CN112772767A - 一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农产品加工技术领域，公开了一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：S1.将所述花椒副产物粉碎，得到粉碎料；S2.向所述粉碎料中加入葡萄糖溶液，得到混合料；S3.向所述混合料中加入复合菌，经发酵和过滤，得到发酵液和发酵渣；S4.所述发酵液经蒸发和冷冻干燥，即得；本发明的方法利用微生物混菌发酵，一方面能够高效地破壁，另一方面能够将所述花椒副产物中的蛋白质变为更易溶解和适于人体吸收的小分子多肽等物质，最后对发酵液进行浓缩和冷冻干燥后，蛋白质类物质的总量和营养保持良好；同时，该方法还可基于发酵得到的所述发酵渣进一步提取黄酮，能够连续高效地提取花椒副产物中的蛋白质和黄酮，实现了营养物质的有效利用。
Description
技术领域
本发明涉及农产品加工技术领域，具体是一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法。
背景技术
花椒是我国传统的“八大调味品”之一。我国花椒种质资源丰富，全国约有花椒属植物45种(全世界约250种)，12个变种，2个变型。在我国大面积人工栽培的品种主要是青椒和花椒，主要分布在陕西、四川、山西、山东、河北等地。
花椒壳和花椒渣是花椒果皮生产中的副产物，大量研究证明其中含有丰富的油脂、蛋白质、多糖、微量元素、黄酮、多酚等营养功能成分，但其目前主要用于饲料生产，丰富的营养成分并未得到充分的利用。然而，我国花椒种植规模每年以20％～30％的速度递增，随着花椒产量的逐年增长，花椒副产物也与日俱增，造成了资源的巨大浪费。因此，如何使花椒副产物得到合理充分的利用已成为我国花椒产业面临的一项新挑战。
虽然，目前关于从花椒叶和花椒中提取蛋白质和黄酮等营养成分的研究已经有了一定的进展，但由于花椒副产物具有致密的细胞壁结构及其较高的油脂含量，为蛋白质的提取带来了极大的难度，故而从花椒副产物中提取蛋白质和黄酮等的方法还未见报道。因此，对于研制开发一种从花椒副产物中提取蛋白质和黄酮等的工艺，以提高花椒副产物的加工效益，具有较大的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，以至少达到高效地提取花椒副产物中的蛋白质，并且能够良好地保持蛋白质类物质的总量和营养，从而实现营养物质的有效利用的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1.将所述花椒副产物粉碎，得到粉碎料；
S2.向所述粉碎料中加入葡萄糖溶液，得到混合料；
S3.向所述混合料中加入复合菌，经发酵和过滤，得到发酵液和发酵渣；
S4.所述发酵液经蒸发和冷冻干燥，即得。
在某些实施方案中，所述花椒副产物包括花椒壳和花椒渣中的至少一种。
在上述技术方案中，所述花椒壳和花椒渣均是花椒油加工过程中的副产物，油脂含量较高，将其用作提取蛋白质的原料，实现了对废物进行利用的效果。
在某些实施方案中，S1中，所述粉碎料的粒径为120～160目。
在某些实施方案中，S2中，所述粉碎料和葡萄糖溶液的质量比为1:1～2。
在某些实施方案中，S2中，所述葡萄糖溶液的浓度为5wt％～8wt％。
在某些实施方案中，S3中，所述复合菌包括发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
在上述技术方案中，所述发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌之间存在协同作用，两者在混合发酵的过程中可以相互提升菌落水平，并且产生生物酶的水平更高，从而能够更好地清除所述花椒副产物的细胞壁，从而提高了提取效率。
在某些实施方案中，S3中，所述发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的质量比为2～3.5:1。
在上述技术方案中，通过对所述发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的比例进行限定，能够更好地破除所述花椒副产物的细胞壁，有利于黄酮和蛋白质的析出。
在某些实施方案中，S3中，所述复合菌的添加量为所述花椒副产物的0.5wt％～1wt％。
