CN114480283B - 一种全囊袋培养再生晶状体模型及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全囊袋培养再生晶状体模型及其构建方法与应用，属于再生晶状体模型构建技术领域。本发明提供的构建全囊袋培养再生晶状体模型的方法，包括如下步骤：将晶状体前囊膜面向上置于37℃低熔点琼脂糖凝胶中，凝胶液面没过晶状体赤道部保留前囊膜，待凝胶凝固后，在前囊膜处切口，去除晶状体纤维团块；然后将凝胶固定的晶状体全囊袋在培养基中隔天换液培养。本发明提供的晶状体再生构建方法，使用低熔点琼脂糖凝胶，可快速固定晶状体组织，减少对晶状体上皮细胞的损伤，并维持囊膜的3D球形结构，克服了现有体外晶状体培养模型多对囊膜或晶状体上皮细胞有破坏，或较难维持晶状体原球形结构的缺陷。
Description
技术领域
本发明属于再生晶状体模型构建技术领域，尤其涉及一种全囊袋培养再生晶状体模型及其构建方法与应用。
背景技术
白内障是全球首位致盲性的眼病，其唯一有效的治疗方法是通过手术摘除浑浊的晶状体并植入人工晶状体以恢复视功能。虽然人工晶状体已广泛应用于临床，但仍存在较多并发症，尤其对于婴幼儿白内障患者。因此，探索新的白内障治疗策略对临床治疗白内障具有重要的意义。目前，哺乳动物再生的晶状体达不到正常晶状体的标准，且再生机制和优化策略尚不清楚。所以，体外有效的晶状体培养系统对晶状体再生机制的研究和药物筛选是有必要的。
目前，体外研究晶状体培养模型主要有两种，一种是晶状体上皮细胞外植体培养系统，另一种是囊袋模型。晶状体上皮细胞外植体培养系统是去除了后囊膜及外周赤道部的晶状体上皮细胞(LECs)，将保留的中央前囊膜和中央前囊膜下的LECs平铺并固定于培养皿底部。该模型验证了FGF、Wnt和TGFβ家族成员等在LECs增殖、分化、细胞凋亡以及上皮-间充质细胞转化过程中的作用，但是改变了囊袋结构，不能有效模拟体内晶状体再生过程。囊袋模型是在晶状体前囊上做环形撕囊开口，摘除晶状体内容物，再将囊袋分离并转移至培养皿中，其主要用于研究后发性白内障。虽然现有技术有体外干细胞诱导类晶状体的研究，但是其尚处于培养具有正常晶状体形态、结构和功能的阶段，其主要作为白内障相关研究的体外模型。另外，现有体外晶状体培养模型多对囊膜或晶状体上皮细胞有破坏，或较难维持晶状体原球形结构。因此，建立再生晶状体模型，实现体外模拟体内晶状体再生的过程，为深入探究晶状体再生机制、优化策略以及创新药物筛选提供体外模型，具有重大意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构建全囊袋培养再生晶状体模型的方法，能够实现体外模拟体内晶状体再生的过程，减少对晶状体上皮细胞的损伤，并维持囊膜的3D球形结构。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种构建全囊袋培养再生晶状体模型的方法，包括如下步骤：将晶状体前囊膜面向上置于37℃低熔点琼脂糖凝胶中，凝胶液面没过晶状体赤道部保留前囊膜，待凝胶凝固后，在前囊膜处切口，去除晶状体纤维团块；然后将凝胶固定的晶状体全囊袋在培养基中隔天换液培养。
优选的，所述晶状体前囊膜面向上固定于培养皿的管环中。
优选的，所述低熔点琼脂糖凝胶为低熔点琼脂糖粉与PBS缓冲液的混合物，所述低熔点琼脂糖粉与PBS缓冲液的质量体积比为(0.05-0.15)g:5ml。
优选的，所述培养基包括基础培养基和bFGF，所述基础培养基包括如下组分：DMEM/F-12、1％B27、1％L-谷氨酰胺、1％双抗、1-5％FBS。
优选的，培养1-7天时的培养基包括基础培养基和1-5ng/ml bFGF。
优选的，培养8-14天的培养基包括基础培养基和100-200ng/ml bFGF。
