WO2022225141A1 - Bmp-2 및 알렌드로네이트를 포함하는 순차적 약물 전달체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

Bmp-2 및 알렌드로네이트를 포함하는 순차적 약물 전달체, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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bone
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윤대성
이동택
김인수
정효기
이규도
전옥희
장학
오보이메이단강
김병준
장재원
김현지
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고려대학교 산학협력단
서울대학교 산학협력단
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a sequential drug delivery system comprising BMP-2 and alendronate, a method for preparing the same, and a use of the same for bone regeneration.
  • Bone healing is a multifaceted process that requires mechanical stability and vascularization along with three of osteogenic cells, osteoconductive matrix, and osteoinductive signals.
  • autologous bone transplantation is considered the best method, but additional surgery and related complications may occur for the surgical donor site, and there is a limit to the amount that can be collected.
  • Xenograft transplantation has potential problems such as immune rejection and pathogen transfer. Synthetic bone is the only substitute for xenograft or autologous bone, so there is no risk of infection and there is no restriction in size and shape. There is also a downside to not having it.
  • stem/progenitor cell transplantation is effective in small animal models, it is necessary to overcome stability and efficiency problems for clinical application in humans, and growth factor therapy requires an excessively large amount to induce bone formation. There are limitations.
  • bone tissue engineering has received considerable attention as a promising alternative strategy for reconstructing bone defects and inducing tissue regeneration.
  • Conventional tissue engineering has used biomaterials along with bioactive molecules and cells, a combination that overcomes problems such as long-term cell culture for new bone formation, including the cost of cell transplantation and preservation, as well as the risk of contamination and cell rejection. can suffer
  • in situ bone tissue engineering which mimics the in vivo microenvironment with cell-free osteoinductive biomaterials, may provide a better solution.
  • the method is to directly implant a biomolecule for recruiting host circulating stem cells, such as bone mesenchymal stem cells (BMSC) in situ, into the transplantation site for bone regeneration.
  • BMSC bone mesenchymal stem cells
  • Biomaterials are important elements of in situ bone tissue engineering because they promote the formation of the extracellular matrix (ECM) and provide a three-dimensional (3D) scaffold to support cell growth.
  • ECM extracellular matrix
  • 3D three-dimensional scaffold to support cell growth.
  • Collagen a biologically-derived protein
  • nHAp nano-hydroxyapatite particles
  • the integration of collagen and nHAp not only promotes bone regeneration through the bone-inducing effect of nHAp on BMSCs but also increases the mechanical properties of the collagen scaffold.
  • Bioactive molecules are important components of bone tissue engineering to enhance the function of biomaterials to promote the recruitment and osteogenic differentiation of BMSCs.
  • Recombinant human bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), a US FDA-approved drug, is an essential osteoinductive growth factor for treating bone defects through recruitment of osteoblast progenitors.
  • BMP-2 bone morphogenetic protein 2
  • the osteoinductive factor delivery system developed so far has been developed for the purpose of delivering only BMP-2, and studies have been conducted to release BMP-2 for a longer period using various delivery systems.
  • side effects such as abnormal cancer cell and osteoclast differentiation may occur due to the high dose, resulting in inhibition of bone regeneration or increase in bone resorption at the scaffold graft site.
  • alendronate a drug approved by the FDA for the treatment of osteoporosis, is a therapeutic agent that promotes bone regeneration by treating bone loss caused by osteoclasts by preventing osteoclast recruitment, differentiation, and bone remodeling activity.
  • it is reported to be particularly effective in treating bone loss and osteoporosis by increasing bone density. Therefore, topical and sustained delivery of alendronate may help to continuously inhibit bone resorption during bone healing.
  • the present inventors have completed the present invention by preparing a biodegradable scaffold for bone regeneration that sequentially releases BMP-2 and alendronate, and confirming the synergistic effect of BMP-2 and alendronate on bone regeneration.
  • an object of the present invention is to provide a multi-drug delivery system comprising a support in which bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and alendronate encapsulated in biodegradable polymer microspheres are incorporated.
  • BMP-2 bone morphogenetic protein-2
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for bone regeneration, including the multi-drug carrier.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a multi-drug delivery system.
  • the present invention provides a scaffold containing (i) bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and (ii) alendronate encapsulated in biocompatible polymer microspheres. ), as a multi-drug carrier, wherein the BMP-2 and alendronate are sequentially released from the support, providing a multi-drug carrier.
  • BMP-2 bone morphogenetic protein-2
  • alendronate alendronate encapsulated in biocompatible polymer microspheres.
  • the drug delivery system may be one in which the BMP-2 and alendronate are incorporated into a collagen-hydroxyapatite scaffold.
  • the biocompatible polymer may be poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA).
  • the average diameter of the microspheres encapsulated in the alendronate may be 10 to 150um.
  • 0.1 to 10 ⁇ g of the BMP-2 may be incorporated in the support.
  • the alendronate may be released from 10 to 15 days after the start of the release of BMP-2.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for bone regeneration comprising the multi-drug carrier.
  • the present invention provides a method for preparing a multi-drug delivery system comprising the following steps.
  • step (c) mixing the collagen-hydroxyapatite slurry prepared in step (a), the alendronate-encapsulated microspheres and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2).
  • the present invention provides a method for bone regeneration, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising the multi-drug carrier.
  • the present invention provides the use of the multi-drug delivery system for bone regeneration.
  • the multi-drug delivery system according to the present invention can minimize the side effects of BMP-2 by using a significantly lower concentration of BMP-2 compared to the prior art, and the side effects of BMP-2 through sequential release with alendronate, that is, osteoclast It is expected that it will be usefully used for bone regeneration for the treatment of bone diseases caused by various causes, since it is possible to induce a significantly improved bone regeneration effect by maximizing drug efficacy by inhibiting aggregate resorption due to cell differentiation. .
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a sequential drug delivery system according to the present invention using BMP-2 and alendronate (ALN).
  • CHAS collagen-hydroxyapatite scaffold
  • FIG. 3 is a result of analyzing the in vitro release profile of BMP-2 and alendronate
  • FIGS. 3a and 3b are results showing the initial or delayed release of BMP-2 ( FIG. 3a ) and alendronate ( FIG. 3b ), respectively.
  • FIG. 4 is a result of in vitro osteogenic analysis of CHAS containing BMP-2 and/or alendronate
  • FIG. 4a is a result of verifying the cytotoxicity of CHAS by measuring cell viability by CCK-8 assay
  • FIG. 4b shows the results of analysis of ALP activity of osteoblasts in the CHAS.
  • ⁇ -CT micro-computed tomography
  • Figure 6 shows the quantitative analysis results of the newly formed bone volume 2, 4 and 8 weeks after implanting each CHAS in a cranial defect rat model.
  • Figure 7 is the result of histological analysis of bone regeneration at the defect site after each CHAS implantation in a cranial defect rat model and after 4 and 8 weeks, respectively, a tissue section image subjected to H&E staining and Masson's trichrome (MT) staining, and This is the result of quantifying the ratio of the area stained in red as a result of MT staining.
  • MT Masson's trichrome
  • the present invention relates to a multi-drug delivery system for bone regeneration.
  • the drug delivery system is composed of a support in which BMP-2 and alendronate encapsulated in biodegradable polymer microspheres are impregnated, and BMP-2 and alendronate for bone regeneration are The present invention was completed by confirming the synergistic effect through specific experiments.
  • the present invention provides a multi-drug delivery system comprising a support in which (i) bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) and (ii) alendronate encapsulated in biocompatible polymeric microspheres are incorporated,
  • It provides a multi-drug delivery system, characterized in that the BMP-2 and alendronate are sequentially released from the support.
  • the scaffold may be a collagen-hydroxyapatite scaffold.
  • the collagen is a biocompatible material approved by the US FDA and the Korean Ministry of Food and Drug Safety, and generally has excellent cell adhesion and easy molding when used as a BMP carrier.
  • hydroxyapatite (hydroxyapatite; HA) is also called hydroxyapatite, and is a resistant component of the complex apatite group. Since hydroxyapatite is found in teeth and bones within the body, it can be used as a filler to replace amputated bone or as a coating to promote bone ingrowth toward artificial implants.
  • the bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is a protein belonging to the TGF- ⁇ superfamily, and, like other bone morphogenetic proteins, plays an important role in the development of bone and cartilage for osteoinductive growth.
  • BMP-2 is known to strongly induce the differentiation of osteoblasts in various cell types.
  • side effects such as abnormal cancer cell and osteoclast differentiation occur, and bone regeneration is inhibited or bone resorption at the transplant site is inhibited. Increasing results may occur.
  • alendronate a bisphosphonate-based drug approved as a treatment for osteoporosis, was used to promote bone formation by suppressing the side effects of BMP-2.
  • the alendronate used as the bone formation promoting substance is an amino-bisphosphonate drug and has the following structure.
  • the substance is known to inhibit osteoclasts, thereby preventing and treating osteoporosis, inhibiting the formation of osteoclasts by reducing RANKL on the surface of osteoblasts, and increasing the proliferation and differentiation of osteoblasts.
