CN113171493A - 生物补片及其制备方法 - Google Patents

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CN113171493A CN202110378091.2A CN202110378091A CN113171493A CN 113171493 A CN113171493 A CN 113171493A CN 202110378091 A CN202110378091 A CN 202110378091A CN 113171493 A CN113171493 A CN 113171493A
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黄敬香
李�浩
杨振
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Abstract

本申请公开了生物补片及其制备方法。制备方法包括：提供离体的脐带；预处理脐带，以去除脐带中包含的脐血和脐血管；将预处理后的脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带；将脱细胞脐带和诱导剂溶液进行交联反应，获得复合支架，其中，诱导剂溶液为能够将间质干细胞分化成软骨细胞的溶液；将复合支架依次经清洗和冷冻处理，获得生物补片。其修复肩袖损伤的效果较好。

Description

生物补片及其制备方法
技术领域
本申请属于生物材料技术领域，具体涉及生物补片及其制备方法。
背景技术
肩袖损伤是肩部疼痛及功能障碍的主要原因，并且由于肩袖肌腱及键骨结构的独特性，肩袖损伤后一般难以自我愈合。
随着组织工程技术的发展，越来越多的研究发现生物材料可以促进肩袖肌腱再生以及键骨愈合。生物材料尤其是细胞外基质材料，具有良好的生物相容性，并可以作为种子细胞和生物信号分子的载体，对肩袖损伤的再生修复具有重要的作用。但是细胞外基质材料的再生修复的效果较差，修复效果仍有待提高。
发明内容
本申请实施例提供了一种生物补片及其制备方法，旨在解决细胞外基质材料再生修复肩袖损伤的效果较差的问题。
第一方面，本申请实施例提供一种生物补片，其包括：提供离体的脐带；预处理脐带，以去除脐带中包含的脐血和脐血管；将预处理后的脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带；将脱细胞脐带和诱导剂溶液进行交联反应，获得复合支架，其中，诱导剂溶液为能够将间质干细胞分化成软骨细胞的溶液；将复合支架依次经清洗和冷冻处理，获得生物补片。
根据本申请第一方面的实施例，将脱细胞脐带和诱导剂溶液进行交联反应，包括：将脱细胞脐带和诱导剂溶液加入交联剂中，于环境温度下，交联反应20h～36h；其中，以脱细胞脐带的干重100mg为基准，诱导剂溶液的体积份数为100～500μL。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，诱导剂溶液的浓度为10μg/mL～100μg/mL。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，诱导剂溶液为2-([1，1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的溶液。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，将预处理后的脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带，包括：将预处理后的脐带依次经冷冻、融化处理；并且至少重复一次冷冻、融化处理的步骤。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，将预处理后的脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带，包括：于振荡条件下，将预处理后的脐带酶解 10h～15h、细胞通透处理10h～15h；然后振荡洗涤3～5次，每次4h～6h。