优选的，所述培养的条件为37℃、5％CO2培养。
优选的，所述凝固的温度为4℃。
本发明还提供了一种采用上述方法构建所得的再生晶状体模型。
本发明还提供了一种上述方法或上述再生晶状体模型在研究晶状体再生机制和/或在筛选治疗晶状体疾病药物中的应用。
本发明的有益效果：
本领域现有的体外晶状体培养模型，主要用于研究后发性白内障，并无晶状体再生相关报道。本发明首次提供了一种构建全囊袋培养再生晶状体模型的方法，使用低熔点琼脂糖凝胶，其在37℃可维持液态，4℃2min即可快速固定晶状体组织，减少对晶状体上皮细胞的损伤，并维持囊膜的3D球形结构，克服了现有体外晶状体培养模型多对囊膜或晶状体上皮细胞有破坏，或较难维持晶状体原球形结构的技术缺陷。另外，采用本发明方法能够实现以体外模型晶状体上皮细胞增殖、迁移和分化的形式模拟了体内晶状体的再生过程，为深入探究晶状体再生机制、优化策略以及创新药物筛选提供体外模型，具有重大意义。
附图说明
图1为小鼠体外全囊袋培养晶状体再生模式流程图，具体为取下小鼠晶状体，用低熔点琼脂糖凝胶固定，去除晶状体纤维团块，培养晶状体囊袋，进行体外晶状体再生；
图2为小鼠体外全囊袋培养晶状体再生的观察以及相关基因表达图，其中A左侧第一列图显示了晶状体再生的模式，左侧第二列和第三列展示在第1、7和14天显示用显微镜观察培养的再生晶状体组织；第四列和第五列分别展示了再生晶状体的赤道部和底部晶状体纤维细胞早期标记物β-crystallin的表达；B为体外培养14天时，qRT-PCR检测显示晶状体上皮细胞相关(pax6、foxe3、cryaa、cryab)和晶状体纤维细胞相关基因(prox1、crybb1、crybb2、cryba2、crygc、crygd、mip、bfsp1、bfsp2、lgsn)的表达水平均较第1天时的变化，其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
本发明提供了一种构建全囊袋培养再生晶状体模型的方法，包括如下步骤：将晶状体前囊膜面向上置于37℃低熔点琼脂糖凝胶中，凝胶液面没过晶状体赤道部保留前囊膜，待凝胶凝固后，在前囊膜处切口，去除晶状体纤维团块；然后将凝胶固定的晶状体全囊袋在培养基中隔天换液培养。
本发明对于晶状体的来源没有特殊限定，可取自任意种类的动物，在本发明具体实施例中，取自于小鼠。本发明对于晶状体的获取方法没有特殊限定，采用本领域常规获取晶状体的方法均可，只需确保获得的晶状体为单一的晶状体组织，不含有其他混杂组织即可。
在本发明中，所述晶状体前囊膜面向上优选的固定于培养皿的管环中。所述管环优选的为吸管经剪制而成的管环，本发明对于吸管的具体规格没有特殊限定，依据晶状体大小自行选择即可。在本发明中，所述管环的作用是盛装低熔点琼脂糖凝胶以固定晶状体，即将管环放于培养皿中，再将晶状体前囊膜面向上放于管环中，然后缓慢滴加低熔点琼脂糖凝胶，进行晶状体的固定。固定时，采用37℃低熔点琼脂糖凝胶进行固定，所述低熔点琼脂糖凝胶优选的为低熔点琼脂糖粉与PBS缓冲液的混合物，所述低熔点琼脂糖粉与PBS缓冲液的质量体积比优选为(0.05-0.15)g:5ml，更优选为(0.08-0.12)g:5ml。本发明对于低熔点琼脂糖凝胶的具体制备方法没有特殊限定，采用本领域常规制备方法均可。本发明对于低熔点琼脂糖粉的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。将配制所得的低熔点琼脂糖凝胶37℃保温，向所述管环中加入37℃低熔点琼脂糖凝胶时，优选的要缓慢加入避免出现气泡，待凝胶液面没过晶状体赤道部时，停止添加，然后优选的在4℃条件下使凝胶凝固，能够快速固定晶状体组织，减少对晶状体上皮细胞的损伤，并维持囊膜的3D球形结构。
