CN103834630A - 一种制备重组牛肠激酶催化亚基的方法 - Google Patents

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Abstract

一种制备重组牛肠激酶催化亚基BEKL的基因工程制备方法，该方法将人血清白蛋白(HSA)信号肽基因3’末端与牛肠激酶催化亚基BEKL基因5’末端进行基因融合，该融合基因克隆到醇氧化酶AOX启动子下游，由人血清白蛋白(HSA)信号肽介导牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母Pichia.pastoris中的分泌表达，表达产物直接分泌到发酵培养基中，无需变性和复性即获得正确的空间构象和生物活性。由于在牛肠激酶催化亚基BEKL羧基末端添加了组氨酸标签6×His，表达产物可以通过Ni2+亲和层析进行分离纯化。本发明对高效制备具有催化活性的重组牛肠激酶催化亚基BEKL具有重要应用价值。

Description

一种制备重组牛肠激酶催化亚基的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。
背景技术
肠激酶(Enterokinase，EK，EC3.4.21.9)是一种存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶，它可以特异性识别胰蛋白酶原中的Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)序列并切割其羧基末端的肽键，从而将胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶。目前已从人、鼠、猪、牛等动物体内分离出天然肠激酶，其中以牛肠激酶的理化性质研究得最为透彻。牛肠激酶分子量为150kDa，由一条115kDa的重链(结构亚基)和一条35kDa的催化亚基(催化亚基)以一个二硫键连接而成(J Biol Chem.1979，254(5)：1677-1683.)，在pH4.5～9.5和温度4～45℃范围内可特异性识别胰蛋白酶原中DDDDK序列并在C端水解肽链，释放出具有活性的胰蛋白酶。此外，1984年，Light A和Fonseca P证明牛肠激酶轻链即具有全酶所具有的特异性切割活性(J BiolChem.，1984，259(21)：13195-13198.)，因此，该链也被称为催化亚基。
由于肠激酶对氨基酸序列DDDDK的特异性识别和切割特性，且切割后的目的蛋白N端没有冗余的氨基酸残基，因此在基因工程融合表达产物的切割加工方面具有很好的应用价值。目前许多具有商业开发价值的药物蛋白和多肽，如抗骨质疏松药物重组人甲状旁腺素、肿瘤坏死因子-β、磷脂酶A2、白细胞介素-11等，均可采用融合方式进行表达，然后采用蛋白酶切割融合蛋白，释放出目的蛋白，这方面的催化应用为肠激酶提供了广阔的市场空间。
由于从动物组织提取肠激酶来源有限，纯化困难，且容易污染有其他蛋白酶，给其实际应用带来了困难，因此采用基因工程方法制备高纯度的肠激酶轻链(EKL，催化亚基)已成为该领域的主要研究方向。然而，由于牛肠激酶催化亚基BEKL具有4对分子内二硫键，是一种结构较为复杂的蛋白，需要建立有效的表达方式以保证其正确折叠才能得到具有活性的表达产物。
为了解决这一问题，目前采用的表达策略主要有两种：
一、将可促进二硫键形成的伴侣蛋白与牛肠激酶催化亚基BEKL进行融合表达，并在两者之间设计一个含牛肠激酶催化亚基BEKL特异性切割序列(Asp)4-Lys的连接肽，然后通过融合蛋白中牛肠激酶催化亚基BEKL的自切割释放出目的蛋白牛肠激酶催化亚基BEKL。例如Huang，L.等(Prep Biochem Biotechnol.2007；37(3)：205-17.)将牛肠激酶催化亚基BEKL基因与二硫键氧化还原酶(DsbA)基因融合后在E.coli中进行表达，融合蛋白分泌表达于细胞周质后，通过自催化反应释放出BEKL，经亲和纯化sBEKLC产量达到6.8mg／L。
