CN115737935A - 可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织修复领域，具体涉及一种可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法，体系包括修饰微球以及修饰细胞外基质；所述的修饰微球为负载干/祖细胞调控因子的多孔微球；所述的修饰细胞外基质为复合有免疫细胞活性因子的细胞外基质；所述的修饰微球具体采用下述方式制备：1）在多孔微球表面修饰聚多巴胺；2）利用聚多巴胺与干/祖细胞调控因子进行吸附得到修饰微球。本申请通过时序控释双活性因子（免疫细胞活性因子、干/祖细胞调控因子），以实现对早期免疫细胞和中后期的干/祖细胞行为的调控，从而有效促进组织内源性再生与修复。

Description

可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法

技术领域

本发明属于组织修复领域，具体涉及一种可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法。

背景技术

原位组织再生是利用活性生物材料激发宿主内源性再生潜能来调控细胞行为进而实现组织原位修复，该策略避免了传统组织工程多种限制，是一种简单有效且临床转化潜力大的组织修复手段。

传统治疗手段采用开放式手术进行支架材料移植会伴有术后感染、愈合差等问题，直接影响患者术后恢复和生活质量。而微创手术具有创伤小、操作方便、临床应用安全等优势。因此，开发新型可注射活性生物材料用于原位注射，促进组织再生修复是当前转化医学研究的重要方向。

人工合成聚合物制备的多孔微球和细胞外基质形成的水凝胶作为可注射生物材料常用于修复骨、软骨、椎间盘、肌肉等组织损伤，及治疗心肌和脑缺血等疾病。尽管大量研究显示人工合成聚合物多孔微球的孔结构和孔隙率可控，能够促进细胞和组织迁入，但人工合成聚合物仍缺乏生物活性，过多的人工合成聚合物降解会导致局部炎症，限制组织修复效果。细胞外基质（ECM）形成的水凝胶成分与天然组织接近，具有良好的生物相容性和温度响应成胶特性。然而，细胞外基质形成的水凝胶力学弱，很难为细胞和组织长入提供空间支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种可注射细胞外基质复合多孔微球体系，包括修饰微球以及修饰细胞外基质；所述的修饰微球为负载干/祖细胞调控因子的多孔微球；所述的修饰细胞外基质为复合有免疫细胞活性因子的细胞外基质；

所述的修饰微球具体采用下述方式制备：1）采用微流控装置制备多孔微球，并在多孔微球表面修饰聚多巴胺；2）将表面修饰聚多巴胺的多孔微球加入到含有干/祖细胞调控因子的溶液中，利用聚多巴胺的粘附性对干/祖细胞调控因子进行物理吸附完成活性修饰得到修饰微球；

所述的多孔微球采用下述方式制备：

将2.5-7.5wt%明胶水溶液与2-5wt%聚合物溶液混合形成总体系，加入总体系1.5-2wt%的乳化剂;将加入乳化剂的总体系置于超声波细胞粉碎机进行超声处理，形成油包水型W/O乳液；超声处理的条件为：超声功率40-60%，超声时间60-90秒。

将油包水型W/O乳液装于微流控装置的内注射器作为非连续相，聚乙烯醇PVA水溶液装于微流控装置的外注射器作为连续相制备微球；通过调节非连续相的针头粗细，调控微球尺寸；

微球在冰水中进行初步固化，后处理去除剩余的未反应物，得到多孔微球。

优选的，所述的聚合物为PLCL，所述的聚合物溶液的溶剂为二氯甲烷；所述的乳化剂为司盘80。

后处理的具体过程为：冰水搅拌条件下去除剩余的聚乙烯醇；之后收集微球置于40-45℃水浴锅中搅拌，去除明胶与乳化剂；最后用无水乙醇与40℃去离子水交替浸泡清洗10分钟，去除剩余的明胶与乳化剂。

修饰微球的具体步骤为：将微流控装置制备的多孔微球置于多巴胺溶液中，多巴胺在多孔微球表面自聚形成聚多巴胺；随后用去离子水反复清洗，再加入到含干/祖细胞调控因子的溶液中浸泡完成活性修饰得到修饰微球。