在本发明中，待晶状体固定后，需在前囊膜处做切口，去除晶状体纤维团块。本发明对于切口的大小没有特殊限定，视晶状体具体情况而定。本发明对于去除晶状体纤维团块的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规去除晶状体纤维团块的方法均可，在本发明具体实施例中，优选的切口是十字形切口，采用冲洗针头完全分离出晶状体纤维团块，再轻轻冲洗残留在赤道部的纤维组织。
待完成体外囊袋的固定以及分离后，进行培养。在本发明中，所述培养的条件优选为37℃、5％CO2培养，所述培养用的培养基优选的包括基础培养基和bFGF，所述基础培养基优选的包括如下组分：DMEM/F-12、1％B27、1％L-谷氨酰胺、1％双抗、1-5％FBS。在培养皿中加入培养基时，优选的液面需没过培养皿中的管环。在培养时，优选的需隔天换液，第1天到第7天培养时，所用的培养基优选的包括基础培养基和1-5ng/ml bFGF，更优选的包括基础培养基和2-4ng/ml bFGF，第8天到第14天培养时，所用的培养基优选的包括基础培养基和100-200ng/ml bFGF，更优选的包括基础培养基和120-180ng/ml bFGF。本发明对于培养基中各组分的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
本发明还提供了一种采用上述方法构建所得的再生晶状体模型。
本发明还提供了一种上述方法或上述再生晶状体模型在研究晶状体再生机制和/或在筛选治疗晶状体疾病药物中的应用。
本发明对于晶状体疾病的具体种类没有特殊限定，包括但不限于白内障和晶状体先天畸形。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
雄性C57BL/6小鼠(年龄，5周，体重，14-20g)购自北京维通利华生物有限公司。将小鼠饲养在山东眼科研究所动物房的无病原体环境中。
小鼠断颈处死后，将眼球取出放于1.5ml EP管(含双抗的PBS)中置于冰盒内，酒精消毒后在超净台内的再次使用含双抗的PBS清洗眼球两次。在体式显微镜下，用眼科剪沿角膜缘剪开角膜，在显微齿镊的帮助下分离虹膜，离断悬韧带，取出晶状体前，用眼科剪在前囊膜上剪一小开口以标记前囊膜。取晶状体时，避免周围混杂的组织。取出晶状体后再次在PBS中漂洗2遍，以尽可能去除周围组织，保证单一的晶状体组织。
低熔点琼脂糖凝胶的制备：称取0.10g低熔点琼脂糖粉加入到已高温加热消毒后的5ml PBS中，混匀后继续高温煮沸30min，以完全溶解琼脂，另一方面可达到消毒的目的。煮沸完成后，设置水浴锅保温37℃以备用。
自制管环的准备：将剪刀、3ml吸管、35mm培养皿、医用纱布等物品放置在超净台内，紫外线照射30min以上消毒，用剪刀将吸管的尾部剪下，将尾部剪成2-3mm厚度的管环。将管环放在培养皿中，每个培养皿可以放置4个管环，继续紫外线照射20min。
将清洗后的晶状体组织放置于管环中，晶状体前囊膜面向上，缓慢加入37℃低熔点琼脂糖凝胶，凝胶液面没过晶状体赤道部保留前囊膜，避免出现气泡，放于4℃冰箱中2min，使液态胶凝固以固定晶状体。使用眼科剪在前囊膜中央做十字型切口(约0.8mm)，用冲洗针头完全分离出晶状体纤维团块，轻轻冲洗残留在赤道部的纤维组织。在培养皿中加入培养基，液面没过管环，将培养皿放到37℃5％CO2培养箱中培养，隔天换液，培养14天即得再生晶状体。培养基由基础培养基和bFGF组成，在第1天至第7天，培养基为在基础培养基的基础上添加bFGF 1ng/ml；在第8天至第14天，培养基为在基础培养基的基础上添加bFGF150ng/ml，其中基础培养基由DMEM/F-12、1％B27、1％L-谷氨酰胺、1％双抗、1％FBS组成。上述构建全囊袋培养再生晶状体模型方法的流程图如图1所示。