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，将预处理后的脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带之后，还包括：冷冻处理脱细胞脐带。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，将复合支架依次经清洗和冷冻处理，包括：将复合支架清洗后放置于冷冻盘中冷冻处理，其中，复合支架的沃顿胶组织与冷冻盘贴合，复合支架的脐带外膜与冷冻盘之间具有间隙，复合支架的冷冻速率小于冷冻盘的冷冻速率。
根据本申请第一方面的前述任一实施例，提供离体的脐带中，脐带的来源为人体、猪、牛、兔或羊。
本申请第二方面提供一种生物补片，其是通过本申请第一方面的制备方法制得的。
根据本申请实施例的制备方法，采用预处理、脱细胞处理、交联反应和清洗、冷冻处理，将脐带和诱导剂交联复合，脐带中的氨基基团和诱导剂中的羧基基团交联复合，冷冻处理后形成的生物补片包含诱导剂。生物补片保留了脐带的脐带外膜以保证良好的生物力学性能和Wharton’s jelly 组织天然的三维空隙结构，并且保留了二者天然紧密连接的构象结构。并且，在将生物补片植入体内时，生物补片可以释放诱导剂，可以促进细胞分化，提高肩袖修复的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。
图1为人脐带组织图片；
图2为脐带的Wharton’s jelly组织的DAPI染色图；
图3为脐带的Wharton’s jelly组织的DNA的含量示意图；
图4为脐带的Wharton’s jelly组织的GAG的含量示意图；
图5为脐带的Wharton’s jelly组织的胶原的含量示意图；
图6为脐带的Wharton’s jelly组织的拉伸弹性模量示意图；
图7为脐带Wharton’s jelly脱细胞组织的扫描电镜图；
图8为生物补片大体观；
图9为生物补片荧光图；
图10为不同补片促进间充质干细胞迁移情况的比较图；
图11为不同补片诱导间充质干细胞成软骨分化的比较图；
图12为不同补片培养兔肩袖腱骨愈合的实验研究图片。
具体实施方式
为了使本申请的申请目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“一种或多种”中“多种”的含义是两个以上。
本申请的上述申请内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
组织工程学是综合应用工程学和生命科学的原理与技术，在根据组织工程学修复组织的技术中，可以在体外预先构建一个有生物活性的组织种植体(如组织工程脐带支架)，然后植入体内，达到修复组织缺损和重建组织功能的目的。
为了推动将组织工程支架应用于临床组织损伤(如肩袖损伤)的治疗，本申请人进行了大量的研究，发现脐带等胎源性的生物组织，富含透明质酸和胶原蛋白以及多种细胞因子，可以促进组织再生，对疤痕的形成也有抑制作用。脐带支架可以为细胞生长提供天然的仿生微环境，并且有利于维持细胞固有形态和功能，促使种子细胞的粘附、增值和分化，因此其在组织修复和再生中起到关键作用。
然而，现有的胎源性的生物组织的处理手段为，将胎源性的生物组织打碎匀浆、冷冻干燥、化学交联形成组织支架。但是此手段制得的组织支架的力学性能较差，不具备可缝合性，不适合作为肩袖再生支架。
另外，保留胎源性的生物组织例如脐带的原有形态，将其脱细胞处理为脐带支架，虽然具有良好的组织工程再生功能，但是纤维软骨再生修复能力相对有限，仍然达不到良好的肩袖修复的效果。
申请人基于上述发现的问题，将脐带中的沃顿胶Wharton’s jelly组织和诱导剂交联复合，脐带支架与诱导剂共价接枝，在将脐带支架植入体内后，脐带支架中的诱导剂释放，可以进一步促进肩袖键骨愈合。
