CN107537068A - 一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法 - Google Patents
一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法，PGS/BMSCs复合支架中BMSCs在PGS支架上的接种浓度为1×105个/cm3～1×108个/cm3。制备方法包括：将PGS多孔支架进行消毒处理，然后切成PGS支架样品，用酒精进行脱水处理，得到处理后的PGS支架置于培养板内备用；将BMSCs细胞悬浮液滴加至上述处理后的PGS支架上，然后将BMSCs培养基逐滴加入至支架培养板内，培养得到PGS/BMSCs复合支架。本发明得到的PGS/BMSCs复合支架，可显著促进损伤子宫内膜受伤组织的形态和功能的修复，在子宫内膜黏连修复领域的应用中具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于受损子宫及子宫内膜黏连恢复技术领域，特别涉及一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法。
背景技术
重复的刮宫术或子宫内膜炎会对子宫内膜造成破坏，进而引发一种常见的妇科疾病Asherman’s综合症。Asherman’s综合症通常会导致子宫内膜功能性丧失，宫腔闭合。临床表现为闭经、月经量少，不孕不育，反复性流产或胎盘前置和增生。目前子宫镜检查技术已经被应用于Asherman’s综合症治疗，但是还没有显示出一致的结果。
聚癸二酸甘油酯PGS是由癸二酸和甘油缩合而成的聚酯材料，在心脏、血管、软骨、视网膜修复等有相关的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架及其制备方法，利用可降解生物材料PGS作为载体，研究了PGS负载BMSCs在促进损伤子宫及子宫内膜黏连恢复的作用，PGS多孔支架可提供BMSCs生长、粘附以及迁移的3维结构。
本发明的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架，其中BMSCs在PGS支架上的接种浓度为1×105个/cm3～1×108个/cm3。
本发明的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，包括：
(1)将重结晶的纯化后的癸二酸和甘油按摩尔比1：0.8～1.1混合，熔融，通N2搅拌反应，然后抽真空反应，降至室温得到PGS预聚体；
(2)将NaCl颗粒平铺于四氟涂层模具内，置于恒温恒湿箱中1～3h，真空干燥得到盐模，然后将质量分数为5％～30％的PGS预聚体溶液均匀灌注在盐模上，待溶剂挥发后，真空干燥，冷却后洗掉NaCl，经冷冻干燥得到孔隙率为60％～95％的PGS多孔支架；
(3)将上述PGS多孔支架进行消毒处理，然后切成PGS支架样品，用酒精进行脱水处理，得到处理后的PGS支架置于培养板内备用；
(4)将BMSCs细胞悬浮液滴加至上述处理后的PGS支架上，然后将BMSCs培养基逐滴加入至支架培养板内，培养得到用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架。
所述步骤(1)中重结晶的次数为1～3次。
所述步骤(1)中熔融的温度为120～140℃。
所述步骤(1)中搅拌的时间为12～32h。
所述步骤(1)中抽真空反应的工艺参数为：反应温度为120～140℃，反应时间为12～48h。
所述步骤(2)中的NaCl颗粒的直径为50～500μm。
所述步骤(2)中的恒温恒湿箱的温度为30～50℃，相对湿度为60～90％。
所述步骤(2)中真空干燥的工艺参数为：在低于-0.1MPa条件下，120～180℃真空干燥12～48h。
所述步骤(3)中PGS支架样品的长1.4～1.6cm，宽0.4～0.6cm，厚度0.05～0.15cm。
所述步骤(3)中消毒处理的工艺参数为：100～150℃条件下高压蒸汽灭菌。
所述步骤(3)中的酒精的浓度为10％～100％。
所述步骤(4)中BMSCs培养基的组成为15％血清、100U/mL青霉素和链霉素。
所述步骤(4)中培养的时间为1～7d。
为了进一步验证本发明得到的PGS/BMSCs复合支架在促进损伤子宫恢复方面的应用，采用本发明得到的PGS/BMSCs复合支架进行了大鼠动物试验，通过对移植损伤子宫内BMSCs的保留情况、BMSCs的粘附增殖情况、相关生长因子表达情况、微脉血管系统再生以及接受生育能力的评估，来评价本发明得到的PGS/BMSCs复合支架修复受损子宫的情况。
