CN104623737A

CN104623737A - 一种可实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架及其制备方法

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Publication number: CN104623737A
Application number: CN201410852970.4A
Authority: CN
Inventors: 陈昌盛; 王明波; 佘振定
Original assignee: Shenzhen Research Institute Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University; Shenzhen Research Institute Tsinghua University
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104623737B

Abstract

本发明提供一种用于骨、软骨、皮肤缺损等创伤修复领域的个性化组织修复支架，由三维打印技术成型，包括一基体以及分散于该基体中的多个缓释微球，所述缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构，生长因子和/或药物载于所述缓释微球的核层及外层。根据治疗部位特点，所述基体的孔洞可进一步浇铸可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶，进而通过低温冷冻干燥法成型。本发明还提供一种个性化组织修复支架的制备方法。本发明的个性化组织修复支架采用三层结构的缓释微球，具有良好的生物相容性和可降解性，用于脉冲式缓释生长因子和/或药物，达到长期稳定缓释的功效，有利于延长生长因子和/或药物的缓释周期。

Description

一种可实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及一种应用于骨、软骨、皮肤缺损等创伤修复领域的个性化组织修复支架及其制备方法。

背景技术

骨、软骨修复材料和皮肤创伤、烧伤修复材料等是目前临床上需求量最大的生物医用材料。这些材料尽管在成分上具有很大的差异，但在结构上均需满足多孔支架的结构特点。理想的组织修复支架材料应当具备良好的生物相容性、三维连通的孔隙结构和适宜的力学及降解性能，能够促进细胞粘附、生长、增殖、分化和代谢，并能够承载、协调生物活性因子和细胞之间的相互作用，影响细胞表面受体的表达和细胞的分化，为新生组织构建提供一个适宜的三维空间结构。

此外，生长因子是组织修复过程中一个重要因素，被用于促进组织修复和功能再生。组织修复支架中一般会包含载有生长因子的微球。缓释微球所包埋的生长因子可根据个体需求进行变更，从而对不同组织缺损和疾病实现个性化修复和治疗的目的。再者，缓释技术不仅可以有效的保护生长因子免受机体破坏，缓释微球降解形成的多孔结构方便组织细胞的长入，从而达到组织再生修复以及促进愈合的目的。然而，现有的缓释微球的释放周期一般较短，通常仅为数周至数月。因此，如何提高三维多孔支架中缓释微球的释放周期成为现在生物医用领域的热点。

发明内容

本发明提供一种能够实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架，包括一基体以及分散于该基体中的多个缓释微球，所述缓释微球中载有生长因子和药物中的至少一种，所述缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构，核层材料为聚酯类高分子材料，中间层材料选自丙烯酸树酯、乙基纤维素、和乙烯-醋酸乙烯共聚物中的一种，外层材料选自壳聚糖和糖胺聚糖中的一种，所述生长因子和/或药物载于所述缓释微球的核层及外层。

优选的，所述聚酯类高分子材料选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、和聚羟基脂肪酸酯的至少一种。

优选的，所述缓释微球的质量占所述基体总质量的2～5％。

优选的，所述基体的主体成分由质量百分比为75％～99％的可降解聚酯类高分子材料和质量百分比为1％～25％的可降解无机材料组成。

优选的，所述基体具有多个孔洞，该基体的孔洞中填充有可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶。

本发明还提供一种能够实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架的制备方法，其包括如下步骤：制备载有生长因子和药物中的至少一种的缓释微球，其中，所述缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构，核层材料为聚酯类高分子材料，中间层材料选自丙烯酸树酯、乙基纤维素、和乙烯-醋酸乙烯共聚物中的一种，外层材料选自壳聚糖和糖胺聚糖中的一种，所述生长因子和/或药物载于所述缓释微球的核层及外层；制备包括所述缓释微球的浆料；以及利用三维打印技术将所述浆料成型为个性化组织修复支架，使所述缓释微球分散于该个性化组织修复支架的基体中。

优选的，所述步骤“制备载有生长因子和药物的至少一种的缓释微球”进一步包括：制得由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球；制得在该核层微球表面包覆有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物涂层的双层微球；以及制得在所述双层微球的表面包覆有为壳聚糖或糖胺聚糖涂层的缓释微球，所述壳聚糖或糖胺聚糖涂层载有生长因子和/或药物，从而使该缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构。