因此，本申请第一方面的实施例提供一种生物补片的制备方法，该方法包括：
S100，提供离体的脐带；
S200，预处理脐带，以去除脐带中包含的脐血和脐血管；
S300，将预处理后的脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带；
S400，将脱细胞脐带和诱导剂溶液进行交联反应，获得复合支架，其中，诱导剂溶液为能够将间质干细胞分化成软骨细胞的溶液；
S500，将复合支架依次经清洗和冷冻处理，获得生物补片。
根据本申请实施例的制备方法，采用预处理、脱细胞处理、交联反应和清洗、冷冻处理，将脐带和诱导剂交联复合，脐带中的氨基基团和诱导剂中的羧基基团交联复合，冷冻处理后形成的生物补片包含诱导剂。生物补片保留了脐带的脐带外膜以保证良好的生物力学性能和Wharton’s jelly 组织天然的三维空隙结构，并且保留了二者天然紧密连接的构象结构。并且，在将生物补片植入体内时，生物补片可以释放诱导剂，可以促进细胞分化，提高肩袖修复的效果。
在步骤S100中，离体指的是脱离生物体，脐带可以是新鲜的脐带。脐带由两条动脉、一条静脉、脐带外膜和黏液样结缔组织围绕的基质沃顿胶 Wharton’s jelly组成。脐带组织含有丰富的透明质酸和胶原，与肩袖组织的构成类似。可以为细胞生长提供天然的仿生微环境。
脐带的来源可以是人脐带、猪脐带、牛脐带、兔脐带和羊脐带等。优选为人脐带，人脐带作为生物补片的来源，其组织结构和肩袖组织的结构相似性更高；并且其产生免疫反应的可能性更低。
在步骤S200中，以生物组织为脐带进行说明；预处理过程包括：洗涤脐带，以去除脐带中的脐血；剥离脐带中的脐血管，保留脐带的脐带外膜和Wharton’s jelly组织；然后将剥离后的脐带修剪为片状。
在一些实施例中，片状的脐带的长度可以为2mm～4mm。脐带在保留自身结构的基础上，具有较小的体积，便于植入体内。
图1为人脐带组织图片，如图1所示，图1A为新鲜的脐带图片，图1B为预处理后的脐带。作为具体的示例，步骤S200可以包括：
S210，将脐带剪成约2～4cm的长段，使用无菌水、磷酸盐缓冲液PBS 和抗凝血剂中的至少一种反复清洗脐带，去除脐带中的血污。其中，抗凝血剂可以为0.9％的无菌肝素钠-生理盐水，具体配置方法为：于生理盐水中加入肝素钠配置成10～100u/ml的肝素钠溶液。在本文中，术语“无菌”指的是达到医学上的无菌要求。
S220，将脐带纵向剖开，剥离脐带中脐血管，将剩余组织铺平修剪整形为片状。可以理解的是，脐带中的脐血管包含静脉和动脉，将脐血管剥离后，脐带剩余组织为脐带外膜和Wharton’s jelly组织，剩余组织和肩袖组织的组成相似，有利于肩袖组织的修复。
在步骤S300中，将天然的脐带组织进行脱细胞处理后获得天然的无细胞基质，以无细胞基质制作天然的脱细胞支架。在保留了基质的弹性蛋白和胶原蛋白的同时，可明显降低组织的免疫原性，不引起脱细胞基质结构和功能的变化。脱细胞处理可以采用物理和/或化学手段处理。例如，物理手段可采用反复冻融、超声破碎等。又例如，化学手段可采用酶消化、去污剂法等。当然，脱细胞处理可以是上述举例中的任一种，也可以是任意两种以上方法的联合使用。
在一些实施例中，可采用反复冻融的方法脱除细胞，将细胞溶胀破碎，并且可以保留较完整的脐带的细胞外基质。
作为具体的示例，步骤S300可以包括：
S310，使用无菌水或PBS溶液洗涤修剪整齐的脐带，每次洗涤 5～10min。洗涤方便后续脱细胞处理。
S320，在周围温度为-75℃～-85℃下，将脐带冷冻1h～1.5h；再将冷冻后的脐带自然融化。重复上述冰冻、融化的步骤至少一次。可选地，将脐带反复冷冻、融化3～5次。反复冷冻、融化可以加深细胞溶胀破碎的程度。
在另一些实施例中，可采用酶消化法处理脐带，脱细胞速率较高。例如可以采用胰酶和细胞通透剂联合处理。
作为具体的示例，步骤S300可以包括：
S330，使用无菌水或PBS溶液洗涤修剪整齐的脐带，每次洗涤 5～10min。洗涤方便后续脱细胞处理。
