CN113425915A - 一种抗凝材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗凝材料及其制备方法。将动物组织脱细胞处理后，冻干、粉碎、胃蛋白酶进一步消化，之后使用特定浓度PBS处理，后处理得到抗凝材料。本发明一些实例的抗凝材料，具有良好的生物相容性和抗凝性能，制备工艺更为简单，成本低。本发明一些实例的制备方法，不需要进行交联处理，操作简便，成功率高，用时短。

Description

一种抗凝材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用材料，具体涉及一种抗凝材料及其制备方法和应用。

背景技术

与血液直接接触的移植材料，一般需要进行抗凝处理，避免形成血栓危及生命。现有的抗凝材料，普遍都是在基础材料上修饰上肝素或者类肝素成分，类肝素成分包含常见的有合成肝素低聚糖衍生物、多硫酸非肝素寡糖及其衍生物、硫酸化的非肝素多糖等；也有将材料与血液接触的面做成超排斥表面，排除血液中带电荷的血细胞；少数研究者将其他抗凝剂比如阿加曲班加入材料或者将材料做成仿内皮功能的材料。

抗凝材料用的多的地方是血管移植物 ，但血管移植物对力学性能也有所要求，优秀的力学性能能避免血压导致的血管破裂，薄膜类可以作为制备血管移植材料的选项，但是抗凝新性能和力学性能很难同时满足，且抗凝这块就要么是药物控制，要么是修饰抗凝剂。现有的抗凝修饰方法相对复杂，成本较高。

去细胞支架直接来源于机体组织，机体器官或组织取下来之后，经过洗涤剂等处理之后，去除细胞，剩余的支架又称去细胞支架，主要保留着细胞外基质的三维结构和活性蛋白成分，为细胞粘附、增殖、迁移提供了很好的微环境，因此，被研究者大量用于再生领域的研究，其最大的优势就是促再生性能和生物相容性，而在去细胞支架的基础上，通过一些化学或物理处理，强化或者支架材料的力学性能，保留其本身优秀的促再生能力，能扩大其应用场景。

将脱细胞基质应用于抗凝材料的案例较少，Qiu等人将聚四氟乙烯芯棒植入大鼠腹壁皮下，在一定时间点之后取出，移植物外层形成的管状结缔组织包裹中抽离出聚四氟乙烯芯轴，形成的纤维导管进行在洗涤剂中脱细胞处理，并化学修饰上肝素抗凝，植入大鼠体内，移植物发生细胞重塑。Mahara等人从非洲黑鸵鸟中分离出颈动脉，脱细胞处理之后，将去细胞颈动脉进行整合素a4b1配体肽(REDV)的修饰，以提高内皮细胞结合的亲和力，加速内皮化，对血管长期的通畅和抗凝有利，具体方法为将去细胞颈动脉浸泡在浓度10μM的肽的盐溶液中，60℃孵育1h。现有方法还是离不了抗凝剂，制备相对复杂，成本高昂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种新型的抗凝材料及其制备方法及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种抗凝材料，其制备方法包括如下步骤：

S1) 取动物组织，进行脱细胞处理；

S2) 将脱细胞处理后的动物组织清洗干净，冻干后粉碎，得组织粉；

S3) 将组织粉加入溶液中，加入胃蛋白酶消化处理8～36 h；

S4) 消化处理完成后，中止酶解反应，得消化液；

S5) 在消化液中加入磷酸盐缓冲液，使消化液中磷酸盐缓冲液的浓度不低于0.024 M，后处理得到抗凝材料。

在一些实例中，抗凝材料为抗凝薄膜。

在一些实例中，所述动物组织为富含胶原蛋白的动物组织。富含胶原蛋白的动物组织在处理后往往具有更好的机械性能，同时其来源也较为丰富同时易于处理，是更佳的选择。

在一些实例中，所述动物组织为皮肤、肌腱和软骨中的至少一种。这些组织富含胶原蛋白，可以带来更好的机械性能，满足使用的需要。

在一些实例中，所述动物选自猪、兔、鱼等生物。动物可以根据具体的需要和获得的难易程度进行相应的选择。

在一些实例中，脱细胞处理的方法选自物理法、化学法、酶法及其结合。

在一些实例中，加入磷酸盐缓冲液前，调节消化液的pH为7～8，优选为7.2～7.4。这种pH更接近使用条件。

在一些实例中，组织粉在溶液的浓度为1～20mg/mL。组织粉的浓度可以根据需要进行相应的调整。

在一些实例中，磷酸盐缓冲液处理的时间为0～30 min。

在一些实例中，消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0.024～0.04 M 。

在一些实例中，所述后处理包括清洗、干燥、成型。

在一些实例中，所述脱细胞处理的操作包括：将动物组织切块之后，PBS清洗3次，每次5min；然后转移至2% triton X-100溶液搅拌24h，每12h换一次新的液体；之后转移至用浓度0.1mol的NaCl溶液的配制0.1% SDS溶液，搅拌48h，每12h更换一次新的液体；最后用ddH₂O清洗24h，每8h换一次新的液体，得到脱细胞组织。

