CN107412859A - 一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法 - Google Patents

一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107412859A
CN107412859A CN201710283013.8A CN201710283013A CN107412859A CN 107412859 A CN107412859 A CN 107412859A CN 201710283013 A CN201710283013 A CN 201710283013A CN 107412859 A CN107412859 A CN 107412859A
Authority
CN
China
Prior art keywords
preparation
poly
rhigf
plga
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710283013.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107412859B (zh
Inventor
刘劲松
徐丽华
邓振南
姚李韬
吴星海
平林超
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SCHOOL & HOSPITAL OF STOMATOLOGY WENZHOU MEDICAL UNIVERSITY
Original Assignee
SCHOOL & HOSPITAL OF STOMATOLOGY WENZHOU MEDICAL UNIVERSITY
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SCHOOL & HOSPITAL OF STOMATOLOGY WENZHOU MEDICAL UNIVERSITY filed Critical SCHOOL & HOSPITAL OF STOMATOLOGY WENZHOU MEDICAL UNIVERSITY
Priority to CN201710283013.8A priority Critical patent/CN107412859B/zh
Publication of CN107412859A publication Critical patent/CN107412859A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107412859B publication Critical patent/CN107412859B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，首先用分子量较大的缓释材料包封含有IGF‑I的质粒，制备成缓释微球，再将微球与分子量较小的PLGA以及含BMP‑2质粒用超临界CO2与粒子沥滤的方法制成三维多孔组织工程材料。当材料植入体内时，由于BMP‑2质粒无缓释微球包封，其周围分子量较小的本体材料首先降解，BMP‑2质粒首先释放；IGF‑I质粒则由于分子量较大的材料包封而延迟释放，可以获得两种目的基因按一定先后顺序释放的效果。这种材料可以模拟组织修复的生理过程时序表达细胞因子，更有利于组织再生，减少全身副作用，基因产物可以局部持续释放，可最大限度地增加局部治疗效果。

Description

一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法
技术领域
本发明涉及医用材料领域，更具体的说是涉及一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法。
背景技术
骨组织修复是一个复杂的过程，涉及多能干细胞分化增殖、细胞外基质与信号分子的识别、相关因子的表达及靶向作用和新骨的发育成熟等一系列链式过程。其中各种成骨因子如骨形态发生蛋白家族、成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等，都在这一过程中起着重要的调控作用，而且它们之间存在一定的时相、位点规律和协同/拮抗关系。将各种成骨因子或负载有成骨因子的控释载体应用于骨缺损区域以刺激成骨，已被证明有显著的效果。可是这些因子造价昂贵、半衰期短、容易变性；将基因复合在支架材料上，通过支架材料调节基因的缓释，这些材料释放的基因进入缺损区周围的修复细胞，表达蛋白质，在蛋白质的作用下靶细胞被刺激分化，通过自分泌或旁分泌的方式达到促进骨愈合的目的，很好地克服了以上缺陷。现在的比较成熟的多孔支架材料的制备方法都常常不可避免地要用到有机溶剂或者需要高温环境，对材料中复合的生物活性物质有不利影响。近年来开始将超临界CO2技术应用于多孔组织工程材料制备中，此法由于具备了低温、无毒、无残留物质等特殊的优点，避免了传统制备多孔支架材料的方法所常用到的有机溶剂或者需要经历的高温过程。
然而目前骨缺损的基因缓释载体系统研究多集中在单一基因方面。事实上，在骨组织修复过程中，有多个基因共同参与，并协同表达，因而根据每个成骨因子特定的释放动力学，研发同时对两种或多种生物活性因子基因缓释的载体系统也成为今后研究的一个重要方向。如何有效发挥细胞信号因子的适时、适量效用，如何模拟正常生理过程中多因子的程序性释放，发挥正常的生理功能以实现最终理想的功能替代，一直未得到有效解决。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，制备出具有基因缓释功能的组织工程材料,在原位转染细胞后程序性地表达相应细胞因子，以促进骨组织缺损修复，两种成骨因子的程序控释和科学配合，使获得的成骨效果显著超过单一因子。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、构建和扩增rhBMP-2和rhIGF-Ⅰ质粒；
步骤二、制备rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
步骤三、制备rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒；
步骤四、制备含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球；
步骤五、制备含有rhBMP-2和rhIGF-Ⅰ的双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料。
作为本发明的进一步改进，所述步骤二中rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒和步骤三rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备具体步骤如下：
a、将0.1grhBMP-2DNA或0.1g rhIGF-Ⅰ和30g药用辅料混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL有机溶剂中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌30-60min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
所述聚乙烯亚胺的重均分子量为600-25000.