实施例2
与实施例1的区别在于制备低熔点琼脂糖凝胶时，低熔点琼脂糖粉的用量为0.05g，培养时，第1天至第7天，培养基为在基础培养基的基础上添加bFGF 5ng/ml；在第8天至第14天，培养基为在基础培养基的基础上添加bFGF 200ng/ml，其中基础培养基由DMEM/F-12、1％B27、1％L-谷氨酰胺、1％双抗、5％FBS组成，其余均同实施例1。培养14天即得再生晶状体。
实施例3
与实施例1的区别在于制备低熔点琼脂糖凝胶时，低熔点琼脂糖粉的用量为0.15g，培养时，第1天至第7天，培养基为在基础培养基的基础上添加bFGF 3ng/ml；在第8天至第14天，培养基为在基础培养基的基础上添加bFGF 150ng/ml，其中基础培养基由DMEM/F-12、1％B27、1％L-谷氨酰胺、1％双抗、5％FBS组成，其余均同实施例1。培养14天即得再生晶状体。
实施例4
在实施例1培养第1天、第7天和第14天对再生晶状体组织进行显微镜观察并拍照记录，qRT-PCR检测晶状体相关基因pax6、prox1、foxe3、cryaa、cryab、crybb1、crybb2、cryba2、crygc、crygd、mip、bfsp1、bfsp2、lgsn的表达情况，免疫荧光检测晶状体纤维细胞早期标记物(β-crystallin)的表达。结果如图2所示。
由图2可以看出，采用本发明方法培养结束后，晶状体上皮细胞相关(pax6、foxe3、cryaa、cryab)和晶状体纤维细胞相关基因(prox1、crybb1、crybb2、cryba2、crygc、crygd、mip、bfsp1、bfsp2、lgsn)的表达水平均较第1天时均显著增加，本发明方法能够实现以体外模型晶状体上皮细胞增殖、迁移和分化的形式模拟体内早期晶状体再生过程。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种构建全囊袋培养再生晶状体模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：将晶状体前囊膜面向上置于37℃低熔点琼脂糖凝胶中，凝胶液面没过晶状体赤道部保留前囊膜，待凝胶凝固后，在前囊膜处切口，去除晶状体纤维团块；然后将凝胶固定的晶状体全囊袋在培养基中隔天换液培养；
所述晶状体前囊膜面向上固定于培养皿的管环中；
所述低熔点琼脂糖凝胶为低熔点琼脂糖粉与PBS缓冲液的混合物，所述低熔点琼脂糖粉与PBS缓冲液的质量体积比为(0.05-0.15)g:5ml；
所述培养基由基础培养基和bFGF组成；
培养1-7天时的培养基由基础培养基和1-5ng/mlbFGF组成；
培养8-14天的培养基由基础培养基和100-200ng/ml bFGF组成；
所述基础培养基由如下组分组成：DMEM/F-12、1％B27、1％L-谷氨酰胺、1％双抗、1-5％FBS。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃、5％CO2培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝固的温度为4℃。
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| 大鼠晶状体再生模型中干细胞样细胞及其相关信号通路的实验研究;张辉;中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑(第08期);摘要，第2页第2段，第3页第2段 * |
| 建立晶状体再生系统的实验研究;刘奕志;科技成果;成果简介部分 * |
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