所述的干/祖细胞调控因子为IGF-1。

修饰细胞外基质采用下述方式制备：取浓度为3wt%细胞外基质预成胶溶液中加入免疫微环境调控因子，均匀混合后即得到修饰细胞外基质。免疫微环境调控因子为白介素-4，优选的，免疫微环境调控因子与3wt%细胞外基质预成胶溶液的比例为100ng/ml。

本发明还包括一种所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系的制备方法，包括下述步骤：将修饰细胞外基质中加入修饰微球，混合均匀，即得到可注射细胞外基质复合多孔微球体系；

所述的修饰微球与修饰细胞外基质的质量体积比为0.5-3：1 mg/ml；

其中，细胞外基质预成胶溶液采用下述方式制备：将细胞外基质粉末溶于含有胃蛋白酶的盐酸溶液中搅拌，待细胞外基质完全溶解，之后将溶液加入碱液将pH调至7.2-7.4之间，再加入一定量的PBS缓冲液形成细胞外基质预成胶溶液。

细胞外基质（ECM）的提取采用下述步骤：

选择天然细胞外基质材料，可以为小肠粘膜下层组织（SIS），猪膀胱细胞外基质（UBM），以及肝肾，肌肉组织等；

本申请以猪肌肉为例进行详细说明：取400g新鲜猪大腿肌肉剔除多余筋膜、脂肪，切成1cm³块，用生理盐水洗净，去除血水，装入800mL含有4%乙醇与0.1%过氧乙酸的去离子水中，摇晃2-3小时灭菌。灭菌完成后，用灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）反复清洗2-3次，每次15分钟。之后加入95%乙醇继续摇晃1-2小时，达到脱脂目的。

脱脂完成后，加入含1%十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐缓冲液进行脱细胞处理，每隔12小时换一次液体。此过程处理3-5天，以肌肉组织透明化为准。脱细胞后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织2-3天，每隔8-10小时换一次液体。直至溶液中无泡沫产生。

加入酶液去除组织中多余DNA与RNA，于37℃摇床处理4-6小时，去除免疫原性。酶液配方如下（以500mL体系为参考）：氯化镁（MgCL₂）4.574g；氯化钙（CaCL₂）0.277g；Tris-HCL（pH=6.4）275mL；双蒸水225mL；DNase：80-100U/mL；RNase：10μg/mL。

磷酸盐缓冲液（PBS）继续清洗组织2天，每隔6-8小时换液，去除多余DNA与RNA酶。最后将得到的肌肉脱细胞组织放置-80℃过夜，随后冷冻干燥3天。

利用冷冻研磨仪（中国净信）将冷冻干燥后的肌肉脱细胞组织进行研磨，研磨时间设定为5-8分钟，直至研磨成粉。粉末状细胞外基质置于-80℃，可长期保存。

细胞外基质预成胶溶液采用下述步骤制备：将100mg-300mg细胞外基质粉末溶于10ml 0.01M含有胃蛋白酶的盐酸（HCL）溶液中形成预成胶溶液，搅拌溶解48小时，待细胞外基质完全溶解，加入预成胶溶液体积1/10的0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液，将溶液pH调至7.2-7.4之间，再加入预成胶溶液体积1/9的10×磷酸盐缓冲溶液（10×PBS），上述步骤完成得到浓度为1%-3%的细胞外基质预成胶溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本申请中构建一种包含多孔微球和细胞外基质的可注射复合体系，从而发挥人工合成聚合物材料制备的多孔微球力学强，细胞外基质材料生物相容性好的优势来协同促进组织再生。

事实上，将材料植入损伤部位进行组织修复会经历四个不同但相互重叠的时期包括止血期、炎症期、增殖期和组织重塑期。在这个过程中，免疫细胞优先激活，清除死细胞和感染性病原体，并通过释放细胞因子引发组织修复反应；随后内源性干/祖细胞、内皮细胞等向损伤部位迁移并增殖，分泌产生新的细胞外基质，形成血管化和神经化网络。最后，细胞外基质通过降解、再合成和重塑过程实现受损部位生理功能恢复。

为了满足组织修复的时序性，本申请在多孔微球表面修饰负载干/祖细胞调控因子形成修饰微球；在细胞外基质内复合免疫细胞活性因子形成修饰细胞外基质，通过时序控释双活性因子（免疫细胞活性因子、干/祖细胞调控因子），以实现对早期免疫细胞和中后期的干/祖细胞行为的调控，从而有效促进组织内源性再生与修复。

