CN115920129A - 一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents
一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球及其制备方法和应用，该复合微球由内到外依次为装载小分子水溶性药物的明胶微球、包覆所述明胶微球的可降解人工合成聚酯、包覆所述可降解人工合成聚酯表面的多巴胺层以及多巴胺层表面吸附的蛋白类药物，将小分子水溶性药物、装载小分子水溶性药物的明胶微球、可降解人工合成聚酯、聚多巴胺和蛋白类药物结合使用，使复合微球同时具有良好的小分子水溶性药物和蛋白类药物释放效果，小分子水溶性药物释放周期可达42天以上，并具备良好的生物相容性和生物活性，可作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，能有效促进骨组织的修复和重建。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球及其制备方法和应用。
背景技术：
骨组织疾病的药物治疗，例如肿瘤化疗、抗感染和消炎，全身性的给药会造成骨组织“病灶”部位的有效药物含量不足，而药物在其它组织的分布则易于引发毒副作用。而口服给药的过肝效应以及药物在运输过程中的衰减和流失，造成药物可利用度很低，血药浓度低。所以需要大量的服用药物，这样又增加过肝效应。因此，将药物缓释引入到骨组织支架中，希望能将两者结合，研制出包载并缓释药物的骨组织支架材料。缓控释药物释放系统(DDS)是近年来国内外研究的热点。以各种骨修复材料为载体的药物缓控释体系是一种新型的给药方式，将DDS植入生物体内骨骼后，载体所承载的药物能够持续、稳定、高效地缓慢释放，达到修复骨缺损和药物治疗的双重目的。在治疗骨髓炎、骨肿瘤、骨结核、骨折、骨不连和人工关节置换等领域，DDS发挥着不可低估的作用。
高分子微球具有微存储器的功能，能存储和保护某些物质，以便在需要的时候、需要的地点、以需要的速度释放出这些物质(多维控释)。最典型的应用是药物输送系统。目前应用于该类微球的材料主要有无机材料、天然高分子及合成高分子，按照降解性能又分为降解类材料及非降解类材料。聚酯类是目前研究最多、应用最广泛的可生物降解的合成高分子材料为可降解人工合成聚酯，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚ε-己内酯、聚β-羟基丁酸、聚β-羟基戊酸以及它们的共聚物。但是，可降解人工合成聚酯基本是疏水性的，在装载小分子水溶性药物过程中存在药物装载量及包封率低的问题；可降解人工合成聚酯一般只能溶解于有机溶剂，而有机溶剂容易使蛋白类药物失活。
发明内容：
本发明的目的是提供一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球及其制备方法和应用。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球，由内到外依次为装载小分子水溶性药物的明胶微球、包覆所述明胶微球的可降解人工合成聚酯、包覆所述可降解人工合成聚酯表面的多巴胺层以及多巴胺层表面吸附的蛋白类药物。
小分子水溶性药物包括但不限于阿仑膦酸钠、白藜芦醇、鲑鱼降钙素、唑来磷酸钠、伊班膦酸钠、雷尼酸锶、庆大霉素、红霉素、青霉素、硫酸庆大霉素、盐酸万古霉素。
蛋白类药物包括但不限于骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、甲状旁腺激素、生长激素、白介素。装载小分子水溶性药物的明胶微球的平均粒径为0.1～50um。
可降解人工合成聚酯选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二酯中的任一种。
优选地，所述可降解聚酯的分子量为1.0～10.0万道尔顿。
明胶、可降解人工合成聚酯和聚多巴胺生物相容性良好；一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球在应用过程中，明胶可起到显著降低小分子水溶性药物的释放速率，可降解人工合成聚酯和聚多巴胺可进一步协同调控小分子水溶性药物的释放速率；微球表面的聚多巴胺层具有以下作用：1)可促进细胞在微球表面的粘附与增殖；2)可有效吸附蛋白类药物，起到释放蛋白类药物的作用；从而使复合微球达到促组织再生修复的效果；小分子水溶性药物释放周期可达42天以上。
所述载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用水溶性高分子明胶装载小分子水溶性药物制备装载小分子水溶性药物的明胶微球；
(2)装载小分子水溶性药物的明胶微球分散在可降解人工合成聚酯网络中，加入到含表面活性剂的水溶液中，通过乳化溶剂挥发法固化形成复合微球；
(3)将复合微球依次分散到含多巴胺及含蛋白类药物的溶液里，先在在复合微球表面形成聚多巴胺层，最后通过聚多巴胺优秀的吸附能力将蛋白类药物固定到微球表面获得载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球。
优选地，步骤(1)包括以下步骤：配制含1～3wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制含0.005～0.05g/ml小分子水溶性药物及0.1～0.4g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，500～900rpm、50～70℃下搅拌5～60min，随后将温度迅速降至3-5℃，继续搅拌10～45min，加入23-28wt％戊二醛溶液，静置24h，离心，加入异丙醇脱水1～10h，然后依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载小分子水溶性药物的明胶微球；所述水相与油相的体积比为1:4～10；所述明胶与戊二醛溶液的质量体积比为15～60:1。
步骤(2)包括以下步骤：将装载小分子水溶性药物的明胶微球分散于可降解人工合成聚酯溶液中，随后，将上述溶液缓慢滴加到2.5～50mg/ml的表面活性剂水溶液中，250～800rpm下持续搅拌10～24h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球；装载小分子水溶性药物的明胶微球与可降解人工合成聚酯的质量比为1：(4～50)；所述表面活性剂包括但不限于聚乙烯醇、明胶、甲基纤维素。
步骤(3)具体包括以下步骤，将复合微球分散于浓度为0.2～2mg/ml的多巴胺的水溶液中，复合微球与多巴胺的质量比为80～200：1，搅拌3～24h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球；然后分散于浓度为0.01～0.1mg/ml的蛋白类药物的水溶液中，4℃下振荡9～24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
