CN105521523A - 一种犬羊膜的制备及保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种犬羊膜的制备及保存方法，涉及组织工程学材料技术领域；解决了现有技术不能制备效果好的犬羊膜的技术问题；该技术方案包括：将无菌获得的犬羊膜置于无菌生理盐水溶液中；使用大量的无菌0.9％氯化钠的生理盐水溶液进行反复冲洗，将羊膜上多余的血迹、粘液及绒毛膜组织碎片冲洗掉；使用灭菌的主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS反复冲洗，将可见的血管、血凝块清洗掉，清洗后的羊膜应呈颜色均一，柔软的半透明膜状。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程学材料技术领域，特别涉及一种犬羊膜的制备及保存方法。
背景技术
羊膜是胎盘的最内层，光滑且具有一定的弹性，厚度约为0.02至0.5mm。羊膜可分为五层：分别为单层柱状上皮细胞层，致密的基底膜层，富含胶原的非细胞层，以及富含I、III、IV、V和VII型胶原蛋白、层粘连蛋白的结缔组织层。结缔组织层分为三个部分：致密的网状纤维组成的无细胞层；网状零星分布成纤维细胞且疏松的成纤维细胞层；以及海绵层。其中包括绒毛膜以及复杂的纤维组成并被粘液包裹。一些动物实验及临床观察显示，人羊膜的基底膜可以促进结膜干细胞分化为结膜上皮细胞，促进结膜上皮细胞向角膜上皮细胞转化，促进角膜缘干细胞增殖并提供其有利的生长环境，促进角膜上皮细胞移行，抑制结膜下纤维组织增生，抑制新生血管形成，抗炎抗菌等功能。其基地膜可以阻止上皮细胞凋亡、促进上皮细胞的增殖和分化。新鲜的羊膜含有一些生长因子，有利于上皮细胞的分化、移行和增强上皮细胞的粘附性的作用。羊膜可以阻止白细胞浸润，抑制多种蛋白酶如胰蛋白、纤维蛋白酶、组织蛋白酶等，通过抑制相应的酶减轻炎症反应、缩短炎症持续时间及新生血管生成。
羊膜脱细胞基质为理想的组织学工程学材料，目前尚无使用犬羊膜进行这一材料制备的研究。
发明内容
本发明要解决的是现有技术不能制备效果好的犬羊膜的技术问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种犬羊膜的制备方法，将无菌获得的犬羊膜置于无菌生理盐水溶液中；
使用大量的无菌0.9％氯化钠的生理盐水溶液进行反复冲洗，将羊膜上多余的血迹、粘液及绒毛膜组织碎片冲洗掉；
使用灭菌的主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS反复冲洗，将可见的血管、血凝块清洗掉，清洗后的羊膜应呈颜色均一，柔软的半透明膜状。
还包括以下步骤，将洗好的羊膜置于1％聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100溶液中密闭，置于37℃恒温摇床中震荡24h；
用主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS充分漂洗干净，加入0.25％胰蛋白酶0.02％乙二胺四乙酸EDTA，放入恒温培养箱37℃消化4h；
加入等量的各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基停止消化，使用主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS充分漂洗干净；
在倒置显微镜下观察细胞残留情况，观察无细胞残留即可分为约2平方厘米小块保存。
还包括以下步骤，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1：1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将所述约2平方厘米小块的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
本发明还包括一种犬羊膜的保存方法，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1：1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将按照上述权利要求1或2制备的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
通过以上技术方案可知，本发明提供一种犬羊膜的制备及保存方法，本发明的优点在于制得的犬羊膜生物相容性好，是理想组织工程学材料。保存的犬羊膜有效可用时间长，避免了使用时没有有效可用材料的尴尬。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行更详细的说明。
需要说明的是，如果不冲突，本发明实施例以及实施例中的各个特征可以相互结合，均在本发明的保护范围之内。
实施例一，一种犬羊膜的制备方法，将无菌获得的犬羊膜置于无菌生理盐水溶液中；
使用大量的无菌0.9％氯化钠的生理盐水溶液进行反复冲洗，将羊膜上多余的血迹、粘液及绒毛膜组织碎片冲洗掉；
使用灭菌的主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS反复冲洗，将可见的血管、血凝块清洗掉，清洗后的羊膜应呈颜色均一，柔软的半透明膜状。
