CN116510091A - 一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法，涉及临床医学治疗技术领域，该方法包括脱细胞过程和水凝胶制备过程；所述脱细胞过程包括：将新鲜卵巢采用脱细胞技术处理后得到脱细胞后的卵巢组织；所述水凝胶制备过程包括：将脱细胞后的卵巢组织依次经过酶消化、杂质萃取以及温度孵化得到卵巢脱细胞水凝胶。通过本申请的卵巢脱细胞水凝胶制备方法制得的卵巢脱细胞水凝胶，是一种新型的生物材料，有低免疫原性、含有天然的促进卵巢细胞生长的细胞因子、使用方式多样性以及有利细胞、药物和细胞因子的添加的优势。
Description
技术领域
本申请涉及临床医学治疗技术领域，具体是一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法。
背景技术
卵巢是女性极为重要的内分泌和生殖器官，疾病和多种理化因素均可能对卵巢造成严重损害。全世界每年约660万妇女确诊恶性肿瘤，其中约10％是育龄期女性，她们在接受化疗和放疗后，绝大多数患者因放化疗的性腺毒性造成卵巢早衰和生育能力丧失。这使得女性生育力保护和保存已成为生殖医学领域亟需解决的重大课题。目前，生育力保存技术包括卵母细胞冷冻、胚胎冷冻、卵巢组织冷冻等技术。由于卵巢组织冷冻不受年龄、伦理限制，已成为目前女性生育力保存技术最有潜力的技术。但因肿瘤患者癌细胞可能对卵巢组织有着不同程度的侵袭，卵巢组织自体移植可能有将肿瘤细胞传播或再种植的安全隐患。其中白血病患者即使在完全缓解后，通过流式细胞技术仍可以发现卵巢组织中残留肿瘤细胞。因此，如何安全使用恶性肿瘤患者冻存卵巢组织，正逐渐成为生育力保存研究的新热点。为解决这一难题，目前方案包括：1)卵泡体外培养方案；2)人工卵巢方案。然而卵泡体外培养仍然处于起步阶段，难于完全模仿体内环境。同时长时间的体外培养可能会干扰表观遗传机制，特别是基因组印记，存在安全隐患。很多研究人员在寻找一种更安全的替代方案将分离的腔前卵泡移植到自然环境中，即人工卵巢。人工卵巢由支持生物支架和不同发育阶段的卵泡组成。这种将完全分离的卵泡移植到卵巢支架中被认为是卵巢受累高危癌症患者的安全选择。如何构建合适的卵泡细胞支持生物支架是人工卵巢的关键。它需要满足为卵泡细胞提供支撑的同时，还会提供必要的信号和生物学环境。目前用于构建人工卵巢的生物支架材料主要包括合成材料和天然聚合物材料。
脱细胞基质材料作为近年来在构建人工器官中备受关注的新型天然聚合材料。其制备的原理是通过化学、物理、生物酶或联合的方式，去除组织或器官内的细胞及核物质，以获得组织的细胞外基质。由于脱细胞基质材料的细胞及核物质被有效去除，从而有效降低了材料的免疫原性；同时最大限度地保留了原组织或器官的宏观和微观结构以及基质功能性蛋白，有利于重新构建复杂的细胞微环境，进而促进细胞的生长、分化及功能表达，被认为是目前最理想的卵巢支架材料。但卵巢脱细胞基质材料在作为卵泡细胞生物支架构建人工卵巢时，出现了卵泡细胞接种困难、细胞局部聚集、细胞分布严重不均匀，且需要通过手术移植(原位或异位)等问题。而卵巢脱细胞基质水凝胶，很好的保留了基质内的基质蛋白和细胞因子，同时也能很好的解决材料细胞接种困难、材料内细胞分布严重不均匀以及避免手术方式移植等问题。因此，我们公开了一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法。
发明内容
本申请的目的在于提供一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。
为实现上述目的，本申请公开了以下技术方案：
一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法，包括脱细胞过程和水凝胶制备过程；
所述脱细胞过程包括：将新鲜卵巢采用脱细胞技术处理后得到脱细胞后的卵巢组织；
所述水凝胶制备过程包括：将脱细胞后的卵巢组织依次经过酶消化、杂质萃取以及温度孵化得到卵巢脱细胞水凝胶。
在一种实施方式中，所述脱细胞过程具体包括：
步骤T1：将完整的新鲜卵巢冲洗干净，然后冷冻；
步骤T2：对冷冻后的卵巢进行解冻，然后进行多孔针刺处理；
步骤T3：采用化学脱细胞试剂对多孔针刺处理后的卵巢进行浸泡处理；