本发明提供了一种全新的双活性因子的递送体系，可以通过原位注射成胶的方式，实现双活性因子的微创递送与组织的原位再生：

1）以人工合成聚合物为原料，利用微流控装置制备多孔微球，通过聚多巴胺修饰将干/祖细胞调控因子负载到多孔微球上得到修饰微球，修饰微球能够实现干/祖细胞调控因子的缓慢释放；

2）通过物理共混将免疫微环境调控因子直接装载到细胞外基质预成胶溶液中得到修饰细胞外基质，修饰细胞外基质能够实现免疫微环境调控因子的快速释放；

3）将修饰微球与修饰细胞外基质混合构建可注射细胞外基质复合多孔微球体系。该体系能够时序控释双活性因子（免疫细胞活性因子、干/祖细胞调控因子），从而协同促进组织内源性再生。

4）可注射细胞外基质复合多孔微球体系设计实现人工合成聚合物和天然细胞外基质材料优势互补，双活性因子遵循组织修复时序控释规律，能够协同促进组织内源性修复，可用于软骨、椎间盘、肌肉、脊髓等组织缺损微创修复，为原位组织再生可注射生物材料的构建提供了新策略和思路。

附图说明

图1是本发明不同明胶浓度得到的PLCL多孔微球的结果图；

图2是本发明不同聚合物材料得到的多孔微球的单次按压结果图；

图3是本发明不同聚合物材料得到的多孔微球的循环次按压结果图；

图4是本发明不同浓度的细胞外基质预成胶溶液的成胶性能图；

图5是本发明可注射细胞外基质复合多孔微球体系构建结果图；

图6为细胞外基质预成胶溶液与不同质量多孔微球进行复合的结果图；

图7为细胞外基质水凝胶以及复合体系的流变学测试结果图；

图8为活性修饰复合体系能够实现IL-4和IGF-1时序控释的曲线图；

图9为活性修饰复合体系在大鼠大体积胫骨前肌损伤模型中的结果图；

图10为活性修饰复合体系植入肌肉修复区的苏木精-伊红的组织学染色显示图。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：多孔微球的制备：2mL的7.5%明胶溶液（溶剂为去离子水）缓慢加入到7.5mL的2.0% PLCL（聚（丙交脂-共-ε-己内酯））溶液中（溶剂为二氯甲烷）得到总体系，加入总体系1.5%的医用级油包水型乳化剂司盘-80（JSENB），50%功率下超声80秒，得到油包水型W/O乳液；将油包水型W/O乳液作为内非连续相装于微流控装置的内注射器，1%聚乙烯醇（PVA）水溶液作为外相连续相装于微流控装置的外注射器制备微球，连续相/非连续相速率比为2：0.05ml/min，冰水作为接收相，通过调节非连续相的针头粗细，调控微球尺寸；本实施例中，针头尺寸为26G。

微流控装置所得微球在150rpm搅拌8-10小时去除剩余的聚乙烯醇和二氯甲烷，搅拌过程在冰浴中进行。收集微球，用去离子水清洗两遍，并置于40-45℃水浴锅中100rpm搅拌3小时，去除明胶与司盘-80。之后用无水乙醇与40℃去离子水交替浸泡清洗10分钟，反复操作3-4次，去除剩余的明胶与司盘-80。最后收集得到所需的多孔微球。

实施例2-4：实施例2-4与实施例1的不同之处在于，明胶的浓度分别为2.5%（实施例2），5%（实施例3）和10%（实施例4）；图1为不同明胶浓度（实施例1（7.5%）、2、3、4）得到的PLCL多孔微球的结果图，图1A图为不同明胶浓度获得的PLCL多孔微球明场图及扫描电镜结果图，其中，图1Aa1、图1Aa2、图1Aa3、图1Aa4分别对应实施例2、3、1、4的明场图，图1Ab1、图1Ab2、图1Ab3、图1Ab4分别对应实施例2、3、1、4的扫描电镜的整体图，图1Ac1、图1Ac2、图1Ac3、图1Ac4分别对应实施例2、3、1、4的扫描电镜的局部放大图，其中图1Ac1、图1Ac2、图1Ac3、图1Ac4中虚线框为多孔微球局部放大图对应整体图中图1Ab1、图1Ab2、图1Ab3、图1Ab4的方框位置。图1B图为不同明胶浓度下，多孔微球直径尺寸的统计结果图；图1C图为不同明胶浓度下，多孔微球孔径大小的统计结果图。需要说明的是，本申请中的测试手段如无特殊说明均为本领域技术人员熟知的测试手段。