本发明还保护所述载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球的应用，作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，促进细菌感染下的骨组织修复与重建。
本发明的有益效果如下：
1)本发明的复合微球的小分子水溶性药物释放周期可达42天以上，适用于组织修复与重建的应用。
2)本发明采用的明胶、可降解人工合成聚酯和聚多巴胺生物相容性良好。
3)本发明得到载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球在应用过程中，明胶可起到显著降低小分子水溶性药物的释放速率，可降解人工合成聚酯和聚多巴胺可进一步协同调控小分子水溶性药物的释放速率。
4)本发明的微球表面的聚多巴胺层1)可促进细胞在微球表面的粘附与增殖；2)可有效吸附蛋白类药物，起到释放蛋白类药物的作用；从而使复合微球达到促组织再生修复的效果。
总之，本发明将小分子水溶性药物、装载小分子水溶性药物的明胶微球、可降解人工合成聚酯、聚多巴胺和蛋白类药物结合使用，使复合微球同时具有良好的小分子水溶性药物和蛋白类药物释放效果，小分子水溶性药物释放周期可达42天以上，并具备良好的生物相容性和生物活性，可作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，能有效促进骨组织的修复和重建。
附图说明：
图1是实施例1-5及对比例1，对比例3-6制得复合微球作为支架材料的体外小分子水溶性药物释放性能检测；
图2是实施例1-5及对比例1-6制得复合微球作为支架材料的体外诱导前成骨细胞成骨分化性能。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
配制100ml含1.5wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.01g/ml阿仑膦酸钠及0.15g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，800rpm、50℃下搅拌10min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水3h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载阿仑膦酸钠的明胶微球。将300mg装载阿仑膦酸钠的明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载阿仑膦酸钠的明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制300ml 10mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于20ml浓度为0.5mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌12h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml骨形态发生蛋白2浓度为0.02mg/ml的水溶液中，4℃下振荡24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
实施例2：
配制160ml含1.8wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.03g/ml伊班膦酸钠及0.3g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，700rpm、65℃下搅拌20min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌15min，加入10ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水2h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载伊班膦酸钠的明胶微球。将20mg装载伊班膦酸钠的明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：6万道尔顿)溶液中，得到装载伊班膦酸钠的明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制200ml 35mg/ml的聚乙烯醇1788水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1788水溶液中，500rpm下持续搅拌10h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于15ml浓度为0.8mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌24h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml骨形态发生蛋白7浓度为0.04mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌18h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
实施例3：
配制200ml含3wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.015g/ml唑来磷酸钠及0.4g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，600rpm、60℃下搅拌60min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌45min，加入50ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水1h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载唑来磷酸钠的明胶微球。将80mg装载唑来磷酸钠的明胶微球分散于10ml含1g聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯(分子量：10万道尔顿)溶液中，得到装载唑来磷酸钠的明胶微球/聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯共混液；配制300ml 2.5mg/ml的聚乙烯醇1788水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1788水溶液中，250rpm下持续搅拌10h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于60ml浓度为0.2mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌3h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml成纤维细胞生长因子浓度为0.1mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌9h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