步骤T4：对浸泡处理后的卵巢进行洗涤，得到脱细胞后的卵巢组织。
在一种实施方式中，所述步骤T1具体包括：用无菌PBS反复冲洗所述新鲜卵巢直至其干净，然后将冲洗干净的卵巢放入50ml试管中并于-80℃的温度下冷冻24小时。
在一种实施方式中，所述步骤T2具体包括：冷冻后卵巢在37℃的水浴中放置30分钟进行解冻，然后用针灸针对解冻后的卵巢行多孔针刺处理。
在一种实施方式中，所述步骤T3具体包括：
步骤T301：将多孔针刺处理后的卵巢用含0.5％十二烷基硫酸钠的去离子水处理2小时；
步骤T302：将经过所述步骤T301处理后的卵巢置于含1％TritonX-100的去离子水中过夜。
在一种实施方式中，所述步骤T4具体包括：
步骤T401：将所述步骤T3处理后的卵巢置于DI-H2O中充分洗涤9小时；
步骤T402：将经过所述步骤ST401处理后的卵巢置于含2％脱氧胆酸盐的去离子水中8小时；
步骤T403：将经过所述步骤T403处理后的卵巢在去离子水中洗涤6小时后得到脱细胞后的卵巢组织，其中，使用的去离子水每2小时更换一次。
在一种实施方式中，所述水凝胶制备过程具体包括：
步骤S1：将脱细胞后的卵巢组织进行酶消化，得到脱细胞组织源性细胞外基质溶液；
步骤S2：将脱细胞组织源细胞外基质溶液与10％(v/v)10倍磷酸盐缓冲盐水按10:1的比例混合；
步骤S3：将经过所述步骤S2处理后的脱细胞基质溶液转移到超滤管中，在6000g4℃条件下离心2小时，收取浓缩的脱细胞基质液；
步骤S4：对得到的浓缩的脱细胞基质液进行PH值调节，使PH值调整为7.4，得到预凝胶溶液；
步骤S5：对得到的预凝胶溶液进行孵育，得到卵巢脱细胞水凝胶。
在一种实施方式中，所述步骤S1具体包括：将脱细胞后的卵巢组织剪碎，用浓度为4mg/ml的胃蛋白酶在浓度为0.02M的中消化72小时，然后得到脱细胞组织源性细胞外基质溶液。
在一种实施方式中，在所述步骤S4中，浓缩的脱细胞基质液的PH值调节在4℃的条件下进行。
在一种实施方式中，在所述步骤S5中，将得到的预凝胶溶液在327℃的温度下孵育30分钟。
有益效果：同现有的水凝胶相比，本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶取材于天然的卵巢组织，虽然进行了细胞去除，但有效的保留了细胞外基质，这里面含有大量的卵巢细胞需要的细胞因子，而且都是按天然的比例进行搭配的，这是目前商品化水凝胶不具备的。而同脱细胞卵巢组织支架相比，本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶将脱细胞卵巢组织进一步通过酶消化、萃取、孵育所得到的水凝胶，可以进一步降低材料内的DNA含量，从而降低免疫原性。在使用方法上，传统的脱细胞卵巢组织作为材料只能是原位或者异位移植，而本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶在移植的基础上还可以通过注射的形式使用，从而实现使用形式的多样性，同时，由于水凝胶本身的特性，有利于细胞、药物及细胞因子的添加。因此本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶，能够作为一种新型的生物材料，有低免疫原性、含有天然的促进卵巢细胞生长的细胞因子、使用方式多样性以及有利细胞、药物和细胞因子的添加的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为新鲜卵巢组织图片经灰度处理后的呈现图；
图2为本申请脱细胞后卵巢组织图片经灰度处理后的呈现图；
图3为本申请脱细胞组织源性细胞外基质溶液图片经灰度处理后的呈现图；
图4为本申请浓缩的预凝胶溶液图片经灰度处理后的呈现图；
图5为本申请卵巢脱细胞水凝胶图片经灰度处理后的呈现图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本文中，术语“包括”意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
请参阅图1-5
本实施例公开了一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法，包括脱细胞过程和水凝胶制备过程。