通过调整明胶浓度（2.5%，5%，7.5%和10%），能够实现多孔微球孔径大小调控，结果表明当明胶浓度为2.5%时，微球表面出孔率低，且孔径较小，而当浓度达到10%时，孔径连接的桥梁容易发生断裂，形貌不稳定。当浓度为5-7.5%之间时，具有稳定的孔径连通结构。实施例5-6，实施例5-6与实施例1的不同之处在于聚合物材料不同，分别使用PLGA（聚乳酸-羟基乙酸）（实施例5）和PCL（聚己内酯）（实施例6）替换PLCL（聚（丙交脂-共-ε-己内酯）（实施例1），图2为实施例1、5、6的单次按压测试结果图；图2A图为不同聚合物多孔微球单次按压2分钟测试的明场结果图，其中，图2Aa1、图2Aa2、图2Aa3、图2Aa4为实施例5使用显微镊按压过程中的不同形态图；图2Ab1、图2Ab2、图2Ab3、图2Ab4为实施例6使用显微镊按压过程中的不同形态图；图2Ac1、图2Ac2、图2Ac3、图2Ac4为实施例1使用显微镊按压过程中的不同形态图；图2B图为单次按压2分钟后，不同实施例对应的聚合物多孔微球形貌恢复的统计分析结果图。

利用显微镊，对PLGA，PCL和PLCL三种聚合物多孔微球进行单次按压测试，结果表明PLGA容易发生破碎，PCL容易发生形变。而PLCL在按压之后能恢复到原始形貌的90%，具有好的回弹性能。

图3为实施例1、5、6的循环按压测试结果图，其中，图3A图为不同聚合物多孔微球循环按压测试的明场图，图3Aa1、图3Aa2为实施例5的循环按压的初始状态图、图3Aa3为实施例5按压1次后的结果图、图3Aa4为实施例5的按压3次后的结果图；图3Ab1、图3Ab2为实施例6的循环按压的初始状态图、b3为实施例6按压1次后的结果图、图3Ab4为实施例6的按压3次后的结果图；图3Ac1、图3Ac2为实施例1的循环按压的初始状态图、图3Ac3为实施例1按压3次后的结果图、图3Ac4为实施例1的按压15次后的结果图；图3B图为循环按压后，不同聚合物多孔微球形貌恢复的统计分析结果图。

通过显微镊，对PLGA，PCL和PLCL三种聚合物多孔微球进行循环按压测试，结果表明，同样在经过3次循环按压之后，PLGA多孔微球发生破碎，PCL多孔微球发生完全形变。而PLCL在经过15个循环按压之后，依旧能够恢复到原始形貌的85%以上，说明PLCL多孔微球具有好的回弹性能。

以PLCL聚合物浓度2%，明胶浓度7.5%，即实施例1作为最优实施例进行下一步试验。

实施例7：修饰微球的制备：将多孔微球（实施例1制备得到）置于0.5mg/mL的多巴胺Tris-HCL溶液中，于摇床上缓慢摇摆12小时，多巴胺在微球表面自聚形成聚多巴胺，收集微球用去离子水反复清洗3次，并去除多余的黑色粉末状得到表面修饰聚多巴胺的多孔微球。将表面修饰聚多巴胺的多孔微球以3mg/mL的质量/体积比，与干/祖细胞活性因子水溶液进行混合；其中，干/祖细胞活性因子以胰岛素样生长因子-1（IGF-1）为例，干/祖细胞活性因子水溶液浓度为500ng/mL，表面修饰聚多巴胺的多孔微球在干/祖细胞活性因子水溶液中浸泡24小时后，通过多孔微球表面聚多巴胺的黏附作用，对干/祖细胞活性因子（IGF-1）进行物理吸附。最后通过冷冻干燥处理12小时，收集得到负载干/祖细胞调控因子的多孔微球即修饰微球。

