CN105709276A - 一种绒毛膜脱细胞液以及脱细胞方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绒毛膜脱细胞液，包括十二烷基磺酸钠0.5份~1份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份~2份；氯化钠3份~6份；DNAse 1份~3份；蛋白酶抑制剂0.1份~0.5份；胰蛋白酶0.4份~1.2份。本发明弥补了现有技术中缺少脱绒毛膜细胞的制剂，本发明通过调节脱细胞液的配方，可以使制备得到的绒毛膜产品保留天然空隙及纤维网状结构，细胞易附着，且不易发生卷曲，便于商业化生产，可广泛推广应用。

Description

一种绒毛膜脱细胞液以及脱细胞方法

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及到一种绒毛膜脱细胞液以及脱细胞方法。

背景技术

脱细胞技术主要是指利用脱细胞技术(物理、化学、酶解等方法)去除组织中各种细胞成分以及遗传物质从而获得天然生物支架材料。由于保留了细胞外基质的三维结构和天然成分，有利于细胞粘附、增殖、分化及其生物学功能的发挥，因此，其在组织修复与再生中具有其他支架材料无法比拟的优势。目前，人们已经能够从多种组织中得到脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、血管、角膜以及更为复杂的心、肺、肝、肾等。

胎盘作为产妇分娩之后的废弃物，其获取简单，并且不会对捐献者造成伤害，对胎盘进行有效的利用可以变废为宝。目前已有研究者对胎盘羊膜进行开发，经过脱细胞后作为生物材料被广泛应用于医疗中，但是却存在材料难依附于组织、细胞不易附着、伤口愈合慢的缺点。如专利CN1369555A所公开的方法中，制备得到的脱细胞羊膜较薄、不易附着于组织上、容易发生卷曲脱落。

胎盘绒毛膜与羊膜类似，有免疫原性低、组织相容性高、韧性强等优点，并且易在体内降解。而相比于羊膜，绒毛膜厚度大，不易卷曲变形，机械度与韧性更强，更有利于依附在组织上，易于实际的医疗操作。绒毛膜内有细胞充斥其中，将这些细胞脱下后则会形成孔隙，便于加快新细胞附着生长。绒毛膜含有胶原、蛋白多糖等多种生物活性成份，能够为细胞生长提供营养。这些特点都使绒毛膜更适合作为生物支架应用于实际医疗中。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种绒毛膜脱细胞液。

为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种绒毛膜脱细胞液，包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠0.5份～1份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份～2份；

氯化钠3份～6份；DNAse1份～3份；

蛋白酶抑制剂0.1份～0.5份；胰蛋白酶0.4份～1.2份。

本发明的优化方案之一，绒毛膜脱细胞液包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠0.6份～0.8份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份～1份；

氯化钠4份～5份；DNAse1份～2份；

蛋白酶抑制剂0.1份～0.4份；胰蛋白酶0.6份～0.8份。

本发明的优化方案之一，绒毛膜脱细胞液包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠0.8份；聚乙二醇辛基苯基醚0.6份；

氯化钠5份；DNAse2份；

蛋白酶抑制剂0.2份；胰蛋白酶0.8份。

本发明的优化方案之一，绒毛膜脱细胞液包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠1份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份；

氯化钠4份；DNAse1.5份；

蛋白酶抑制剂0.4份；胰蛋白酶0.6份。

本发明的优化方案之一，绒毛膜脱细胞液包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠1份；聚乙二醇辛基苯基醚2份；

氯化钠6份；DNAse2.5份；

蛋白酶抑制剂0.5份；胰蛋白酶1份。

本发明的优化方案之一，绒毛膜脱细胞液的溶质为水。

本发明的另外一个目的是提供利用绒毛膜脱细胞液的绒毛膜脱细胞方法，包括将绒毛膜置于绒毛膜脱细胞液中处理的步骤。

具体的，脱细胞方法包括以下步骤：

将绒毛膜放入绒毛膜脱细胞液中并置于水平摇床上，在室温下摇动处理48h～72h；然后取出放入纯水中振荡冲洗；冲洗完毕后灭菌、冷冻保存。

进一步的，脱细胞方法包括以下步骤：

将绒毛膜放入绒毛膜脱细胞液中并置于水平摇床上，摇床转速为100～200转/分钟，室温摇动处理48h～72h；然后放入摇床上的纯水中进行清洗，摇床转速为100～200转/分钟，室温摇动处理0.5h～2h，重复5～8次；将清洗好的绒毛膜放入0.1％～0.3％的过氧乙酸溶液中浸泡3h～6h灭菌，灭菌后置于-80℃冷冻4h，再使用冻干机冻干保存。

本发明的另一个目的是提供利用绒毛膜脱细胞液以及绒毛膜脱细胞方法获得的绒毛膜制品。

综上所述，本发明具有以下优点：

本发明弥补了现有技术中缺少脱绒毛膜细胞的制剂，本发明通过调节脱细胞液的配方，可以使制备得到的绒毛膜产品保留天然空隙，细胞易附着，且不易发生卷曲，便于商业化生产，弥补了脱细胞羊膜生物膜制品的不足，可广泛推广应用。