S340，于振荡条件下，使用胰酶混合物酶解脐带10h～15h。其中，胰酶混合物为0.1％胰酶/0.1％乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)混合液。在振荡条件下，可以加速胰酶混合物酶解的速度。
S350，于振荡条件下，使用细胞通透剂例如曲拉通-100(1％Triton X- 100)溶液处理脐带10h～15h。在振荡条件下，可以加快细胞通透剂破坏细胞的速度。
S360，使用无菌水或PBS溶液振荡洗涤脐带3～5次，每次4h～6h；以去除脐带中的胰酶混合物和细胞通透剂。
在再一些实施例中，可以采用反复冻融和酶消化法联合脱细胞处理，在尽量保留细胞外基质的完整结构的基础上，提高酶消化的速度。例如，首先反复冻融，然后酶消化法处理。其中，反复冻融、酶消化法处理的步骤与上文一致，在此不再赘述。
在步骤S400中，具体包括：将脱细胞脐带和诱导剂溶液加入交联剂中，于环境温度下，交联反应20h～36h；其中，以脱细胞脐带的干重 100mg为基准，诱导剂溶液的体积份数为100～500μL。交联剂可以用于接枝氨基官能团和羧基官能团，交联剂将脐带支架中的氨基官能团和诱导剂溶液中所携带的羧基官能团进行化学缩合，形成复合支架。在将复合支架植入体内时，可以稳定释放诱导剂小分子。
在一些实施例中，诱导剂溶液的浓度可以为10μg/mL～100μg/mL。例如，诱导剂溶液的浓度可以为10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、 50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL和100μg/mL中的任一数值，或者任两个数值的组合范围。此范围的诱导剂溶液可以充分发挥诱导作用，将复合支架中的种子细胞诱导分化。并且可以根据需要修复的肩袖组织的损伤程度，灵活选择诱导剂溶液的浓度。
在一些实施例中，诱导剂溶液可以为2-([1,1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸(Kartogenin，KGN)溶液。KGN溶液的具体配置过程如下：将KGN小分子溶于有机溶剂例如二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)配置为 KGN溶液。KGN溶液可以将间充质干细胞等转变成为软骨细胞，并且其分子量较小，有利于释放扩散，提高诱导细胞分化的效率。
在一些实施例中，交联剂可以为EDC/NHS，EDC/NHS的配置方式为将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入95％无水乙醇中，配置为EDC/NHS交联剂。其中，EDC和 NHS的添加摩尔比为3：1。
在步骤S500中，具体可以包括：
S510，使用无菌水或PBS缓冲液清洗复合支架3～5次，每次 5～10min。去除复合支架中残留的胰酶混合物和细胞通透剂等。
S520，于周围温度为-75℃～-85℃下，冷冻复合支架1h～1.5h。将复合支架冷冻，一方面可以干燥复合支架去除复合支架中的水分，另一方面可以将复合支架冷冻为冻干支架，便于储存。
可选地，冷冻复合支架的过程中，将复合支架放置于冷冻盘中，并且复合支架的Wharton’s jelly组织与冷冻盘贴合，复合支架的脐带外膜与冷冻盘之间保留有间隙，脐带外膜和冷冻盘不接触。其中，复合支架的冷冻速率小于冷冻盘的冷冻速率。例如，冷冻盘为金属材质。Wharton’s jelly组织和冷冻盘直接接触，可以加速Wharton’s jelly组织的静态定向结晶。
根据本申请的实施例，使用脐带构架生物补片，保留了脐带外膜和 Wharton’sjelly组织之间天然的构象关系；并且脐带外膜较为致密，具有良好的拉伸力学特性；Wharton’s jelly组织较为疏松，具有天然的三维空隙结构，有利于细胞的浸润长入。利用脐带的Wharton’s jelly组织富含大量氨基官能团的特性，利用化学交联方法将其与诱导剂携带的羧基官能团进行化学缩合，构建的脐带支架可以稳定释放诱导剂分子。