在上述技术方案中，若所述复合菌的添加量过低，则达不到较好的效果；若所述复合菌的添加量过高，则增加成本，并且不能控制体系的pH。因此，通过对所述复合菌的添加量进行限定，从而在控制成本的条件下，达到了更好的提取效果。
在某些实施方案中，S3中，所述发酵的温度为40～45℃，时间为24～40h。
在上述技术方案中，综合菌种生长和代谢反应等因素的考量，对所述发酵的条件进行限定，达到了更好的提取效果。
在某些实施方案中，S4中，所述蒸发具体为：将所述发酵液蒸发至原体积的20％～25％。
在某些实施方案中，S4中，所述冷冻干燥的温度为-40℃，时间为24～36h。
在某些实施方案中，还包括从所述发酵渣中提取黄酮的步骤。
在某些实施方案中，从所述发酵渣中提取黄酮，包括以下步骤：
S5.所述发酵渣依次经超声提取、微波提取和过滤，得到提取液；
S6.对所述提取液进行蒸发浓缩，得到浸膏；
S7.对所述浸膏进行多级梯度洗脱，得到最终洗脱液；
S8.对所述最终洗脱液进行浓缩，即得。
在某些实施方案中，S5中，采用65wt％～75wt％的乙醇对所述发酵渣进行超声提取，再将所述乙醇调整至90wt％～95wt％并进行微波提取，最后过滤得到提取液。
在某些实施方案中，S5中，所述超声提取的提取温度为40～65℃，提取功率为120～300W，提取时间为1～3h。
在某些实施方案中，S5中，所述微波提取的提取频率为500～900MHz，提取时间为0.5～1.5h。
在上述技术方案中，通过对所述超声提取和微波提取的步骤进行限定，有利于黄酮的析出和溶解，结合对各步骤的参数进行限定，达到了优化提取率的效果。
在某些实施方案中，S7中，所述多级梯度洗脱，包括以下步骤：
A1.将所述浸膏加入大孔吸附树脂，依次用20wt％乙醇、45wt％乙醇、65wt％乙醇、90wt％乙醇和纯乙醇进行洗脱，收集90wt％乙醇和纯乙醇的洗脱液，合并得到洗脱液Ⅰ；
A2.将所述洗脱液Ⅰ加入硅胶柱，依次用体积比分别为70:1、50:1、20:1和10:1的氯仿-正丙醇进行洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-正丙醇的洗脱液，得到洗脱液Ⅱ；
A3.依次用体积比分别为10:1、8:1、5:1和2:1的乙酸乙酯-甲醇，以及甲醇继续洗脱，将全部洗脱液合并，得到洗脱液Ⅲ；
A4.将所述洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ合并，得到所述最终洗脱液。
在某些实施方案中，A1中，所述大孔吸附树脂包括D-101B型和H30型中的一种或两种。
在上述技术方案中，所述多级梯度洗脱能够使黄酮更好地从组成复杂的样品中分离。
在某些实施方案中，A1中，用于洗脱的不同浓度的乙醇均为5～9个柱体积。
在某些实施方案中，A2中，用于洗脱的不同体积比的氯仿-正丙醇均为5～9个柱体积。
在某些实施方案中，A3中，用于洗脱的甲醇以及不同体积比的乙酸乙酯-甲醇均为5～9个柱体积。
在上述技术方案中，所述柱体积的范围是根据实际洗脱情况来确定的，当所述柱体积为5～9时，既能够有效地分离成分，又能够最大程度地节约洗脱时间，相应地，本领域技术人员也可以根据实际需求对所述柱体积进行适应性地调整。
应当理解的是，本发明中的“和/或”是指，通过“和/或”连接的前后两个技术特征既可以为并列关系，也可以为择一选用关系。例如，“A和/或B”包含“A”、“B”和“A+B”三种情况。
值得注意的是，本发明利用微生物混菌发酵方法，即利用所述复合菌对花椒副产物进行半固态发酵，一方面能够高效地破壁，另一方面能够利用所述发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵时所具有的产酶和成分改善的能力，将所述花椒副产物中的蛋白质变为更易溶解和适于人体吸收的小分子多肽等物质，最后对发酵液进行浓缩和冷冻干燥以得到蛋白质，使得蛋白质类物质的总量和营养保持良好，并且提取率可提高至90％以上；同时，基于上述处理得到的所述发酵渣，还可进一步通过所述超声提取、微波提取以及大孔吸附树脂和硅胶柱层析结合的方法提取黄酮，配合对吸附剂的洗脱梯度和组成的优化，有效地将黄酮的提取率提高至98％以上；最终达到了连续高效地提取花椒副产物中的蛋白质和黄酮，实现营养物质的有效利用的效果。
本发明的有益效果是：
1.本发明的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，利用微生物混菌发酵方法，即利用所述复合菌对花椒副产物进行半固态发酵，最后对发酵液进行浓缩和冷冻干燥以得到蛋白质，使得蛋白质类物质的总量和营养保持良好，并且提取率可提高至90％以上。