还包括以下步骤，将洗好的.羊膜置于1％聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100溶液中密闭，置于37℃恒温摇床中震荡24h；
用主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲PBS溶液磷酸盐缓冲溶液PBS充分漂洗干净，加入0.25％胰蛋白酶0.02％乙二胺四乙酸EDTA，放入恒温培养箱37℃消化4h；
加入等量的各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基停止消化，使用主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS充分漂洗干净；
在倒置显微镜下观察细胞残留情况，观察无细胞残留即可分为约2平方厘米小块保存。
还包括以下步骤，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1∶1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将所述约2平方厘米小块的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
犬羊膜的制备及保存的材料及仪器
材料：无菌犬羊膜、微米滤膜、试剂、Dulbecco’sModifiedEagleMediumbasic(DMEMbasic)培养液、无菌培养皿、0.25％胰酶-EDTA、TritonX-100、PhosphateBufferedSaline(PBS)、纯甘油、0.25％戊二醛溶液其中，缩写的含义为：PhosphateBufferedSaline(PBS)：磷酸盐缓冲溶液、TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚、EDTA：乙二胺四乙酸、DMEM：各种氨基酸和葡萄糖培养基。
各种氨基酸和葡萄糖培养基DMEM成分：
仪器：倒置显微镜、超净工作台、恒温摇床、CO2培养箱、-80℃冰箱。
羊膜是包裹胎儿的一层半透明的膜状物，获得时可以将透明度好的组织尽量保留，但其于胎盘连接处则不必过多的保留，获得的羊膜应尽可能的透明部分，这样在清洗的过程中也会比较容易并获得血管组织较少的羊膜。取材时选取血管少的组织可以大大降低钝性分离时的难度，并同时减少对羊膜本身的破坏。分离时也应小心，尽量分离干净，得到单层的羊膜组织，这对之后制备过程中这种试剂的充分接触也有很大的帮助。否则有可能出现脱细胞不完整及过度处理造成的羊膜损伤。
本发明选取了对基底膜伤害较少，但去细胞效果略差的非离子型去污剂TritonX-100并结合使用胰蛋白酶消化来达到比较完全的脱细胞作用。同时对机械性能及细胞微结构破坏最少。
扫描电镜的结果也支持了这一方案的可行性，扫描电镜下可见表面有一层基底膜，在其下会出现交织成网状的胶原纤维，说明制作过程良好的保存了羊膜原有的物理性状。对于只含有一层上皮细胞及基质中少量成纤维母细胞的犬羊膜来说，使用TritonX-100处理后，再结合胰蛋白酶处理会达到比较理想的去细胞效果，而对其自身的基底膜、各种生物因子及生物相容性影响降至到最小，扫描电镜的结果也很好的说明了这一点。
实施例二，一种犬羊膜的保存方法，本发明还包括一种犬羊膜的保存方法，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1∶1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将按照上述权利要求1或2制备的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
保存后犬羊膜的质量检验
分别将刚制得的新鲜犬羊膜，保存1个月后、3个月后、6个月后的犬羊膜取出于室温复温10分钟后，分别包裹在盖玻片上，放入0.25％戊二醛溶液中固定后进行电镜样本制作及扫描电镜观察。
电镜样本制作：
(1)用PBS洗涤(PH7.2，0.1M，洗涤3次，每次20分钟)固定后的样本；
仪器：倒置显微镜、超净工作台、恒温摇床、CO2培养箱、-80℃冰箱。
羊膜是包裹胎儿的一层半透明的膜状物，获得时可以将透明度好的组织尽量保留，但其于胎盘连接处则不必过多的保留，获得的羊膜应尽可能的透明部分，这样在清洗的过程中也会比较容易并获得血管组织较少的羊膜。取材时选取血管少的组织可以大大降低钝性分离时的难度，并同时减少对羊膜本身的破坏。分离时也应小心，尽量分离干净，得到单层的羊膜组织，这对之后制备过程中这种试剂的充分接触也有很大的帮助。否则有可能出现脱细胞不完整及过度处理造成的羊膜损伤。
本发明选取了对基底膜伤害较少，但去细胞效果略差的非离子型去污剂TritonX-100并结合使用胰蛋白酶消化来达到比较完全的脱细胞作用。同时对机械性能及细胞微结构破坏最少。
扫描电镜的结果也支持了这一方案的可行性，扫描电镜下可见表面有一层基底膜，在其下会出现交织成网状的胶原纤维，说明制作过程良好的保存了羊膜原有的物理性状。对于只含有一层上皮细胞及基质中少量成纤维母细胞的犬羊膜来说，使用TritonX-100处理后，再结合胰蛋白酶处理会达到比较理想的去细胞效果，而对其自身的基底膜、各种生物因子及生物相容性影响降至到最小，扫描电镜的结果也很好的说明了这一点。