实施例8：细胞外基质预成胶溶液的制备：

步骤一：细胞外基质的提取：新鲜猪大腿肌肉剔除多余筋膜、脂肪，切成1cm³块，用含4%乙醇与0.1%过氧乙酸的去离子水灭菌处理2-3小时，95%乙醇脱脂处理1-2小时。清洗完毕后，加入1%十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐缓冲液脱细胞处理3-5天，直至肌肉组织透明化。脱细胞后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织2-3天。加入酶液去除组织中多余DNA与RNA，于37℃摇床处理4-6小时，去除免疫原性。酶液配方如下（以500mL体系为参考）：氯化镁（MgCL₂）4.574g；氯化钙（CaCL₂）0.277g；Tris-HCL（pH=6.4）275mL；双蒸水225mL；DNase：80-100U/mL；RNase ：10μg/mL。磷酸盐缓冲液（PBS）继续清洗组织2天，去除多余DNA与RNA酶。最后将得到的肌肉脱细胞组织冷冻干燥3天，研磨成粉状，-80℃长期保存。

步骤二：细胞外基质预成胶溶液的制备：将100mg、200mg、300mg的细胞外基质粉末分别溶于10ml 0.01M含有胃蛋白酶的盐酸（HCL）溶液中搅拌消化48小时，待细胞外基质完全溶解得到预成胶溶液，加入预成胶溶液体积1/10的0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液，将溶液pH调至7.2-7.4之间，再加入预成胶溶液体积1/9的10×磷酸盐缓冲溶液（10×PBS），上述步骤完成分别得到浓度为1%、2%、3%的细胞外基质的预成胶溶液；

图4示出不同浓度的细胞外基质的预成胶溶液的成胶性能，其中，图4A图为1%浓度下细胞外基质预成胶溶液的成胶性能图片；图4Aa1、图4Aa2为1%浓度下细胞外基质预成胶溶液在37℃，30s后在试管中不同放置形式下的成胶状态。图4B图为2%浓度下细胞外基质预成胶溶液的成胶性能图片，图4Bb1、图4Bb2为2%浓度下细胞外基质预成胶溶液在37℃，30s后在试管中不同放置形式下的成胶状态，图4Ab3为2%浓度下细胞外基质预成胶溶液在37℃，30s后在锡箔纸上的成胶状态。图4C图为3%浓度下细胞外基质预成胶溶液的成胶性能图片，图4Cc1、图4Cc2为3%浓度下细胞外基质预成胶溶液在37℃，30s后在试管中不同放置形式下的成胶状态，图4Cc3为3%浓度下细胞外基质预成胶溶液在37℃，30s后在锡箔纸上成胶后用显微镊进行夹取的状态。

结果表明，1%浓度下细胞外基质预成胶溶液不能够成胶，2%浓度下细胞外基质预成胶溶液能够成胶，但是性能较弱，能够吸附在锡箔纸，但不能够用显微镊进行夹取。在3%浓度下的细胞外基质预成胶溶液，具有良好的成胶性能，能够维持水凝胶形状，能够被显微镊夹取。

实施例9：修饰细胞外基质的制备：直接在3%浓度的细胞外基质预成胶溶液（1ml）中加入100ng免疫微环境调控因子（以白介素-4（IL-4）为例）混合均匀，得到修饰细胞外基质，修饰细胞外基质能够在生理温度37℃，30秒内成胶。