二、将牛肠激酶催化亚基BEKL基因嵌合在信号肽基因下游，目的产物在信号肽介导下分泌至细胞外培养基中，分泌过程中信号肽被信号肽酶识别并切除，且表达产物直接形成具有正确天然构象的活性蛋白，省却了产物变性、切割、复性等复杂的产物后处理程序，给目的产物的分离纯化带来极人方便。例如，Svetina M.等(J.Biotechnol.2000，76：245-251.)将插入了KEX-2蛋白酶酶切位点的牛肠激酶催化亚基BEKL的cDNA融合在葡萄糖淀粉酶基因下游，在黑曲霉中进行分泌表达，产量达到5mg／L。LaVallie ER等(J.Biol.Chem.，1993，268：23311-23317.)以哺乳动物丝氨酸蛋白酶PACE的前肽作为分泌引导序列融合到BEKL的N末端，将此融合基因PACE-EKL构建到pMT3表达载体上然后转染猴肾COS-1细胞进行分泌表达获得了具有活性的BEKL。Choi等(Biotechnol Bioeng.，2001，75(6)：718-724)将牛EKL cDNA克隆至载体pIL20Gh，构建了pIL20牛EKL分泌表达载体，在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中进行分泌表达，经Ni柱亲和层析分离纯化后牛肠激酶催化亚基BEKL的产量约为1mg／L。
此外，由于毕赤酵母Pichia.pastoris表达系统具有较强的翻译后修饰功能以及培养成本低廉、容易实现高密度发酵等优点，目前已有多篇报道应用该系统分泌表达牛肠激酶催化亚基BEKL。例如，Fang L.等(Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2004，36(7)：513-517)利用酿酒酵母α配对因子信号肽序列在Pichia.pastoris GS115中分泌表达牛肠激酶催化亚基BEKL，经Ni金属螯合层析对发酵液上清中的目的产物分离纯化后，产量达到5.4mg／L。Fang Z.J.等(Bioinformatics and Biomedical Engineering，2009.ICBBE2009.3rd International Conference)同样利用分泌表达载体pPIC9中的酿酒酵母α配对因子信号肽序列将牛肠激酶催化亚基BEKL在Pichia.pastoris GS115中进行了分泌表达，分离纯化后产率为10.9mg／L发酵液。由此可见，虽然酿酒酵母α配对因子信号肽序列可以有效引导牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母Pichia.pastoris中进行有效分泌表达，但表达水平较低。
综上所述，由于牛肠激酶催化亚基BEKL具有4对分子内二硫键，是一种结构较为复杂的蛋白，目前所采用的表达方法表达水平较低，因此建立有效的表达方式对BEKL进行高水平表达，且表达产物可以自动正确折叠成具有催化活性的功能分子，这对其实际应用具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于采用人血清白蛋白(HSA)信号肽序列构建一种新的牛肠激酶催化亚基BEKL分泌表达载体，该重组表达载体电转化毕赤酵母宿主菌GS115后，可以实现牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母Pichia.pastoris中的高效分泌表达，且表达产物无需进行下游的变性复性即具有生物催化活性。
本发明构建的用于牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母中分泌表达的载体，其特征是应用人血清白蛋白(HSA)信号肽介导牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母中的分泌表达。
本发明采用PCR技术将人血清白蛋白(HSA)信号肽与牛肠激酶催化亚基BEKL进行基因融合，然后将该融合基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K(Invitrogen公司)的AOX启动子下游，构建得到由人血清白蛋白(HSA)信号肽介导牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母中分泌表达的新型载体。
本发明构建的分泌表达牛肠激酶催化亚基BEKL的重组质粒电转化毕赤酵母宿主菌GS115后，经筛选获得阳性克隆，其中牛肠激酶催化亚基BEKL基因处于AOX启动子下游，经甲醇诱导表达，牛肠激酶催化亚基BEKL目的产物分泌到培养基中。