其中，所述脱细胞过程包括：将新鲜卵巢采用脱细胞技术处理后得到脱细胞后的卵巢组织。
具体来说，所述脱细胞过程包括以下步骤：
步骤T1：将完整的新鲜卵巢冲洗干净，然后冷冻。在本实施例中，用无菌PBS反复冲洗所述新鲜卵巢直至其干净，然后将冲洗干净的卵巢放入50ml试管中并于-80℃的温度下冷冻24小时。
步骤T2：对冷冻后的卵巢进行解冻，然后进行多孔针刺处理。在本实施例中，冷冻后卵巢在37℃的水浴中放置30分钟进行解冻，然后用针灸针对解冻后的卵巢行多孔针刺处理。
步骤T3：采用化学脱细胞试剂对多孔针刺处理后的卵巢进行浸泡处理。在本实施例中，本步骤包括：步骤T301：将多孔针刺处理后的卵巢用含0.5％十二烷基硫酸钠的去离子水处理2小时；步骤T302：将经过所述步骤T301处理后的卵巢置于含1％TritonX-100的去离子水中过夜。
步骤T4：对浸泡处理后的卵巢进行洗涤，得到脱细胞后的卵巢组织。在本实施例中，本步骤包括：步骤T401：将所述步骤T3处理后的卵巢置于DI-H2O中充分洗涤9小时；步骤T402：将经过所述步骤ST401处理后的卵巢置于含2％脱氧胆酸盐的去离子水中8小时；步骤T403：将经过所述步骤T403处理后的卵巢在去离子水中洗涤6小时后得到脱细胞后的卵巢组织，其中，使用的去离子水每2小时更换一次。
需要说明的是，在脱细胞过程中，采取在室温下使用定轨振荡器以200rpm的速度进行。
其中，所述水凝胶制备过程包括：将脱细胞后的卵巢组织依次经过酶消化、杂质萃取以及温度孵化得到卵巢脱细胞水凝胶。
具体来说，所述水凝胶制备过程具体包括：
步骤S1：将脱细胞后的卵巢组织进行酶消化，得到脱细胞组织源性细胞外基质溶液。在本实施例中，将脱细胞后的卵巢组织剪碎，用浓度为4mg/ml的胃蛋白酶在浓度为0.02M的中消化72小时，然后得到脱细胞组织源性细胞外基质溶液。
步骤S2：将脱细胞组织源细胞外基质溶液与10％(v/v)10倍磷酸盐缓冲盐水按10:1的比例混合。
步骤S3：将经过所述步骤S2处理后的脱细胞基质溶液转移到超滤管中，在6000g4℃条件下离心2小时，收取浓缩的脱细胞基质液。
步骤S4：对得到的浓缩的脱细胞基质液进行PH值调节，使PH值调整为7.4，得到预凝胶溶液。在本实施例中，浓缩的脱细胞基质液的PH值调节在4℃的条件下进行。
步骤S5：对得到的预凝胶溶液进行孵育，得到卵巢脱细胞水凝胶。在本实施例中，将得到的预凝胶溶液在37℃的温度下孵育30分钟。
本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶，同现有的水凝胶相比，本申请取材于天然的卵巢组织，虽然进行了细胞去除，但保留了细胞外基质，这里面含有大量的卵巢细胞需要的细胞因子，而且都是按天然的比例进行搭配的，这是目前商品化水凝胶不具备的。而同脱细胞卵巢组织支架相比，本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶将脱细胞卵巢组织进一步通过酶消化、萃取、孵育所得到的水凝胶，可以进一步降低材料内的DNA含量，从而降低免疫原性。在使用方法上，传统的脱细胞卵巢组织作为材料只能通过原位或者异位移植，而本申请制得的卵巢脱细胞水凝胶在移植的基础上还可以通过注射的形式使用，从而实现使用形式的多样性，同时，由于水凝胶本身的特性，有利于细胞、药物及细胞因子的添加。
最后应说明的是：以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，包括脱细胞过程和水凝胶制备过程；
所述脱细胞过程包括：将新鲜卵巢采用脱细胞技术处理后得到脱细胞后的卵巢组织；
所述水凝胶制备过程包括：将脱细胞后的卵巢组织依次经过酶消化、杂质萃取以及温度孵化得到卵巢脱细胞水凝胶。
2.根据权利要求1所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述脱细胞过程具体包括：
步骤T1：将完整的新鲜卵巢冲洗干净，然后冷冻；
步骤T2：对冷冻后的卵巢进行解冻，然后进行多孔针刺处理；
步骤T3：采用化学脱细胞试剂对多孔针刺处理后的卵巢进行浸泡处理；
步骤T4：对浸泡处理后的卵巢进行洗涤，得到脱细胞后的卵巢组织。