有益效果
(1)本发明得到的PGS/BMSCs复合支架，可显著促进损伤子宫内膜受伤组织的形态和功能的修复，在子宫内膜黏连修复领域的应用中具有潜在的应用前景。
(2)本发明得到的PGS/BMSCs复合支架能有效用于促进损伤子宫修复，主要表现在移植至受损子宫后的PGS/BMSCs复合支架可以附着于再生的子宫内膜粘膜下层和基底膜的基础层，并能分泌bFGF、IGF-1、TGFβ1和VEGF生长因子，可诱导局部子宫内膜基质细胞的增殖同时促进血管再生以重新生成子宫内膜。再生的子宫内膜可以改善受伤部位的怀孕率和胚胎植入情况。
附图说明
图1为实施例1中PGS/BMSCs复合支架制备实验结果；其中，图1A为实施例1中PGS支架置于完全培养基示意图；图1B为实施例1中表面滴加BMSCs细胞悬浮液的PGS支架示意图；图1C为实施例1中表面滴加BMSCs细胞悬浮液的PGS支架置于BMSCs培养基示意图；图1D为不同培养时间点的(PGS+完全培养基)和(PGS+BMSCs培养基)支架内部细胞生长情况SEM图，其中黑色箭头指示的是BMSCs。
图2为实施例3中BMSCs在损伤子宫的保留时间评估结果；其中，图2A为大鼠的BMSCs图；图2B为用CM-Dil染色的BMSCs图；图2C为被慢病毒感染表达荧光素酶标记的BMSCs种植到PGS支架图；图2D为大鼠腹部切口后子宫角暴露示意图；图2E为子宫内膜损伤处理示意图；图2F为PGS/PBS或PGS/BMSCs复合支架移植入子宫损伤部位示意图；图2G为BMSCs组大鼠在不同时间点的IVIS Lumina II成像系统观测结果；图2H为PGS/BMSCs组大鼠在不同时间点的IVIS Lumina II成像系统观测结果。
图3为实施例5中5个实验组第30d和90d的子宫角HE染色结果。
图4为实施例6中5个实验组第30d和90d的子宫内膜间质细胞增殖的免疫组织化学染色结果。
图5为实施例7中5个实验组第30d和90d的新生血管检测CD34含量的表达结果。
图6为实施例8中修复后的大鼠子宫接受生育能力情况评估结果；其中，A为假手术组，B为自修复组，C为PGS/PBS组，D为BMSCs组，E、F为PGS/BMSCs组，浅色箭头指示的是植入的胚胎，深色箭头指示的是损伤过的区域。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)将重结晶2次的纯化后的癸二酸和甘油按摩尔比1：1混合，于130℃下熔融，通N2搅拌24h，然后130℃下抽真空24h，降至室温得到PGS预聚体。
(2)将直径在100μm的NaCl颗粒平铺于四氟涂层模具内，然后移入温度40℃、相对湿度75％的恒温恒湿箱中2h，随后置于真空干燥箱中150℃，低于-0.1MPa条件下干燥24h，得到盐模；将质量分数为20％的PGS预聚体溶液均匀灌注在干燥后的盐模上，待溶剂挥发后，置于真空干燥箱中150℃，低于-0.1MPa条件下干燥24h，冷却后洗掉NaCl，然后冷冻干燥得到孔隙率为90％的PGS多孔支架。
(3)将步骤(2)得到的PGS进行消毒处理，然后切成长1.5cm，宽0.5cm，厚度0.1cm的样品，用不同浓度的酒精(100％、70％、50％、30％、0％，其中0％作为对照组)进行脱水处理，得到处理后的PGS支架置于培养板内备用。
(4)将浓度为106/mL的BMSCs细胞悬浮液滴加至上述处理后的PGS支架上，使PGS支架上的细胞浓度为5×105/cm2，如图1B所示，然后将BMSCs培养基逐滴加入至支架培养板内，如图1C所示，培养7d得到PGS/BMSCs复合支架。
(5)设置平行对照实验组：将步骤(1)得到的PGS进行消毒处理，然后切成长1.5cm，宽0.5cm，厚度0.1cm的支架，用不同浓度的酒精(100％、70％、50％、30％、0％，其中0％作为对照组)进行脱水处理，并浸泡在完全培养基中，如图1A所示，培养7d。
分别对本实施例步骤(4)和步骤(5)中不同培养时间点(1d、3d、5d、7d)的支架进行电镜扫描测试，研究支架内部细胞生长情况，SEM结果如图1D所示，其中箭头指示的是BMSCs，表明通过本发明的方法，三维PGS支架可成功负载BMSCs。
实施例2
为了进一步验证本发明得到的PGS/BMSCs复合支架在促进损伤子宫恢复方面的应用，本实施例采用实施例1得到的PGS/BMSCs复合支架进行了大鼠动物试验。实验中，取125只大鼠随机分成5个实验组，包括：
①假手术组：对大鼠进行腹部切口，不对子宫做损伤处理；
②自修复组：对大鼠子宫损伤处理，不进行其它操作，让其自愈合；