根据本申请的实施例，步骤S300之后还可以包括S600，冷冻处理脱细胞脐带。将脱细胞脐带冷冻处理，可以初步使得脱细胞脐带的Wharton’s jelly组织静态定向结晶，并使得脐带初步成型为支架。其中，冷冻处理的过程和步骤S520中冷冻处理相同，在此不再赘述。
本申请第二方面的实施例提供了一种生物补片，应用于肩袖修复，其是通过上述第一方面的实施例制得。因此，该生物补片也具有相应的有益效果。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
实施例1
将人脐带剪成约2cm的长段，然后用0.9％的无菌肝素钠-生理盐水冲洗，去除人脐带中的血污。将人脐带纵向剖开，将人脐带中的两根动脉和一根静脉剥离，并将剩余组织铺平并修剪整齐为片状。
将修剪整齐的脐带使用无菌水漂洗3次，每次5min。在-80℃下冷冻脐带1h，然后将其自然融化。反复冷冻、融化的步骤3次。
使用无菌水振荡洗涤脐带3次，每次1h。然后将脐带放入0.1％胰酶 /0.1％EDTA混合液中，室温振荡12小时。放入1％Triton X-100溶液中，室温震荡12小时。然后无菌蒸馏水震荡洗涤3次，每次6小时。
将KGN小分子溶于DMSO中配置为100μg/ml的KGN溶液。然后按照每100mg脱细胞脐带(干重)加入100μl KGN溶液，混合处理。
将复合有KGN溶液的脱细胞脐带放入交联剂中，于室温下反应24h，获得复合支架。其中，交联剂由以下步骤配置而成：1.9179g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.46g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入 200ml 95％无水乙醇中。
使用无菌水漂洗复合支架3次，每次10min；然后于-80℃下冷冻干燥为生物补片。
测试部分
(1)脐带的Wharton’s jelly组织的荧光染色
将实施例1脱细胞处理前的脐带、实施例1脱细胞处理后的脱细胞脐带用4％多聚甲醛固定后，脱水，石蜡包埋，切片后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液染色，利用Leica TCS- SP8共聚焦显微镜拍照观察。
图2为脐带的Wharton’s jelly组织的DAPI染色图，其中，图2A为脱细胞处理前的脐带的Wharton’s jelly组织的DAPI染色图，图2B为脱细胞处理后的脐带的Wharton’sjelly组织的DAPI染色图。如图2所示，脱细胞处理后的Wharton’s jelly组织中基本不含细胞。
(2)脐带的Wharton’s jelly组织的脱氧核糖核酸(DeoxyriboNucleic Acid，DNA)的含量测试
测试过程：将实施例1脱细胞处理前的脐带、实施例1脱细胞处理后的脱细胞脐带各100mg(干重)匀浆后放到2ml的离心管中离心，然后加入木瓜蛋白酶，于60℃离心4小时，然后于10000r/min下离心5min，然后利用PicoGreen DNA assay(Invitrogen)试剂盒，根据试剂盒的说明书进行具体操作，测量样品中DNA的含量。
图3为脐带的Wharton’s jelly组织的DNA的含量示意图。如图3所示，脱细胞处理后的Wharton’s jelly组织中DNA含量较低，脱细胞较为彻底。
(3)脐带的Wharton’s jelly组织的糖胺多糖(glucosaminoglycan， GAG)的含量测试
测试过程：将实施例1脱细胞处理前的脐带、实施例1脱细胞处理后的脱细胞脐带各100mg(干重)，利用组织GAG含量DMMB(1,9- dimethylmethylene blue)分析试剂盒(杰美基因，上海)，依据试剂盒说明书进行操作，测量样品中GAG的含量.