实施例10-11：可注射细胞外基质复合多孔微球体系构建（图5为其构建体系的结果示意图）：取修饰微球（实施例7制备），以不同质量/体积比0mg/mL（对照例）、0.5mg/mL（实施例10），及3mg/mL（实施例11））加入到修饰细胞外基质（实施例9制备）中，混合均匀，图6为修饰细胞外基质与不同质量的修饰微球进行复合的结果图，其中，图6a1为对照例用罗丹明标记修饰微球的结果图（红光），图6a2为对照例用异硫氰酸荧光素标记修饰细胞外基质的结果图（绿光），图6a3为对照例同时使用罗丹明、异硫氰酸荧光素标记的结果图；图6b1为实施例10用罗丹明标记修饰微球的结果图（红光），图6b2为实施例10用异硫氰酸荧光素标记修饰细胞外基质的结果图（绿光），图6b3为实施例10同时使用罗丹明、异硫氰酸荧光素标记的结果图；图6c1为实施例11用罗丹明标记修饰微球的结果图（红光），图6b2为实施例11用异硫氰酸荧光素标记修饰细胞外基质的结果图（绿光），图6b3为实施例11同时使用罗丹明、异硫氰酸荧光素标记的结果图；结果表明两者之间都能够形成互穿网络结构。

以实施例11的可注射细胞外基质复合多孔微球体系（以下简称活性修饰复合体系）作为最优实施例进行说明。

实施例12：复合体系的构建，将实施例1制备的PLCL多孔微球以及实施例8制备的浓度为3%的细胞外基质预成胶溶液混合均匀后作为复合体系进行对照。

图7为实施例8制备的3%浓度的细胞外基质预成胶溶液（图7中的单纯细胞外基质）以及实施例12制备的复合体系（图7中的复合体系）的流变学测试结果图，结果表明细胞外基质预成胶溶液具有温度响应特性，在37℃能够响应成胶，弹性模量（G’）与损耗模量（G”）的差值显著提高。3%浓度的细胞外基质预成胶溶液初始弹性模量（G’）较低，几乎为零，在加入多孔微球形成复合体系后，初始弹性模量（G’）就得到明显提升，且初始弹性模量与损耗模量差异也显著高于单纯细胞外基质预成胶溶液，表明多孔微球的加入能够显著提高细胞外基质预成胶溶液的力学强度，且多孔微球的掺入并不会影响细胞外基质预成胶溶液的成胶过程。

图8为活性修饰复合体系（实施例11）的IL-4和IGF-1的释放曲线图，(各时间点的释放率)，结果表明活性复合体系（实施例11）能够实现双活性因子IL-4和IGF-1的时序缓释，其中IL-4在3天基本释放完毕，而IGF-1释放则可以达到10天。

图9为活性修饰复合体系（实施例11）、生理盐水以及复合体系（实施例12）分别注射到大鼠大体积胫骨前肌损伤部位后的结果图，其中，图9A图为大体积肌肉缺损模型构建图，及不同材料参与修复2周和8周后的肌肉修复结果图。图9Aa1为生理盐水组肌肉缺损模型构建中的肌肉缺损图，图9Ab1为生理盐水组肌肉缺损模型构建的注射生理盐水后的肌肉修复初始图；图9Ac1为注射生理盐水2周后的肌肉修复结果图，图9Ad1为注射生理盐水8周后的肌肉修复结果图；图9Aa2为实施例12组肌肉缺损模型构建中的肌肉缺损图，图9Ab2为实施例12组肌肉缺损模型构建的注射复合体系后的肌肉修复初始图；图9Ac2为注射复合体系2周后的肌肉修复结果图，图9Ad2为注射复合体系8周后的肌肉修复结果图；图9Aa3为实施例11组肌肉缺损模型构建中的肌肉缺损图，图9Ab3为实施例11组肌肉缺损模型构建的注射活性修饰复合体系后的肌肉修复初始图；图9Ac3为注射活性修饰复合体系2周后的肌肉修复结果图，图9Ad3为注射活性修饰复合体系8周后的肌肉修复结果图；图9B图为修复不同时期(2周和8周)，损伤侧/正常肌肉侧质量比统计结果图。

结果表明活性修饰复合体系在注射2周后就表现出较好的修复效果，能够提高损伤测肌肉质量，在8周的时候，能恢复损伤测肌肉至正常肌肉的80%以上。而注射复合体系组（实施例11）也能提高损伤测肌肉质量，改善肌肉形貌，但效果不如活性修饰复合体系（实施例10）。单纯损伤给与生理盐水组中，损伤肌肉区域质量丢失明显，愈合效果较差。