  • the biocompatible polymer is poly(lactic acid-co-glycolic acid) (PLGA), polycaprolactone, polylactic acid (PLA), polylactide, polyglycolic acid, polyphosphazine, polyimino Carbonates, polyphosphoesters, polyanhydrides, polyorthoesters, copolymers of lactic/glycolic acid and caprolactone, polyhydroxyvalates, polyhydroxybutyrates, polyamino acids and lactic acid and amino acids It may be selected from the group consisting of copolymers of, and preferably, PLGA.
  • the drug delivery system according to the present invention is encapsulated in biocompatible polymeric microspheres, preferably PLGA microspheres, for controlled release of alendronate, and from about 10 to 15 days, preferably from 12 to 15 days after the start of the release of BMP-2. It can be released from day 1, more preferably from day 13 to day 15, and most preferably from day 14, and through this, osteoclast differentiation by BMP-2 and bone resorption can be suppressed to promote bone formation. .
  • the release timing can be controlled by controlling the size of the microspheres of the biocompatible polymer encapsulated with alendronate.
  • the average diameter of the biocompatible polymer microspheres encapsulated with alendronate according to the present invention may be specifically 10 to 150um, preferably 10 to 100um, more preferably 10 to 80um, still more preferably 10 to 50um, more Even more preferably, it may be 20 to 40um, most preferably 30um, but is not limited thereto.
  • the BMP-2 may be incorporated in an amount of 0.1 to 10 ⁇ g in the support to minimize side effects due to the use of high concentration and high content, preferably 0.5 to 5 ⁇ g, more preferably 0.7 to 4 ⁇ g, still more preferably Preferably 0.8 to 3ug, even more preferably 0.9 to 2ug, and most preferably 1ug may be incorporated, but is not limited thereto.
  • the present inventors prepared a multi-drug delivery system according to the present invention through specific examples, and verified the bone regeneration effect thereof.
  • the bone formation performance of the drug delivery system according to the present invention was analyzed in vitro .
  • the carrier did not induce cytotoxicity through CCK-8 assay, and after culturing pro-osteoblasts using CHAS loaded with BMP-2 and/or alendronate, alkaline phosphatase (ALP)
  • ALP alkaline phosphatase
  • the scaffold in order to analyze the in vivo osteogenesis performance by the drug delivery system according to the present invention, that is, CHAS containing alendronate encapsulated in BMP-2 and PLGA microspheres, the scaffold is implanted in a cranial defect rat model. After that, ⁇ -CT images were taken, and the increase in bone volume/total volume (BV/TV) was analyzed. As a result, it was confirmed that, when the delivery system according to the present invention was used, bone regeneration was promoted and the bone content increased with the passage of time after transplantation. In addition, it was confirmed that mature bone was generated through histological analysis (see Examples 5-1 and 5-2).
  • the bone regeneration effect of the drug delivery system according to the present invention which sequentially released BMP-2 and alendronate, was about twice or more higher than that of the delivery system that simply released BMP-2. This is to prove the excellent bone regeneration effect of the drug delivery system.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for bone regeneration comprising the multi-drug carrier.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diseases requiring bone regeneration or bone formation, including the multi-drug carrier.
  • bone regeneration may be used interchangeably with bone formation, and includes promoting bone formation by healing lost bone tissue. Specifically, it may include both increasing the amount of bone tissue, bone cells, or bone matrix, or shortening the amount of time the amount is increased.
  • Treatment refers to any action in which the symptoms of a disease or disease requiring bone regeneration or promotion of bone formation are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • prevention refers to inhibiting the occurrence of a disease or disease requiring bone regeneration or promotion of bone formation by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Diseases that require bone regeneration and promotion of bone formation in the present invention may include fractures, alveolar bone regeneration, arthroplasty, vertebral union, and osteocysts/bone tumors, etc. It can be used for various diseases requiring surgical operation, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes the multi-drug carrier as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in formulation, and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It does not, and may further include other conventional additives such as antioxidants and buffers, if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations formulations can be preferably made according to each component using the method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to a desired method, but parenteral administration for topical application is preferred. .
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient into the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination, and may be appropriately determined by those skilled in the art. can be selected.
  • the present invention provides a method for bone regeneration comprising administering to an individual a composition comprising the drug delivery system.
  • “individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle. means mammals.
  • the present invention provides a method for preparing the multi-drug delivery system comprising the following steps.
  • step (c) mixing the collagen-hydroxyapatite slurry prepared in step (a), the alendronate-encapsulated microspheres and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2).
  • the step (a) is a step for preparing a collagen-hydroxyapatite slurry.
  • the step (a) may be performed by omitting the chemical cross-linking step to avoid protein loss in solution, and it is preferable that the entire process be performed at a temperature of 4° C. in order to prevent collagen gelation and thermal denaturation.
  • a slurry is prepared by mixing the collagen solution and hydroxyapatite nanoparticles ( ⁇ 200 nm), stirring, and blending the suspension through a homogenizer at 15,000 rpm for 10 to 30 minutes, preferably for 20 minutes.
  • a process of degassing the slurry in vacuum to remove air bubbles may be performed.
  • step (b) is a step of preparing biocompatible polymeric microspheres encapsulated in alendronate.
  • the step (b) may be performed using a W/O/W (Water-in-oil-in-water) technology.
  • the biocompatible polymer is poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polycaprolactone, polylactic acid (PLA), polylactide, polyglycolic acid, polyphosphazine, polyiminocarbonate, polyphospho Esters, polyanhydrides, polyorthoesters, copolymers of lactic/glycolic acid and caprolactone, polyhydroxyvalates, polyhydroxybutyrates, polyamino acids and copolymers of lactic acid and amino acids It may be one selected from the group, preferably PLGA.
  • the PLGA polymer may be dissolved in dichloromethane, alendronate dissolved in sodium hydroxide (NaOH) may be added to the polymer solution, and then homogenized to form a primary emulsion (W/O). Then, the alendronate-encapsulated biocompatible polymer microspheres can be prepared by adding the mixed polymer solution dropwise to the polyvinyl alcohol aqueous solution in a dropwise manner and then stirring in the open air for about 6 hours to evaporate the organic solvent.
  • NaOH sodium hydroxide
  • step (c) is a step for preparing alendronate-encapsulated microspheres and BMP-2-encapsulated collagen-hydroxyapatite support.
  • Step (c) may be accomplished by gently mixing rhBMP-2 and the PLGA microspheres with the slurry prepared in step (a), and in one embodiment of the present invention, 150 ⁇ L of CHAS slurry and 1 ug of rhBMP-2 in total In an 8 mm (width) ⁇ 2 mm (height) polydimethylsiloxane (PDMS) mold, the alendronate-encapsulated microspheres and BMP-2-impregnated collagen-hydroxyapatite scaffolds were produced. Thereafter, the prepared support is freeze-dried at -80°C, and a process of sterilization by irradiating UV at 4°C for 4 hours may be additionally performed.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • rat tail-derived collagen type I (3.8 mg/ml) and a neutralizing solution were purchased from Advanced BioMatrix (CA, USA).
  • Recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) was purchased from Peprotech (NJ, USA), and nano-hydroxyapatite particles (nHAp) were purchased from Sigma-Aldrich, USA. It was purchased and it was confirmed that the particle size was within 200 nm through a scanning electron microscope (SEM).
  • Cell counting kit-8 (CCK-8) and the rhBMP-2 ELISA kit were purchased from Goma Biotech (Korea), and carboxyl (Carboxyl)-terminated 50:50 PLGA (0.67dl/g) was purchased from LACTEL Absorbable Polymers. did.
  • polyvinyl alcohol (Mw 13,000-23,000), dichloromethane (DCM), alendronate (alendronate; hereinafter ALN), sodium hydroxide (sodium hydroxide), 2-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol; 2ME) and ortho-phthalaldehyde (OPA) were purchased from Sigma-Aldrich, Korea.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) and penicillin-streptomycin were purchased from Gibco.
  • CHAS was prepared by omitting the chemical crosslinking step to avoid protein loss in solution before use in in vitro and in vivo experiments. Specifically, 2 mL of collagen solution (3.8 mg/mL) was added to each vial and the collagen solution was stirred with 100 mg of nano-hydroxyapatite particles (nHAp, ⁇ 200 nm). In addition, in order to prevent unintentional gelation and thermal denaturation of collagen, the entire manufacturing process was performed at a temperature of 4°C. The suspension was blended for 20 minutes at 15,000 rpm using an overhead blender in a reaction vessel maintained at 4°C, and the slurry was degassed in vacuo to remove air bubbles, which could lead to uncontrolled porosity.
