CN101176785B - 一种重组双功能水蛭素口服制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属药剂学领域，涉及重组双功能水蛭素特殊口服制剂及其制备方法。本发明利用超临界CO2流体包衣技术，以聚乳酸为包衣材料包覆重组双功能水蛭素药物颗粒，制成口服制剂，所制备的制剂颗粒规则，表面光滑，外观均匀，无粘连，平均粒径在70-105μm，载药量、包封率高。通过动物实验，结果表明具有抗凝作用，口服后24小时内有效，具有缓释作用，能克服现有技术的缺陷，拓宽了临床应用范围，宜用于治疗和预防慢性的血栓性疾病。
Description
技术领域
本发明属药剂学领域，涉及重组双功能水蛭素特殊口服制剂及其制备方法。
背景技术
重组双功能水蛭素(r-RGD-Hirudin)是蛋白质/多肽类药物，目前一般将r-RGD-Hirudin制备成静脉注射用粉针剂，因其直接口服，容易被胃酸、胃肠道蛋白酶破坏而失去生物学活性，故导致临床应用范围有限，尚不宜用于治疗和预防慢性的血栓性疾病。
本领域公知，胃肠道对蛋白质/多肽类药物口服吸收构成三大屏障，包括酶的降解、黏液层的扩散屏障以及粘膜的吸收屏障。常规制剂工艺多需使用高温、水和/或有机溶剂，极易使蛋白质降解或活性丧失，以致给制备蛋白质/多肽类药物口服制剂带来很大难度。近年来口服结肠靶向给药系统和超临界流体包衣技术在理论和实践上的发展，为能有效地解决蛋白质/多肽类药物口服吸收的靶向部位及工艺敏感性等问题带来希望。
根据解剖特点，结肠部位蛋白水解酶少、活力低，能避免蛋白质/多肽类药物的降解；结肠对大分子药物的吸收屏障作用较小肠小、药物在结肠滞留时间长、结肠部位水分少使药物浓度高等因素也有利于蛋白质/多肽类药物的吸收。因此结肠是蛋白质/多肽类药物口服给药在胃肠道吸收的最佳部位。已有的研究表明，如，将降钙素以0.1-5.0mg/kg剂量直接给大鼠结肠给药，其血药浓度显著升高，幅度达12％-38％。因此，降钙素结肠给药制剂已进入人体临床试验阶段。此外，研究表明，胰岛素、万古霉素或人生长激素等均可通过结肠吸收。
常规结肠靶向制剂工艺中的传统包衣工艺，往往使蛋白质/多肽类药物变性失活。
近年发展起来的超临界流体技术工作环境温和，不用或少用水及有机溶剂、在室温常压下呈气态而易与产品分离，目前，最常用的超临界流体是CO2，无毒、不易燃、价廉易得，而且临界点参数低，在室温常压下呈气态而易与所制得产品分离。近年来发展了的有关技术还包括：超临界流体快速膨胀法、超临界流体抗溶剂法、气溶胶溶剂萃取系统和超临界流体强制分散技术等。
经查阅文献，目前尚无r-RGD-Hirudin口服制剂及其相关研究报道。因此，研究开发r-RGD-Hirudin的口服缓释制剂具有重要现实意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种重组双功能水蛭素口服制剂及其制备方法。
本发明的进一步目的是将r-RGD-Hirudin制成特殊口服制剂后，扩展其临床适应症和临床使用范围。
本发明重组双功能水蛭素口服制剂由重组双功能水蛭素和结肠靶向性聚合物聚乳酸及药物辅料组成。
所述的重组双功能水蛭素具有序列1的结构(专利号：01105798.X)，其分子的第32至35位和第53至66位氨基酸序列为：Arg32-Gly33-Asp34-Ser35；Gln53-Gly54-Asp55-Phe56-Glu57-Pro58-Ile59-Pro60-Glu61-Asp62-Ala63-Tyr64-Asp65-Glu66。
所述的聚乳酸是良好的包衣材料，具有安全无毒性，可生物降解等特点(市购)。
本发明的目的通过下述技术方案实现，
利用超临界流体抗溶剂技术，将结肠靶向性聚合物聚乳酸先溶于溶剂中形成溶液，将该溶液迅速喷洒在流化的r-RGD-Hirudin颗粒表面，由于温度和压力的变化，聚合物的溶解度降低而包覆在r-RGD-Hirudin的表面上，制成口服颗粒制剂，通过动物实验，证实所得的r-RGD-Hirudin口服制剂具有抗凝作用和缓释作用。
