CN110684101A - 一种重组水蛭素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵的技术领域,更具体地,本发明提供了一种重组水蛭素的制备方法。本发明的第一方面提供一种重组水蛭素的制备方法,包括:将种子液置于初始培养基中,当DO值大于55%时,于初始培养基中滴加补料培养基;其中,初始培养基的制备过程包括步骤:将糖溶液进行灭菌处理,并添加于发酵罐中;将微量金属溶液过滤除菌,并添加于发酵罐中;将维生素溶液过滤除菌,并添加于发酵罐中,即得初始培养基。
Description
技术领域
本发明涉及发酵的技术领域,更具体地,本发明提供了一种重组水蛭素的制备方法。
背景技术
水蛭素对凝血酶的抑制作用是相对独立的,无需其他凝血因子的参与,对凝血酶具有选择性和特异性,可以直接抑制凝血酶阻断其凝血功能。水蛭素是凝血酶的天然抑制剂,靶向目标单一,在现有的已知的抗凝类药物中是相对安全有效的。水蛭素能够阻止凝血酶催化的凝血因子活化及血小板反应导致的严重淤血现象。水蛭素是一种很有前途的药物,在很多形式的血栓性疾病中都有显著的治疗效果,如静脉血栓、弥漫性血管凝血、外科手术后预防动脉血栓的形成、预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成等。
但天然的水蛭素产量有限,每条水蛭只含20μg的水蛭素,不能满足临床应用的要求,为此,采用生物工程技术生产重组水蛭素的研究——特别是能够生产高产率的重组水蛭素的方法——显得尤为重要。
目前制备得到的重组水蛭素表达量较低,不能很好的解决高活性水蛭素制备的问题,因此,本发明提供一种新型的重组水蛭素制备工艺。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的第一方面提供一种重组水蛭素的制备方法,重组水蛭素的制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,当DO值大于55%时,于初始培养基中滴加补料培养基;其中,初始培养基的制备原料包括糖溶液、微量金属溶液以及维生素溶液。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,糖溶液包括无氨基酵母氮源、碳源以及氨基酸溶液。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,氨基酸溶液包括L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的至少一种。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,微量金属溶液包括锌盐、锰盐、钴盐、铁盐、钙盐、钠盐、铜盐中的至少一种。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,维生素溶液包括生物素、烟酸、盐酸硫胺、维生素B2中的至少一种。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,重组水蛭素的制备过程中通过滴加氨水控制初始培养基的pH为4.5~5.5。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,初始培养基的温度为25~40℃。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,种子液的接种量为10~15%。
作为本发明的一种优选技术方案,其中,补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液以及碳源。
本发明的第二方面提供一种根据所述重组水蛭素的制备方法制备得到的重组水蛭素。
与现有技术相比,本发明提供的重组水蛭素的制备方法可以得到大量的分泌菌体,提高活性产物的表达,从而提高水蛭素的生产效率。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例,否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量,且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致,则以本申请中提供的术语定义为准。
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述,并非对其保护范围的限制。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指,在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而,在相同的情况下或其他情况下,其他实施方案也可能是优选的。此外,对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用,也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
本发明的第一方面提供一种重组水蛭素的制备方法,包括:将种子液置于初始培养基中,当DO值大于55%时,于初始培养基中滴加补料培养基;其中,初始培养基的制备原料包括糖溶液、微量金属溶液以及维生素溶液。
申请人在意外发现,在当体系中DO值大于55%时加入补料培养基有利于提高所得水蛭素的表达活性,而过早或过晚加入均有负面影响,会降低菌体的生长或产物的表达量,可能在不同DO值条件下,菌体对补料培养基的吸收能力不同,从而会影响最后有效水蛭素的表达效果。