  • PLGA microspheres encapsulated with rhBMP-2 (R&D Systems, UK) and ALN were then gently mixed with the CHAS slurry before the degassing step to incorporate rhBMP-2 and ALN into the support, followed by using 150 ⁇ L of the CHAS slurry for 8 mm ( A support was produced in a polydimethylsiloxane (PDMS) mold in the form of width) ⁇ 2 mm (height). At this time, 1ug of rhBMP-2 per one CHAS was incorporated. Next, the prepared CHAS was gelled for 3 hours, lyophilized at -80°C using a constant cooling freeze-drying protocol, and sterilized by irradiation with UV light ( ⁇ nm) at 4°C for 4 hours.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the hydrogel was placed in 3 mL PBS and placed in a shaking incubator (WIS-20, Daihan Scientific, Korea) at 120 rpm and 37°C. At that point up to day 28, the release medium (ie, PBS buffer) was extracted and replaced with fresh PBS buffer. Thereafter, the protein concentration released from CHAS was confirmed using a rhBMP-2 ELISA kit (KOMA Biotech, Korea) through a microplate reader (Versa Max, Molecular Devices, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • a rhBMP-2 ELISA kit (KOMA Biotech, Korea) through a microplate reader (Versa Max, Molecular Devices, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • PLGA microspheres containing BMP-2 or ALN were prepared using a water-in-oil-in-water (W/O/W) technique. Specifically, 400 mg PLGA polymer was dissolved in 10 mL of dichloromethane (DCM), and ALN dissolved in 0.05M NaOH (0.25 mL, 4% w/v) or BMP-2 dissolved in PBS was added to the polymer solution. and homogenized at 3000 rpm for 1 minute to form a primary emulsion (W/O).
  • DCM dichloromethane
  • ALN 0.05M NaOH (0.25 mL, 4% w/v
  • BMP-2 dissolved in PBS was added to the polymer solution. and homogenized at 3000 rpm for 1 minute to form a primary emulsion (W/O).
  • Osteoblasts (MC3T3-E1) and osteoclast progenitor cells (RAW 264.7) were cultured in DMEM supplemented with 100 units/mL of penicillin-streptomycin and 20% FBS under conditions of 37° C. and 5% CO 2 , and the cells were cultured in the culture area. It was subcultured when it reached 70-90% of In the present invention, a CCK-8 cell viability kit was used to measure cell viability. Specifically, for cell viability assay, cells were cultured in CHAS at a density of 2.0 ⁇ 10 4 cells/well for 3 and 7 days, respectively. Next, CCK-8 reagent (10 ⁇ L) was added to the serum-free medium and incubated at 37° C. for 3 hours.
  • CCK-8 reagent (WST-8) is reduced by dehydrogenases in cells to form yellow formazan.
  • the intensity of the color was measured with an absorbance of 450 nm with a reference wavelength of 650 nm using a microplate reader.
  • pNPP frozen pnitrophenyl phosphate
  • each rat was anesthetized with isoflurane, and alfaxalone (ALFAXAN CIV 80 mg/kg) and xylazine (Rompun, 10 mg/kg) were intraperitoneally administered for deeper anesthesia. . After anesthesia, the hair on the scalp covering the cranial projections was shaved and disinfected with Betadine (Hyundai Pharm, Korea).
  • a subcutaneous injection containing 0.3ml of 2% lidocaine and 1:100,000 epinephrine was administered along the mid-sagittal line of the skull to be local anesthetized, and a length of 4 cm above the scalp from the nasal bone to the mid-sagittal crest A sagittal incision was made. Thereafter, the full-thickness flap was raised and the periosteum was incised to expose the skull bones, and then a defect of 8 mm critical size was created using a trephine bur under sterile saline irrigation. Extensive care was taken to excise the calvarium and avoid damage to the dura mater.
  • rats were randomly distributed to 6 rats per group and divided into the following 7 groups: ( ⁇ ) Sham/empty defect, ( ⁇ ) Control/vehicle control, ( ⁇ ) ALN, ( ⁇ ) BMP-2, ( ⁇ ) ) A+B(P), ( ⁇ ) A+B(E) and (vii) B+A(E). Samples were then randomly assigned to each group. After transplanting the surrounding soft tissue and sealing the skin, analgesics were administered to the animals until recovery, and it was confirmed that there were no side effects after the operation.
  • a circular region of predefined size was selected as a region of interest (ROI) in the two-dimensional image, and the pixel region representing ossification in the defined ROI was defined as the lower and upper bounds of the threshold using gray scale units.
  • a volume of interest (VOI) was generated from the range and reconstructed in 3D, where new bone formation was determined by setting the gray threshold level to 1000.
  • the percentage of new bone volume fractures (BV/TV) was calculated by dividing the newly formed BV by the fracture of the original TV.
  • H&E hematoxylin and eosin
  • MT Masson's trichrome
  • the assay experiments were performed independently in triplicate. Statistical analysis was performed using prism7 software (GraphPad Software, Inc., USA) to evaluate differences between groups through analysis of variance (ANOVA), as follows: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p Differences of ⁇ 0.001 were considered statistically significant. The size of nHAps, pore distribution of PLGA microspheres, and MT-stained area were analyzed with ImageJ software (V1.8.0_172, NIH, USA).
  • ALN-encapsulated PLGA microspheres were prepared using the W/O/W technique. Specifically, ALN can be encapsulated into PLGA microspheres via a direct capture method and released in a sustained manner. The diameter of PLGA microspheres was controlled by adjusting the concentration of PLGA. ALN encapsulated with PLGA microspheres was prepared by adding an ALN solution during the fabrication of PLGA microspheres.
  • BMP-2 was physically adsorbed to CHAS and ALN encapsulated in PLGA microspheres was incorporated into the support to prepare a multi-drug delivery system (B+A(E)) according to the present invention.
  • CHAS in which neither BMP-2 nor ALN was incorporated was used.
  • a CHAS-based transporter was prepared in which BMP-2 and ALN were simultaneously released, in which case ALN was directly incorporated into CHAS rather than PLGA microspheres.
  • Table 1 each experimental group and its abbreviations are summarized in Table 1 below.
  • the size and shape of PLGA microspheres and nHAp were investigated, respectively.
  • the average diameter of PLGA microspheres was measured to be 29.4 ⁇ 8.64 ⁇ m, and the shape or size of PLGA microspheres was large for the loading of ALN or BMP-2 on CHAS. It was confirmed that there was no influence. Meanwhile, the pore size of PLGA microspheres gradually increased with the degradation time.
  • nano-sized nHAp improved bone induction compared to micro-sized HAp
  • nano-sized nHAp average diameter of 97.7 ⁇ 57 nm
  • BMP-2 and ALN from CHAS were analyzed in vitro using the BMP-2 ELISA kit and spectrophotometry, respectively.
  • 30% of the total BMP-2 was rapidly released from the support on the first day, and up to 90% of BMP-2 was accumulated until 7 days later. Confirmed.
  • BMP-2 (BMP-2(E)) encapsulated into PLGA microspheres showed delayed release compared to the BMP-2. Specifically, it was found that only 10% of the total BMP-2 was initially released, and it was confirmed that it was released up to 4 weeks.
  • the present inventors implanted each CHAS scaffold in Table 1 into the cranial defect rat model prepared in Examples 1-8, and after 2, 4 and 8 weeks, the accumulation of bone-like tissue in the skull defect through in vivo ⁇ -CT images and maturity were evaluated.
  • FIG. 5 after 2, 4, and 8 weeks (2, 4 and 8 weeks), the bone of the group transplanted with BMP-2 and B+A(E), respectively, compared to the group transplanted with other supports. It was observed that the content increased. In addition, it was confirmed that new bone was created from the edge to the center of the defect site.
  • the bone volume fraction was highest in the B+A(E) scaffold in which BMP-2 and ALN were sequentially released.
  • the increase in bone volume/total volume (BV/TV) of BMP-2 and B+A(E) scaffolds was analyzed.
  • the BV/TV increase rates of the BMP-2 and B+A(E) scaffolds were measured to be 27.16% and 35.62% ( p ⁇ 0.05), respectively, during the first 2 weeks. At 4 weeks, they were 41.99% and 54.71% ( p ⁇ 0.01), respectively, and after 8 weeks, they were 46.58% and 76.23% (p ⁇ 0.001), respectively.

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Abstract

본 발명은 BMP-2 및 알렌드로네이트를 포함하는 순차적 약물 전달체, 이의 제조방법 및 이의 골재생 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다중 약물 전달체는 종래 기술과 비교하여 BMP-2를 현저히 낮은 농도로 사용함으로써 BMP-2의 부작용을 최소화할 수 있고 알렌드로네이트와의 순차적 방출을 통해 BMP-2의 부작용 즉, 파골세포 분화로 인한 골재흡수를 억제함으로써 약물 효능을 극대화시켜 현저히 향상된 골재생 효과를 유도할 수 있는바, 다양한 원인으로 발생하는 골 질환의 치료를 위한 골재생 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

BMP-2 및 알렌드로네이트를 포함하는 순차적 약물 전달체, 이의 제조방법 및 이의 용도
본 발명은 BMP-2 및 알렌드로네이트를 포함하는 순차적 약물 전달체, 이의 제조방법 및 이의 골재생 용도에 관한 것이다.
외상, 종양 절제 또는 대사질환 등 다양한 원인으로 인한 골질환 환자 수는 전세계적으로 증가하고 있으며, 이에 따라 관련 시장규모 또한 지속적으로 증가하는 추세이다. 또한, 인구 고령화와 더불어 수술기법의 발전으로 외상, 인공관절 수술, 척추 유합술과 같은 부분에서 골의 치유를 필요로 하는 수요가 늘어나고 있다.