③PGS/PBS组：对大鼠子宫损伤处理，并将PGS支架移植入损伤部位，对其进行修复；
④BMSCs组：对大鼠子宫损伤处理，并向损伤部位直接注射BMSCs，对其进行修复；
⑤PGS/BMSCs组：对大鼠子宫损伤处理，并将PGS/BMSCs复合支架移植入损伤部位，对其进行修复。
通过对5个实验组的移植损伤子宫内BMSCs的保留情况、BMSCs的粘附增殖情况、相关生长因子表达情况、微脉血管系统再生以及接受生育能力的评估，以评价实施例1得到的PGS/BMSCs复合支架修复受损子宫的情况。
实施例3
BMSCs在大鼠损伤子宫的保留时间评估：
大鼠的BMSCs如图2A所示；用CM-Dil染色的BMSCs如图2B所示；采用被慢病毒感染表达荧光素酶对BMSCs进行标记，然后进行实施例1步骤(4)的操作得到被标记的BMSCs种植到PGS支架上，如图2C所示，用于移植。
老鼠的子宫角损伤/再生手术在无菌室进行。其中，对大鼠腹部切口之后，子宫角被暴露出，如图2D所示；对子宫内膜进行损伤处理，如图2E所示；将PGS/PBS或PGS/BMSCs复合支架移植入子宫损伤部位，如图2F所示。
取BMSCs组和PGS/BMSCs组大鼠进行相应的试验操作，并通过IVIS Lumina II成像系统观测不同时间点(1d、3d、5d、7d)的试验结果，其中BMSCs组试验结果如图2G所示，PGS/BMSCs组试验结果如图2H所示，结果表明试验进行的第7d，PGS/BMSCs组中的BMSCs仍保留在损伤子宫内，而BMSCs组中的BMSCs已不太明显。
在BMSCs组和PGS/BMSCs组移植后两周和四周时间，分别收集大鼠新生的子宫，并进行固定和切片。用DAPI对子宫细胞核进行染色，采用共焦显微镜追踪红色标记的BMSCs，结果显示在移植后两周和四周，PGS/BMSCs组大鼠损伤子宫中的BMSCs保留情况明显好于BMSCs组，表明PGS/BMSCs复合支架可显著延长BMSCs在损伤子宫的保留时间。
实施例4
大鼠损伤子宫的BMSCs的粘附增殖情况以及相关生长因子表达情况评估：
植入4周后，通过荧光显微镜观察被染色的BMSCs细胞分布在再生子宫内膜的粘膜下层和基底层，并且一些BMSCs可以直接分化为对波形蛋白染色呈阳性的子宫内膜基质细胞。通过ELISA试剂评估受损子宫的生长因子(bFGF，IGF-1，TGFβ-1和VEGF)水平，在移植后7d，14d和21d观察到PGS/BMSCs构建体，PGS/PBS组和BMSCs组中bFGF的水平高于自发再生组。并且，在移植后7d和14d，仅在PGS/BMSCs构建体再生区域中观察到IGF-1，TGFβ-1和VEGF的水平高于自修复组。
实施例5
大鼠损伤子宫角横切面的组织学变化情况评估：
通过观察5个实验组(假手术组、自修复组、PGS/PBS组、BMSCs组、PGS/BMSCs组)的子宫角横切面，可发现其组织学变化。5个实验组第30d和90d的子宫角HE染色结果如图3所示，其中箭头指示的是修复部位(bar:200μm)；30天和90天两个时间点，子宫在粘膜下层和基底层均呈现出几个腺体，且胶原纤维沉积少，表明其子宫内膜形态正常。5个实验组的子宫内膜厚度的统计分析结果显示，30天时，PGS/BMSCs组子宫内膜厚度(418.71±143.57μm)和腺体数量均高于BMSCs组(311.01±34.54μm)，PGS/PBS组(262.22±33.72μm)和自修复组(214.28±28.46μm)。90天时，PGS/BMSCs组子宫内膜厚度(423.21±83.27μm)和腺体数量均高于BMSCs组(331.21±75.14μm)，PGS/PBS组(231.32±33.52μm)和自修复组(222.24±42.26μm)。以上结果显示PGS/BMSCs组的子宫内膜厚度和腺体数量要多于BMSCs组，自修复组以及PGS/PBS组，表明PGS/BMSCs复合支架具有较好的促进损伤子宫恢复作用，在受损子宫恢复及子宫内膜黏连治疗领域具有潜在的应用。
实施例6
大鼠损伤子宫内膜基质细胞增殖情况评估：
对5个实验组(假手术组、自修复组、PGS/PBS组、BMSCs组、PGS/BMSCs组)的子宫内膜基质细胞增殖的免疫组织进行化学染色，第30d和90d的子宫内膜基质细胞增殖的免疫组织化学染色结果如图4所示，可以观察到对波形蛋白染色呈阳性的子宫内膜基质细胞，并且PGS/BMSCs组明显多于自修复组、PGS/PBS组、BMSCs组。以上结果表明PGS/BMSCs组促进了损伤部位子宫内膜基质细胞的增殖。
实施例7
大鼠损伤子宫内膜微脉血管系统再生情况评估：