图4为脐带的Wharton’s jelly组织的GAG的含量示意图。如图4所示，脱细胞处理后的Wharton’s jelly组织中GAG含量降低不明显，说明脱细胞过程对Wharton’s jelly中有效成分糖胺多糖损失不大。
(4)脐带的Wharton’s jelly组织的胶原的含量测试
测试过程：将实施例1脱细胞处理前的脐带、实施例1脱细胞处理后的脱细胞脐带各100mg(干重)，利用组织羟脯氨酸分析试剂盒(南京建成)，根据试剂盒说明书，对测量样品中总胶原的含量进行测量。
图5为脐带的Wharton’s jelly组织的胶原的含量示意图。如图5所示，脱细胞处理后的Wharton’s jelly组织中胶原含量没有明显变化，说明脱细胞过程对Wharton’s jelly中有效成分胶原蛋白损失不大。
(5)脐带的Wharton’s jelly组织的拉伸弹性模量的测试
测试过程：将实施例1脱细胞处理前的脐带、实施例1脱细胞处理后的脱细胞脐带制作成长10mm，宽5mm，厚2mm的标准的长方形小试件，然后利用生物力学机(INSTRON 5567,USA)对样品的拉伸性能进行测试。
图6为脐带的Wharton’s jelly组织的拉伸弹性模量的含量示意图。如图6所示，脱细胞处理后的Wharton’s jelly组织的力学性能丢失不多，可以保持在肩袖修补时的缝合张力。
(6)脐带的Wharton’s jelly组织的扫描电镜观察
扫描电镜观察使用日本日立公司(Hitachi，Tokyo，Japan)的S-4800 型扫描电镜对脱细胞脐带支架的微观结构进行表征。
图7为脐带的Wharton’s jelly组织的扫描电镜图像，其中，图7A为脱细胞脐带正面的扫描电镜图像，图7B为脱细胞脐带侧面的扫描电镜图像。
(7)生物补片的荧光染色
测试过程：将带有荧光燃料FITC的KGN小分子与实施例1的脱细胞脐带在交联剂存在的情况下进行化学键缩合，形成化学键桥接，然后利用 Leica TCS-SP8共聚焦显微镜对脱细胞脐带-KGN-FITC的生物补片进行观察。图8为生物补片的大体观，如图8所示，生物补片具有三维空隙结构。图9为生物补片的荧光图，其中，灰色荧光为KGN小分子上标记的FITC。如图9所示，KGN小分子与脱细胞脐带形成了桥接。
(8)脱细胞脐带和脱细胞脐带-KGN的生物补片对促进间充质干细胞迁移的影响
测试过程：利用Transwell系统评估脱细胞脐带和脱细胞脐带-KGN的生物补片促进细胞迁移的能力，选择中间膜为3μm孔的Transwell，将脱细胞脐带和生物补片分别放置于Transwell小室的下室，将细胞种植于上室，在8小时和16小时后分别取Transwell膜，将膜上面的细胞用酒精棉球擦洗掉，然后进行结晶紫染色，并用ImageJ软件对膜下层的细胞进行计数。
图10为脱细胞脐带和生物补片两种补片促进间充质干细胞迁移的比较图，如图10所示，脱细胞脐带和生物补片相对于空白对照而言，均可明显促进细胞迁移，但是生物补片的促进效果大于脱细胞脐带的促进效果。
(9)间充质干细胞分别种植于脱细胞脐带、生物补片和空白六孔板，在软骨诱导培养基中培养21天后，其软骨相关基因表达情况的分析。
测试过程：将相同量的间充质干细胞分别种植到脱细胞脐带、生物补片和空白六孔板中，分别作为脱细胞脐带组、脱细胞脐带-KGN组和空白组；加入软骨诱导培养基后，在37℃，5％CO2环境中培养，21天后取材，利用Trizol提取样品中的mRNA,然后按照RT-PCR的常规步骤进行操作，评估样品中软骨相关基因的表达情况。
图11为不同补片诱导间充质干细胞软骨分化的比较图，其中，图11A为Col 2A1基因的表达情况比较，图11B为Aggrecan基因的表达情况比较，图11C为SOX9基因的表达情况比较。如图11所示，与空白组比较，脱细胞脐带组和脱细胞脐带-KGN组均具有促进间充质干细胞软骨相关基因表达的能力，但是脱细胞脐带组的促进效果相对较差。与脱细胞脐带组比较，脱细胞脐带-KGN组可明显促进间充质干细胞软骨相关基因的表达，促进其软骨分化。
动物实验