골의 치유는 골형성 세포, 골전도 기질, 골유도 신호의 세가지와 더불어 기계적 안정성 및 혈관화 과정을 필요로 하는 다각적인 과정이다. 이러한 측면에서 자가 골 이식은 최선의 방법으로 여겨지나, 수술 공여부에 대한 추가적인 수술 및 이와 관련된 합병증이 발생할 수 있고, 채취할 수 있는 양에 제한이 있다. 이종골 이식은 면역거부반응 및 병원체 전달과 같은 잠재적인 문제점이 있으며, 합성골은 이종골이나 자가골의 유일한 대체재로써 감염의 위험이 없고 크기, 모양에 제한이 없지만 골재생 효과가 우수하지 않으며 골유도성 또한 없다는 단점이 있다. 또한, 줄기/전구세포의 이식치료가 작은 동물모델에서는 유효한 효과가 있으나, 인간에 임상 적용을 위해서는 안정성 및 효율성 문제의 극복이 필요하며, 성장인자 치료법은 골 생성 유도를 위해 과다하게 많은 양이 필요한 한계점이 있다.
이에 따라 골재생을 위한 효과적인 방법의 개발이 요구되어 왔으며, 이러한 측면에서 골 조직공학은 골 결함을 재구성하고 조직 재생을 유도하기 위한 유망한 대안 전략으로 상당한 주목을 받아왔다. 기존의 조직공학에는 생체활성 분자 및 세포와 함께 생체 물질이 사용되었는데, 이러한 조합은 세포 이식 및 보존을 위한 비용 뿐만아니라 오염 및 세포 거부 위험을 포함하여 새로운 골형성을 위한 장기 세포 배양과 같은 문제를 겪을 수 있다. 이에 대한 대안으로, 세포가 없는 골유도성 생체재료로 생체 내 미세 환경을 모방하는 in situ 골 조직공학은 더 나은 해결책을 제공할 수 있다. 상기 방법은 골재생을 위한 골 중간엽 줄기세포 (bone mesenchymal stem cell; BMSC)와 같은 숙주 순환 줄기세포를 in situ로 모집하기 위한 생체 분자를 이식 부위에 직접 이식하는 것이다. 생체 재료는 세포외 기질 (extracellular matrix; ECM)의 형성을 촉진하고 세포 성장을 지지하는 3차원 (3D) 스캐폴드를 제공하기 때문에 in situ 골 조직공학의 중요한 요소이다. 생물학적 유래 단백질인 콜라겐 (Collagen)은 생체활성 분자의 활성을 효과적으로 보존하고 BMSCs의 골형성 분화를 도울 수 있기 때문에 효과적인 골 조직 공학의 재료로 여겨진다. 또한 나노하이드록시아파타이트 입자 (nano-hydroxyapatite particles; nHAp)는 체내 뼈와 화학적으로 유사하기 때문에 우수한 골 전도성을 나타낸다고 알려져 있다. 따라서 콜라겐과 nHAp의 통합은 BMSC에 대한 nHAp의 골 유도 효과를 통해 골재생을 촉진시킬 뿐만아니라 콜라겐 스캐폴드의 기계적 특성을 증가시킨다고 알려져 있다.
생체활성 분자는 BMSCs의 모집 및 골형성 분화를 촉진하기 위해 생체 물질의 기능을 향상시키는 골 조직 공학의 중요한 요소이다. 미국 FDA 승인 약물인 재조합 인간 골 형태형성 단백질-2 (bone morphogenetic protein 2; BMP-2)는 조골세포 (osteoblast) 전구세포의 모집을 통해 골 결손을 치료하기 위한 필수적인 골유도성 성장인자이다. 그러나 현재까지 개발된 골유도성 인자 전달 시스템의 경우 BMP-2만을 전달하기 위한 용도로 개발되었고, 다양한 전달 시스템을 이용해 BMP-2를 더욱 오랫동안 방출하는 연구들이 진행되었다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, 단일 BMP-2만을 사용하는 경우 높은 용량으로 인해 비정상적인 암세포 및 파골세포 분화와 같은 부작용이 발생하여 스캐폴드 이식 부위에 골재생이 억제되거나 골재흡수가 증가하는 결과가 초래될 수 있다.
한편, FDA에서 골다공증 치료 용도로 승인 받은 약물인 알렌드로네이트 (Alendronate; ALN)는 파골세포의 모집, 분화 및 골 재형성 활성을 방지하여 파골세포에 의한 골 손실을 치료하여 골재생을 촉진하는 치료제이다. 또한, 골밀도를 증가시켜 골손실 및 골다공증 치료에 특히 효과적인 것으로 보고되어 있다. 따라서 알렌드로네이트의 국소적이고 지속적인 전달은 골치유 중에 골흡수를 지속적으로 억제하는 데 도움이 될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 BMP-2와 알렌드로네이트를 순차적으로 방출하는 골재생용 생분해성의 지지체를 제조하고, 골재생에 대한 BMP-2와 알렌드로네이트의 상승효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2) 및 생분해성 고분자 미립구에 봉입된 알렌드로네이트 (Alendronate)가 함입된 지지체를 포함하는, 다중 약물 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 약물 전달체를 포함하는, 골재생용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다중 약물 전달체의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2) 및 (ii) 생체적합성 고분자 미립구에 봉입된 알렌드로네이트 (Alendronate)가 함입된 지지체 (scaffold)를 포함하는, 다중 약물 전달체로서 상기 BMP-2 및 알렌드로네이트는 상기 지지체로부터 순차적으로 방출되는 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 약물 전달체는 상기 BMP-2 및 알렌드로네이트가 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체 (Collagen-hydroxyapatite scaffold)에 함입된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 생체적합성 고분자는 PLGA (poly(lactic-co-glycolic acid))일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 알렌드로네이트가 봉입된 미립구의 평균 직경은 10 내지 150um일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 BMP-2는 지지체 내에 0.1 내지 10ug이 함입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 알렌드로네이트는 BMP-2의 방출 시작 후 10 내지 15일째부터 방출되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 다중 약물 전달체를 포함하는, 골재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 다중 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
(a) 콜라겐 (collagen) 용액과 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite) 나노입자를 혼합하여 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리 (slurry)를 제조하는 단계;
(b) 생체적합성 고분자 중합체 용액에 알렌드로네이트 (Alendronate)를 첨가한 후 교반하여 알렌드로네이트를 생분해성 고분자 미립구 내로 봉입시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a)에서 제조된 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리, 상기 알렌드로네이트가 봉입된 미립구 및 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2)를 혼합하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 다중 약물 전달체를 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골재생 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 약물 전달체의, 골재생 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 다중 약물 전달체는 종래 기술과 비교하여 BMP-2를 현저히 낮은 농도로 사용함으로써 BMP-2의 부작용을 최소화할 수 있고 알렌드로네이트 (alendronate)와의 순차적 방출을 통해 BMP-2의 부작용 즉, 파골세포 분화로 인한 골재흡수를 억제함으로써 약물 효능을 극대화시켜 현저히 향상된 골재생 효과를 유도할 수 있는바, 다양한 원인으로 발생하는 골 질환의 치료를 위한 골재생 용도로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 BMP-2 및 알렌드로네이트 (ALN)를 이용한 본 발명에 따른 순차적 약물 전달 시스템의 개략도이다.
도 2는 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체 (collagen-hydroxyapatite scaffold; CHAS)의 형태학적 분석을 실시한 결과로, SEM 및 μ-CT 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 BMP-2 및 알렌드로네이트의 in vitro 방출 프로파일을 분석한 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 각각 BMP-2 (도 3a) 및 알렌드로네이트 (도 3b)의 초기 또는 지연된 방출을 보여주는 결과이다.
도 4는 BMP-2 및/또는 알렌드로네이트가 함입된 CHAS에 대한 in vitro 골형성 분석을 실시한 결과로서, 도 4a는 CCK-8 어세이로 세포 생존율을 측정하여 상기 CHAS의 세포독성 여부를 검증한 결과이고, 도 4b는 상기 CHAS에서 조골세포의 ALP 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 두개골 결함 랫트 모델에 각 CHAS를 이식하고 골재생 효과를 평가하기 위해 2, 4 및 8주 후 촬영한 마이크로-컴퓨터 단층촬영 (μ-CT) 이미지 결과이다.
도 6은 두개골 결함 랫트 모델에 각 CHAS를 이식하고 2, 4 및 8주 후 새로 형성된 골 부피의 정량적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 두개골 결함 랫트 모델에 각 CHAS를 이식하고 각각 4 및 8주 후 결함 부위에서 골재생 여부를 조직학적으로 분석한 결과로서, H&E 염색 및 Masson's trichrome (MT) 염색을 실시한 조직 절편 이미지, 및 MT 염색 결과 적색으로 염색된 영역의 비율을 정량화한 결과이다.