实现所述技术方案的方法包括下述步骤：
1、r-RGD-Hirudin超细颗粒制备：
将药用淀粉加入r-RGD-Hirudin原液10mg/mL，终浓度为5％，混匀，冷冻干燥，将冻干粉研磨，80目筛后，制成r-RGD-Hirudin超细颗粒；
2、CO2超临界包衣：
以聚乳酸为包衣材料，放入CO2超临界包衣反应器的萃取釜中，将r-RGD-Hirudin超细颗粒放入流化床。CO2经一定温度(Tc＝31℃)和压力(Pc＝7.38Mpa)处理后，加入萃取釜，反应15min后，将萃取釜中的流体导入流化床，在这一过程中，将温度和压力恢复到正常状态，聚乳酸重新析出晶体，在r-RGD-Hirudin超细颗粒表面形成包衣。本发明选用的聚乳酸分子量为4.0×104-1.0×105。
所采用的CO2超临界包衣技术的主要原理是：在一定的温度和压力下，CO2形成流体，非极性的包衣材料可溶解在CO2流体中，而蛋白质/多肽类药物是极性分子，不能溶解在CO2流体中，呈固体状态。改变反应体系的温度和压力，CO2流体汽化，CO2释放，包衣材料从流体中析出，在蛋白质/多肽类药物颗粒表面形成均匀的包衣。由于这种包衣材料能抵抗胃酸的破坏，并且崩解的时间较长，口服后需6-8小时才崩解，蛋白质/多肽类药物达到结肠后吸收。
3、大鼠口服r-RGD-Hirudin，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取血，枸橼酸钠抗凝，测定血液学指标，作为自身空白对照；口服药物后2、4、6、8hr，再次取血，枸橼酸钠抗凝，测定血液学指标。
4、观察指标：取血，测定给药前和给药后2、4、6、8hr的凝血酶原时间、凝血酶时间、部分凝血活酶时间和最大血小板聚集率。
5、数据统计：采用SSPS软件。
本发明所制备r-RGD-Hirudin制剂颗粒规则，表面光滑，外观均匀，无粘连，平均粒径在70-105μm，载药量、包封率高。通过动物实验，结果表明具有抗凝作用，口服后24小时内有效，具有缓释作用，能克服现有技术的缺陷，拓宽了临床应用范围，宜用于治疗和预防慢性的血栓性疾病。
附图说明
图1是用药前后，凝血酶原时间的变化。
图2是用药前后，凝血酶时间的变化。
图3是用药前后，部分凝血活酶时间的变化。
图4是用药前后，最大血小板聚集率的变化。
具体实施方式
下面通过实施实例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1
1、制备r-RGD-Hirudin超细颗粒：
将药用淀粉加入浓度为10mg/mL的r-RGD-Hirudin原液，药用淀粉的终浓度为 10％，混匀，冷冻干燥。将冻干粉充分研磨，80目筛后，制成r-RGD-Hirudin超细颗粒。
2、CO2超临界包衣制剂：以聚乳酸为包衣材料，称取20克，放置入CO2超临界包衣反应器的萃取釜中，称取步骤1中获得的r-RGD-Hirudin超细颗粒20克，放入超临界包衣反应器的流化床。高纯度CO2经31℃保温和7.38Mpa加压处理后，导入萃取釜，反应15分钟。将萃取釜中的CO2流体导入流化床，在导入过程中，将温度恢复到20℃，压力恢复到大气压，聚乳酸在相变过程中，重新析出晶体，并在r-RGD-Hirudin超细颗粒表面形成包衣。所制得的口服颗粒制剂平均粒径为70-105μm。
本发明实验选用的聚乳酸分子量为4.0×104-1.0×105。
3、r-RGD-Hirudin包衣制剂的药效学研究：取SD大鼠16只，分为2组，每组8只，分别灌胃，口服r-RGD-Hirudin包衣制剂。剂量为：r-RGD-Hirudin 5mg/kg、20mg/kg。口服后，大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，剂量为40mg/kg。麻醉后，分离左颈总动脉，插入动脉导管(5分钟内完成)，取血1.35mL，3.8％枸橼酸钠抗凝，抗凝剂量为全血体积∶抗凝剂体积＝1∶9，测定凝血酶原时间、凝血酶时间、部分凝血活酶时间和最大血小板聚集率4项血液学指标，作为自身空白对照。口服r-RGD-Hirudin包衣制剂后2、4、6、8小时，再次取血1.35mL，3.8％枸橼酸钠抗凝，抗凝剂量为全血体积∶抗凝剂体积＝1∶9，测定凝血酶原时间、凝血酶时间、部分凝血活酶时间和最大血小板聚集率4项血液学指标。数据统计用SPSS软件作组内T检验。