实施例二，一种犬羊膜的保存方法，本发明还包括一种犬羊膜的保存方法，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1：1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将按照上述权利要求1或2制备的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
保存后犬羊膜的质量检验
分别将刚制得的新鲜犬羊膜，保存1个月后、3个月后、6个月后的犬羊膜取出于室温复温10分钟后，分别包裹在盖玻片上，放入0.25％戊二醛溶液中固定后进行电镜样本制作及扫描电镜观察。
电镜样本制作：
(1)用PBS洗涤(PH7.2，0.1M，洗涤3次，每次20分钟)固定后的样本；
(2)以1％饿酸固定1小时，用PBS洗涤(方法同上)；
(3)30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇逐级脱水3次，每次20分钟；
(4)醋酸异戊酯置换，3次，每次20分钟；
(5)临界点干燥(HITACHIHCP-2)；
(6)离子溅射(EIKOIB-3)喷金；
(7)电镜(HITACHIS-3400N)扫描，观察其组织结构特点。
结果：
物理性质：
制的的犬羊膜为单层、均质、白色半透明、菲薄的膜状，柔韧性好。于倒置显微镜下观察，可以看见已无细胞结构。
保存1个月后，保存液为淡粉色，复温后的犬羊膜与刚制备时无差别。
保存3个月后，保存液为淡粉色，复温后的犬羊膜颜色偏白，其余性状与刚制备时无差别。
保存6个月后，保存液为淡粉色，复温后的犬羊膜与3个月时无差别。
电镜扫描结果：
刚制作好的犬羊膜五细胞残留，较远纤维交织成网，覆盖一层底膜。
存放1个月的犬羊膜可见胶原纤维交织成网，基地膜有大量裂纹。
存放3个月的犬羊膜可见胶原纤维交织成网，基底膜大量裂纹。
存放6个月的犬羊膜可见较远纤维大部分交织成网，部分出现断裂，断裂处胶原纤维稀疏。基底膜上有大量裂痕。
材料的保存方法也一直是研究的重要问题之一。从眼观来看，其质地及柔韧性并没有改变，从第三个月开始出现的一定程度的变白，可能是由于其基质层有部分的吸水导致，但在进行固定缝合时没有明显的差异。在实际应用保存后的犬羊膜时，从扫描电镜结果看，随着保存时间的增加，该保存方法会出现基底膜的损坏，从保存1个月开始就已经出现，到3个月时已经出现了大量基底膜的损坏，为了达到更好的治疗效果，保存方法对基底膜的损伤在现有技术中使用DMEM/纯甘油(1：1)深低温方法及冷冻干燥方法保存人羊膜，结果显示保存后24小时即可出现基底膜损伤。从纤维蛋白网状结构上看，保存1个月的犬羊膜没有出现裂痕等异常，保存3个月的出现了小的断裂，而保存6个月的犬羊膜出现了比较大的断裂。
使用非离子去污剂结合酶解法可以制的犬羊膜生物相容性好，是理想组织工程学材料。保存的犬羊膜有效可用时间长，避免了使用时没有有效可用材料的尴尬。
当然，本发明还可有其他多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种犬羊膜的制备方法，其特征在于，将无菌获得的犬羊膜置于无菌生理盐水溶液中；
使用大量的无菌0.9％氯化钠的生理盐水溶液进行反复冲洗，将羊膜上多余的血迹、粘液及绒毛膜组织碎片冲洗掉；
使用灭菌的主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS反复冲洗，将可见的血管、血凝块清洗掉，清洗后的羊膜应呈颜色均一，柔软的半透明膜状。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤，将洗好的羊膜置于1％聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100溶液中密闭，置于37℃恒温摇床中震荡24h；
用主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS充分漂洗干净，加入0.25％胰蛋白酶0.02％乙二胺四乙酸EDTA，放入恒温培养箱37℃消化4h；
加入等量的各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基停止消化，使用主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl的磷酸盐缓冲溶液PBS充分漂洗干净；
在倒置显微镜下观察细胞残留情况，观察无细胞残留即可分为约2平方厘米小块保存。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1∶1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将所述约2平方厘米小块的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
4.一种犬羊膜的保存方法，其特征在于，将各种氨基酸和葡萄糖DMEM培养基同纯甘油1∶1进行混合，使用20微米孔径滤膜进行过滤得到无菌的保存液约4毫升一份分装至无菌的5ml离心管中，将按照上述权利要求1或2制备的犬羊膜分别放入有保存液的离心管中，使保存液完全浸润犬羊膜，密封后放入-80℃冰箱保存。
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