物乳杆菌B7、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)BNCC185324为例对本发明进行进一步地解释说明；
植物乳杆菌B7已公布在Jie Bao,Xia Zhang,Jia-Hui Zheng,Di-Feng Ren＊,JunLu＊.Mixed fermentation of Spirulina platensis with Lactobacillus plantarumand Bacillus subtilis by random-centroid optimization.Food Chemistry,2018,264:64-72；公众可从北京林业大学获取；
纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)BNCC185324购自北纳生物(BNCC)。
实施例1一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品
本发明提供一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其制备方法如下：
(1)玫瑰花渣发酵基质制备：取经过精油提取后剩余的玫瑰花渣进行干燥，利用粉碎机将其粉碎后过100目筛，配置成浓度为1g/L的溶液，使之充分混合，在121℃条件下灭菌15min制备玫瑰花渣发酵基质；
(2)复合发酵：在玫瑰花渣发酵基质中接入1％(V:V)的植物乳杆菌发酵液，和1％(V:V)的纳豆芽孢杆菌发酵液，38℃，110rpm，发酵40h；
所述植物乳杆菌发酵液的制备方法如下：将植物乳杆菌经活化后按1％接种量在MRS培养基中，于37℃培养14h；
所述纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌经活化后按1％接种量在营养肉汤培养基(NA)中，于37℃培养14h；
(3)花渣发酵前后基本成分含量对比
益生菌复合发酵玫瑰花渣发酵前、后发酵液的基本成分含量如表1所示。
表1花渣发酵液基本成分含量
由表1可知，发酵液中基本成分的含量都出现了不同的变化。与发酵前相比，发酵液中的蛋白质含量增加了6.86％；脂肪含量降低；粗纤维的含量与发酵前相比也有大幅度的下降，而可溶性膳食纤维含量有所提升；总糖含量降低约7.13％；发酵液中的还原糖含量上升了1.52％；发酵液中的多酚含量有明显提升，增加了约24.65mg/100mL；黄酮含量明显增加，增加了约10.24mg/100mL。
(4)花渣发酵前后酚类化合物种类和含量对比
未经益生菌复合发酵的玫瑰花渣中多酚物质总离子色谱图如图1所示，经益生菌复合发酵的玫瑰花渣中多酚物质总离子色谱图如图2所示。定性定量结果如表2所示：
表2 LC-MS/MS定性定量分析结果
根据液质图谱进行人工解析并与数据库比对，共鉴定出多酚类化合物15种，其中包括没食子酸、槲皮素、对香豆酸、绿原酸等多种酚类物质。根据液质图谱结果分别对15种多酚化合物在未发酵组和发酵组的含量进行了相对定量，其相对含量采用峰面积归一法进行计算，结果如表2所示。
在益生菌复合发酵玫瑰花渣后，发酵产物中绿原酸为新的酚类物质，而没食子酸、槲皮素、对香豆酸等含量也分别提升了5倍、4倍和8倍。
多酚类化合物中的没食子酸、槲皮素和对香豆酸均为优良的天然抗氧化物质，新增的绿原酸物质则具有降血糖、降血脂、抗肿瘤等多种生理功效，在医药保健、食品等行业有广泛应用。表2中的数据表明，益生菌复合发酵在提升没食子酸、绿原酸、槲皮素等酚类化合物上，有着更为显著的能力，研究表明这类多酚类化合物普遍具有良好的抗氧化能力和降血糖能力。
(5)功能酶活性测定
测定发酵过程中发酵液SOD酶、淀粉酶和蛋白酶的活性变化，结果如图3所示。SOD酶、淀粉酶和蛋白酶的功能酶活性均随发酵时间的延长呈增长趋势。其中SOD酶活性在发酵0-24h之间有显著增加(P<0.05)，发酵时间40h时SOD酶含量达到最大值为52.81±1.85U/mL；淀粉酶在0-24h期间酶活性变化较为缓慢，之后酶活性变化较大，40h达到最大值，为36.30±3.11U/mL；蛋白酶活性在0-32h内增加迅速，后趋于平缓，最大值为9.53±0.41U/mL。
(6)发酵液抗氧化活性变化
将发酵液进行了20倍的稀释后，检测三种自由基清除能力：羟基自由基清除力、ABTS自由基清除力、DPPH自由基清除力，结果如图4所示。
由图4可知经复合发酵后玫瑰花渣发酵液的三种抗氧化活性均得以提升，ABTS清除力和DPPH清除力在发酵40h时达到最高值。花渣发酵液的三种自由基清除力中，ABTS自由基清除力效果最好，优于其它两种自由基的清除力。通过对比不同发酵时间点的发酵液中羟基自由基清除能力、ABTS清除能力和DPPH清除能力大小，可以看出发酵液ABTS清除能力、DPPH清除能力与羟基自由基清除能力在发酵前后其清除率分别增加60.93％、37.00％、57.70％，这说明花渣发酵后发酵液抗氧化活性具有显著性提高(P<0.05)。可以看出ABTS清除能力相对较大。
实施例2一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品
本发明提供一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其制备方法如下：
(1)玫瑰花渣发酵基质制备：取经过精油提取后剩余的玫瑰花渣进行干燥，利用粉碎机将其粉碎后过100目筛，配置成浓度为0.8g/L的溶液，使之充分混合，在121℃条件下灭菌15min制备玫瑰花渣发酵基质；
(2)复合发酵：在玫瑰花渣发酵基质中接入0.5％(V:V)的植物乳杆菌发酵液，和0.5％(V:V)的纳豆芽孢杆菌发酵液，35℃，100rpm，发酵35h；
所述植物乳杆菌发酵液的制备方法如下：将植物乳杆菌经活化后按1％接种量在MRS培养基中，于37℃培养12h；