2.本发明的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，还可基于发酵得到的所述发酵渣进一步提取黄酮，提取率达到98％以上。
3.本发明的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，能够连续高效地提取花椒副产物中的蛋白质和黄酮，实现了营养物质的有效利用。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1.将花椒副产物(花椒壳和花椒渣)粉碎，得到粒径为120～160目的粉碎料；
S2.按照1:1的质量比向粉碎料中加入浓度为8wt％的葡萄糖溶液，得到混合料；
S3.向混合料中加入复合菌(质量比为3:1的发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)，其添加量为花椒副产物的1wt％，然后在40℃下发酵24h，并进行压榨过滤，分别收集发酵渣和发酵液；
S4.将发酵液蒸发至原体积的20％，在-40℃下冷冻干燥30h，所得产品即为蛋白质；
S5.采用70wt％的乙醇对发酵渣进行超声提取，提取温度为60℃，提取功率为250W，提取时间为1.5h；再将乙醇调整至95wt％并进行微波提取，提取频率为500MHz，提取时间为1.5h；最后过滤得到提取液；
S6.采用旋转蒸发仪将提取液浓缩为浸膏；
S7.对浸膏进行多级梯度洗脱，具体步骤如下：
1)将浸膏加入H-30大孔吸附树脂，依次用9个柱体积的20wt％乙醇、45wt％乙醇、65wt％乙醇、90wt％乙醇和纯乙醇进行洗脱，收集90wt％乙醇和纯乙醇的洗脱液，合并得到洗脱液Ⅰ；
2)将洗脱液Ⅰ加入硅胶柱，依次用5个柱体积的体积比分别为70:1、50:1、20:1和10:1的氯仿-正丙醇进行洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-正丙醇的洗脱液，得到洗脱液Ⅱ；
3)再依次用9个柱体积的体积比分别为10:1、8:1、5:1和2:1的乙酸乙酯-甲醇，以及甲醇继续洗脱，收集全部洗脱液，混合得到洗脱液Ⅲ；
4)将洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ合并，得到最终洗脱液；
S8.将最终洗脱液浓缩，所得产品即为黄酮。
实施例2
一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1.将花椒副产物(花椒壳和花椒渣)粉碎，得到粒径为120～160目的粉碎料；
S2.按照1:1的质量比向粉碎料中加入浓度为5wt％的葡萄糖溶液，得到混合料；
S3.向混合料中加入复合菌(质量比为2:1的发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)，其添加量为花椒副产物的0.8wt％，然后在43℃下发酵24h，并进行压榨过滤，分别收集发酵渣和发酵液；
S4.将发酵液蒸发至原体积的20％，在-40℃下冷冻干燥24h，所得产品即为蛋白质；
S5.采用70wt％的乙醇对发酵渣进行超声提取，提取温度为55℃，提取功率为150W，提取时间为2h；再将乙醇调整至95wt％并进行微波提取，提取频率为900MHz，提取时间为1.5h；最后过滤得到提取液；
S6.采用旋转蒸发仪将提取液浓缩为浸膏；
S7.对浸膏进行多级梯度洗脱，具体步骤如下：
1)将浸膏加入D-101B大孔吸附树脂，依次用5个柱体积的20wt％乙醇、45wt％乙醇、65wt％乙醇、90wt％乙醇和纯乙醇进行洗脱，收集90wt％乙醇和纯乙醇的洗脱液，合并得到洗脱液Ⅰ；
2)将洗脱液Ⅰ加入硅胶柱，依次用8个柱体积的体积比分别为70:1、50:1、20:1和10:1的氯仿-正丙醇进行洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-正丙醇的洗脱液，得到洗脱液Ⅱ；
3)再依次用8个柱体积的体积比分别为10:1、8:1、5:1和2:1的乙酸乙酯-甲醇，以及甲醇继续洗脱，收集全部洗脱液，混合得到洗脱液Ⅲ；
4)将洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ合并，得到最终洗脱液；
S8.将最终洗脱液浓缩，所得产品即为黄酮。