在一种优选地实施方式中,重组水蛭素的制备方法,其中,重组水蛭素的制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于55%时,于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基。
在一种实施方式中,无菌空气的通气量为3~7L/min;优选地,无菌空气的通气量为5L/min。
在一种实施方式中,初始培养基的温度为25~40℃;优选地,初始培养基的温度为27~35℃;更优选地,初始培养基的温度为30℃。
在一种实施方式中,重组水蛭素的制备过程在本领域常规或熟知的装置和条件下进行。
在一种实施方式中,重组水蛭素的制备过程在摇瓶中进行,转速为300~1000r/min;优选地,转速为650r/min。
在一种实施方式中,重组水蛭素的制备过程在5L发酵罐中进行。
在一种实施方式中,通过滴加氨水控制初始培养基的pH为4.5~5.5;优选地,通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0。
在一种实施方式中,氨水的浓度为20~30wt%;优选地,氨水的浓度为25wt%。
在一种实施方式中,种子液的接种量为10~15%;优选地,种子液的接种量为11~13%。
在一种实施方式中,种子液的制备方法为:接种工程菌甘油保藏菌至装有种子培养基的瓶中,培养,即得待接种的种子液。
优选地,种子液的制备方法为:种子液的制备方法为:①接种工程菌甘油保藏菌至装有5mL种子培养基的100mL三角瓶中,于30℃,220rpm摇床培养24小时;②转接至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,于30℃,220rpm摇床培养24小时;③转接至装有250mL种子培养基的1000mL三角瓶中(共两瓶),于30℃,220rpm摇床培养12小时,即得待接种的种子液。
在一种实施方式中,种子培养基包括葡萄糖、YNB、氨基酸以及水。
在一种实施方式中,种子培养基中的葡萄糖含量为初始培养基的溶液的总体积的10~30g/L;优选地,种子培养基中的蔗糖含量为初始培养基的溶液的总体积的20g/L。
在一种实施方式中,葡萄糖、YNB、氨基酸的重量比为(10~30):(5~9):(1~2);优选地,葡萄糖、YNB、氨基酸的重量比为20:7:1.5。
在一种实施方式中,种子培养基中的水含量为400~550mL;优选地,种子培养基中的水含量为480mL。
在一种实施方式中,氨基酸选自L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的任一种或多种的组合;优选地,氨基酸为L-精氨酸、L-组氨酸以及L-色氨酸;进一步优选地,氨基酸为L-精氨酸、L-组氨酸以及L-色氨酸的重量比为1:(0.8~1.2):(0.8~1.2);更优选地,L-精氨酸、L-组氨酸以及L-色氨酸的重量比为1:1:1。
在一种实施方式中,接种工程菌为INVSC1酿酒酵母菌株。
在一种实施方式中,糖溶液包括无氨基酵母氮源(YNB)、碳源以及氨基酸溶液;优选地,糖溶液还包括铵盐、磷酸盐、镁盐、锌盐、锰盐、钴盐、铁盐、钙盐、钠盐、铜盐中的至少一种;更优选地,糖溶液还包括消泡剂。
在一种实施方式中,糖溶液包括无氨基酵母氮源(YNB)、碳源、氨基酸溶液、铵盐、磷酸盐、镁盐以及消泡剂。
在一种实施方式中,无氨基酵母氮源(YNB)含量为初始培养基的溶液的总体积的4~10g/L;优选地,无氨基酵母氮源(YNB)含量为初始培养基的溶液的总体积的6~8g/L;更优选地,无氨基酵母氮源(YNB)含量为初始培养基的溶液的总体积的7g/L。
在一种实施方式中,碳源含量为初始培养基的溶液的总体积的20~50g/L;优选地,碳源含量为初始培养基的溶液的总体积的30~40g/L;更优选地,碳源含量为初始培养基的溶液的总体积的35g/L。
在一种实施方式中,氨基酸溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的10~40mL/L;优选地,氨基酸溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的15~30mL/L;更优选地,氨基酸溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的20mL/L。
在一种实施方式中,糖溶液中的铵盐、磷酸盐以及镁盐的重量比为(1~1.5):(1.5~3):1;优选地,糖溶液中的铵盐、磷酸盐以及镁盐的重量比为1.3:2.5:1。
在一种实施方式中,糖溶液中的铵盐含量为初始培养基的溶液的总体积的10~30g/L;优选地,糖溶液中的铵盐含量为初始培养基的溶液的总体积的15g/L。
在一种实施方式中,消泡剂含量为初始培养基的溶液的总体积的0.1~1mL/L;优选地,消泡剂含量为初始培养基的溶液的总体积的0.5mL/L。
在一种实施方式中,消泡剂为有机硅类消泡剂和/或聚醚类消泡剂;优选地,消泡剂为吐温80。
在一种实施方式中,氨基酸溶液包括L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的至少一种;优选地,氨基酸溶液包括L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸;进一步优选地,L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸的重量比为1:(2~4):(1~3):(0.5~1.5);更优选地,L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸的重量比为1:3:1.5:1。