优选的，所述步骤“制得由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球”进一步包括：取一定量的聚酯类高分子溶于二氯甲烷溶液中；往该二氯甲烷溶液加入含有一定量的生长因子和/或药物的磷酸盐缓冲溶液；用高速分散器在一定的剪切力下对该二氯甲烷溶液乳化一段时间，制得内乳液；将该内乳液加入到含有一定量乳化剂的外水相中，用高速分散器在一定的剪切力下乳化一段时间，制得复乳液；搅拌该复乳液以挥发其中的二氯甲烷；以及洗涤，冷冻干燥，制得所述由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球。

优选的，所述步骤“制得在该核层微球表面包覆有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物涂层的双层微球”进一步包括：取一定量的核层微球分散于含有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物的甲醇溶液中，待充分混合后，将该甲醇溶液加入到含有一定量斯盘-80的液体石蜡中；搅拌该液体石蜡以挥发其中的甲醇；以及洗涤，离心，真空干燥，制得具有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物涂层的双层微球。

优选的，所述步骤“制得在所述双层微球的表面包覆有为壳聚糖或糖胺聚糖涂层的缓释微球，壳聚糖或糖胺聚糖涂层载有生长因子和/或药物”进一步包括：取一定量的双层微球以及生长因子和/或药物分散于含有壳聚糖或糖胺聚糖的醋酸/醋酸钠缓冲溶液中；将所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液缓慢加入到含有斯盘-80或PO-500的石蜡/石油醚混合溶液中；反应数小时后在该石蜡/石油醚混合溶液中加入戊二醛溶液进一步交联；以及待反应完成后，静置，离心，洗涤，冷冻干燥，从而得到在所述双层微球的表面包覆有为壳聚糖或糖胺聚糖涂层的缓释微球。

本发明的个性化组织修复采用三层结构的缓释微球，具有良好的生物相容性和可降解性，用于脉冲式缓释生长因子和/或药物，达到长期稳定缓释的功效，有利于延长生长因子和/或药物的缓释周期。其中，外层所承载的生长因子和/或药物可在初期向机体组织提供较大量的生长因子和/或药物，以促进对相应细胞的分化、增殖。中间层作为阻隔层使得内层所承载的生长因子和/或药物缓慢释放，从而确保该个性化组织修复呈现出较长的释放周期。

具体实施方式

本发明较佳实施方式的能够实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架，包括一基体以及分散于所述基体中的多个缓释微球。该基体具有所需的三维形状。所述缓释微球中载有生长因子和药物中的至少一种，其可根据个体需求进行变更。所述缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构，所述生长因子和/或药物载于所述缓释微球的核层及外层。其中，核层材料可选自聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、和聚羟基脂肪酸酯(PHA)等聚酯类高分子材料中的至少一种，中间层材料选自丙烯酸树酯、乙基纤维素(EC)、和乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)中的一种，外层材料选自壳聚糖(Chitosan)和糖胺聚糖(GAG)中的一种。其中，所述丙烯酸树酯可采用商品名为尤特奇()L100-55的丙烯酸树酯产品。所述糖胺聚糖可以是，但不限于透明质酸、硫酸软骨素等中的至少一种。所述生长因子可选自骨形态发生蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、和活性多肽(HGH)中的至少一种。其中，所述骨形态发生蛋白可以是，但不限于BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-7及BMP-14中的至少一种。所述转化生长因子可以是，但不限于TGF-α及TGF-β中的至少一种。所述活性多肽(HGH)可以是类胰岛素生长因子(IGFs)或其等同物。所述类胰岛素生长因子可以是，但不限于IGF-I、IGF-II中的至少一种。所述药物选自抗癌药物和抗菌药物中的至少一种。其中所述抗癌药物可为，但不限于紫杉醇、阿霉素(DOX)、和顺铂中的其中一种，所述抗菌药物可为，但不限于万古霉素、庆大霉素、和环丙沙星等中的其中一种。更具体的，所述缓释微球呈球形，平均粒径约为50～200μm。所述缓释微球的质量占所述基体总质量的2～5％。