为方便表达产物的下游分离纯化，本发明在目的蛋白牛肠激酶催化亚基BEKL羧基端添加了6×His标签，这样发酵液上清经过Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Ni2+亲和层析即可方便制得纯的具有催化活性的牛肠激酶催化亚基BEKL表达产物。
附图说明
图1、本发明构建的HSA signal-EKL-His6融合基因序列。灰色部分指示人血清白蛋白信号肽(HSA signal)序列，箭头指示信号肽酶切割位点
图2、本发明构建的pPIC9K／HSA signal-EKL-His6重组表达质粒图谱
图3、本发明构建的牛肠激酶催化亚基BEKL工程菌高密度发酵上清Western-Blot分析检测结果，一抗为抗组氨酸标签6×His tag抗体
泳道1：GS115宿主菌发酵液上清对照组
泳道2：牛肠激酶催化亚基BEKL工程菌发酵液上清Western-Blot分析检测结果
图4、本发明中牛肠激酶催化亚基BEKL蛋白纯化产物SDS-PAGE分析
泳道1：分子量标准蛋白质，分子量分别为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4 kDa(自上而下)
泳道2：工程菌发酵液上清
泳道3：发酵液上清经Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离纯化后表达产物
泳道4：Ni2+柱亲和层析纯化后表达产物
图5、本发明中牛肠激酶催化亚基BEKL分泌表达产物C-18柱RP-HPLC分析检测
(1)工程菌发酵液上清
(2)发酵液上清经Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离纯化后表达产物
(3)Ni2+柱亲和层析纯化后表达产物
图6、本发明制备的牛肠激酶催化亚基BEKL切割活性分析(底物为含肠激酶酶切位点DDDDK的水蛭素III-露那辛融合蛋白HV3-Lunasin
M：分子量标准蛋白质，分子量分别为100，30，25，20，15，10，5，3.4kDa(自上到下)泳道1：10 ul浓度为0.1μg／μl的水蛭素III-露那辛融合蛋白HV3-Lunasin
泳道2-8：20μl底物(1μg／μl)中分别添加0，0.1，0.15，0.2，0.5，1，2μg牛肠激酶催化亚基BEKL，37℃切割16小时
具体实施方式
实施例1人白蛋白信号肽-牛肠激酶催化亚基BEKL融合基因设计与克隆
根据人白蛋白信号肽氨基酸序列以及牛肠激酶催化亚基氨基酸序列，应用密码子优化设计软件OPTIMIZER(http:／/genomes.urv.es／OPTIMIZER)及Gene Designer(http:／／www.DNA20.com)设计了在毕赤酵母中表达的人白蛋白信号肽-牛肠激酶催化亚基融合基因序列(见附图1)。此外，为了基因克隆需要在基因5’和3’端分别添加了BamHI和EcoRI限制性酶切位点，同时为方便表达产物的分离纯化，在牛肠激酶催化亚基羧基末端添加了6×His表达标签。附图1中阴影部分为人血清白蛋白信号肽序列，箭头所指位置为信号肽酶切割位点。
将上述HSA signal-BEKL-His6基因用BamHI和EcoRI双酶切后克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9K(Invitrogen公司)中得到重组质粒pPIC9K／HSA signal-EKL-His6(图2)。
实施例2重组表达质粒电转化及阳性重组子筛选与鉴定
用SacI酶将重组质粒pPIC9K／HSA signal-EKL-His6酶切线性化，然后采用电转化方法转化Pichia.pastoris宿主菌GS115(电转化参数：1.5KV、25μF和200Ω，4ms)。电转化后立即向电转杯中加入1mL预冷的1M山梨醇，30℃温育2小时后，取一定量(200μL)涂布于MD平板，30℃培养2-6天。
G418抗性筛选，待克隆长出后，将单菌落用2-4mlYPD液体培养基冲洗下来，测定OD600nm，1OD600nm相当于细胞数为5×107个／ml，之后再用YPD液体培养基稀释至每200μl含细胞数量级为105，涂布于含不同浓度G418的YPD平板上，G418浓度梯度为0.5，1，2，4，6，8mg／ml，30℃培养2-5天。
选择最高抗性G418-YPD平板上的单菌落，转移到MM平板和MD平板上筛选Mut+和Muts型转化子。并采用菌落PCR的方法筛选出阳性克隆。
实施例3毕赤酵母分泌表达牛EKL-His6摇瓶筛选及产物鉴定