在一种实施方式中,L-组氨酸含量为100X氨基酸溶液的1~3g/L;优选地,L-组氨酸含量为氨基酸溶液的2g/L。
在一种实施方式中,初始培养基的制备原料中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的5~20mL/L;优选地,初始培养基的制备原料中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的10mL/L。
在一种实施方式中,初始培养基的制备原料中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的5~20mL/L;优选地,初始培养基的制备原料中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的10~15mL/L;初始培养基的制备原料中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的12mL/L。
在一种实施方式中,补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液以及碳源;优选地,补料培养基还包括磷酸盐、铵盐、磷酸盐、镁盐、锌盐、锰盐、钴盐、铁盐、钙盐、钠盐、铜盐、钾盐中的至少一种。
在一种实施方式中,补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液、碳源、磷酸盐、镁盐以及钾盐。
申请人意外发现,在特定的初始培养基以及补料培养基协同作用下,利用本发明提供的制备方法所得水蛭素的活性较高,可能由于有利于在菌体发酵过程的不同阶段营养成分充足,活性物产量较高,同时避免新生水蛭素的分解,最后有效表达的水蛭素产率较高。
在一种实施方式中,补料培养基中的碳源含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的300~500g/L;优选地,补料培养基中的碳源含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的350~450g/L;更优选地,补料培养基中的碳源含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的400g/L。
在一种实施方式中,补料培养基中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的5~20mL/L;优选地,补料培养基中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的10~15mL/L;更优选地,补料培养基中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的12mL/L。
在一种实施方式中,补料培养基中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的3~15mL/L;优选地,补料培养基中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的8~12mL/L;更优选地,补料培养基中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的10mL/L。
在一种实施方式中,补料培养基中的钾盐含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的1.5~6g/L;优选地,补料培养基中的钾盐含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的3~5g/L;更优选地,补料培养基中的钾盐含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的3.5g/L。
在一种实施方式中,补料培养基中的钾盐、镁盐以及磷酸盐的重量比为1:(1~3):(2~5);优选地,补料培养基中的钾盐、镁盐以及磷酸盐的重量比为1:1.5:3.5。
在一种实施方式中,碳源选自葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、麦芽糖、乳糖中的任一种或多种的组合。
在一种实施方式中,微量金属溶液包括锌盐、锰盐、钴盐、铁盐、钙盐、钠盐、铜盐、钾盐中的至少一种;优选地,微量金属溶液包括钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐;进一步优选地,钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐的重量比为1:(50~90):(20~40):(3~10);更优选地,钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐的重量比为1:80:30:5。
在一种实施方式中,微量金属溶液中的钠盐含量为微量金属溶液的0.05~0.2g/L;优选地,微量金属溶液中的钠盐含量为微量金属溶液的0.1g/L。
在一种实施方式中,微量金属溶液还包括0.5M EDTA;进一步优选地,EDTA含量为微量金属溶液的70~90mL/L;更优选地,EDTA含量为微量金属溶液的80mL/L。