所述基体具有多个孔洞。所述孔洞包括平均孔径为200～600μm的相互连通的大孔和平均孔径为1～150μm的相互连通的小孔。该基体的孔隙率为85％～98％。更具体的，所述大孔大致呈方形，其沿相互垂直的两个方向的尺寸分别为200×200～600×600μm²以及230×200～230×600μm²。所述小孔可呈球形或不规则形状。可以理解的，由于所述个性化组织修复支架包括相互连通的大孔和相互连通的小孔，从而有利于提高该个性化组织修复支架的孔隙率。

在本实施方式中，所述基体的主体成分为可降解聚酯类高分子材料。在另一实施方式中，所述基体的主体成分由质量百分比为75％～99％的可降解聚酯类高分子材料和质量百分比为1％～25％的可降解无机材料组成。通过采用聚酯类高分子材料和无机材料共混作为所述基体的主体成分，可以改善单独使用其中一种材料时脆性大、抗折及抗冲击性能差、力学性能不够等缺点。聚酯类高分子材料和无机材料具有很好的生物相容性，能与骨组织形成牢固的生物化学键组合，同时传导骨组织生长。其中，当所述基体的主体成分为可降解聚酯类高分子材料时，该个性化组织修复支架适用于软骨和皮肤修复。当所述基体的主体成分为聚酯类高分子材料和无机材料共混时，该个性化组织修复支架适用于骨修复。

其中，所述聚酯类高分子材料可选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)、聚羟基脂肪酸酯、聚羟基丁酸酯(PHB)、和3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物(PHBV)中的至少一种。所述无机材料可选自磷酸钙、硫酸钙和生物玻璃中的至少一种。其中，所述磷酸钙可为羟基磷灰石(以下简称HA)或β-磷酸三钙(以下简称β-TCP)。

该个性化组织修复支架还包括填充于该基体的孔洞中的可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶，使该个性化组织修复支架为具有分级结构的多孔支架。所述高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶用于提高该个性化组织修复支架的生物相容性以及力学和降解性能，从而促进组织修复和治疗。其中，所述可降解高分子化合物水凝胶为胶原、透明质酸、硫酸软骨素、和壳聚糖中的至少一种通过与戊二醛、碳二亚胺等交联剂交联而成。所述可降解高分子/无机物杂化水凝胶为胶原、透明质酸、硫酸软骨素、和壳聚糖中的至少一种与磷酸钙或硫酸钙共混复合，并通过戊二醛、碳二亚胺等交联剂交联形成。其中，所述磷酸钙可为羟基磷灰石或β-磷酸三钙。在本实施例中，所述可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶基本填充于所述基体的大孔中。

本发明还提供一种制备所述含有具三层结构缓释微球的个性化组织修复支架的方法，其包括如下步骤：

(1)制备所述具有三层结构的缓释微球。

该步骤(1)具体可为：取一定量的聚酯类高分子溶于二氯甲烷(以下简称DCM)溶液中，再加入含有一定量生长因子和/或药物的pH约为7.4的磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS溶液，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾)；用高速分散器在一定的剪切力下对该DCM溶液乳化一段时间，制得内乳液(w/o)；然后将该内乳液加入到含有一定量乳化剂T-80(化工行业标准型号)的外水相中，用高速分散器在一定的剪切力下乳化一段时间，制得复乳液(w/o/w)；将该复乳液中速搅拌数小时以挥发其中的DCM；静置，离心，清洗，最后冷冻干燥，制得由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球。

取一定量的核层微球分散于含有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物的甲醇溶液中，待充分混合后，将该甲醇溶液加入到含有一定量的斯盘-80(化工行业标准型号，也称山梨糖醇酐油酸酯)的液体石蜡中；搅拌该液体石蜡以挥发其中的甲醇；静置，离心，清洗，最后真空干燥，制得在核层微球表面包覆有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物的双层微球。

取一定量的双层微球以及生长因子和/或药物分散于含有壳聚糖或糖胺聚糖的醋酸/醋酸钠缓冲溶液中；将所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液缓慢加入到含有斯盘-80或PO-500(化工行业标准型号)的石蜡/石油醚混合溶液中；反应数小时后在该石蜡/石油醚混合溶液中加入戊二醛溶液进一步交联；待反应完成后，静置，离心，清洗，最后冷冻干燥，得到在所述双层微球的表面包覆有壳聚糖或糖胺聚糖涂层的三层结构的缓释微球，且该壳聚糖或糖胺聚糖涂层中分散有生长因子和/或药物。优选的，当在所述双层微球的表面包覆壳聚糖涂层时，在步骤“将所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液缓慢加入到含有斯盘-80或PO-500的石蜡/石油醚混合溶液中”后，还进一步将该石蜡/石油醚混合溶液搅拌数小时，然后在该石蜡/石油醚混合溶液中缓慢加入一定量的三聚磷酸钠(以下简称TPP)水溶液，以稳定所述双层微球。