取新西兰大白兔若干，平均分为3组，分别为脱细胞脐带-KGN组、脱细胞脐带组和空白组，其中，脱细胞脐带-KGN组植入实施例1的生物补片、脱细胞脐带组植入实施例1的脱细胞脐带，空白组仅做缝合。麻醉后，对新西兰大白兔的左肩进行去毛，碘伏消毒，然后用手术刀划开皮肤。分离皮下组织，暴露三角肌，然后用手术刀划开三角肌，暴露其下的冈上肌肌腱，离断冈上肌，并在腱骨结合位置再次离断，造成一个冈上肌腱至肱骨附着点的方形缺损，然后将生物补片、脱细胞脐带和植入缺损位置，肌腱残端缝合固定，腱骨位置采用骨道固定，然后逐次关闭三角肌和皮肤。术后3天内，每天一次青霉素注射，兔可以在笼内自由活动。分别在术后4周，8周和12周处死，观察不同补片促进肩袖腱骨愈合情况，并将兔的冈上肌腱骨结合部位取材，多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片后HE染色，然后利用组织学评分系统对腱骨结合的修复情况进行半定量评估。
图12为不同补片培养兔肩袖腱骨愈合的实验研究图片；其中，图12A为手术设计图；图12B为修复后的大体观；图12C为修复后的HE组织学，图12D为修复后的组织学评分比较。Repair region为修复区域， Tendon-bone interface为键骨结合部，New Tissue为新生组织，New Tendon Tissue为新生的肌腱组织。如图12所示，脱细胞脐带-KGN组可以更好的促进肩袖腱骨的愈合，其形成的腱骨结构在组织学层面与单纯脱细胞脐带相比更接近正常腱骨结构。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种生物补片的制备方法，所述生物补片应用于肩袖修复，其特征在于，包括：
提供离体的脐带；
预处理所述脐带，以去除所述脐带中包含的脐血和脐血管；
将预处理后的所述脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带；
将所述脱细胞脐带和诱导剂溶液进行交联反应，获得复合支架，其中，所述诱导剂溶液为能够将间质干细胞分化成软骨细胞的溶液；
将所述复合支架依次经清洗和冷冻处理，获得生物补片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述脱细胞脐带和诱导剂溶液进行交联反应，包括：
将所述脱细胞脐带和所述诱导剂溶液加入交联剂中，于环境温度下，交联反应20h～36h；其中，以所述脱细胞脐带的干重100mg为基准，所述诱导剂溶液的体积份数为100～500μL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂溶液的浓度为10μg/mL～100μg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂溶液为2-([1，1-联苯]-4-基氨基甲酰)苯甲酸的溶液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将预处理后的所述脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带，包括：
将预处理后的所述脐带依次经冷冻、融化处理；并且至少重复一次所述冷冻、融化处理的步骤。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将预处理后的所述脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带，包括：
于振荡条件下，将预处理后的所述脐带酶解10h～15h、细胞通透处理10h～15h；然后振荡洗涤3～5次，每次4h～6h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将预处理后的所述脐带经脱细胞处理制成脱细胞脐带之后，还包括：
冷冻处理所述脱细胞脐带。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将所述复合支架依次经清洗和冷冻处理，包括：
将所述复合支架清洗后放置于冷冻盘中冷冻处理，其中，所述复合支架的沃顿胶组织与所述冷冻盘贴合，所述复合支架的脐带外膜与所述冷冻盘之间具有间隙，所述复合支架的冷冻速率小于所述冷冻盘的冷冻速率。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述提供离体的脐带中，所述脐带为脱离人体的脐带。
10.一种生物补片，所述生物补片应用于肩袖修复，其特征在于，所述生物补片由权利要求1至9任一项所述的制备方法制得。
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