在一种实施方式中,可列举的锌盐包括但不限于:硫酸锌、氯化锌;可列举的锰盐包括但不限于:硫酸锰、二氯化锰、甘氨酸锰;可列举的钴盐包括但不限于:二氯化钴;可列举的铁盐包括但不限于:硫酸亚铁、氯化亚铁;可列举的钙盐包括但不限于:氯化钙、甘氨酸钙;可列举的钠盐包括但不限于:氯化钠、钼酸钠;可列举的铜盐包括但不限于:无水硫酸铜、甘氨酸铜;可列举的钾盐包括但不限于:硫酸钾、氯化钾、钼酸钾;可列举的铵盐包括但不限于:硝酸铵、硫酸铵、氯化铵;可列举的磷酸盐包括但不限于:磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钙。
在一种实施方式中,维生素溶液包括生物素、烟酸、盐酸硫胺、维生素B2中的至少一种;优选地,维生素溶液包括生物素、烟酸以及盐酸硫胺;进一步优选地,生物素、烟酸以及盐酸硫胺的重量比为1:(15~30):(10~30);更优选地,生物素、烟酸以及盐酸硫胺的重量比为1:22:20。
在一种实施方式中,生物素含量为维生素溶液的0.03~0.1g/L;优选地,生物素含量为维生素溶液的0.05g/L。
在一种实施方式中,维生素溶液还包括肌醇与吡哆醛盐酸,优选地,烟酸、肌醇以及吡哆醛盐酸的重量比为1:(0.5~1.5):(0.5~1.5);更优选地,烟酸、肌醇以及吡哆醛盐酸的重量比为1:1:1。
申请人在制备过程中在体系中加入肌醇以及吡哆醛盐酸可进一步优化所得水蛭素的活性,可能由于肌醇与吡哆醛盐酸可以促进菌体的生长,避免新生菌体的分解,从而提高所得水蛭素的表达活性。
在一种实施方式中,初始培养基的制备过程包括以下步骤:
(1)将糖溶液进行灭菌处理,并添加于发酵罐中;
(2)将微量金属溶液过滤除菌,并添加于发酵罐中;
(3)将维生素溶液过滤除菌,并添加于发酵罐中,即得初始培养基。
在一种优选地实施方式中,初始培养基的制备过程包括以下步骤:
(1)将糖溶液进行灭菌处理,并通过流加的添加于发酵罐中;
(2)将微量金属溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中;
(3)将维生素溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中,即得初始培养基。
本发明的第二方面提供了一种根据所述重组水蛭素的制备方法制备得到的重组水蛭素。
实施例1
本发明的实施例1提供一种重组水蛭素,其制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于55%时,于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基;其中,无菌空气的通气量为5L/min,初始培养基的温度为30℃,并通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0,且氨水的浓度为25wt%;
重组水蛭素的制备过程在摇瓶中进行,转速为650r/min;
种子液的接种量为11%;
种子液的制备方法为:种子液的制备方法为:①接种工程菌甘油保藏菌至装有5mL种子培养基的100mL三角瓶中,于30℃,220rpm摇床培养24小时;②转接至装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,于30℃,220rpm摇床培养24小时;③转接至装有250mL种子培养基的1000mL三角瓶中(共两瓶),于30℃,220rpm摇床培养12小时,即得待接种的种子液;
种子培养基包括葡萄糖、YNB、氨基酸以及水,种子培养基中的蔗糖含量为初始培养基的溶液的总体积的20g/L;葡萄糖、YNB、氨基酸的重量比为20:7:1.5;种子培养基中的水含量为480mL;氨基酸为L-精氨酸、L-组氨酸以及L-色氨酸;L-精氨酸、L-组氨酸以及L-色氨酸的重量比为1:1:1;接种工程菌为INVSC1酿酒酵母菌株;
初始培养基的制备原料包括糖溶液、微量金属溶液以及维生素溶液;
糖溶液包括无氨基酵母氮源(YNB)、碳源、氨基酸溶液、铵盐、磷酸盐、镁盐以及消泡剂,无氨基酵母氮源(YNB)含量为初始培养基的溶液的总体积的7g/L,碳源含量为初始培养基的溶液的总体积的35g/L,氨基酸溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的20mL/L,铵盐含量为初始培养基的溶液的总体积的15g/L;
糖溶液中的铵盐、磷酸盐以及镁盐的重量比为1.3:2.5:1;
消泡剂为吐温80;消泡剂含量为初始培养基的溶液的总体积的1mL/L;
氨基酸溶液包括L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸,L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸的重量比为1:3:1.5:1;其中,L-组氨酸含量为氨基酸溶液的2g/L;
初始培养基的制备原料中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的10mL/L,初始培养基的制备原料中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的12mL/L;
补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液、碳源、磷酸盐、镁盐以及钾盐,补料培养基中的碳源含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的400g/L;补料培养基中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的12mL/L;补料培养基中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的10mL/L;补料培养基中的钾盐含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的3.5g/L;补料培养基中的钾盐、镁盐以及磷酸盐的重量比为1:1.5:3.5;