子宫内膜的新血管形成有助于上皮的再生，对恢复生育功能的起重要作用。对5个实验组(假手术组、自修复组、PGS/PBS组、BMSCs组、PGS/BMSCs组)的损伤子宫内膜新生血管的评估通过CD34(一种重要的血管内皮细胞标记物)免疫组化染色确定，结果如图5所示，第30天和90天，PGS/BMSCs组CD34的含量明显多于自修复组、PGS/PBS组、BMSCs组。以上结果表明PGS/BMSCs复合支架更能促进血管新生。
实施例8
修复后的大鼠子宫恢复生育能力情况评估：
研究5个实验组的大鼠受损子宫修复90天后的受孕情况发现PGS/BMSCs组的妊娠率为74.7％，BMSCs组为33.1％，PGS/PBS组为30.5％，自修复组为13.8％，假手术组为100％。各组胚胎植入的代表性图像如图6所示，其中A为假手术组，B为自修复组，C为PGS/PBS组，D为BMSCs组，E、F为PGS/BMSCs组，浅色箭头指示的是植入的胚胎，深色箭头指示的是损伤过的区域。结果表明：在自修复组(0/18)，PGS/PBS组(0/15)以及子宫内注射BMSCs组(0/20)，植入的胚胎只出现在正常组织中，然而在PGS/BMSCs组(10/18)，植入的胚胎不只出现在正常子宫内膜处，同时也出现在新生的子宫内膜处。
Claims (10)
1.一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架，其特征在于：所述PGS/BMSCs复合支架中BMSCs在PGS支架上的接种浓度为1×105个/cm3～1×108个/cm3。
2.一种如权利要求1所述的用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，包括：
(1)将重结晶的纯化后的癸二酸和甘油按摩尔比1：0.8～1.1混合，熔融，通N2搅拌反应，然后抽真空反应，降至室温得到PGS预聚体；
(2)将NaCl颗粒平铺于四氟涂层模具内，置于恒温恒湿箱中1～3h，真空干燥得到盐模，然后将质量分数为5％～30％的PGS预聚体溶液均匀灌注在盐模上，待溶剂挥发后，真空干燥，冷却后洗掉NaCl，经冷冻干燥得到孔隙率为60％～95％的PGS多孔支架；
(3)将上述PGS多孔支架进行消毒处理，然后切成PGS支架样品，用酒精进行脱水处理，得到处理后的PGS支架置于培养板内备用；
(4)将BMSCs细胞悬浮液滴加至上述处理后的PGS支架上，然后将BMSCs培养基逐滴加入至支架培养板内，培养得到用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架。
3.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中重结晶的次数为1～3次；熔融的温度为120～140℃；搅拌的时间为12～32h；抽真空反应的工艺参数为：反应温度为120～140℃，反应时间为12～48h。
4.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的NaCl颗粒的直径为50～500μm。
5.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的恒温恒湿箱的温度为30～50℃，相对湿度为60～90％；真空干燥的工艺参数为：在低于-0.1MPa条件下，120～180℃真空干燥12～48h。
6.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中PGS支架样品的长1.4～1.6cm，宽0.4～0.6cm，厚度0.05～0.15cm。
7.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中消毒处理的工艺参数为：100～150℃条件下蒸汽灭菌。
8.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的酒精的浓度为10％～100％。
9.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中BMSCs培养基的组成为15％血清、100U/mL青霉素和链霉素。
10.根据权利要求2所述的一种用于促进损伤子宫恢复的PGS/BMSCs复合支架的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中培养的时间为1～7d。
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