3.根据权利要求2所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤T1具体包括：用无菌PBS反复冲洗所述新鲜卵巢直至其干净，然后将冲洗干净的卵巢放入50ml试管中并于-80℃的温度下冷冻24小时。
4.根据权利要求2所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤T2具体包括：冷冻后卵巢在37℃的水浴中放置30分钟进行解冻，然后用针灸针对解冻后的卵巢行多孔针刺处理。
5.根据权利要求2所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤T3具体包括：
步骤T301：将多孔针刺处理后的卵巢用含0.5％十二烷基硫酸钠的去离子水处理2小时；
步骤T302：将经过所述步骤T301处理后的卵巢置于含1％TritonX-100的去离子水中8小时。
6.根据权利要求2所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤T4具体包括：
步骤T401：将所述步骤T3处理后的卵巢置于DI-H2O中充分洗涤9小时；
步骤T402：将经过所述步骤ST401处理后的卵巢置于含2％脱氧胆酸盐的去离子水中8小时；
步骤T403：将经过所述步骤T403处理后的卵巢在去离子水中洗涤6小时后得到脱细胞后的卵巢组织，其中，使用的去离子水每2小时更换一次。
7.根据权利要求1所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述水凝胶制备过程具体包括：
步骤S1：将脱细胞后的卵巢组织进行酶消化，得到脱细胞组织源性细胞外基质溶液；
步骤S2：将脱细胞组织源细胞外基质溶液与10％(v/v)10倍磷酸盐缓冲盐水按10:1的比例混合；
步骤S3：将经过所述步骤S2处理后的脱细胞基质溶液转移到超滤管中，在6000g4℃条件下离心2小时，收取浓缩的脱细胞基质液；
步骤S4：对得到的浓缩的脱细胞基质液进行PH值调节，使PH值调整为7.4，得到预凝胶溶液；
步骤S5：对得到的预凝胶溶液进行孵育，得到卵巢脱细胞水凝胶。
8.根据权利要求7所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：将脱细胞后的卵巢组织剪刀剪碎，用浓度为4mg/ml的胃蛋白酶在浓度为0.02M的中消化72小时，然后得到脱细胞组织源性细胞外基质溶液。
9.根据权利要求7所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，在所述步骤S4中，浓缩的脱细胞基质液的PH值调节在4℃的条件下进行。
10.根据权利要求7所述的卵巢脱细胞水凝胶制备方法，其特征在于，在所述步骤S5中，将得到的预凝胶溶液在37℃的温度下孵育30分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310515190.XA CN116510091A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310515190.XA CN116510091A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116510091A true CN116510091A (zh) | 2023-08-01 |
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|---|---|---|---|
| CN202310515190.XA Pending CN116510091A (zh) | 2023-05-09 | 2023-05-09 | 一种卵巢脱细胞水凝胶制备方法 |
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2023
- 2023-05-09 CN CN202310515190.XA patent/CN116510091A/zh active Pending
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