(2)制备用于成型所述基体的浆料。

该步骤(2)具体可为：取一定量的可降解的聚酯类高分子材料溶于二氧六环或丙酮溶剂中；然后向该溶剂中加入一定量的可降解无机材料以及缓释微球，搅拌分散，以制得所述浆料。

(3)利用三维打印成型所述基体。

该步骤(3)具体可为：提供三维打印机；将步骤(2)得到的浆料装入其注射器中；控制该注射器根据预设参数进行逐层扫描形成一基体预制体；真空干燥该基体预制体，从而制得所述具有多个孔洞的基体。其中，所述预设参数包括大孔的平均孔径。所述基体中的大孔为在三维打印过程中按照预设的平均孔径而形成的，所述小孔为真空干燥过程中形成。在本实施方式中，所述注射器先沿X轴再沿Y轴逐层扫描。所述预设参数还包括基体的形状、大小、注射器喷嘴大小、喷嘴运动轨迹和速度等。所述预设参数还包括喷嘴气流压力及扫描速度。其中，所述三维打印机可采用清华大学激光快速成形中心开发研制的生物材料快速成形机TissFormTM。

(4)在所述基体的孔洞内填充高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶，并通过低温冷冻干燥法成型，形成具有分级结构的个性化组织修复支架。

该步骤(4)具体可为：将可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶通过浇铸的方式加入步骤(3)获得的基体孔洞中；老化一段时间，通过冷冻干燥法成型，从而制得所述具有分级结构的个性化组织修复支架材料。在本实施方式中，由于流动性较小，所述可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶基本填充于基体的大孔中。在其它实施例中，也可以通过其它方式，比如浸涂的方式，使可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶填充于基体的孔洞内。

可以理解的，三维打印技术有利于解决患者组织缺损部位在形状和尺寸方面的差异性、复杂性和精确性问题，能够根据患者组织缺损部位的特征制作出类似机体组织结构、成分以及任意形状的多孔支架。此外，三维打印技术成型工艺简单快捷。

下面通过实施例来对本发明进行具体说明。

实施例1

(1)制备载有BMP-2的核层材料为PLGA、中间层材料为尤特奇L100-55、外层材料为壳聚糖的缓释微球。

取0.6g平均分子量为100kDa的PLGA溶于6mL浓度为100mg/mL的DCM溶液中，再加入0.3mL含有2mg的BMP-2的PBS水溶液；用高速分散器以4500rpm的转速对该DCM溶液乳化1min，制得内乳液；将该内乳液加入120mL含1.2mL乳化剂T-80的水溶液中，用高速分散器以8000rpm的转速乳化1min，制得复乳液；将该复乳液在室温下以500rpm的转速机械搅拌过夜，以挥发其中的DCM；静置，离心，清洗，冷冻干燥，得到由分散有BMP-2的PLGA形成的核层微球。

取60mg上述核层微球分散于6mL含5％尤特奇L100-55的甲醇溶液中，待充分混合后，将该甲醇溶液加入到120mL含有体积浓度为2％的斯盘-80的液体石蜡中；将该液体石蜡以700～400rpm的速度搅拌过夜，以挥发其中的甲醇；反复洗涤，真空干燥，得到在所述核层微球表面包覆有尤特奇L100-55涂层的双层微球。

取60mg上述双层微球加入20mL含3％壳聚糖的体积浓度为2％的醋酸/醋酸钠水溶液中，并加入0.1mL含有0.5mg的BMP-2的PBS溶液，以中速机械搅拌分散所述双层微球；将上述混合后的醋酸/醋酸钠水溶液加入含120mL液体石蜡/石油醚(液体石蜡和石蜡醚的体积比为7:5)和3.6mL体积浓度为3％的斯盘-80的混合溶液中，室温下乳化30min至1h；使用恒流泵在该混合溶液中缓慢加入20mL质量浓度为5％的TPP水溶液；然后将10mL的戊二醛饱和甲苯溶液滴入上述混合溶液中；待反应完成后静置，离心，清洗，最后经冷冻干燥得到在所述双层微球的表面包覆有壳聚糖涂层的三层结构的缓释微球，壳聚糖涂层载有BMP-2。