碳源为半乳糖;
微量金属溶液包括钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐,钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐的重量比为1:80:30:5;其中,微量金属溶液中的钠盐含量为微量金属溶液的0.1g/L;
微量金属溶液还包括0.5M EDTA,EDTA含量为微量金属溶液的80mL/L;
锌盐为硫酸锌,钠盐为钼酸钠,钙盐为氯化钙,锰盐为二氯化锰;钾盐为硫酸钾,镁盐为硫酸镁,磷酸盐为磷酸二氢钾;铵盐为硫酸铵;
维生素溶液包括生物素、烟酸以及盐酸硫胺,生物素、烟酸以及盐酸硫胺的重量比为1:22:20;其中,生物素含量为维生素溶液的0.05g/L;
维生素溶液还包括肌醇与吡哆醛盐酸,烟酸、肌醇以及吡哆醛盐酸的重量比为1:1:1;
初始培养基的制备过程包括以下步骤:
(1)将糖溶液进行灭菌处理,并通过流加的添加于发酵罐中;
(2)将微量金属溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中;
(3)将维生素溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中,即得初始培养基。
实施例2
本发明的实施例2提供一种重组水蛭素,其制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于55%时,于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基;其中,无菌空气的通气量为7L/min,初始培养基的温度为30℃,并通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0,且氨水的浓度为30wt%;
重组水蛭素的制备过程在摇瓶中进行,转速为650r/min;
种子液的接种量为11%;
初始培养基的制备原料包括糖溶液、微量金属溶液以及维生素溶液;
糖溶液包括无氨基酵母氮源(YNB)、碳源、氨基酸溶液、铵盐、磷酸盐、镁盐以及消泡剂,无氨基酵母氮源(YNB)含量为初始培养基的溶液的总体积的10g/L,碳源含量为初始培养基的溶液的总体积的50g/L,氨基酸溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的40mL/L,铵盐含量为初始培养基的溶液的总体积的30g/L;
糖溶液中的铵盐、磷酸盐以及镁盐的重量比为1.5:3:1;
消泡剂为吐温80;消泡剂含量为初始培养基的溶液的总体积的1mL/L;
氨基酸溶液包括L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸,L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸的重量比为1:4:3:1.5;其中,L-组氨酸含量为氨基酸溶液的3g/L;
初始培养基的制备原料中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的20mL/L,初始培养基的制备原料中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的20mL/L;
补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液、碳源、磷酸盐、镁盐以及钾盐,补料培养基中的碳源含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的500g/L;补料培养基中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的20mL/L;补料培养基中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的15mL/L;补料培养基中的钾盐含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的6g/L;补料培养基中的钾盐、镁盐以及磷酸盐的重量比为1:3:5;
碳源为半乳糖;
微量金属溶液包括钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐,钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐的重量比为1:90:40:10;其中,微量金属溶液中的钠盐含量为微量金属溶液的0.2g/L;
微量金属溶液还包括0.5M EDTA,EDTA含量为微量金属溶液的90mL/L;
锌盐为硫酸锌,钠盐为钼酸钠,钙盐为氯化钙,锰盐为二氯化锰;钾盐为硫酸钾,镁盐为硫酸镁,磷酸盐为磷酸二氢钾;铵盐为硫酸铵;
维生素溶液包括生物素、烟酸以及盐酸硫胺,生物素、烟酸以及盐酸硫胺的重量比为1:30:30;其中,生物素含量为维生素溶液的0.1g/L;
维生素溶液还包括肌醇与吡哆醛盐酸,烟酸、肌醇以及吡哆醛盐酸的重量比为1:1.5:1.5;
初始培养基的制备过程包括以下步骤:
(1)将糖溶液进行灭菌处理,并通过流加的添加于发酵罐中;
(2)将微量金属溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中;