作为本发明的进一步改进，所述药用辅料选自赤鲜糖醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮中的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述有机溶剂选自二氯亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃二氯甲烷或乙酸乙酯的一种或几种。
作为本发明的进一步改进，所述步骤四中含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺颗粒的PLGA缓释微球的制备具体步骤如下：
在60-85℃，将3.5-9mL二乙醇胺和3gPLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散5-8s，加入15mLPVA溶液，再超声5-8s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
作为本发明的进一步改进，所述PLGA重均分子量为50000-120000。
作为本发明的进一步改进，所述步骤五中含双DNA/PEI颗粒的PLGA组织工程复合材料的制备具体步骤如下：
a、将氯化钠、rhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、rhBMP-2DNA/PEI颗粒和粒径为200-400μm、重均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为60-80℃，时间为50-90min；
b、在室温下冷却，将其放在9-25MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间3-150min，然后将气压在5-10s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
作为本发明的进一步改进，所述氯化钠、rhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、rhBMP-2DNA/PEI颗粒和PLGA颗粒的重量比为10:50:30:10。
本发明将基因治疗和组织工程相结合，制备具有基因缓释功能的组织工程材料,在原位转染细胞后程序性地表达相应细胞因子，以促进骨组织缺损修复，首先用分子量较大的缓释材料包封含有IGF-I的质粒，制备成缓释微球，再将微球与分子量较小的PLGA以及含BMP-2质粒用超临界CO2与粒子沥滤的方法制成三维多孔组织工程材料。当材料植入体内时，由于BMP-2质粒无缓释微球包封，其周围分子量较小的本体材料首先降解，BMP-2质粒首先释放；IGF-I质粒则由于分子量较大的材料包封而延迟释放，可以获得两种目的基因按一定先后顺序释放的效果。这种材料可以模拟组织修复的生理过程时序表达细胞因子，更有利于组织再生，减少全身副作用，基因产物可以局部持续释放，可最大限度地增加局部治疗效果。
附图说明
图1为双基因时序性缓释的组织工程支架材料设计模式图。
具体实施方式
下面结合所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
实施例1
步骤一、通过质粒的构建和扩增得到0.1g的rhBMP-2和0.1g的rhIGF-Ⅰ。
步骤二、rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备：
a、将0.1grhBMP-2DNA和30g聚环氧乙烷混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL N,N-二甲基甲酰胺中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为1000的聚乙酰亚胺乙醇溶液中并连续搅拌30min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用。
步骤三、rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1g rhIGF-Ⅰ和30g赤鲜糖醇混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL四氢呋喃中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为1500的聚乙酰亚胺乙醇溶液中并连续搅拌30min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤四、含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球的制备；
在60℃，将3.5mL二乙醇胺和3g重均分子量为50000的PLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散5s，加入15mLPVA溶液，再超声5s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
步骤五、含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料的制备：
a、将1g氯化钠、5grhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、3grhBMP-2DNA/PEI颗粒和1g粒径为200μm、重均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为60℃，时间为50min；
b、在室温下冷却，将其放在9MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间30min，然后将气压在5s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
实施例2
步骤一、通过质粒的构建和扩增得到0.1g的rhBMP-2和0.1g的rhIGF-Ⅰ。
步骤二、rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1grhBMP-2DNA和30g聚吡咯烷酮混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL二氯亚砜中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为3500的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌40min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤三、rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1g rhIGF-Ⅰ和30g药用辅料聚环氧乙烷混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL有机溶剂乙酸乙酯中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为4000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌40min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤四、含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球的制备；
在70℃，将4mL二乙醇胺和3g重均分子量为90000PLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散6s，加入15mLPVA溶液，再超声6s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
步骤五、含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料的制备。
a、2g将氯化钠、10grhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的6gPLGA缓释微球、rhBMP-2DNA/PEI颗粒和2g粒径为250μm、平均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为65℃，时间为60min；