(2)制备用于成型基体的浆料。

取3g平均分子量为100kDa的PLGA75/25溶于6mL的1,4-二氧六环中，加入0.8g的HA粉末搅拌分散，再加入0.2g上述缓释微球搅拌分散，以制得所述浆料。

(3)三维打印成型所述基体。

提供三维打印机；将浆料装入其注射器中；预设所述个性化组织修复支架的长宽为10mm×10mm，喷嘴直径0.23mm，所述个性化组织修复支架中大孔沿相互垂直的两个方向的尺寸分别为200×200～600×600μm²以及200×230μm²，喷嘴气压40-60PSI，扫描速度0.8mm/s；控制注射器进行逐层扫描形成基体预制体；真空干燥该基体预制体；从而获得具有多个孔洞的基体。

实施例2

(1)制备载有DOX的核层材料为PLGA、中间层材料为尤特奇L100-55、外层材料为壳聚糖的缓释微球。

取0.6g平均分子量为100kDa的PLGA75/25溶于6mL浓度为100mg/mL的DCM溶液中，再加入0.3mL含有6mg的DOX的二甲基亚砜(以下简称DMSO)溶液；用高速分散器以4500rpm的转速对该DCM溶液乳化1min，制得内乳液；将该内乳液加入120mL含1.2mL乳化剂T-80的水溶液中，用高速分散器以8000rpm的转速乳化1min，制得复乳液；将该复乳液在室温下以500rpm的速度机械搅拌过夜，以挥发其中的DCM；静置，离心，洗涤，冷冻干燥，得到由分散有DOX的PLGA形成的核层微球。

取60mg上述核层微球分散于6mL含5％尤特奇L100-55的甲醇溶液中；待充分混合后，将该甲醇溶液加入到120mL含有体积浓度为2％的斯盘-80的液体石蜡中；将该液体石蜡以700～400rpm的速度搅拌过夜以挥发其中的甲醇；反复洗涤，真空干燥，得到在该核层微球表面包覆尤特奇L100-55涂层的双层微球。

取60mg上述双层微球加入到20mL含3％的壳聚糖的体积浓度为2％的醋酸/醋酸钠水溶液中，并加入0.1mL含有2mg的DOX的DMSO溶液，以中速机械搅拌分散所述双层微球；将上述混合后的醋酸/醋酸钠水溶液加入至含120mL液体石蜡/石油醚(液体石蜡和石油醚的体积比为7:5)和3.6mL体积浓度为3％的斯盘-80的混合溶液中，室温下乳化30min至1h；使用恒流泵在该混合溶液中缓慢加入20mL质量浓度为5％的TPP水溶液；然后将10mL的戊二醛饱和甲苯溶液滴入上述混合溶液中；待反应完成后静置，离心，清洗，最后经冷冻干燥得到在所述双层微球的表面包覆有壳聚糖涂层的缓释微球，壳聚糖涂层载有DOX。

(2)制备用于成型基体的浆料。

取3g平均分子量为100kDa的PLGA75/25溶于6mL的1,4-二氧六环中，加入质量为0.8g的HA粉末搅拌分散，再加入0.1g上述缓释微球搅拌分散，以制得所述浆料。

(3)三维打印成型所述个性化组织修复支架。

提供三维打印机；将该浆料加入其注射器中，预设所述个性化组织修复支架的长宽为10mm×10mm，喷嘴直径0.3mm，所述个性化组织修复支架中大孔沿相互垂直的两个方向的尺寸分别为250×250～600×600μm²以及300×350μm²，喷嘴气压50-75PSI，扫描速度0.5mm/s；控制注射器进行逐层扫描形成基体预制体；真空干燥该基体预制体，从而获得所述具有多个孔洞的基体。