附图说明

图1为本发明一个实施例中脱细胞绒毛膜；

其中图1a为脱细胞绒毛膜在100倍的倒置显微镜图，图1b为30000倍的扫描电子显微镜图；

图2为本发明另一个实施例中羊毛膜和绒毛膜处理后的电镜图；

其中图2c为脱细胞羊毛膜的使用倒置显微镜拍摄的放大图，图2d为脱细胞绒毛膜的使用倒置显微镜拍摄的放大图。

具体实施方式

实施例1

步骤1、将胎盘用0.9％生理盐水冲洗干净，随后剥离绒毛膜；

步骤2、将绒毛膜放入摇床上的脱细胞绒毛膜制备液，其中包括0.8％十二烷基磺酸钠、0.6％聚乙二醇辛基苯基醚、5％氯化钠、2％DNAse、0.2％蛋白酶抑制剂、0.8％胰蛋白酶，调整转速为200转/分钟，室温摇动30小时；

步骤3、将绒毛膜取出，放入摇床上的纯水中清洗，200转/分钟，室温摇动1小时，重复8次；

步骤4、将清洗好的绒毛膜放入0.1的过氧乙酸中浸泡5小时灭菌后，置于4℃下，保存待用。

实施例2

步骤1、将胎盘用0.9％生理盐水冲洗干净，随后剥离绒毛膜；

步骤2、将绒毛膜放入摇床上的脱细胞绒毛膜制备液，其中包括1％十二烷基磺酸钠、0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、4％氯化钠、1.5％DNAse、0.4％蛋白酶抑制剂、0.6％胰蛋白酶，调整转速为160转/分钟，室温摇动36小时；

步骤3、将绒毛膜取出，放入摇床上的纯水中清洗，160转/分钟，室温摇动1小时，重复7次；

步骤4、将清洗好的绒毛膜放入0.1的过氧乙酸中浸泡4小时灭菌后，置于4℃下，保存待用。

实施例3

步骤1、将胎盘用0.9％生理盐水冲洗干净，随后剥离绒毛膜；

步骤2、将绒毛膜放入摇床上的脱细胞绒毛膜制备液，其中包括1％十二烷基磺酸钠、2％聚乙二醇辛基苯基醚、6％氯化钠、2.5％DNAse、0.5％蛋白酶抑制剂、1％胰蛋白酶，调整转速为180转/分钟，室温摇动24小时；

步骤3、将绒毛膜取出，放入摇床上的纯水中清洗，180转/分钟，室温摇动1小时，重复8次；

步骤4、将清洗好的绒毛膜放入0.3的过氧乙酸中浸泡3小时灭菌后，置于4℃下，保存待用。

对比实施例1

步骤1、将胎盘用0.9％生理盐水冲洗干净，随后剥离绒毛膜；

步骤2、将绒毛膜放入摇床上的脱细胞绒毛膜制备液，其中包括0.8％十二烷基磺酸钠、5％氯化钠、2％DNAse、0.2％蛋白酶抑制剂、0.8％胰蛋白酶，调整转速为200转/分钟，室温摇动30小时；

步骤3、将绒毛膜取出，放入摇床上的纯水中清洗，200转/分钟，室温摇动1小时，重复8次；

步骤4、将清洗好的绒毛膜放入0.1的过氧乙酸中浸泡5小时灭菌后，置于4℃下，保存待用。

对比实施例2

步骤1、将胎盘用0.9％生理盐水冲洗干净，随后剥离绒毛膜；

步骤2、将绒毛膜放入摇床上的脱细胞绒毛膜制备液，其中包括0.8％十二烷基硫酸钠、0.6％聚乙二醇辛基苯基醚、5％氯化钠、2％DNAse、0.2％蛋白酶抑制剂、0.8％胰蛋白酶，调整转速为200转/分钟，室温摇动30小时；

步骤3、将绒毛膜取出，放入摇床上的纯水中清洗，200转/分钟，室温摇动1小时，重复8次；

步骤4、将清洗好的绒毛膜放入0.1的过氧乙酸中浸泡5小时灭菌后，置于4℃下，保存待用。

对比实施例3

a、制备脱细胞生物羊膜：

(1)取绒毛膜，用甲醇-氯仿混合溶液浸泡24h，混合溶液中甲醇与氯仿的体积比为1:1，纯化水或去离子水清洗；

(2)用1％(w/v)十二烷基硫酸钠溶液浸泡24h，纯化水或去离子水清洗；

(3)用0.5％(w/v)胰蛋白酶溶液消化24h，纯化水或去离子水清洗；

b、取步骤a制备的脱细胞生物羊膜，浸泡于浓度为1％的京尼平溶液中，35℃恒温下作用42h，纯化水或去离子水清洗；

c、病毒灭活，纯化水或去离子水清洗，真空冷冻干燥，即可。

对比实施例4

步骤1、将胎盘用0.9％生理盐水冲洗干净，随后剥离取得羊毛膜；

步骤2、将羊毛膜放入摇床上的脱细胞羊毛膜制备液，其中包括0.8％十二烷基磺酸钠、0.6％聚乙二醇辛基苯基醚、5％氯化钠、2％DNAse、0.2％蛋白酶抑制剂、0.8％胰蛋白酶，调整转速为200转/分钟，室温摇动30小时；