挑取阳性克隆单菌落至50ml YPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡培养16-18小时，以4％按种量转接至50ml BMGY液体培养基，30℃，250rpm振荡培养至至OD600nm2-6，5000rpm，5min离心收获菌体，转接至30ml BMMY液体培养基中诱导表达。每隔24小时补加甲醇至终浓度1％，连续诱导表达72h。取发酵液上清作SDS-PAGE分析，筛选高表达菌株。同时，采用抗组氨酸标签6×His tag抗体为一抗作Western-Blot鉴定(图3)，结果显示目的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体发生特异性反应，说明表达的蛋白正是目的蛋白牛EKL-His6。
实施例4毕赤酵母工程菌高密度发酵表达牛EKL-His6
参考Invitrogen公司.Pichia Fermentation Process Guidelines进行。
种子液培养阶段：从高产菌株的平板上挑取单菌落接至50ml YPD液体培养基，30℃，250rpm培养24h，此为一级种液；从培养好的一级种液各取2ml转按下另两瓶200ml YPD液体培养基(1％(V／V)接种量)，30℃，220rpm培养24h，此为二级种液；将培养好的二级种液共400ml，按转接10％(V／V)接种量接至7L发酵罐(Bioengineering)中，其中含4LFM21培养基(FM21培养基配方：1L培养基中含85％H3PO426.7ml；CaSO4·2H2O0.93g；K2SO418.2g；MgSO4·7H2O14.9g；KOH16.72g；甘油40g；PTM14.0ml。加去离子水至1L，氨水调节pH至5.5)。
甘油批次培养阶段：通过调节通气量和搅拌速度来维持溶氧水平在30％以上，持续约27h后，溶氧DO值会在1min之内上升接近100％，此时表明罐内培养基甘油已耗尽，需要向发酵罐内补加甘油。
甘油流加补料阶段：甘油被消耗完全后，以18.15ml／h/L起始发酵培养基体积的速度补加50％(W／V)甘油(每升含12ml PTM1)，溶氧水平维持在30％-60％，此阶段可维持大约5h左右，之后饥饿30min左右，以耗尽甘油等碳源。
甲醇诱导表达阶段：此过程将培养温度由30℃调整为25℃(Noseda D G，et al.ProteinExpr Purif.，2013，92(2)：235-244.；Li Z，et al.Protein Expr Purif.,2001，21(3)：438-445.)，并流加无水甲醇(含0.03％Tween-20，1.2％(V／V)PTM1)。添加初始期低速流加(约1ml／h／L起始发酵培养基体积)以使工程菌适应甲醇，此过程约2小时。之后，根据溶氧变化，逐渐提高甲醇流加速度，约每30min提高10％左右，以维持溶氧水平在30％-60％，直至流加速度达到3ml/h／L起始发酵培养基体积。然后，以3ml／h／L起始发酵培养基体积的流加速度维持至发酵终点，整个甲醇诱导过程维持约70h。诱导表达中后期时，向发酵液中添加0.2L有机氮源溶液(含酵母粉200g／L，蛋白胨400g／L)。
实施例5发酵过程中表达产物浓度实时监测
采用高效液相标准曲线法(Stuart A.Rosenfeld etal.，Protein Expr Purif.，1996(8)：476-482)对发酵液上清中的表达产物的浓度进行分析。
标准曲线制作：以本实验室分离纯化得到的牛EKL-His6(纯度＞95％)为标准品，配制不同浓度的牛EKL-His6标准品，进行RP-HPLC分析(日本岛津LC-2010分析型HPLC；Kromasil-C18柱；A相为含0.1％TFA的H2O；B相为含0.1％TFA的CH3CN；沈脱程序为首先30％B相等度洗脱2min，其次进行30-60％B相梯度洗脱3min，流速为1ml／min)，以牛EKL-His6标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，经过回归计算，峰面积与进样标准品浓度成正比线性关系，并且线性关系良好(R2=0.999)，可用于牛EKL-His6的定量分析。
发酵液上清中表达产物浓度分析：将发酵不同时间点的样品进行相同的RP-HPLC分析，得到的目的蛋白的峰面积代入测得的标准曲线，这样就可以得到发酵过程中及最终发酵上清中牛EKL-His6的含量，经过代入标准曲线计算，本发明发酵上清中牛EKL-His6含量约为123.7mg／L。