实施例3

本实施例与上述实施例1的步骤基本相同，不同的是在三维打印成型所述基体后还进一步包括：在所述基体的孔洞内填充高分子化合物水凝胶，并通过低温冷冻干燥法成型，形成具有分级结构的个性化组织修复支架。

具体为：向100份含0.3％的胶原的醋酸/醋酸钠水溶液中加入2份3％的壳聚糖的醋酸/醋酸钠水溶液，搅拌混匀，再向其中加入2份20％的戊二醛水溶液，搅拌混匀，使胶原与戊二醛发生交联反应而生成高分子化合物水凝胶；将三维打印成型得到的个性化组织修复支架置于聚四氟模板中，然后将高分子化合物水凝胶浇铸入个性化组织修复支架的基体孔洞中直至该高分子化合物水凝胶恰好铺满所述孔洞；通过冷冻干燥法成型，从而得到所述基体孔洞中含有高分子化合物水凝胶的个性化组织修复支架。

实施例4

(1)制备载有VEGF的核层材料为PLGA、中间层材料为尤特奇L100-55、外层材料为壳聚糖的缓释微球。

取0.6g平均分子量为100kDa的PLGA75/25溶于6mL浓度为100mg/mL的DCM溶液中，再加入0.3mL含有2mg的VEGF的PBS水溶液；用高速分散器以4500rpm的转速对该DCM溶液乳化1min，制得内乳液；将该内乳液加入120mL含1.2mL乳化剂T-80的水溶液中，用高速分散器以8000rpm的转速乳化1min，制得复乳液；将该复乳液在室温下以500rpm的转速机械搅拌过夜，以挥发其中的DCM；静置，离心，清洗，冷冻干燥，得到由分散有VEGF的PLGA形成的核层微球。

取60mg上述核层微球分散于6mL含5％尤特奇L100-55的甲醇溶液中，待充分混合后，将该甲醇溶液加入到120mL含有体积浓度为2％的斯盘-80的液体石蜡中；将该液体石蜡以700～400rpm的速度搅拌过夜，以挥发其中的甲醇；反复洗涤，真空干燥，得到在所述核层微球表面包覆有尤特奇L100-55的双层微球。

取60mg上述双层微球加入20mL含3％壳聚糖的体积浓度为2％的醋酸/醋酸钠水溶液中，并加入0.1mL含有0.5mg的VEGF的PBS溶液，以中速机械搅拌分散所述双层微球；将上述混合后的醋酸/醋酸钠水溶液加入含有120mL液体石蜡/石油醚(液体石蜡和石油醚的体积比为7:5)和3.6mL体积浓度为3％的斯盘-80的混合液中，室温下乳化30min至1h；使用恒流泵在该混合溶液中缓慢加入20mL质量浓度为5％的TPP水溶液；然后将10mL的戊二醛饱和甲苯溶液滴入上述混合溶液中；待反应完成后静置，离心，清洗，最后经冷冻干燥在所述双层微球的表面包覆有壳聚糖涂层的三层结构的缓释微球，且壳聚糖涂层载有VEGF。

(2)制备用于成型基体的浆料。

取3g平均分子量为100kDa的PLGA75/25溶于6mL的1，4-二氧六环中，再加入0.15g上述缓释微球搅拌分散，以制得所述浆料。

(3)三维打印成型所述基体。

提供三维打印机；将该浆料加入其注射器中；预设所述个性化组织修复支架的长宽为10mm×10mm，喷嘴直径0.23mm，所述个性化组织修复支架中大孔沿相互垂直的两个方向的尺寸分别为200×200～600×600μm²以及200×230μm²，喷嘴气压30-40PSI，扫描速度1mm/s；控制注射器进行逐层扫描形成基体预制体；真空干燥该基体预制体，从而获得所述具有多个孔洞的基体。

(4)在所述基体的孔洞内填充高分子化合物水凝胶，并通过低温冷冻干燥法成型，形成具有分级结构的个性化组织修复支架。

向100份含0.3％的胶原的醋酸/醋酸钠水溶液中加入2份3％的壳聚糖的醋酸/醋酸钠水溶液，搅拌混匀，再向其中加入2份20％的戊二醛水溶液，搅拌混匀，使胶原与戊二醛发生交联反应而生成高分子化合物水凝胶；将步骤(3)得到的个性化组织修复支架置于聚四氟模板中，然后将高分子化合物水凝胶浇铸入个性化组织修复支架的基体孔洞中直至该高分子化合物水凝胶恰好铺满所述孔洞；通过冷冻干燥法成型，从而得到所述基体孔洞中含有高分子化合物水凝胶的个性化组织修复支架。