步骤3、将羊毛膜取出，放入摇床上的纯水中清洗，200转/分钟，室温摇动1小时，重复8次；

步骤4、将清洗好的羊毛膜放入0.1的过氧乙酸中浸泡5小时灭菌后，置于4℃下，保存待用。

按照实施例1～对比实施例4合计7组实施例提供的方法制备得到脱细胞的绒毛膜或者羊毛膜，在显微镜下观察其微观结构，具体实验步骤如下。

实验1：按照实施例1提供的方法制备得到的脱细胞绒毛膜，冷冻干燥后进行倒置显微镜和扫描电子显微镜观察，获得的电镜图如图1所示。

实验2：将对比实施例4的人胎盘羊膜、对比实施例1的绒毛膜制备成脱细胞生物膜冷冻干燥，切割成大小为1cm×1cm块并使用紫外线消毒30min。然后在12孔板(coring)中的每一孔中粘贴一张生物膜，每个生物膜上接种1000个P3代胎盘间充质干细胞，并在温度为37℃、二氧化碳含量为5％的孵箱中培养2小时，每孔再加入1ml生长培养基含(含10％FBS(Gibco)的DMEM(Hyclone))，再在温度为37℃、二氧化碳含量为5％的孵箱中培养24小时，最后使用倒置显微镜下观察拍照，其获得的电镜图如图2所示。

从图1和图2的电镜图中可以得知，采用本发明的方法制备得到的脱细胞绒毛膜天然空隙较大，细胞附着性好，而且不易发生卷曲。另外，在其他对比实验中，其处理效果显著低于实施例1本发明的方法。例如在对比实施例1中，缺少了聚乙二醇辛基苯基醚，脱细胞绒毛膜的细胞附着性显著降低，保留的天然空隙也较少；对比实施例2和对比实施例3处理后的脱细胞绒毛膜易发生卷曲，附着性也有显著性降低；而且对比实施例4中的羊膜和绒毛膜在电镜下相比，羊膜在S区域，即两条黑线之间的区域内发生了明显的卷曲，然而绒毛膜并没有发生卷曲，说明本发明的方法处理绒毛膜可以获得良好的处理效果。

Claims (10)

1.一种绒毛膜脱细胞液，包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠0.5份～1份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份～2份；

氯化钠3份～6份；DNAse1份～3份；

蛋白酶抑制剂0.1份～0.5份；胰蛋白酶0.4份～1.2份。

2.如权利要求1所述的绒毛膜脱细胞液，其特征在于：包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠0.6份～0.8份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份～1份；

氯化钠4份～5份；DNAse1份～2份；

蛋白酶抑制剂0.1份～0.4份；胰蛋白酶0.6份～0.8份。

3.如权利要求1所述的绒毛膜脱细胞液，其特征在于：包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠0.8份；聚乙二醇辛基苯基醚0.6份；

氯化钠5份；DNAse2份；

蛋白酶抑制剂0.2份；胰蛋白酶0.8份。

4.如权利要求1所述的绒毛膜脱细胞液，其特征在于：包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠1份；聚乙二醇辛基苯基醚0.5份；

氯化钠4份；DNAse1.5份；

蛋白酶抑制剂0.4份；胰蛋白酶0.6份。

5.如权利要求1所述的绒毛膜脱细胞液，其特征在于：包括以下按重量配比的组分：

十二烷基磺酸钠1份；聚乙二醇辛基苯基醚2份；

氯化钠6份；DNAse2.5份；

蛋白酶抑制剂0.5份；胰蛋白酶1份。

6.如权利要求1所述的绒毛膜脱细胞液，其特征在于：所述绒毛膜脱细胞液的溶质为水。

7.基于权利要求1～6中任一所述绒毛膜脱细胞液的绒毛膜脱细胞方法，包括将绒毛膜置于绒毛膜脱细胞液中处理的步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将绒毛膜放入绒毛膜脱细胞液中并置于水平摇床上，在室温下摇动处理48h～72h；然后取出放入纯水中振荡冲洗；冲洗完毕后灭菌、冷冻保存。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将绒毛膜放入绒毛膜脱细胞液中并置于水平摇床上，摇床转速为100～200转/分钟，室温摇动处理48h～72h；然后放入摇床上的纯水中进行清洗，摇床转速为100～200转/分钟，室温摇动处理0.5h～2h，重复5～8次；将清洗好的绒毛膜放入0.1％～0.3％的过氧乙酸溶液中浸泡3h～6h灭菌，灭菌后置于-80℃冷冻4h，再使用冻干机冻干保存。

10.使用权利要求1～6中任一所述绒毛膜脱细胞液以及权利要求7～9中任一所述绒毛膜脱细胞方法获得的绒毛膜制品。