본 발명은 골재생을 위한 다중 약물 전달체에 관한 것으로, 구체적으로 상기 약물 전달체는 BMP-2 및 생분해성 고분자 미립구에 봉입된 알렌드로네이트가 함입된 지지체로 구성되며, 골재생에 대한 BMP-2와 알렌드로네이트의 상승효과를 구체적인 실험을 통해 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (i) 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2) 및 (ii) 생체적합성 고분자 미립구에 봉입된 알렌드로네이트 (Alendronate)가 함입된 지지체를 포함하는, 다중 약물 전달체로서,
상기 BMP-2 및 알렌드로네이트는 상기 지지체로부터 순차적으로 방출되는 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 지지체는 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체 (Collagen-hydroxyapatite scaffold)인 것일 수 있다.
상기 콜라겐 (collagen)은 미국 FDA 및 우리나라 식약처의 허가를 받은 생체적합성 재료로서, BMP 전달체로 사용시 일반적으로 세포접착성이 우수하고 성형이 용이한 장점이 있다.
상기 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite; HA)는 수산화인회석이라고도 하며, 복합적 아파타이트군의 내성분이다. 하이드록시아파타이트는 몸 안에 있는 치아와 뼈에서 발견되므로 절단된 뼈를 대신하기 위한 필러나 인공 임플란트 쪽으로 뼈의 내성장 (ingrowth)를 촉진하기 위한 코팅제로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2)는 TGF-β수퍼패밀리에 속하는 단백질로서, 다른 골 형태형성 단백질들과 마찬가지로 뼈와 연골의 발달에 있어서 중요한 역할을 하는 골유도성 성장인자이다. 구체적으로 BMP-2는 다양한 세포 유형에서 조골세포의 분화를 강력하게 유도하는 것으로 알려져 있으나, 고농도로 이용하는 경우 비정상적인 암세포 및 파골세포 분화와 같은 부작용이 발생하여 이식 부위에서 골재생이 억제되거나 골재흡수가 증가하는 결과가 나타날 수 있다.
이에 본 발명에서는 BMP-2의 부작용을 억제함으로써 골형성을 촉진시키기 위해 골다공증 치료제로 승인 받은 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 계열 약물인 알렌드로네이트 (Alendronate)를 이용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 골형성 촉진물질로 사용된 알렌드로네이트는 아미노-비스포스포네이트계 약물로 하기와 같은 구조를 갖는다. 상기 물질은 파골세포를 억제시켜 골다공증 예방과 치료 효과가 있으며, 조골세포 표면의 RANKL을 감소시켜 파골세포의 형성을 억제시키고, 조골세포의 증식과 분화를 증가시키는 것으로 알려져 있다.
[Alendronate]
Figure PCTKR2022000530-appb-I000001
본 발명에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리글리콜산, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리언하이드라이드 (polyanhydride), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 락트산/글리콜산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산 및 락트산과 아미노산의 공중합체로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 PLGA일 수 있다.
상기 BMP-2의 부작용 즉, 파골세포의 분화 및 파골세포에 의한 골흡수는 골재생의 중간 단계 후에 발생하므로, 알렌드로네이트를 조기 방출하는 것은 파골세포의 활성을 억제하는 효과를 달성할 수 없다. 따라서 본 발명에 따른 약물 전달체는 알렌드로네이트의 제어된 방출을 위해 생체적합성 고분자 미립구, 바람직하게 PLGA 미립구에 봉입되어 있으며, BMP-2의 방출 시작 후 약 10일 내지 15일, 바람직하게는 12일 내지 15일, 더욱 바람직하게는 13일 내지 15일, 가장 바람직하게는 14일부터 방출될 수 있고, 이를 통해 BMP-2에 의한 파골세포 분화 및 이에 따른 골 재흡수를 억제하여 골형성을 촉진할 수 있다.
본 발명에서, 상기 알렌드로네이트가 봉입된 생체적합성 고분자 미립구의 크기를 조절함으로써 방출 시기를 조절할 수 있는데, 예컨대 미립구의 크기가 클수록 입자가 용해되는 속도가 느려져 알렌드로네이트의 지연 방출에 도움을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 상기 알렌드로네이트가 봉입된 생체적합성 고분자 미립구의 평균 직경은 구체적으로 10 내지 150um일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 100um, 더욱 바람직하게는 10 내지 80um, 더더욱 바람직하게는 10 내지 50um, 더더더욱 바람직하게는 20 내지 40um, 가장 바람직하게는 30um일 수 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 BMP-2는 고농도 및 고함량 사용으로 인한 부작용을 최소화하기 위해 지지체 내에 0.1 내지 10ug이 함입될 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 5ug, 더욱 바람직하게는 0.7 내지 4ug, 더더욱 바람직하게는 0.8 내지 3ug, 더더더욱 바람직하게는 0.9 내지 2ug, 가장 바람직하게는 1ug이 함입될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 다중 약물 전달체를 제조하고, 이의 골재생 효과를 검증하였다.
본 발명의 일실시예에서는, in vitro에서 상기 전달체로부터 BMP-2 및 알렌드로네이트의 방출 프로파일을 분석한 결과, PLGA 미립구의 캡슐화가 지연된 방출을 유도하는 것을 확인하였으며, 따라서 본 발명에 따른 다중 약물 전달체인 CHAS로부터 알렌드로네이트는 BMP-2가 방출되고 2주 후부터 8주 동안 지속적으로 방출되는 것을 확인하였다 (실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 약물 전달체에 의한 골형성능을 in vitro에서 분석하였다. 먼저 CCK-8 어세이를 통해 상기 전달체가 세포독성을 유발하지 않는 것을 확인하였고, BMP-2 및/또는 알렌드로네이트가 탑재된 CHAS를 이용하여 전-조골세포를 배양한 후 알칼라인 포스파타아제 (ALP) 활성을 측정한 결과 본 발명에 따른 BMP-2 및 PLGA 미립구에 봉입된 알렌드로네이트가 함입된 CHAS에서 ALP 수준이 가장 높은 것을 확인하였다 (실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 약물 전달체, 즉 BMP-2 및 PLGA 미립구에 봉입된 알렌드로네이트가 함입된 CHAS에 의한 in vivo 골형성능을 분석하기 위해 두개골 결손 랫트 모델에 상기 지지체를 이식한 후 μ-CT 영상을 촬영하고 골 부피/총 부피(BV/TV) 증가 여부를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 전달체를 이용한 경우 이식 후 시간이 흐름에 따라서 골재생이 촉진되며 골 함량이 증가한 것을 확인하였다. 또한, 조직학적 분석을 통해 성숙한 뼈가 생성된 것을 알 수 있었다 (실시예 5-1 및 5-2 참조).
결과적으로 단순히 BMP-2만을 방출하는 전달체와 비교하여 BMP-2 및 알렌드로네이트를 순차적으로 방출하는 본 발명에 따른 약물 전달체의 골재생 효과가 약 2배 이상 높은 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 본 발명에 따른 약물 전달체의 우수한 골재생 효과를 입증하는 것이다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 다중 약물 전달체를 포함하는 골재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 다중 약물 전달체를 포함하는 골재생 또는 골형성이 필요한 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “골재생”이란 골형성과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 소실된 골조직의 치유로 골형성 촉진을 포함하는 것이다. 구체적으로 골조직, 골세포 또는 골매트릭스 등의 양을 증가시키거나 또는 양이 증가되는 시간을 단축시키는 것을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어. “치료”는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골재생 또는 골형성의 촉진이 필요한 질환 또는 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 골재생 또는 골형성의 촉진이 필요한 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명에서 골재생 및 골형성 촉진이 필요한 질환은 골절, 치조골재생, 관절성형술, 척추유합, 및 골낭포/골종양 등을 포함할 수 있고, 이러한 질환으로 인해 뼈의 자연적 회복이 어려워 골이식과 같은 외과적 수술이 필요한 다양한 질환에 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 다중 약물 전달체를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 국소에 적용하는 비경구 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약물 전달체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골재생 방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 다중 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
(a) 콜라겐 (collagen) 용액과 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite) 나노입자를 혼합하여 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리 (slurry)를 제조하는 단계;
(b) 생체적합성 고분자 중합체 용액에 알렌드로네이트 (Alendronate)를 첨가한 후 교반하여 알렌드로네이트를 생체적합성 고분자 미립구 내로 봉입시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a)에서 제조된 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리, 상기 알렌드로네이트가 봉입된 미립구 및 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2)를 혼합하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (a)는 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리를 제조하기 위한 단계이다.
구체적으로, 상기 단계 (a)는 용액에서 단백질 손실을 피하기 위해 화학적 가교 단계를 생략하여 수행될 수 있으며, 콜라겐의 겔화 및 열 변성을 막기 위해 전체 공정이 4℃ 온도 조건에서 수행되는 것이 바람직하다. 콜라겐 용액과 하이드록시아파타이트 나노입자 (<200 nm)를 혼합하여 교반하고 균질기 (Homogenizer)를 통해 15,000 rpm에서 10분 내지 30분 동안, 바람직하게는 20분 동안 상기 현탁액을 블렌딩하여 슬러리를 제조할 수 있으며, 기포를 제거하기 위해 슬러리를 진공에서 탈기하는 과정을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (b)는 알렌드로네이트가 봉입된 생체적합성 고분자 미립구를 제조하는 단계이다.