实施例3
一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1.将花椒副产物(花椒壳和花椒渣)粉碎，得到粒径为120～160目的粉碎料；
S2.按照1:1.5的质量比向粉碎料中加入浓度为6wt％的葡萄糖溶液，得到混合料；
S3.向混合料中加入复合菌(质量比为2:1的发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)，其添加量为花椒副产物的0.5wt％，然后在45℃下发酵24h，并进行压榨过滤，分别收集发酵渣和发酵液；
S4.将发酵液蒸发至原体积的20％，在-40℃下冷冻干燥32h，所得产品即为蛋白质；
S5.采用70wt％的乙醇对发酵渣进行超声提取，提取温度为60℃，提取功率为300W，提取时间为2.5h；再将乙醇调整至95wt％并进行微波提取，提取频率为700MHz，提取时间为1.5h；最后过滤得到提取液；
S6.采用旋转蒸发仪将提取液浓缩为浸膏；
S7.对浸膏进行多级梯度洗脱，具体步骤如下：
1)将浸膏加入D-101B大孔吸附树脂，依次用均为7个柱体积的20wt％乙醇、45wt％乙醇、65wt％乙醇、90wt％乙醇和纯乙醇进行洗脱，收集90wt％乙醇和纯乙醇的洗脱液，合并得到洗脱液Ⅰ；
2)将洗脱液Ⅰ加入硅胶柱，依次用5个柱体积的体积比分别为70:1、50:1、20:1和10:1的氯仿-正丙醇进行洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-正丙醇的洗脱液，得到洗脱液Ⅱ；
3)再依次用5个柱体积的体积比分别为10:1、8:1、5:1和2:1的乙酸乙酯-甲醇，以及甲醇继续洗脱，收集全部洗脱液，混合得到洗脱液Ⅲ；
4)将洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ合并，得到最终洗脱液；
S8.将最终洗脱液浓缩，所得产品即为黄酮。
实施例4
一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，包括以下步骤：
S1.将花椒副产物(花椒壳和花椒渣)粉碎，得到粒径为120～160目的粉碎料；
S2.按照1:2的质量比向粉碎料中加入浓度为5wt％的葡萄糖溶液，得到混合料；
S3.向混合料中加入复合菌(质量比为3.5:1的发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)，其添加量为花椒副产物的0.5wt％，然后在45℃下发酵24h，并进行压榨过滤，分别收集发酵渣和发酵液；
S4.将发酵液蒸发至原体积的23％，在-40℃下冷冻干燥24h，所得产品即为蛋白质；
S5.采用75wt％的乙醇对发酵渣进行超声提取，提取温度为50℃，提取功率为200W，提取时间为1h；再将乙醇调整至95wt％并进行微波提取，提取频率为900MHz，提取时间为0.5h；最后过滤得到提取液；
S6.采用旋转蒸发仪将提取液浓缩为浸膏；
S7.对浸膏进行多级梯度洗脱，具体步骤如下：
1)将浸膏加入D-101B大孔吸附树脂，依次用均为9个柱体积的20wt％乙醇、45wt％乙醇、65wt％乙醇、90wt％乙醇和纯乙醇进行洗脱，收集90wt％乙醇和纯乙醇的洗脱液，合并得到洗脱液Ⅰ；
2)将洗脱液Ⅰ加入硅胶柱，依次用5个柱体积的体积比分别为70:1、50:1、20:1和10:1的氯仿-正丙醇进行洗脱，收集体积比为10:1的氯仿-正丙醇的洗脱液，得到洗脱液Ⅱ；
3)再依次用5个柱体积的体积比分别为10:1、8:1、5:1和2:1的乙酸乙酯-甲醇，以及甲醇继续洗脱，收集全部洗脱液，混合得到洗脱液Ⅲ；
4)将洗脱液Ⅱ和洗脱液Ⅲ合并，得到最终洗脱液；
S8.将最终洗脱液浓缩，所得产品即为黄酮。
对照例1
采用本发明实施例1中的方法与对照例1进行对比，对照例1的方法为：将花椒副产物(花椒壳和花椒渣)粉碎，得到粒径为120～160目的粉碎料，按照1:5的质量比向粉碎料中加入纯净水，并将pH值调节至8～11，进一步过滤得到蛋白质絮凝物，烘干后即得粗蛋白产品。
对照例2
采用本发明实施例1中的方法与对照例2进行对比，其中对照例2与实施例1的区别在于：S2中，将葡萄糖溶液替换为纯净水(替换物的用量与实施例1相同)；其他条件如剩余物料的选择和用量以及其他的工艺步骤等均与本发明实施例1相同。
对照例3