本发明的有益效果是：

本发明一些实例的抗凝材料，具有良好的生物相容性和抗凝性能，制备工艺更为简单，成本低。

本发明一些实例的制备方法，不需要进行交联处理，操作简便，成功率高，用时短。

附图说明

图1是不同脱细胞方法制备的抗凝材料的体外凝血试验；

图2是抗凝材料用于大鼠股动脉出血模型的试验；

图3是不同浓度的PBS的抗凝材料的凝血性能试验。

具体实施方式

脱细胞组织和器官的制备包括从组织或器官中移除细胞和遗传物质，保留复杂的超微结构的细胞外基质(ECM)作为天然支架。目前在去细胞化中应用的技术有物理、化学和生物酶法，这些方法各有优缺点。在脱细胞过程中要满足的两个重要标准是:(i)保留原生结构和(ii)去除最大限度的细胞成分。脱细胞剂的选择取决于组织或器官的性质。本发明对脱细胞的方法没有特别的要求，可以使用现有的脱细胞方法进行，可用的脱细胞方法包括但不限于物理方法包括冻融、直接压力、电穿孔、超声和搅拌；化学方法主要是各种化学试剂，包括酸碱处理（醋酸、过氧乙酸等）、非离子去污剂（Triton X-100）、离子去污剂（SDS、SDC）、两性离子洗涤剂（CHAPS）、三(正丁基)磷酸(TBP)、低渗高渗处理（NaCl）、螯合剂（EDTA）等；生物酶法包括胰蛋白酶、核酸酶、胶原酶、分散酶、磷脂酶等。通常会选用几种方法相结合的方式，一般是物理化学相结合，也有物理、化学和酶三者结合。比如机械搅拌和超声波与化学处理同时被用来帮助细胞裂解和清除细胞碎片。机械搅拌可以通过使用磁力搅拌板，轨道振动筛，或低轮廓辊等应用。在所有这些程序中，最佳速度、试剂的体积和机械搅拌的时间取决于组织的组成、体积和密度。一般再去细胞之后还会使用抗生素避免细菌污染。然而，由于组织的来源，组成和密度等都不同，所以脱细胞方法需要根据不同组织类型进行优化。

脱细胞处理的方法优选搅拌法和化学法，浸泡和搅拌的时间，搅拌强度，洗涤剂浓度取决于组织的厚度和密度，薄的组织比如膀胱，小肠粘膜下层或者切薄的器官可以选择相对短的时间（24～48h）；而对于比较致密的组织（皮肤、肌腱等）可以调整到（48～84h）。

蛋白酶的用量，可以根据组织粉的用量和预期的消化时间进行确定，以可以充分消化为准。为了避免残留蛋白酶带来不利影响，优选使用免疫原性较弱的蛋白酶。

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

以下实例中，如无特别说明，脱细胞处理的操作包括：

将动物组织切块之后，PBS清洗3次，每次5min；然后转移至2% triton X-100溶液搅拌24h，每12h换一次新的液体；之后转移至用浓度0.1mol的NaCl溶液的配制0.1% SDS溶液，搅拌48h，每12h更换一次新的液体；最后用ddH₂O清洗24h，每8h换一次新的液体，得到脱细胞组织。

实施例1：不同组织对抗凝材料的影响

分别采用猪皮、猪肌腱、猪软骨、兔皮、兔肌腱、鱼皮进行脱细胞处理并制备得到抗凝材料。

S1) 脱细胞处理后，清洗干净，冻干后粉碎，得组织粉；

S2) 将组织粉加入溶液中，加入胃蛋白酶消化处理8～36 h(鱼皮8h，兔皮12h，猪皮24h，肌腱36 h)；消化完成后，调节pH至7.2～7.4；

S3) 之后在消化液中加入磷酸盐缓冲液PBS，使消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0.025 M，处理时间为15min；