图10为生理盐水组、实施例11、实施例12的苏木精-伊红染色显示图，其中，图10a1为使用生理盐水修复2周后的染色结果整体图，图10b1为使用生理盐水修复2周后的染色结果局部放大图，方框代表图10b1图中对应图10a1图的位置，下同；图10c1为使用生理盐水修复8周后的染色结果整体图；图10d1为使用生理盐水修复8周后的染色结果局部放大图；图10a2为使用实施例12的材料（复合体系）修复2周后的染色结果整体图，图10b2为使用实施例12的材料修复2周后的染色结果局部放大图；图10c2为使用复合体系（实施例12）修复8周后的染色结果整体图；图10d2为使用复合体系（实施例12）修复8周后的染色结果局部放大图；图10a3为使用活性修饰复合体系（实施例11）修复2周后的染色结果整体图，图10b3为使用活性修饰复合体系（实施例11）修复2周后的染色结果局部放大图；图10c3为使用活性修饰复合体系（实施例11）修复8周后的染色结果整体图；图10d3为使用活性修饰复合体系（实施例11）修复8周后的染色结果局部放大图。

结果表明活性修饰复合体系（实施例11）能够填充肌肉缺损部位，并能够显著促进肌纤维形成，促进肌肉再生修复。在注射第2周后多孔微球内部就存在大量细胞浸润。而在8周后，虽然多孔微球在体内有所残留，但多孔微球仍能够募集大量细胞，并伴随微小血管形成。

综上所述，本申请的活性修饰复合体系能够在生理温度下聚合成符合任何缺陷部位形状的水凝胶，同时通过双活性因子（免疫细胞活性因子，干/祖细胞调控因子）的先后释放满足组织修复的时序性，以实现药物的微创递送与组织的原位再生。

本申请中除特殊指明，百分含量均为质量百分含量；以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种可注射细胞外基质复合多孔微球体系，其特征在于，包括修饰微球以及修饰细胞外基质；所述的修饰微球为负载干/祖细胞调控因子的多孔微球；所述的修饰细胞外基质为复合有免疫细胞活性因子的细胞外基质；

所述的修饰微球具体采用下述方式制备：1）采用微流控装置制备多孔微球，并在多孔微球表面修饰聚多巴胺；2）将表面修饰聚多巴胺的多孔微球加入到含有干/祖细胞调控因子的溶液中，利用聚多巴胺的粘附性对干/祖细胞调控因子进行物理吸附完成活性修饰得到修饰微球。

2.根据权利要求1所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系，其特征在于，所述的多孔微球采用下述方式制备：

将2.5-7.5wt%明胶水溶液与2-5wt%聚合物溶液混合形成总体系，加入总体系1.5-2wt%的乳化剂；将加入乳化剂的总体系置于超声波细胞粉碎机进行超声处理，形成油包水型W/O乳液；

将油包水型W/O乳液装于微流控装置的内注射器作为非连续相，聚乙烯醇PVA水溶液装于微流控装置的外注射器作为连续相制备微球；通过调节非连续相的针头粗细，调控微球尺寸；

微球在冰水中进行初步固化，后处理去除剩余的未反应物，得到多孔微球。

3.根据权利要求2所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系，其特征在于，所述的聚合物为PLCL，所述的聚合物溶液的溶剂为二氯甲烷；所述的乳化剂为司盘80。

4.根据权利要求2所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系，其特征在于，修饰微球制备的步骤为：将微流控装置制备的多孔微球置于多巴胺溶液中，多巴胺在多孔微球表面自聚形成聚多巴胺；随后用去离子水反复清洗，再加入到含干/祖细胞调控因子的溶液中浸泡完成活性修饰即得到修饰微球。

5.根据权利要求4所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系，其特征在于，所述的干/祖细胞调控因子为IGF-1。

6.根据权利要求1所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系，其特征在于，修饰细胞外基质采用下述方式制备：取浓度为3wt%细胞外基质预成胶溶液中加入免疫微环境调控因子，均匀混合后得到修饰细胞外基质。

7.一种权利要求1-6任一项所述的可注射细胞外基质复合多孔微球体系的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：修饰细胞外基质中加入修饰微球，混合均匀，即得到可注射细胞外基质复合多孔微球体系。

8.根据权利要求7所述可注射细胞外基质复合多孔微球体系的制备方法，其特征在于，免疫微环境调控因子为白介素-4。

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