상기 단계 (b)는 W/O/W (Water-in-oil-in-water) 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 생체적합성 고분자는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락트산(PLA), 폴리락타이드, 폴리글리콜산, 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리언하이드라이드 (polyanhydride), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 락트산/글리콜산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산 및 락트산과 아미노산의 공중합체로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 PLGA일 수 있다.
구체적으로, 상기 PLGA 중합체를 디클로로메탄에 용해시키고, 수산화나트륨 (NaOH)에 용해된 알렌드로네이트를 상기 중합체 용액에 첨가한 다음 균질화하여 1차 에멀젼 (W/O)을 형성할 수 있다. 이어서 상기 혼합된 중합체 용액을 폴리비닐 알코올 수용액에 dropwise 방식으로 첨가한 다음 약 6시간 동안 야외에서 교반하여 유기 용매를 증발시킴으로써 알렌드로네이트가 봉입된 생체적합성 고분자 미립구를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (c)는 알렌드로네이트가 봉입된 미립구 및 BMP-2가 함입된 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체를 제조하기 위한 단계이다.
상기 단계 (c)는 rhBMP-2 및 상기 PLGA 미립구를 상기 단계 (a)에서 제조된 슬러리와 부드럽게 혼합하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 일실시양태에서는 150μL의 CHAS 슬러리 및 총 1ug의 rhBMP-2를 사용하였으며, 8mm (너비) × 2mm (높이) 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 주형에서 상기 알렌드로네이트가 봉입된 미립구 및 BMP-2가 함입된 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체를 생산하였다. 이후 제조된 상기 지지체를 -80℃에서 동결건조하며, 4℃에서 4시간 동안 UV를 조사하여 살균하는 과정을 추가로 실시할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험재료 및 실험방법
1-1. 실험재료
3차원 (3D) 구조화 하이드로겔을 위해 Advanced BioMatrix (CA, USA)에서 랫트의 꼬리 유래 제1형 콜라겐(collagen type I) 용액 (3.8mg/ml)과 중화 용액을 구입하였다. 재조합 인간 골 형태형성 단백질-2 (bone morphogenetic protein-2; rhBMP-2)는 Peprotech (NJ, USA)에서 구입하였고, 나노-하이드록시아파타이트 입자 (nano-hydroxyapatite particles; nHAp)는 미국 Sigma-Aldrich에서 구입하였으며 주사전자현미경 (SEM)을 통해 상기 입자의 크기가 200　nm 이내임을 확인하였다. cell counting kit-8 (CCK-8) 및 the rhBMP-2 ELISA kit는 Goma Biotech (Korea)에서 구입하였고, 카르복실 (Carboxyl)-말단 50:50 PLGA (0.67dl/g)는 LACTEL Absorbable Polymers에서 구입하였다. 또한, 폴리비닐 알코올 (Polyvinyl alcohol) (Mw = 13,000-23,000), 디클로로메탄 (dichloromethane; DCM), 알렌드로네이트 (alendronate; 이하 ALN), 수산화 나트륨 (sodium hydroxide), 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol; 2ME) 및 오르토-프탈알데히드 (ortho-phthalaldehyde; OPA)는 한국 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 마지막으로 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 소태아혈청 (fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin)은 Gibco에서 구입하였다.
1-2. 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체 (CHAS)의 제조
CHAS는 in vitro 및 in vivo 실험에 사용하기 전, 용액에서 단백질 손실을 피하기 위해 화학적 가교 단계를 생략하여 제조하였다. 구체적으로, 2mL의 콜라겐 용액 (3.8mg/mL)을 각 바이알에 첨가하고 콜라겐 용액을 100mg의 나노-하이드록시아파타이트 입자 (nHAp, < 200nm)와 함께 교반하였다. 또한, 콜라겐의 의도하지 않은 겔화 및 열 변성을 막기 위해 전체 제조 공정은 4℃ 온도 조건에서 수행되었다. 4℃로 유지된 반응 용기에서 오버 헤드 블렌더를 사용하여 15,000 rpm에서 20분 동안 상기 현탁액을 블렌딩하였고, 기포를 제거하기 위해 슬러리를 진공에서 탈기하였으며, 이는 조절되지 않은 다공성을 초래할 수 있다. 이후 rhBMP-2 및 ALN를 지지체에 함입시키기 위해 rhBMP-2 (R&D Systems, UK) 및 ALN가 봉입된 PLGA 미립구를 탈기 단계 전에 상기 CHAS 슬러리와 부드럽게 혼합하였으며, 이어서 상기 CHAS 슬러리 150μL를 사용하여 8mm (너비) × 2mm (높이) 형태의 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 주형에서 지지체를 생산하였다. 이때 상기 하나의 CHAS 당 rhBMP-2는 1ug이 함입되었다. 다음으로 제조된 CHAS를 3시간 동안 겔화시킨 후, 일정한 냉각 동결-건조 프로토콜을 사용하여 -80℃에서 동결건조시켰으며, 4℃에서 4시간 동안 UV 광선(λnm)을 조사하여 살균하였다.
1-3. CHAS에서 BMP-2의 방출 프로파일 분석
CHAS로부터 BMP-2의 방출 프로파일을 조사하기 위해, 하이드로겔을 3mL PBS에 넣고 120 rpm, 37℃ 조건에서 진탕 배양기(WIS-20, Daihan Scientific, Korea)에 넣었다. 해당 시점에서 최대 28일까지 방출 배지 (즉, PBS 버퍼)를 추출하고 새로운 PBS 버퍼로 교체하였다. 이후 마이크로 플레이트 리더(Versa Max, Molecular Devices, CA, USA)를 통해 제조사의 지침에 따라 rhBMP-2 ELISA 키트 (KOMA Biotech, Korea)를 이용하여 CHAS로부터 방출된 단백질 농도를 확인하였다.
1-4. CHAS에서 알렌드로네이트의 방출 프로파일 분석
본 발명자들은 ALN의 점진적인 방출을 정량화 하기 위해 분광광도법을 이용하였다. 구체적으로, 0.05M NaOH 10mL에 무수 OPA 10mg을 녹여 작업 용액을 준비한 후 2ME 용액을 50μL를 첨가하였다. ALN 표준 용액은 ALN을 용해하여 준비한 후 희석하였다. 검량선의 경우 ALN을 포함하는 표준 용액과 작업 용액을 1:1 부피 비율로 혼합하고 37℃에서 60분 동안 배양하였다. 상기 배양된 용액은 다중 플레이트 판독기를 사용하여 335nm에서 측정하였으며, CHAS에서 방출된 ALN은 동일한 과정을 통해 측정정하고 보정 곡선을 이용하여 정량화하였다.
1-5. PLGA 미립구의 제조 및 CHAS로의 함입
BMP-2 또는 ALN를 포함하는 PLGA 미립구 (microsphere)는 water-in-oil-in-water (W/O/W) 기술을 이용하여 제조하였다. 구체적으로, 400mg PLGA 중합체를 디클로로메탄 (dichloromethane; DCM) 10mL에 용해시켰고, 0.05M NaOH (0.25mL, 4% w/v)에 용해된 ALN 또는 PBS에 용해된 BMP-2를 상기 중합체 용액에 첨가하고 3000 rpm에서 1분 동안 균질화 하여 1차 에멀젼 (W/O)을 형성하였다. 이어서 상기 디클로로메탄 중의 중합체 용액을 폴리비닐 알코올(Polyvinyl alcohol; PVA)의 0.5% 수용액 4mL에 dropwise 방식으로 첨가한 다음, 혼합물을 자기 교반기를 사용하여 600 rpm에서 6시간 동안 야외에서 교반하여 유기 용매를 증발시켰다. 분해 시간에 따른 PLGA 미립구의 기공 크기는 주사전자현미경을 사용하여 확인하였다.
1-6. 세포배양 및 세포 생존율 분석
조골세포 (MC3T3-E1)와 파골세포 전구세포 (RAW 264.7)는 100units/mL의 페니실린-스트렙토마이신 및 20% FBS가 보충된 DMEM에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양되었고, 세포가 배양 면적의 70-90%에 도달하였을 때 계대배양하였다. 본 발명에서는 세포의 생존율을 측정하기 위해 CCK-8 세포 생존율 키트를 사용하였다. 구체적으로, 세포 생존율 분석을 위해 세포를 2.0 × 104 세포/웰의 밀도로 CHAS에서 각각 3일 및 7일 동안 배양하였다. 다음으로, CCK-8 시약 (10μL)을 무혈청 배지에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. CCK-8 시약 (WST-8)은 세포에서 탈수소효소 (dehydrogenases)에 의해 환원되고 노란색의 포르마잔 (formazan)을 형성하게 된다. 결과적으로 색의 강도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 650nm의 참조 파장과 함께 450nm의 흡광도로 측정하였다.
1-7. 알칼라인 포스파타아제 (Alkaline phosphatase; ALP) 활성 분석
조골세포의 ALP 활성을 측정하기 위해, 동결된 파라니트로페닐인산염 (pnitrophenyl phosphate; pNPP)을 실온에서 새로 평형화하였다. 다음으로, 세포를 각 CHAS 상에서 3일 또는 7일 동안 배양한 후 초음파 처리와 함께 세포 용해 완충액을 이용하여 용해시켰다. 이어서 상기 세포가 용해된 완충액에 pNPP를 첨가하고 실온에서 30분 동안 암조건하에 배양한 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 405nm에서 색상의 강도를 측정하였다.