实施例5

(1)制备载有TGF-β的核层材料为PLA、中间层材料为尤特奇L100-55、外层材料为壳聚糖的缓释微球。

取0.6g平均分子量为100kDa的PLA溶于6mL浓度为100mg/mL的DCM溶液，再加入0.3mL含有2mg的TGF-β的PBS水溶液；用高速分散器以4500rpm的转速乳化1min，制得内乳液；将该内乳液加入120mL含1.2mL乳化剂T-80的水溶液中，用高速分散器以8000rpm的转速乳化1min，制得复乳液；将该复乳液乳液在室温下以500rpm的转速机械搅拌过夜，以挥发其中的DCM；静置，离心，清洗，冷冻干燥，得到由分散有TGF-β的PLA形成的核层微球。

取60mg上述核层微球分散于6mL含5％尤特奇L100-55的甲醇溶液中，待充分混合后，将该甲醇溶液加入到120mL含有体积浓度为2％的斯盘-80的液体石蜡中；将该液体石蜡以700～400rpm的速度搅拌过夜以挥发其中的甲醇；反复洗涤，真空干燥，得到在所述核层微球表面包覆有尤特奇L100-55涂层的双层微球。

取60mg上述双层微球加入到20mL含3％壳聚糖的体积浓度为2％的醋酸/醋酸钠水溶液中，并加入0.1mL含有0.5mg的TGF-β的PBS溶液，以中速机械搅拌分散所述双层微球；将上述混合后的醋酸/醋酸钠水溶液加入至含有120mL液体石蜡/石油醚(液体石蜡和石油醚的体积比为7:5)和3.6mL体积浓度为3％的斯盘-80的混合溶液中，室温下乳化30min至1h；使用恒流泵在该混合溶液中缓慢加入20mL质量浓度为5％的TPP水溶液；然后将10mL的戊二醛饱和甲苯溶液滴入上述混合溶液中；待反应完成后静置后，离心，清洗，最后经冷冻干燥得到在所述双层微球的表面包覆有壳聚糖壳聚糖涂层的缓释微球，且壳聚糖涂层载有TGF-β。

(2)制备用于成型基体的浆料。

取3g平均分子量为100kDa的PLA溶于6mL的1,4-二氧六环中，加入质量为0.5g的β-TCP粉末搅拌分散，再加入0.15g上述缓释微球搅拌分散，以制得所述浆料。

(3)三维打印成型所述基体。

提供三维打印机；将该浆料加入其注射器中；预设所述个性化组织修复支架的长宽为10mm×10mm，喷嘴直径0.23mm，所述个性化组织修复支架中大孔沿相互垂直的两个方向的尺寸分别为200×200～600×600μm²以及270×300μm²，喷嘴气压40～60PSI，扫描速度1mm/s；控制注射器进行逐层扫描形成基体预制体；真空干燥该基体预制体，从而获得具有多个孔洞的基体。

向100份含0.3％胶原的醋酸/醋酸钠水溶液中加入5份3％的硫酸软骨素水溶液，搅拌混匀，再向其中加入3份20％的戊二醛水溶液，搅拌混匀，使胶原和硫酸软骨素与戊二醛发生交联反应而生成高分子化合物水凝胶；将步骤(3)得到的个性化组织修复支架置于聚四氟模板中，然后将高分子化合物水凝胶浇铸入个性化组织修复支架的基体孔洞中直至该高分子化合物水凝胶恰好铺满所述孔洞；通过冷冻干燥法成型，从而得到所述基体孔洞中含有高分子化合物水凝胶的个性化组织修复支架。

另外，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和技术构思做出其它各种相应的变化，而所有这些变化都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims

1.一种能够实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架，包括一基体以及分散于该基体中的多个缓释微球，所述缓释微球中载有生长因子和药物中的至少一种，其特征在于，所述缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构，核层材料为聚酯类高分子材料，中间层材料选自丙烯酸树酯、乙基纤维素、和乙烯-醋酸乙烯共聚物中的一种，外层材料选自壳聚糖和糖胺聚糖中的一种，所述生长因子和/或药物载于所述缓释微球的核层及外层。