实施例4：
配制80ml含2.5wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.05g/ml白藜芦醇及0.25g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，900rpm、50℃下搅拌30min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌10min，加入150ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水5h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载白藜芦醇的明胶微球。将250mg装载白藜芦醇的明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸(分子量：5万道尔顿)溶液中，得到装载白藜芦醇的明胶微球/聚乳酸共混液；配制600ml 50mg/ml的甲基纤维素水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到甲基纤维素水溶液中，800rpm下持续搅拌16h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于8ml浓度为2mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌15h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml血小板衍生因子浓度为0.01mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌12h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
实施例5：
配制120ml含1wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.005g/ml雷尼酸锶及0.1g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，500rpm、70℃下搅拌5min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌30min，加入100ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水10h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载雷尼酸锶的明胶微球。将150mg装载雷尼酸锶的明胶微球分散于10ml含1g聚己内酯(分子量：1万道尔顿)溶液中，得到装载雷尼酸锶的明胶微球/聚己内酯共混液；配制500ml 20mg/ml的明胶水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到明胶水溶液中，300rpm下持续搅拌24h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于16.67ml浓度为1.5mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌9h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml血管内皮生长因子浓度为0.05mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌15h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
对比例1：
本对比例提供一种抗菌表面含聚多巴胺层的复合微球的制备方法，与实施例1大致相同，不同之处在于：不使用明胶装载小分子水溶性药物，其包括以下步骤：
将3mg阿仑膦酸钠分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万)溶液中，得到阿仑膦酸钠/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制300ml 10mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于20ml浓度为0.5mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌12h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml骨形态发生蛋白2浓度为0.02mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
对比例2：
本对比例提供一种表面含聚多巴胺层的复合微球的制备方法，与实施例1大致相同，不同之处在于：不使用小分子水溶性药物，其包括以下步骤：
配制100ml含1.5％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.15g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，800rpm、50℃下搅拌10min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水3h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得明胶微球。将300mg明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制300ml 10mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于20ml浓度为0.5mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌12h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g具有多巴胺层的微球分散于50ml骨形态发生蛋白2浓度为0.02mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