1-8. 동물 모델 및 수술 절차
본 실시예에서는 Sprague-Dawley 랫트 (수컷 42마리, 9-10 주령, 체중 300-350g) (Koatech, Keung-Ki, Pyong-Taek, Korea)를 이용하여 서울대학교병원 실험동물윤리위원회(IACUC No. 35-2019-0072)의 승인을 받은 후 진행하였다. 또한 모든 실험은 ARRIVE를 포함한 관련 지침 및 규정을 준수하여 수행되었다. 동물들에게는 사료와 물을 자유롭게 급여하였고, 각 샘플 유형에 대해 3개 batch를 테스트하였다. 본 발명자들은 초기에 공지된 방법에 따라 각 랫트에서 임계 크기의 두개골 결함을 만들었다. 이를 위해, 각 랫트를 이소플루란 (isoflurane)으로 마취시켰고 더욱 깊게 마취시키기 위해 알팍솔론 (alfaxalone)(ALFAXAN CIV 80mg/kg)과 자일라진 (xylazine)(Rompun, 10mg/kg)을 복강 내 투여하였다. 마취 후 두개 돌기를 덮고 있는 두피의 모발을 면도한 후 Betadine (Hyundai Pharm, Korea)으로 소독하였다. 이어서 0.3ml의 2% 리도카인 (lidocaine)과 1:100,000 에피네프린 (epinephrine)을 포함하는 피하 주사를 두개골의 시상 중앙선을 따라 투여하여 국소 마취하였고, 비골 (nasal bone)에서 중간 시상 볏까지 두피 위에 4cm 길이의 시상 절개를 만들었다. 이후, 전체 두께의 플랩을 높이고 골막을 절개하여 두개골 뼈를 노출시킨 다음, 멸균 식염수 관개하에 trephine bur를 이용하여 8mm 임계 크기의 결함을 생성하였다. 두개관 (calvarium)을 절제하고 경막 손상을 피하기 위해 광범위한 주의를 기울였다. 아울러, 랫트를 무작위로 한 그룹 당 6마리씩 분배하여 하기 7개의 그룹으로 나누었다: (π) Sham/empty defect, (θ) Control/vehicle control, (ρ) ALN, (σ) BMP-2, (τ) A+B(P), (υ) A+B(E) 및 (vii) B+A(E). 다음으로 샘플을 각 그룹에 무작위로 할당하였다. 주변 연조직을 이식하고 피부를 봉합한 후 회복될 때까지 동물에게 진통제를 투여했으며, 수술 후 부작용은 없는 것을 확인하였다.
1-9. 마이크로 컴퓨터 단층촬영 (μ-CT) 분석
새로운 골형성을 평가하기 위해, 수술 후 2, 4 및 8주에 마이크로 컴퓨터 단층촬영 (μ-CT; NFR Polaris-G90, Nano Focus Ray, Korea)을 통해 골 결손 이미지를 얻었다. 영상화는 180μA의 X선 튜브 전류 및 55kV의 전압으로 9μm의 등방성 복셀 크기 (isotropic voxel size)로 스캐너를 이용해 수행되었다. 보다 상세하게, 각 해당 시점에 상기 전술한 프로토콜을 사용하여 상기 실시예 1-8에 따른 랫트 모델을 마취시켰고, AMIRA 소프트웨어 (버전 5.4, ZIB & Visage Imaging, 독일)를 사용하여 결함 영역에서 새로운 뼈가 형성되는지 여부를 평가하였다. 새로 형성된 뼈를 측정하기 위해 미리 정의된 크기의 원형 영역을 2차원 이미지에서 관심 영역 (ROI)으로 선택하였고, 정의된 ROI에서 골화를 나타내는 픽셀 영역은 그레이 스케일 단위를 사용하여 임계 값의 하한 및 상한 범위에서 관심 용적 (volume of interest; VOI)을 생성하여 3D로 재구성하였으며, 여기서 새로운 뼈 형성은 회색 임계 값 수준을 1000으로 설정하여 결정하였다. 새로운 골 용적 골절 (BV/TV) 백분율은 새로 형성된 BV를 원래 TV의 골절로 나누어 계산하였다.
1-10. 샘플 제조 및 조직학적 분석
새로운 뼈의 형성을 추가적으로 확인하기 위해, 수술 후 4주 및 8주에 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 Masson's trichrome (MT) 염색을 실시하여 조직학적 평가를 실시하였다. 이를 위해, CO2를 이용해 랫트를 안락사시키고 주변의 뼈와 연조직과 함께 결함 부위를 제거하였다. 회수된 표본을 10% (v/v) 완충 중성 포르말린 (Sigma-Aldrich, USA)에 3일 동안 담그고, 7일 동안 석회질을 제거한 다음, 5μm 두께의 절편으로 절단한 후 H&E 또는 MT 염색을 수행하였다. MT 염색은 미네랄화되지 않은 골조직과 결합 조직이 파란색으로 나타나고 미네랄화된 뼈는 적색으로 나타나게 되어 이들 차이를 구별할 수 있다. MT 염색 결과 적색으로 염색된 면적 비율(%)의 반정량적 검출은 ImageJ 소프트웨어 (V1.8.0_172, NIH, USA)를 이용하여 수행하였다. 또한 전문 병리학자가 슬라이드를 ×40 및 ×200 배율의 광학 현미경 (BX53F, OLYMPUS, Japan)으로 관찰하여 조직학적 평가를 실시하였다.
1-11. 통계분석
상기 분석 실험들은 3회 독립적으로 수행되었다. 통계분석은 prism7 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., USA)를 이용해 수행하여 분산 분석 (ANOVA)을 통해 그룹 간의 차이를 평가하였으며, 다음과 같이 *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001의 차이를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. nHAps의 크기와 PLGA 미립구의 기공 분포 및 MT 염색된 영역은 ImageJ 소프트웨어 (V1.8.0_172, NIH, USA)로 분석하였다.
실시예 2. CHAS 기반 BMP-2 및 ALN의 순차적 전달 시스템의 개발
본 발명자들은 PLGA 미립구를 사용하여 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체 (CHAS) 기반의 BMP-2 및/또는 ALN의 순차적 이중 전달 시스템을 개발하였다. 첫째, ALN가 봉입된 PLGA 미립구는 W/O/W 기술을 사용하여 제조하였다. 구체적으로, ALN는 직접 포획 방법을 통해 PLGA 미립구 내로 봉입되어 지속적인 방식으로 방출될 수 있다. PLGA 미립구의 직경은 PLGA의 농도를 조정함으로써 제어하였다. PLGA 미립구를 제작하는 동안 ALN 용액을 첨가하여 PLGA 미립구로 봉입된 ALN를 제조하였다. 마지막으로 BMP-2를 CHAS에 물리적으로 흡착시키고 PLGA 미립구에 봉입된 ALN를 상기 지지체에 함입시켜 본 발명에 따른 다중 약물 전달체 (B+A(E))를 제작하였다. 대조군으로는 BMP-2와 ALN이 모두 함입되지 않은 CHAS를 이용하였다. 또한 BMP-2와 ALN가 동시에 방출되는 CHAS 기반 전달체를 제조하였는데, 이때 ALN는 PLGA 미립구가 아닌 CHAS에 바로 함입되도록 하였다. 보다 상세하게 각 실험군 및 이의 약어를 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
실험군 설명
Sham 수술을 통해 결함을 만들고 CHAS를 이식하지 않은 군
Control BMP-2 및 ALN가 함입되지 않은 기본 CHAS
ALN ALN가 물리적으로 흡착된 CHAS
BMP-2 BMP-2가 물리적으로 흡착된 CHAS
B+A(P) BMP-2 및 ALN가 물리적으로 흡착된 CHAS
A+B(E) BMP-2가 PLGA 미립구 내로 봉입되고, ALN가 물리적으로 흡착된 CHAS
B+A(E) ALN가 PLGA 미립구 내로 봉입되고, BMP-2가 물리적으로 흡착된 CHAS
다음으로, PLGA 미립구 및 nHAp의 크기와 형태를 각각 조사하였다. 그 결과, 도 2의 A 및 B 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이 PLGA 미립구의 평균 직경은 29.4 ± 8.64 μm인 것으로 측정되었고, PLGA 미립구의 형태나 크기는 CHAS에 대한 ALN 또는 BMP-2의 로딩에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 한편 PLGA 미립구의 기공 크기는 분해 시간에 따라 점차 증가하였다. 또한, 선행 연구결과를 통해 마이크로 크기의 HAp에 비해 나노 크기인 nHAp의 골 유도 개선 효과가 보고되었는바, 본 발명에서는 나노 크기의 nHAp (평균 직경 97.7 ± 57 nm)를 사용하였다. 나아가 도 2의 C 및 D에 나타낸 바와 같이 SEM 관찰을 통해 PLGA 미립구 및 nHAps가 CHAS 내에 균일하게 분산되어 있음을 확인하였다. 더욱이, 도 2의 E에서 볼 수 있는 바와 같이 CHAS의 μ-CT 이미지를 통해 전체 CHAS (8mm (너비) × 2mm (높이))의 측면과 상단을 관찰하였다.