实施例6表达产物分离纯化
阴离子交换柱层析：取500ml发酵液13000rpm离心30min收集上清，采用0.22μm滤膜过滤除杂，之后选用截留分子量为30kDa的超滤膜组件对发酵液上清浓缩以及脱盐，脱盐缓冲液选用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱平衡缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)。Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(GE healthcare，1.0cm×10cm)平衡液平衡后以0.5ml／min流速上样，上样完成后静置吸附4小时左右，以1ml／min流速平衡缓冲液洗杂蛋白，核酸蛋白仪检测至基线。之后采用含0～0.5M NaCl的平衡缓冲液梯度洗脱，流速为1ml／min，15％SDS-PAGE分析后，合并含目的蛋白的收集液。
Ni2+柱亲和层析(High Affinity Ni-NTA Resin，Genscript公司产品，1.8cm×2.5cm)：将阴离子柱洗脱的含目的蛋白收集液用Ni2+柱平衡液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0)透析过夜，然后上Ni2+亲和层析柱，柱体积为6ml。以0.5ml／min流速上样，然后用50mM NaH2PO4(含300mM NaCl，4mM咪唑，pH8.0)洗至基线，之后用50mM NaH2PO4(含300mM NaCI，20mM咪唑，pH8.0)进行沈脱。15％SDS-PAGE分析并收集含目的蛋白的收集液。通过15％SDS-PAGE及RP-HPLC分析(图4，图5)，结果表明，表达产物纯度达95％以上。
表达产物经过Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱及Ni2+柱亲和层析等步骤纯化后，最终产物得率为58.2mg／L，回收率为47％
实施例7表达产物活性鉴定
参考Invitrogen公司产品EnterokinaseMaxTM(EKMaxTM)活性分析方法(http:／／tools.lifetechnologies.com／content／sfs／manuals／ekmax_man.pdf)，以本实验室制备的水蛭素III-露那辛融合蛋白(HV3-Lunasin，两者间由含肠激酶酶切位点的连接肽GGGDDDDK连接)为底物，对纯化的肠激酶催化亚基EKL-His6表达产物进行切割活性分析。设立以下反应体系：每管含底物HV3-Lunasin融合蛋白20μl(浓度为1μg／μl)，然后分别加入0，0.1，0.15，0.2，0.5，1，2μl纯化的表达产物肠激酶催化亚基EKL-His6(浓度为1μg／μl)，反应缓冲液为50mMTris-HCl(pH8.0，含1mM CaCl2，0.1％Tween-20)，37℃酶切反应16hr后，采用16.5％Tricine-SDS-PAGE对酶切结果进行分析(图6)。结果显示，当酶与底物之比为1∶100时，底物即可完全切割(切割效率＞90％)。如果酶量加人，会出现非特异性切割，这与Choi(BiotechnolBioeng.，2001，75(6)：718-724)等文献报道一致。
Figure IDA0000488482180000021
Figure IDA0000488482180000031

Claims (3)

1.一种制备重组牛肠激酶催化亚基BEKL的方法，其特征是：应用人血清白蛋白(HSA)信号肽介导牛肠激酶催化亚基BEKL在毕赤酵母Pichia.pastoris中的分泌表达。
2.根据权利要求1所述的牛肠激酶催化亚基BEKL的基因工程制备方法，其特征在于：将人血清白蛋白(HSA)信号肽基因3’末端与牛肠激酶催化亚基BEKL基因5’末端进行基因融合，该融合基因克隆到醇氧化酶AOX启动子下游，在毕赤酵母中实现分泌表达，表达产物分泌到发酵培养基中。
3.根据权利要求1、2所述牛肠激酶催化亚基BEKL羧基末端添加了组氨酸标签6×His，其特征是表达产物可以通过Ni2+亲和层析进行分离纯化。
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