4、药效学研究：大鼠口服r-RGD-Hirudin包衣制剂，结果表明，口服用药5mg/kg，血液学指标几乎没有变化，口服用药20mg/kg，口服后6小时，凝血酶原时间、凝血酶时间、部分凝血活酶时间均显著的延长，其中部分凝血活酶时间在口服后2小时就有显著延长，口服用药20mg/kg后4小时，最大血小板聚集率显著下降，作用持续4小时左右。
表1为口服用药5mg/kg后，血液学指标的变化。
表2为口服用药20mg/kg后，血液学指标的变化。
其中，*表示显著差异，P＜0.05；**表示极显著差异，P＜0.01。
表1.
表2.
说明书核苷酸和氨基酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学
<120>一种重组双功能水蛭素口服制剂及其制备方法
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>66
<212>PRT
<213>Artificial
<400>1
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys
1 5 10 15
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Arg
20 25 30
Gly Asp Ser Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro
35 40 45
Gln Ser His Asn Gln Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr
50 55 60
Asp Glu
65
Claims (7)
1.一种重组双功能水蛭素口服制剂，其特征是由序列1的重组双功能水蛭素和聚乳酸及药物辅料组成，所述的重组双功能水蛭素其分子的第32至35位和第53至66位氨基酸序列为：Arg32-Gly33-Asp34-Ser35；Gln53-Gly54-Asp55-Phe56-Glu57-Pro58-Ile59-Pro60-Glu61-Asp62-Ala63-Tyr64-Asp65-Glu66。
2.权利要求1的重组双功能水蛭素口服制剂的制备方法，其特征是利用超临界流体抗溶剂技术，将聚乳酸溶于溶剂中形成溶液后，将该溶液喷洒并包覆在流化的重组双功能水蛭素颗粒表面，制成口服颗粒制剂，包括下述步骤：
(1)制备重组双功能水蛭素超细颗粒
将药用淀粉加入重组双功能水蛭素原液10mg/mL，终浓度为5％，混匀，冷冻干燥，将冻干粉研磨，80目筛后，制成重组双功能水蛭素超细颗粒；
(2)CO2超临界包衣：
以聚乳酸为包衣材料，放入CO2超临界包衣反应器的萃取釜中，将重组双功能水蛭素超细颗粒放入流化床，CO2经31℃保温和7.38Mpa加压处理后，加入萃取釜，反应15min后，将萃取釜中的流体导入流化床，将温度和压力恢复到正常状态，聚乳酸析出晶体，在重组双功能水蛭素超细颗粒表面形成包衣。
3.按权利要求2所述的方法，其特征是所述的步骤(2)的聚乳酸分子量为4.0×104-1.0×105。
4.按权利要求2所述的方法，其特征是所述的口服颗粒制剂平均粒径为70-105μm。
5.权利要求1的重组双功能水蛭素口服制剂在制备抗凝口服药物中的用途。
6.权利要求1的重组双功能水蛭素口服制剂在制备缓释口服药物中的用途。
7.权利要求1的重组双功能水蛭素口服制剂在制备治疗慢性的血栓性疾病口服药物中的用途。
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