b、在室温下冷却，将其放在12MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间60min，然后将气压在6s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
实施例3
步骤一、通过质粒的构建和扩增得到0.1g的rhBMP-2和0.1g的rhIGF-Ⅰ。
步骤二、rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1grhBMP-2DNA和30g药用辅料赤鲜糖醇混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL有机溶剂二氯亚砜中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为9000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌50min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤三、rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1g rhIGF-Ⅰ和30g聚环氧乙烷混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL N,N-二甲基甲酰胺中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为9500的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌50min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤四、含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球的制备：
在70℃，将6mL二乙醇胺和3g重均分子量为100000PLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散7s，加入15mLPVA溶液，再超声7s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
步骤五、含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料的制备。
a、1.5g将氯化钠、7.5grhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、4.5grhBMP-2DNA/PEI颗粒和1.5g粒径为200-400μm、平均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为60-80℃，时间为50-90min；
b、在室温下冷却，将其放在16MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间80min，然后将气压在8s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
实施例4
步骤一、通过质粒的构建和扩增得到0.1g的rhBMP-2和0.1g的rhIGF-Ⅰ。
步骤二、rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1grhBMP-2DNA和30g聚吡咯烷酮混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL二氯甲烷中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为15000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌60min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤三、rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1g rhIGF-Ⅰ和30g赤鲜糖醇混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL四氢呋喃中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为12000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌60min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤四、含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球的制备：
在80℃，将8mL二乙醇胺和3g重均分子量为80000PLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散8s，加入15mLPVA溶液，再超声7s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
步骤五、含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料的制备：
a、1g将氯化钠、5grhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、3grhBMP-2DNA/PEI颗粒和1g粒径为200-400μm、平均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为80℃，时间为80min；
b、在室温下冷却，将其放在9-25MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间140min，然后将气压在9s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
实施例5
步骤一、通过质粒的构建和扩增得到0.1g的rhBMP-2和0.1g的rhIGF-Ⅰ。
步骤二、rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1grhBMP-2DNA和30g聚环氧乙烷混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL二氯亚砜中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为25000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌60min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤三、rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1g rhIGF-Ⅰ和30g聚吡咯烷酮混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL N,N-二甲基甲酰胺中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为25000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌60min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤四、含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球的制备：
在85℃，将9mL二乙醇胺和3g重均分子量为120000PLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散8s，加入15mLPVA溶液，再超声8s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
步骤五、含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料的制备：
a、2g将氯化钠、10grhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、6grhBMP-2DNA/PEI颗粒和2g粒径为200-400μm、平均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为80℃，时间为90min；