对比例3：
本对比例提供一种抗菌表面含聚多巴胺层的复合微球的制备方法，与实施例1大致相同，不同之处在于：不使用多巴胺，其包括以下步骤：
配制100ml含1.5wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.01g/ml阿仑膦酸钠及0.15g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，800rpm、50℃下搅拌10min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水3h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载阿仑膦酸钠的明胶微球。将300mg装载阿仑膦酸钠的明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载阿仑膦酸钠的明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制300ml 10mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g微球分散于50ml骨形态发生蛋白2浓度为0.02mg/ml的水溶液中，4℃下振荡搅拌24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
对比例4：
本对比例提供一种长效抗菌复合微球的制备方法，与实施例1大致相同，不同之处在于：不使用蛋白类药物，其包括以下步骤：
配制100ml含1.5wt％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.01g/ml阿仑膦酸钠及0.15g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，800rpm、50℃下搅拌10min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25wt％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水3h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载阿仑膦酸钠的明胶微球。将300mg装载阿仑膦酸钠的明胶微球分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万道尔顿)溶液中，得到装载阿仑膦酸钠的明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制300ml 10mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将2g复合微球分散于20ml浓度为0.5mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌12h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。
对比例5：
本对比例提供一种长效抗菌复合微球的制备方法，与实施例1大致相同，不同之处在于：不使用可降解聚酯，其包括以下步骤：
配制100ml含1.5％Span 80的液体石蜡，获得油相；配制20ml含0.01g/ml阿仑膦酸钠及0.15g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，800rpm、50℃下搅拌10min。随后将温度迅速降至4℃后，继续搅拌20min，加入200ml 25％戊二醛，静置24h。离心，加入异丙醇脱水3h。依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载阿仑膦酸钠的明胶微球。将2g微球分散于20ml浓度为0.5mg/ml的多巴胺水溶液中，搅拌12h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球。将1g微球分散于50ml骨形态发生蛋白2浓度为0.02mg/ml的水溶液中，搅拌24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
对比例6：
本对比例提供一种长效抗菌复合微球的制备方法，与实施例1大致相同，不同之处在于：不使用多巴胺和明胶，其包括以下步骤：
将20mg阿仑膦酸钠分散于10ml含1g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(分子量：3万)溶液中，得到装载阿仑膦酸钠的明胶微球/聚乳酸-羟基乙酸共聚物共混液；配制300ml 10mg/ml的聚乙烯醇1799水溶液；然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇1799水溶液中，400rpm下持续搅拌12h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球。将1g微球分散于50ml骨形态发生蛋白2浓度为0.02mg/ml的水溶液中，搅拌24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
试验例1：
将实施例1-5和对比例1-6中制备得到的微球作为支架材料进行如下性能评价，结果见表1。
1、体外细胞毒性评价
取制得的支架，按GB/T 16886.5的要求进行评价和计分。实验结果如下表：
表1实施例1-5及对比例1-6所制得复合微球的体外细胞毒性计分
1.体外小分子水溶性药物释放性能检测
本试验例测试了实施例1-5和对比例1-4制备的复合微球的性能。具体方法和结果为：
将实施例1～5和对比例1～6中制备得到的复合微球进行体外溶质释放评价，结果见图1。
环境：温度为37℃，搅拌速度为60rpm，温控装置为恒温摇床；
液体缓释介质：PBS(pH＝7.4磷酸缓冲液)；
比例：50mg高分子复合微球：20mLPBS；
小分子水溶性性药物的释放速率测定：定期收集PBS测试液，并补充等量的PBS，将收集的测试液用高效液相色谱法(HPLC)测定溶质(疏水性药物)含量；
将某时间点溶质的吸光度代入到其标准曲线中，得到这一时间点小分子水溶性性药物的实际量；将实际量除以复合微球中负载小分子水溶性性药物的总量即得到这一时间点小分子水溶性性药物的累积释放量。
2、体外诱导前成骨细胞成骨分化性能检测
复合微球辐照灭菌后按照10mg/mL的浓度浸泡在DMEM基础培养基内，放入37℃摇床内120rpm浸提24h。浸提完成后将微球及培养基1000rpm离心后收集上清。将收集的浸提液分别用相应的DMEM培养基稀释2倍，最后添加10％胎牛血清得到完全培养基。