S4) PBS处理后，烘干、溶胀，再次烘干、溶胀，反复3次，制备成为抗凝薄膜材料。

抗凝材料示例性的制备方法包括：

PBS处理完成后的脱细胞组织，清洗完成后3500rpm离心3min，倒入方形模具，37℃烘箱烘干24h预成型；

取出预成型的薄膜，于0.025 M 的PBS溶液中溶胀3h, 取出薄膜，37℃烘箱继续干燥8h. 反复烘干溶胀3次，得到抗凝薄膜材料。

使用前，使用制备时相同终浓度的PBS溶液溶胀平衡处理即可。

实施例2：不同脱细胞方法对抗凝材料的影响

分别使用冻融法、化学法(同实施例1)和生物酶法对猪皮进行脱细胞处理，之后按相同的方法(同实施例1)制备得到抗凝薄膜材料。

图1为不同脱细胞方法制备的抗凝材料的体外凝血测试，血液放置7天，几种方法制备的抗凝材料都没有使血液凝固，具备优异的抗凝性能。

结果显示不同脱细胞方法制备的抗凝薄膜材料抗凝性能区别并不大。

图2为将抗凝材料用在大鼠股动脉出血模型中，检测抗凝材料的抗凝性能。

结果显示，抗凝材料显著的延长了股动脉出血的时间，同时显著增加了股动脉出血量，说明抗凝材料具备非常优异的抗凝性能。

实施例3：不同PBS浓度对抗凝材料凝血时间的影响

按实施例1的方法，分别使用不同深度的PBS溶液处理猪皮脱细胞组织，测试其抗凝的效果。

实验结果(图3)显示，抗凝材料中的PBS浓度从0.006 M开始，血液凝固的时间大于对照组（不加任何材料血液自己凝固的时间）, 随着PBS浓度的增加，凝固时间加长 ，当材料中PBS的浓度达到0.025 M 时，血液不凝固。 (图3，图中，纵坐标为体外凝血时间，横坐标Control为不加任何材料的血液凝固的时间，其余为抗凝薄膜材料中PBS的终浓度)。

实施例4：抗凝薄膜拉伸性能的检测

取实施例1制备得到的抗凝薄膜材料（厚度0.05mm, 宽5mm的长条），进行拉伸试验，胶原蛋白含量丰富的组织制备的抗凝薄膜力学性能更好一点（比如猪皮），但是抗凝效果没有显著差别。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗凝材料，其制备方法包括如下步骤：

S1)取动物组织，进行脱细胞处理；

S2)将脱细胞处理后的动物组织清洗干净，冻干后粉碎，得组织粉；

S3)将组织粉加入溶液中，加入胃蛋白酶消化处理8～36 h；

S4)消化处理完成后，中止酶解反应，得消化液；

S5)在消化液中加入磷酸盐缓冲液，使消化液中磷酸盐缓冲液的浓度不低于0.024 M，后处理得到抗凝材料。

2.根据权利要求1所述的抗凝材料，其特征在于：脱细胞处理的方法选自物理法、化学法、酶法及其结合。

3.根据权利要求1所述的抗凝材料，其特征在于：加入磷酸盐缓冲液前，调节消化液的pH为7～8。

4.根据权利要求1～3任一项所述的抗凝材料，其特征在于：组织粉在溶液的浓度为1～20mg/mL。

5.根据权利要求1～3任一项所述的抗凝材料，其特征在于：磷酸盐缓冲液处理的时间为0～30 min。

6.根据权利要求1～3任一项所述的抗凝材料，其特征在于：消化液中磷酸盐缓冲液的浓度为0.024～0.04 M。

7.根据权利要求1～3任一项所述的抗凝材料，其特征在于：所述动物组织为富含胶原蛋白的动物组织。

8.根据权利要求7所述的抗凝材料，其特征在于：所述动物组织为皮肤、肌腱和软骨中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的抗凝材料，其特征在于：所述后处理包括清洗、干燥、成型。

10.根据权利要求1所述的抗凝材料，其特征在于：所述脱细胞处理的操作包括：

将动物组织切块之后，PBS清洗3次，每次5min；然后转移至2% triton X-100溶液搅拌24h，每12h换一次新的液体；之后转移至用浓度0.1mol的NaCl溶液的配制0.1% SDS溶液，搅拌48h，每12h更换一次新的液体；最后用ddH₂O清洗24h，每8h换一次新的液体，得到脱细胞组织。

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