실시예 3. CHAS로부터 BMP-2 및 알렌드로네이트의 in vitro 방출 확인
BMP-2 ELISA 키트와 분광광도법을 각각 이용하여 in vitro에서 CHAS로부터 BMP-2 및 ALN의 방출 프로파일을 분석하였다. 먼저 BMP-2의 방출 프로파일을 분석한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 지지체로부터 전체 BMP-2의 30%가 첫째 날에 빠르게 방출되었고, 7일 후까지 BMP-2의 90%까지 누적 방출되는 것을 확인하였다. 이와는 대조적으로, PLGA 미립구 내로 봉입된 BMP-2 (BMP-2(E))의 경우에는 상기 BMP-2와 비교할 때 방출이 지연되는 것으로 나타났다. 구체적으로, 전체 BMP-2의 10%만이 초기 방출되는 것으로 나타났으며, 최대 4주까지 방출되는 것을 확인하였다. 즉, 첫째 주에 PLGA 미립구에 봉입되지 않은 BMP-2는 약 90%까지 지지체로부터 방출되는 반면 PLGA 미립구에 봉입된 BMP-2는 방출되지 않고 남아있는 양이 50% 이상인 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 PLGA 미립구 내로의 봉입에 의해 방출이 지연되는 것을 알 수 있었다.
상기 결과와 유사하게, 지지체로부터 PLGA 미립구의 내부 또는 외부의 ALN의 뚜렷한 방출 프로파일을 확인하였다. 구체적으로, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 1일째에 지지체에서 ALN (60%)의 급격한 방출이 관찰되었으며, 2주 후에 누적 방출이 전체 ALN의 90%가 되었을 때 포화상태가 되었다. 이와는 대조적으로, PLGA 미립구에 봉입된 ALN는 봉입되지 않은 것에 비해 상대적으로 느리고 지속적인 방출 양상을 나타냈다. 구체적으로 초기 2주 동안에는 지지체로부터 ALN가 거의 방출되지 않았으며, 2주 후부터 8주 동안 지속적으로 방출되었다. 이러한 결과는 지지체로부터 ALN 및 BMP-2의 방출이 PLGA 미립구를 통한 캡슐화로 인해 현저히 지연될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4. In vitro 골형성 분석
BMP-2 및/또는 ALN가 함입된 CHAS에서 전-조골세포의 증식을 평가하기 위해 먼저 3일 및 7일 후 CCK-8 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 전-조골세포는 3일 및 7일 동안 BMP-2 및/또는 ALN이 함입된 지지체에서 적절한 증식 능력을 나타내었다. 상기 결과는 두 생체활성 분자 (즉, BMP-2 및 ALN)를 갖는 CHAS가 세포독성 없이 양호한 생체적합성을 가지고 있음을 의미하는 것이다.
또한, 지지체의 골형성 효과를 평가하기 위해, BMP-2 및/또는 ALN이 함입된 지지체를 이용해 전-조골세포를 배양하고 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이 BMP-2가 함입되어 있는 지지체는 BMP-2가 함입되어 있지 않은 지지체 보다 더 높은 ALP 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 ALN가 PLGA 미립구 내로 봉입되고, BMP-2가 물리적으로 흡착된 지지체 즉, B+A (E)가 모든 그룹 중에서 가장 높은 수준의 ALP 활성을 나타내었다.
실시예 5. In vivo 골형성 분석
5-1. μ-CT 분석
본 발명자들은 상기 실시예 1-8에서 제작한 두개골 결손 랫트 모델에 상기 표 1의 각 CHAS 지지체를 이식하고 2, 4 및 8주 후에 in vivo μ-CT 영상을 통해 두개골 결손에서 골 유사 조직의 축적과 성숙을 평가하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 2, 4 및 8주 후 (2, 4 및 8 weeks)에 다른 지지체를 이식한 군에 비하여 각각 BMP-2 및 B+A(E)를 이식한 군의 골 함량이 증가한 것을 관찰하였다. 또한 결함 부위의 가장자리에서 중앙까지 새로운 뼈가 생성된 것을 확인하였다. 더욱이, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 골 부피 분율은 BMP-2와 ALN이 순차적으로 방출되는 B+A(E) 스캐폴드에서 가장 높게 나타났다.
나아가 대조군(Control)과 비교하여 BMP-2 및 B+A(E) 지지체의 골 부피/총 부피(BV/TV) 증가 여부를 분석하였다. 그 결과, BMP-2 및 B+A(E) 지지체의 BV/TV 증가율은 처음 2주 동안 각각 27.16%와 35.62% (p <0.05)인 것으로 측정되었다. 4주째에는 각각 41.99%와 54.71% (p <0.01)로 나타났고, 8주 후에는 각각 46.58%와 76.23% (p <0.001)로 확인되었다. 상기 결과로부터 BMP-2만이 함입된 지지체의 경우 골 함량 증가가 4주 동안 41.99% (p <0.05)로 현저히 증가한 것에 반해 8주 (46.58%)에는 무시할 수 있는 수준으로 거의 증가하지 않은 것을 알 수 있었다. 상기 도 3a의 2주 후 BMP-2 방출의 포화 상태를 고려하면, 이러한 결과는 PLGA 미립구에 봉입된 ALN의 지연된 방출이 이식 부위에서 골재생을 더욱 향상시킨다는 가설을 뒷받침한다. 특히, B+A(E) 그룹의 평균 BV/TV는 다른 모든 실험군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높게 나타났다.
5-2. 조직학적 분석
BMP-2와 ALN의 순차적인 방출이 두개골 결손 부위에서 성숙한 골 유사 조직의 생성을 유도하는지 확인하기 위해 조직학적 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 7의 상단에서 볼 수 있는 바와 같이 수술 후 4주와 8주에 sham, control 및 ALN 그룹에서 여러 결손 부위가 골조직이 많지 않은 섬유질 결합 조직으로 채워진 것을 관찰하였다. 특히 ALN, A+B(P) 및 A+B(E) 군은 결손 부위 내부에 섬유아세포 유사 세포와 함께 여러 개의 염증세포가 관찰되어 새로운 골이 형성되는 것이 저해된 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 PLGA 미립구로 봉입되지 않은 ALN의 폭발적 방출은 골재생의 부작용으로 이식 부위에 염증 반응이 유도된 것을 알 수 있었다. 또한, 결함 영역 외부의 이종 골화 징후는 관찰되지 않았다. 반면에 B+A(E) 그룹은 8주에 다른 군과 비교하여 층상 구조와 함께 상당한 양의 성숙한 뼈가 생성된 것으로 나타났다. 더욱이, 결함 영역은 원래 두개골의 자연 구조와 유사한 diploe를 포함하여 조밀한 뼈로 거의 덮여 있는 것을 확인하였다. 도 7 하단의 정량적 분석 결과, MT 염색을 통해 적색으로 나타난 면적의 비율은 각각 4주와 8주 모두에서 유의한 증가를 보였으며 (p <0.001), 이는 시간이 지남에 따라 뼈의 성숙도가 증가했음을 나타내는 것이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. (i) 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2) 및 (ii) 생체적합성 고분자 미립구에 봉입된 알렌드로네이트 (Alendronate)가 함입된 지지체 (scaffold)를 포함하는, 다중 약물 전달체로서,
    상기 BMP-2 및 알렌드로네이트는 상기 지지체로부터 순차적으로 방출되는 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지지체는 콜라겐-하이드록시아파타이트 지지체 (Collagen-hydroxyapatite scaffold)인 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생체적합성 고분자는 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA)인 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 알렌드로네이트가 봉입된 미립구의 평균 직경은 10 내지 150um인 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 BMP-2는 지지체 내에 0.1 내지 10ug이 함입된 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 알렌드로네이트는 BMP-2의 방출 시작 후 10 내지 15일째부터 방출되는 것을 특징으로 하는, 다중 약물 전달체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 다중 약물 전달체를 포함하는, 골재생용 약학적 조성물.
  8. 하기 단계를 포함하는, 다중 약물 전달체의 제조방법:
    (a) 콜라겐 (collagen) 용액과 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite) 나노입자를 혼합하여 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리 (slurry)를 제조하는 단계;
    (b) 생체적합성 고분자 중합체 용액에 알렌드로네이트 (Alendronate)를 첨가한 후 교반하여 알렌드로네이트를 생체적합성 고분자 미립구 내로 봉입시키는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (a)에서 제조된 콜라겐-하이드록시아파타이트 슬러리, 상기 알렌드로네이트가 봉입된 미립구 및 골 형태형성 단백질-2 (BMP-2)를 혼합하는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 생체적합성 고분자는 폴리(락틱-코-글리콜산) (poly(lactic-co-glycolic acid); PLGA)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 알렌드로네이트가 봉입된 미립구의 평균 직경은 10 내지 150um인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 BMP-2는 0.1 내지 10ug이 포함되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
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