(3)将维生素溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中,即得初始培养基。
实施例3
本发明的实施例3提供一种重组水蛭素,其制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于55%时,于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基;其中,无菌空气的通气量为3L/min,初始培养基的温度为30℃,并通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0,且氨水的浓度为20wt%;
重组水蛭素的制备过程在摇瓶中进行,转速为650r/min;
种子液的接种量为11%;
初始培养基的制备原料包括糖溶液、微量金属溶液以及维生素溶液;
糖溶液包括无氨基酵母氮源(YNB)、碳源、氨基酸溶液、铵盐、磷酸盐、镁盐以及消泡剂,无氨基酵母氮源(YNB)含量为初始培养基的溶液的总体积的4g/L,碳源含量为初始培养基的溶液的总体积的20g/L,氨基酸溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的10mL/L,铵盐含量为初始培养基的溶液的总体积的10g/L;
糖溶液中的铵盐、磷酸盐以及镁盐的重量比为1:1.5:1;
消泡剂为吐温80;消泡剂含量为初始培养基的溶液的总体积的0.1mL/L;
氨基酸溶液包括L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸,L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸以及L-蛋氨酸的重量比为1:2:1:0.5;其中,L-组氨酸含量为氨基酸溶液的1g/L;
初始培养基的制备原料中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的5mL/L,初始培养基的制备原料中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液的总体积的10mL/L;
补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液、碳源、磷酸盐、镁盐以及钾盐,补料培养基中的碳源含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的300g/L;补料培养基中的维生素溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的10mL/L;补料培养基中的微量金属溶液含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的8mL/L;补料培养基中的钾盐含量为初始培养基的溶液与补料培养基的溶液的总体积的1.5g/L;补料培养基中的钾盐、镁盐以及磷酸盐的重量比为1:1:2;
碳源为半乳糖;
微量金属溶液包括钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐,钠盐、锌盐、钙盐以及锰盐的重量比为1:50:20:3;其中,微量金属溶液中的钠盐含量为微量金属溶液的0.05g/L;
微量金属溶液还包括0.5M EDTA,EDTA含量为微量金属溶液的70mL/L;
锌盐为硫酸锌,钠盐为钼酸钠,钙盐为氯化钙,锰盐为二氯化锰;钾盐为硫酸钾,镁盐为硫酸镁,磷酸盐为磷酸二氢钾;铵盐为硫酸铵;
维生素溶液包括生物素、烟酸以及盐酸硫胺,生物素、烟酸以及盐酸硫胺的重量比为1:15:10;其中,生物素含量为维生素溶液的0.03g/L;
维生素溶液还包括肌醇与吡哆醛盐酸,烟酸、肌醇以及吡哆醛盐酸的重量比为1:0.5:0.5;
初始培养基的制备过程包括以下步骤:
(1)将糖溶液进行灭菌处理,并通过流加的添加于发酵罐中;
(2)将微量金属溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中;
(3)将维生素溶液通过0.22μm的无菌过滤器过滤除菌,并添加于发酵罐中,即得初始培养基。
实施例4
本发明的实施例4提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,初始培养基中的维生素溶液与补料培养基中的维生素溶液均为0。
实施例5
本发明的实施例5提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,初始培养基中的微量金属溶液与补料培养基中的微量金属溶液均为0。
实施例6
本发明的实施例6提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,初始培养基与补料培养基中的维生素溶液与微量金属溶液均为0。
实施例7
本发明的实施例7提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,糖溶液中的氨基酸溶液含量为0。
实施例8
本发明的实施例8提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,重组水蛭素的制备过程包括:于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基,再向所得培养基中添加种子液,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于55%时,其中,无菌空气的通气量为5L/min,初始培养基的温度为30℃,并通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0,且氨水的浓度为25wt%。