采用本发明实施例1中的方法与对照例3进行对比，其中对照例3与实施例1的区别在于：S3中，仅添加单一的发酵乳杆菌(替换菌的用量与实施例1相同)；其他条件如剩余物料的选择和用量以及其他的工艺步骤等均与本发明实施例1相同。
对照例4
采用本发明实施例1中的方法与对照例4进行对比，其中对照例4与实施例1的区别在于：S3中，仅添加单一的鼠李糖乳杆菌(替换菌的用量与实施例1相同)；其他条件如剩余物料的选择和用量以及其他的工艺步骤等均与本发明实施例1相同。
试验效果
为了验证本发明的方法对蛋白质和黄酮的提取效果，分别对实施例1～4和对照例1～4中蛋白质和黄酮的提取率进行了测试；其中，蛋白质的提取率根据GB 5009.5-2016的规定进行测试，黄酮的提取率根据DB43/T 476-2009的规定进行测试。结果如下表所示：
由上表可知：
1)相比于实施例1～4，对照例1～4中蛋白质的提取率显著下降，并且所得蛋白质中易吸收的小分子蛋白质的含量也明显降低；
2)相比于实施例1，对照例2～4中黄酮的提取率也显著下降；
3)相比于实施例1，对照例2～3中蛋白质和黄酮的提取率均显著下降，这说明发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌复合使用的效果较之于两者单独使用的效果存在明显的提升，即本发明的发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌存在协同作用。
综上所述，本发明的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，能够连续高效地提取花椒副产物中的蛋白质和黄酮，并且能够良好地保持蛋白质的总量和营养，从而实现营养物质的有效利用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将所述花椒副产物粉碎，得到粉碎料；
S2.向所述粉碎料中加入葡萄糖溶液，得到混合料；
S3.向所述混合料中加入复合菌，经发酵和过滤，得到发酵液和发酵渣；
S4.所述发酵液经蒸发和冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，所述花椒副产物包括花椒壳和花椒渣中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，S1中，所述粉碎料的粒径为120～160目。
4.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，S2中，所述粉碎料和葡萄糖溶液的质量比为1:1～2；
和/或，S2中，所述葡萄糖溶液的浓度为5wt％～8wt％。
5.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，S3中，所述复合菌包括发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。
6.根据权利要求5所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，所述发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的质量比为2～3.5:1；
和/或，所述复合菌的添加量为所述花椒副产物的0.5wt％～1wt％；
和/或，所述发酵的温度为40～45℃，时间为24～40h。
7.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，S4中，所述蒸发具体为：将所述发酵液蒸发至原体积的20％～25％。
8.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，S4中，所述冷冻干燥的温度为-40℃，时间为24～36h。
9.根据权利要求1所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，还包括从所述发酵渣中提取黄酮的步骤。
10.根据权利要求9所述的一种从花椒副产物中提取蛋白质的方法，其特征在于，从所述发酵渣中提取黄酮，包括以下步骤：
S5.所述发酵渣依次经超声提取、微波提取和过滤，得到提取液；
S6.对所述提取液进行蒸发浓缩，得到浸膏；
S7.对所述浸膏进行多级梯度洗脱，得到最终洗脱液；
S8.对所述最终洗脱液进行浓缩，即得。
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