所述纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌经活化后按1％接种量在营养肉汤培养基(NA)中，于37℃培养12h。
(3)发酵结束后，对比发酵前后发酵液基本成分含量显示，多酚含量增加了23.15mg/100mL，黄酮含量增加了9.38mg/100mL，蛋白质含量增加了6.17％，可溶性膳食纤维增加了10.12％，粗纤维下降了4.05％，脂肪下降了0.34％，总糖下降了6.98％，还原糖增加了1.45％。
香豆酸的含量提升了7.5倍，没食子酸含量提升了4.6倍、槲皮素提升了3.9倍，绿原酸为发酵液中新增加的多酚单体物质。
发酵液中SOD酶、淀粉酶及蛋白酶的酶活力分别为50.23±0.96U/mL、35.78±2.83U/mL和8.72±0.26U/mL。发酵液的抗氧化活性在发酵过程中逐渐增强，ABTS清除能力、羟基自由基清除能力及DPPH清除能力在发酵后清除率分别增加了58.84％、56.23％、36.63％。
实施例3一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品
本发明提供一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其制备方法如下：
(1)玫瑰花渣发酵基质制备：取经过精油提取后剩余的玫瑰花渣进行干燥，利用粉碎机将其粉碎后过100目筛，配置成浓度为1.2g/L的溶液，使之充分混合，在121℃条件下灭菌15min制备玫瑰花渣发酵基质；
(2)复合发酵：在玫瑰花渣发酵基质中接入2％(V:V)的植物乳杆菌发酵液，和2％(V:V)的纳豆芽孢杆菌发酵液，40℃，150rpm，发酵45h；
所述植物乳杆菌发酵液的制备方法如下：将植物乳杆菌经活化后按1.5％接种量在MRS培养基中，于37℃培养16h；
所述纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌经活化后按1.5％接种量在营养肉汤培养基(NA)中，于37℃培养16h。
(3)发酵结束后，对比发酵前后发酵液基本成分含量显示，多酚含量增加了22.83mg/100mL，黄酮含量增加了10.01mg/100mL，蛋白质含量增加了6.34％，可溶性膳食纤维增加了10.34％，粗纤维下降了4.16％，脂肪下降了0.29％，总糖下降了7.02％，还原糖增加了1.37％。
香豆酸的含量提升了7.8倍，没食子酸含量提升了4.7倍、槲皮素提升了3.8倍，绿原酸为发酵液中新增加的多酚单体物质。
发酵液中SOD酶、淀粉酶及蛋白酶的酶活力分别为51.46±1.24U/mL、35.09±2.96U/mL和8.96±0.37U/mL。发酵液的抗氧化活性在发酵过程中逐渐增强，ABTS清除能力、羟基自由基清除能力及DPPH清除能力在发酵后清除率分别增加了57.26％、55.78％、35.49％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (6)

1.一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其特征在于，制备方法如下：
(1)玫瑰花渣发酵基质制备：取经过精油提取后剩余的玫瑰花渣进行干燥，利用粉碎机将其粉碎后过100目筛，配置成浓度为0.5-2g/L的水溶液，使之充分混合，在121℃条件下灭菌15min制备成玫瑰花渣发酵基质；
(2)复合发酵：在玫瑰花渣发酵基质中接入0.5-2％的植物乳杆菌发酵液，和0.5-2％的纳豆芽孢杆菌发酵液，35-40℃，100-150rpm，发酵35-45h。
2.如权利要求1所述的一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其特征在于，所述植物乳杆菌具体为植物乳杆菌B7；所述纳豆芽孢杆菌具体为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)BNCC185324。
3.如权利要求1所述的一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其特征在于，所述植物乳杆菌发酵液的制备方法如下：将植物乳杆菌按1-1.5％接种量接种于在MRS培养基中，于37℃培养12-16h。
4.如权利要求1所述的一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将纳豆芽孢杆菌按1-1.5％接种量接种于在营养肉汤培养基(NA)中，于37℃培养12-16h。
5.如权利要求3或4所述的一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其特征在于，
MRS液体活化培养基组成为：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，用去离子水定容至1000mL；
营养肉汤培养基组成为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖10.0g，酵母膏5.0g，蒸馏水定容至1000mL，调培养基pH7.0-7.2。
6.如权利要求1所述的一种益生菌复合发酵玫瑰花渣产品，其特征在于，制备方法如下：
(1)玫瑰花渣发酵基质制备：取经过精油提取后剩余的玫瑰花渣进行干燥，利用粉碎机将其粉碎后过100目筛，配置成浓度为1g/L的水溶液，使之充分混合，在121℃条件下灭菌15min制备成玫瑰花渣发酵基质；
(2)复合发酵：在玫瑰花渣发酵基质中接入1％的植物乳杆菌发酵液，和1％的纳豆芽孢杆菌发酵液，38℃，110rpm，发酵40h。
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