实施例9
本发明的实施例9提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,重组水蛭素制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于45%时,于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基;其中,无菌空气的通气量为5L/min,初始培养基的温度为30℃,并通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0,且氨水的浓度为25wt%。
实施例10
本发明的实施例10提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,重组水蛭素制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,通无菌空气,并保持DO值大于40%;当DO值大于65%时,于初始培养基中通过流加的方式滴加补料培养基;其中,无菌空气的通气量为5L/min,初始培养基的温度为30℃,并通过滴加氨水控制初始培养基的pH为5.0,且氨水的浓度为25wt%。
实施例11
本发明的实施例11提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,维生素溶液中肌醇含量为0。
实施例12
本发明的实施例12提供一种重组水蛭素,其具体实施方式同实施例1,不同之处在于,维生素溶液中吡哆醛盐酸含量为0。
性能评估:
重组水蛭素的活性测试,具体测试方法如下:
①0.5%纤维蛋白原的Tris-HCl缓冲液配制:取0.2mol·L-1三羟甲基氨基甲烷溶液25mL与0.1mol·L-1盐酸溶液40mL,加水至100mL,用pH计调节其pH至7.4,加入0.5g(人)纤维蛋白原溶解,即得含0.5%(人)纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。
②凝血酶滴定液的配制:将100NIH·mL-1的凝血酶加入2.5mL的0.9%氯化钠溶液,配成浓度为40NIH·mL-1的凝血酶滴定液。
③水蛭素的含量测定精密量取提取液100μL,置试管(10mm×100mm)中,加入含0.5%(人)纤维蛋白原200μL,摇匀,置水浴(37±0.5)℃中保温5min,缓缓滴加凝血酶溶液(每5μL/min,边滴加边轻轻摇匀)至凝固,记录消耗凝血酶溶液的体积。
④按下式计算含量。
U=C1V1/(C2V2W)
U为每1g(或1mL)含抗凝血酶活性单位(U·g-1或U·mL-1);C1为凝血酶溶液的浓度(U·mL-1);C2为供试品溶液的质量浓度(g·mL-1);V1为消耗凝血酶溶液的体积(μL);V2为供试品溶液的加入量(μL);W为取样量。
表1性能测试结果
前述的实例仅是说明性的,用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围,且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此,申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围,这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (10)
1.一种重组水蛭素的制备方法,其特征在于,重组水蛭素的制备过程包括:将种子液置于初始培养基中,当DO值大于55%时,滴加补料培养基;其中,初始培养基的制备原料包括糖溶液、微量金属溶液以及维生素溶液。
2.根据权利要求1所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,糖溶液包括无氨基酵母氮源、碳源以及氨基酸溶液。
3.根据权利要求2所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,氨基酸溶液包括L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,微量金属溶液包括锌盐、锰盐、钴盐、铁盐、钙盐、钠盐、铜盐中的至少一种。
5.根据权利要求1所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,维生素溶液包括生物素、烟酸、盐酸硫胺、维生素B2中的至少一种。
6.根据权利要求5所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,维生素溶液还包括肌醇与吡哆醛盐酸。
7.根据权利要求1~6任一项所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,重组水蛭素的制备过程中通过滴加氨水控制初始培养基的pH为4.5~5.5。
8.根据权利要求1~6任一项所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,种子液的接种量为10~15%。
9.根据权利要求1~6任一项所述重组水蛭素的制备方法,其特征在于,补料培养基包括微量金属溶液、维生素溶液以及碳源。
10.一种根据权利要求1~9任一项所述重组水蛭素的制备方法制备得到的重组水蛭素。
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