将MC3T3-E1细胞按照每孔1×105个的密度接种于24孔板，贴壁培养24h后分别更换完全培养基，在温度为37℃且5％二氧化碳气氛下的培养箱中培养。培养基每2-3d更换一次，培养7天后，MC3T3-E1细胞的成骨分化性能通过其分泌的碱性磷酸酶检测，利用pNPP法进行测定，具体步骤如下：细胞用PBS溶液洗涤后，浸没于含有0.1M甘氨酸、1mM氯化镁以及0.05％曲拉通X-100的PBS溶液。待细胞溶解后，将溶解液与对硝基苯磷酸二钠盐均匀混合，将混合液置于37℃下30min。随后，将混合液滴加到96孔板，用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸光值。根据公式计算出每个支架上细胞中实际的碱性磷酸酶含量。
由实施例及对比例的体外细胞毒性评价结果(表1)可知，本发明方法所制备的复合微球均无细胞毒性。由体外小分子水溶性药物释放性能检测结果可知(图1和表2)，实施例1～5都有长效的小分子水溶性药物释放性能，实施例1与对比例1都是基于装载小分子水溶性药物的复合微球。其中，实施例1在制备复合微球的过程中，使用明胶包裹小分子水溶性药物并形成微球，对比例1则不使用明胶包裹小分子水溶性药物。在没有用明胶包裹小分子水溶性药物的情况下，微球中的小分子水溶性药物在28d内便释放出去，也达不到长效的缓控释的效果。与实施例1相比，对比例3没有添加多巴胺，其小分子水溶性药物释放速度稍快；对比例4没有添加蛋白类药物，其小分子水溶性药物释放速度基本不变。对比例5不含可降解聚酯，诱导组织再生药物在21d内便释放出去，也达不到长效的缓控释的效果；对比例6不含多巴胺和明胶，诱导组织再生药物在35d内便释放出去，也达不到长效的缓控释的效果。使用实施例1的微球，第21天的累计释放率为51.69％，即药物残留率为48.31％。而使用对比例5和6的第21天的累计释放率分别为100％和86.69％，即药物残留率分别为0％和13.31％。对比例5和6的药物残留率之和远低于实施例1，说明明胶、可降解人工合成聚酯、含钙无机颗粒、钙磷层四者具有协同增效作用，这四种成分组合能达到良好的缓释效果。
由体外诱导前成骨细胞成骨分化性能可知(图2)，实施例1～5都有较好的诱导细胞分泌碱性磷酸酶的效果。与实施例1相比，对比例1由于在7天内小分子水溶性药物释放量较大，对细胞活性有不利的作用(表1)，因此细胞分泌的碱性磷酸酶浓度较低；对比例2不使用小分子水溶性药物，其诱导前成骨细胞成骨分化性能主要依靠微球表面固定的蛋白类药物，因此其细胞分泌的碱性磷酸酶浓度也较低；对比例3和4分别不使用多巴胺，其诱导前成骨细胞分泌的碱性磷酸酶较低；对比例5不含可降解聚酯，其诱导前成骨细胞成骨分化性能也较弱，因此细胞分泌的碱性磷酸酶浓度也较低；对比例6不含多巴胺和明胶，该组细胞分泌的碱性磷酸酶也低于实施例1。
表2实施例和对比例样品的药物累计释放率
Claims (10)
1.一种载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球，其特征在于，由内到外依次为装载小分子水溶性药物的明胶微球、包覆所述明胶微球的可降解人工合成聚酯、包覆所述可降解人工合成聚酯表面的多巴胺层以及多巴胺层表面吸附的蛋白类药物。
2.根据权利要求1所述的复合微球，其特征在于，小分子水溶性药物包括阿仑膦酸钠、白藜芦醇、鲑鱼降钙素、唑来磷酸钠、伊班膦酸钠、雷尼酸锶、庆大霉素、红霉素、青霉素、硫酸庆大霉素、盐酸万古霉素中的任一种。
3.根据权利要求1所述的复合微球，其特征在于，蛋白类药物包括骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子、血小板衍生因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、胰岛素样生长因子、甲状旁腺激素、生长激素、白介素中的任一种。
4.根据权利要求1所述的复合微球，其特征在于，装载小分子水溶性药物的明胶微球的平均粒径为0.1～50um。
5.根据权利要求1所述的复合微球，其特征在于，所述可降解聚酯的分子量为1.0～10.0万道尔顿；可降解人工合成聚酯选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚3-羟基烷酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、聚3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯、聚三亚甲基碳酸酯、聚丁二酸丁二酯中的任一种。
6.权利要求1所述的载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用水溶性高分子明胶装载小分子水溶性药物制备装载小分子水溶性药物的明胶微球；(2)装载小分子水溶性药物的明胶微球分散在可降解人工合成聚酯网络中，加入到含表面活性剂的水溶液中，通过乳化溶剂挥发法固化形成复合微球；(3)将复合微球依次分散到含多巴胺及含蛋白类药物的溶液里，获得载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：配制含1～3wt％Span80的液体石蜡，获得油相；配制含0.005～0.05g/ml小分子水溶性药物及0.1～0.4g/ml的明胶水溶液，获得水相；将水相加入到油相中，500～900rpm、50～70℃下搅拌5～60min，随后将温度迅速降至3-5℃，继续搅拌10～45min，加入23-28wt％戊二醛溶液，静置24h，离心，加入异丙醇脱水1～10h，然后依次按丙酮、异丙醇、石油醚的顺序洗涤3次，抽滤，干燥，获得装载小分子水溶性药物的明胶微球；所述水相与油相的体积比为1:4～10；
所述明胶与戊二醛溶液的质量体积比为15～60:1。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：将装载小分子水溶性药物的明胶微球分散于可降解人工合成聚酯溶液中，随后，将上述溶液缓慢滴加到2.5～50mg/ml的表面活性剂水溶液中，250～800rpm下持续搅拌10～24h后将容器底部的复合微球分离出来，制得复合微球；装载小分子水溶性药物的明胶微球与可降解人工合成聚酯的质量比为1：(4～50)；所述表面活性剂选自聚乙烯醇、明胶、甲基纤维素中的任一种。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体包括以下步骤，将复合微球分散于浓度为0.2～2mg/ml的多巴胺的水溶液中，复合微球与多巴胺的质量比为80～200：1，搅拌3～24h，离心、清洗获得具有多巴胺层的微球；然后分散于浓度为0.01～0.1mg/ml的蛋白类药物的水溶液中，4℃下振荡9～24h，离心、清洗获得表面固定有蛋白类药物的微球。
10.权利要求1所述载水溶性药物表面含聚多巴胺层的复合微球的应用，其特征在于，作为支架材料支撑细胞的粘附和增殖，促进细菌感染下的骨组织修复与重建。
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