b、在室温下冷却，将其放在25MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间150min，然后将气压在10s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
实施例6
步骤一、通过质粒的构建和扩增得到0.1g的rhBMP-2和0.1g的rhIGF-Ⅰ。
步骤二、rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1grhBMP-2DNA和30g聚环氧乙烷混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL二氯亚砜中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为18000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌45min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤三、rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
a、将0.1g rhIGF-Ⅰ和30g聚吡咯烷酮混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL N,N-二甲基甲酰胺中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％重均分子量为9000的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌50min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
步骤四、含rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球的制备：
在75℃，将9mL二乙醇胺和3g重均分子量为60000PLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-Ⅰ DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散5s，加入15mLPVA溶液，再超声7s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
步骤五、含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料的制备：
a、2g将氯化钠、10grhIGF-Ⅰ DNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、6grhBMP-2DNA/PEI颗粒和2g粒径为200-400μm、平均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为75℃，时间为60min；
b、在室温下冷却，将其放在25MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间150min，然后将气压在10s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
检测结果
基因体外释放实验
将实施例1-6制备好的含有双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料加入孔板内,各添加1mLPBS，静置于37℃恒温箱内,定期检测基因释放情况，设观察时间点为5d、10d、15d、20d、25d、30d、40d、50d、60d、65d，取出15uL释放液,用凝胶电泳实验分析。
凝胶电泳测定结果
观察不同时间点的质粒在凝胶中移动的情况,利用电泳实验来验证该基因复合材料是否能够释放出质粒。结果显示随着时间的推移,条带的亮度也在增加，直观的表明了该基因复合材料能够释放出质粒,并且该过程是一个相对缓慢的过程。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、构建和扩增rhBMP-2和rhIGF-Ⅰ质粒；
步骤二、制备rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备；
步骤三、制备rhIGF-ⅠDNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒；
步骤四、制备含rhIGF-ⅠDNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的PLGA缓释微球；
步骤五、制备含有rhBMP-2和rhIGF-Ⅰ的双DNA/聚乙酰亚胺的PLGA组织工程复合材料。
2.根据权利要求1所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤二中rhBMP-2DNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒和步骤三rhIGF-ⅠDNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒的制备具体步骤如下：
a、将0.1grhBMP-2DNA或0.1g rhIGF-Ⅰ和30g药用辅料混合均匀得到药物混合物，
b、将药物混合物溶解到50mL有机溶剂中得到药物油溶液；
c、将药物油溶液加入到90g质量浓度为60％的聚乙酰亚胺溶液中并连续搅拌30-60min；
d、再加入40g蔗糖低压冻干备用；
所述聚乙烯亚胺的重均分子量为600-25000。
3.根据权利要求2所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述药用辅料选自赤鲜糖醇、聚环氧乙烷或聚吡咯烷酮中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂选自二氯亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃二氯甲烷或乙酸乙酯的一种或几种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤四中含rhIGF-ⅠDNA/聚乙酰亚胺颗粒的PLGA缓释微球的制备具体步骤如下：
在60-85℃，将3.5-9mL二乙醇胺和3gPLGA加入到40mL二氯甲烷溶液中，加入10g的rhIGF-ⅠDNA/聚乙酰亚胺纳米颗粒，超声分散5-8s，加入15mLPVA溶液，再超声5-8s，将得到的混合液再倒入的50mLPVA溶液中，然后室温下磁力搅拌，自然挥发除去有机溶剂，冷冻干燥备用。
6.根据权利要求5所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述PLGA重均分子量为50000-120000。
7.根据权利要求6所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤五中含双DNA/PEI颗粒的PLGA组织工程复合材料的制备具体步骤如下：
a、将氯化钠、rhIGF-ⅠDNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、rhBMP-2DNA/PEI颗粒和粒径为200-400μm、重均分子量为50000的PLGA颗粒混合后，放在模具中热压成型，温度为60-80℃，时间为50-90min；
b、在室温下冷却，将其放在9-25MPa的高压CO2气体中机械饱和，时间3-150min，然后将气压在5-10s内降至大气压水平，从而形成三维多孔材料；
c、用水将其中氯化钠溶解去除。
8.根据权利要求7所述的一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述氯化钠、rhIGF-ⅠDNA/PEI颗粒的PLGA缓释微球、rhBMP-2DNA/PEI颗粒和PLGA颗粒的重量比为10:50:30:10。
CN201710283013.8A 2017-04-26 2017-04-26 一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法 Active CN107412859B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710283013.8A CN107412859B (zh) 2017-04-26 2017-04-26 一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710283013.8A CN107412859B (zh) 2017-04-26 2017-04-26 一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107412859A true CN107412859A (zh) 2017-12-01