2.如权利要求1所述的个性化组织修复支架，其特征在于，所述聚酯类高分子材料选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、和聚羟基脂肪酸酯的至少一种。

3.如权利要求1所述的个性化组织修复支架，其特征在于，所述缓释微球的质量占所述基体总质量的2～5％。

4.如权利要求1所述的个性化组织修复支架，其特征在于，所述基体的主体成分由质量百分比为75％～99％的可降解聚酯类高分子材料和质量百分比为1％～25％的可降解无机材料组成。

5.如权利要求4所述的个性化组织修复支架，其特征在于，所述基体具有多个孔洞，该基体的孔洞中填充有可降解高分子化合物水凝胶或者可降解高分子/无机物杂化水凝胶。

6.一种能够实现脉冲式缓释的个性化组织修复支架的制备方法，其包括如下步骤：

制备载有生长因子和药物中的至少一种的缓释微球，其中，所述缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构，核层材料为聚酯类高分子材料，中间层材料选自丙烯酸树酯、乙基纤维素、和乙烯-醋酸乙烯共聚物中的一种，外层材料选自壳聚糖和糖胺聚糖中的一种，所述生长因子和/或药物载于所述缓释微球的核层及外层；

制备包括所述缓释微球的浆料；以及

利用三维打印技术将所述浆料成型为个性化组织修复支架，使所述缓释微球分散于该个性化组织修复支架的基体中。

7.如权利要求6所述的个性化组织修复支架的制备方法，其特征在于，所述步骤“制备载有生长因子和药物的至少一种的缓释微球”进一步包括：

制得由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球；

制得在该核层微球表面包覆有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物涂层的双层微球；以及

制得在所述双层微球的表面包覆有为壳聚糖或糖胺聚糖涂层的缓释微球，所述壳聚糖或糖胺聚糖涂层载有生长因子和/或药物，从而使该缓释微球具有包括核层、中间层及外层的三层结构。

8.如权利要求7所述的个性化组织修复支架的制备方法，其特征在于，所述步骤“制得由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球”进一步包括：

取一定量的聚酯类高分子溶于二氯甲烷溶液中；

往该二氯甲烷溶液加入含有一定量的生长因子和/或药物的磷酸盐缓冲溶液；

用高速分散器在一定的剪切力下对该二氯甲烷溶液乳化一段时间，制得内乳液；

将该内乳液加入到含有一定量乳化剂的外水相中，用高速分散器在一定的剪切力下乳化一段时间，制得复乳液；

搅拌该复乳液以挥发其中的二氯甲烷；以及

洗涤，冷冻干燥，制得所述由载有生长因子和/或药物的聚酯类高分子形成的核层微球。

9.如权利要求8所述的个性化组织修复支架的制备方法，其特征在于，所述步骤“制得在该核层微球表面包覆有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物涂层的双层微球”进一步包括：

取一定量的核层微球分散于含有丙烯酸树酯、乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物的甲醇溶液中，待充分混合后，将该甲醇溶液加入到含有一定量斯盘-80的液体石蜡中；

搅拌该液体石蜡以挥发其中的甲醇；以及

洗涤，离心，真空干燥，制得具有丙烯酸树酯、或乙基纤维素、或乙烯-醋酸乙烯共聚物涂层的双层微球。

10.如权利要求9所述的个性化组织修复支架的制备方法，其特征在于，所述步骤“制得在所述双层微球的表面包覆有为壳聚糖或糖胺聚糖涂层的缓释微球，壳聚糖或糖胺聚糖涂层载有生长因子和/或药物”进一步包括：

取一定量的双层微球以及生长因子和/或药物分散于含有壳聚糖或糖胺聚糖的醋酸/醋酸钠缓冲溶液中；

将所述醋酸/醋酸钠缓冲溶液缓慢加入到含有斯盘-80或PO-500的石蜡/石油醚混合溶液中；

反应数小时后在该石蜡/石油醚混合溶液中加入戊二醛溶液进一步交联；以及

待反应完成后，静置，离心，洗涤，冷冻干燥，从而得到在所述双层微球的表面包覆有为壳聚糖或糖胺聚糖涂层的缓释微球。