CN107412859B CN107412859B (zh) 2020-07-14

Family

ID=60424783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710283013.8A Active CN107412859B (zh) 2017-04-26 2017-04-26 一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107412859B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115737935A (zh) * 2022-10-18 2023-03-07 南开大学 可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1676121A (zh) * 2004-03-29 2005-10-05 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 用于组织、器官局部治疗的缓释微球制剂,及其制备方法和应用
CN103143065A (zh) * 2013-03-19 2013-06-12 四川大学 一种具有多生长因子次第释放特性的组织工程支架
CN103596553A (zh) * 2011-04-11 2014-02-19 感应生物制品股份有限公司 用于生长因子的多相释放的系统和方法
CN104622795A (zh) * 2015-01-28 2015-05-20 杭州市萧山区中医院 一种多细胞因子序贯缓释微球-水凝胶复合系统及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1676121A (zh) * 2004-03-29 2005-10-05 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 用于组织、器官局部治疗的缓释微球制剂,及其制备方法和应用
CN103596553A (zh) * 2011-04-11 2014-02-19 感应生物制品股份有限公司 用于生长因子的多相释放的系统和方法
CN103143065A (zh) * 2013-03-19 2013-06-12 四川大学 一种具有多生长因子次第释放特性的组织工程支架
CN104622795A (zh) * 2015-01-28 2015-05-20 杭州市萧山区中医院 一种多细胞因子序贯缓释微球-水凝胶复合系统及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
曾戎: "《生物医用仿生高分子材料》", 31 October 2010, 华南理工大学出版社 *
杨扬震: "《太安大典系列 骨与关节创伤》", 31 August 2013, 上海科学技术出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115737935A (zh) * 2022-10-18 2023-03-07 南开大学 可注射细胞外基质复合多孔微球体系及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107412859B (zh) 2020-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair
Dang et al. Biomimetic delivery of signals for bone tissue engineering
US8563082B2 (en) Method for producing a cross-linked substance, especially in the form of a microcapsule or layer
CN105079883B (zh) 一种多级纳米纤维复合可载药牙周组织材料及其制备方法
Shapira et al. Stabilization strategies in extrusion-based 3D bioprinting for tissue engineering
Lee et al. Long acting injectable formulations: the state of the arts and challenges of poly (lactic-co-glycolic acid) microsphere, hydrogel, organogel and liquid crystal
Hasany et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of alginate methacrylate (ALMA)-based hydrogels: Current advances and challenges
CN103012562B (zh) 一种双重靶向的d构型多肽及其递药系统
CN103237565A (zh) 用于基于材料的细胞疗法的可注射的成孔水凝胶
Zhang et al. An effective strategy for preparing macroporous and self-healing bioactive hydrogels for cell delivery and wound healing
CN101509153A (zh) 以同轴静电纺丝技术制备壳-芯结构药物纳米纤维的方法
CN108926745B (zh) 一种纳米多孔微支架的制备方法及其复合体系
Bakhshandeh et al. Recent progress in the manipulation of biochemical and biophysical cues for engineering functional tissues
CN104623737A (zh) 一种可实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架及其制备方法
CN103690959A (zh) 一种可注射的中空羟基磷灰石微球/壳聚糖复合药物载体材料及其制备方法
Salerno et al. Review on computer-aided design and manufacturing of drug delivery scaffolds for cell guidance and tissue regeneration
CN108339153A (zh) 一种3d打印多孔组织工程支架复合材料及其制备方法
CN108187145A (zh) 明胶-海藻酸盐复合浆料、明胶-海藻酸盐复合支架及其制备方法
CN107412859A (zh) 一种双基因时序性缓释的组织工程支架材料的制备方法
Ji et al. 3D-printed scaffold with halloysite nanotubes laden as a sequential drug delivery system regulates vascularized bone tissue healing
Arkan et al. Biomacromolecular based fibers in nanomedicine: a combination of drug delivery and tissue engineering
Liu et al. Preparation and Biocompatibility of Core‐Shell Microspheres for Sequential, Sustained Release of BMP‐2 and VEGF
Amler et al. Electrospun core/shell nanofibers: a promising system for cartilage and tissue engineering?
CN102499996A (zh) 一种用于非病毒基因治疗的纤维膜及其制备方法
Li et al. L-polylactic acid porous microspheres enhance the mechanical properties and in vivo stability of degummed silk/silk fibroin/gelatin scaffold

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant